JPS5860256A - 生物学的に活性な物質の測定法およびそれに使用する標識剤 - Google Patents
生物学的に活性な物質の測定法およびそれに使用する標識剤Info
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- JPS5860256A JPS5860256A JP15819381A JP15819381A JPS5860256A JP S5860256 A JPS5860256 A JP S5860256A JP 15819381 A JP15819381 A JP 15819381A JP 15819381 A JP15819381 A JP 15819381A JP S5860256 A JPS5860256 A JP S5860256A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は微粒子を用いて生物学的に活性な物質を測定す
る方法およびそれに使用する標識剤に関する。
る方法およびそれに使用する標識剤に関する。
近年、抗原抗体反応を利用し、微量成分を定量的に測定
す右方法が臨床検査および医学、獣医学、薬学、微生物
学などの研究分野において利用されてきている。
す右方法が臨床検査および医学、獣医学、薬学、微生物
学などの研究分野において利用されてきている。
赤血球凝集反応や免疫拡散法などの古典的方法に加えて
、最近では抗原・抗体反応により生じさせた免疫複合体
を光散乱により測定するネフエロメトリー、螢光や放射
性同位元素または酵素などで抗体も７しくは抗原を標識
し、抗原もしくは抗体を測定する標識免疫測定法、さら
に加えて合成ポリマー微粒子に抗原や抗体を固定化し、
抗体や抗原の存在でおとる微粒子の凝集の程度をガラス
板上やマイクロプレートで観察することや、凝集にとも
なう光の透過度の変化を分光光度計で測定することで抗
体や抗原の測定をおこなう方法も開発されつつある。
、最近では抗原・抗体反応により生じさせた免疫複合体
を光散乱により測定するネフエロメトリー、螢光や放射
性同位元素または酵素などで抗体も７しくは抗原を標識
し、抗原もしくは抗体を測定する標識免疫測定法、さら
に加えて合成ポリマー微粒子に抗原や抗体を固定化し、
抗体や抗原の存在でおとる微粒子の凝集の程度をガラス
板上やマイクロプレートで観察することや、凝集にとも
なう光の透過度の変化を分光光度計で測定することで抗
体や抗原の測定をおこなう方法も開発されつつある。
とりわけ、放射性同位元素を用いた免疫測定法（ＲＩＡ
）は、最も高感度の分析法として広く実用的に利用され
ているが、放射性同位元素を取り扱うため、被爆の危険
が伴う、特別の施設が必要等の大きな欠点を有している
。したがってＲＩＡ−にかかわる高感度測定法の実現が
求められている。その１つが、標識免疫測定の利点を残
して、放射性同位元素のかわりに酵素を利用することで
、高感度で取り扱いやすい方法として開発された酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）である。
）は、最も高感度の分析法として広く実用的に利用され
ているが、放射性同位元素を取り扱うため、被爆の危険
が伴う、特別の施設が必要等の大きな欠点を有している
。したがってＲＩＡ−にかかわる高感度測定法の実現が
求められている。その１つが、標識免疫測定の利点を残
して、放射性同位元素のかわりに酵素を利用することで
、高感度で取り扱いやすい方法として開発された酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）である。
ｇＩＡは確かに一部の被測定物質についてはＲＩＡに匹
敵する測定感度であるが、必ずしも全ての物質について
Ｒ，ＩＡと同様の感度をあげているわけでもないし、試
薬も比較的高価であることなどからいまだＲＩＡ法を凌
駕するに至ってはいない。
敵する測定感度であるが、必ずしも全ての物質について
Ｒ，ＩＡと同様の感度をあげているわけでもないし、試
薬も比較的高価であることなどからいまだＲＩＡ法を凌
駕するに至ってはいない。
一般にＲ，ＩＡ法に代表される免疫測定法は原理的に２
方法に大別される。１つは競争法であり他の１つはサン
ドウィッチ法と称されている方法である。競争法とは、
抗原もしくは抗体である被測定物質を含む測定試料液と
、前もって放射性同位元素などの標識剤で標識しておい
た既知濃度の被測定物質を混合し、そこに抗体もしくは
抗原を混合し反応させると抗原−抗体複合物ができるが
、複合物まだは複合物を形成しなかった遊離物質には標
識された被測定物質と標識されていない被測定物質が含
まれており、その比率を測定することで検体中の被測定
物質の測定をおこなう方法である。他の１つの方法であ
るサンドウィッチ法は２工程からなる測定法である。す
なわち被測定物質と特異的に結合する結合のパートナ−
を固定化しておいた固相を用意しておき、被測定物質と
反応させるという工程を経た後に、固相を液相より分離
し、次工程で被測定物質と特異的に反応しうる物質を放
射性同位元素などで標識して得た標識した結合性物質と
固相上の被測定物質を反応させ、固相もしくは液相中の
標識物質の測定をおこなうことで、被測定物質の測定を
おこなう方法である。
方法に大別される。１つは競争法であり他の１つはサン
ドウィッチ法と称されている方法である。競争法とは、
抗原もしくは抗体である被測定物質を含む測定試料液と
、前もって放射性同位元素などの標識剤で標識しておい
た既知濃度の被測定物質を混合し、そこに抗体もしくは
抗原を混合し反応させると抗原−抗体複合物ができるが
、複合物まだは複合物を形成しなかった遊離物質には標
識された被測定物質と標識されていない被測定物質が含
まれており、その比率を測定することで検体中の被測定
物質の測定をおこなう方法である。他の１つの方法であ
るサンドウィッチ法は２工程からなる測定法である。す
なわち被測定物質と特異的に結合する結合のパートナ−
を固定化しておいた固相を用意しておき、被測定物質と
反応させるという工程を経た後に、固相を液相より分離
し、次工程で被測定物質と特異的に反応しうる物質を放
射性同位元素などで標識して得た標識した結合性物質と
固相上の被測定物質を反応させ、固相もしくは液相中の
標識物質の測定をおこなうことで、被測定物質の測定を
おこなう方法である。
競争法はサンドウィッチ法に比較して操作力；簡便であ
り、しかも被測定物質の抗原部位がたとえ１個であって
も測定が可能なのであるのに対してサンドイツチ法は抗
原部位が１個の場合には測定することは不可能である。
り、しかも被測定物質の抗原部位がたとえ１個であって
も測定が可能なのであるのに対してサンドイツチ法は抗
原部位が１個の場合には測定することは不可能である。
したがって現行のＲＩＡ法では競争法の方が多く用いら
れている。
れている。
本発明者らは、ＲＩＡ法にかわる安全で安価な高感度測
定方法を開発すべく検討した結果、競争法において微粒
子を使用することにより生物学的に活性な物質を高感度
で測定できる新規な測定法を見い出し、本発明に到達し
た。
定方法を開発すべく検討した結果、競争法において微粒
子を使用することにより生物学的に活性な物質を高感度
で測定できる新規な測定法を見い出し、本発明に到達し
た。
すなわち本発明は、検体溶液中の生物学的に活性な被測
定物質と、既知量の標識剤で標識された被測定物質とを
、被測定物質に特異的に結合する結合のパートナ−を固
定化した固相に対して競争的に反応させた後、液相に残
存した標識物質を測定することにより、被測定物質を測
定する方法において、標識剤として粒径０，０３μｍ〜
６μｍの微粒子を用いることを特徴とする生物学的に活
性な物質の測定法において、標識剤として粒径０，０３
〜３μｍの微粒子を用いることを特徴とする生物学的に
活性な物質の測定法およびそれに使用する標識剤に関す
る。
定物質と、既知量の標識剤で標識された被測定物質とを
、被測定物質に特異的に結合する結合のパートナ−を固
定化した固相に対して競争的に反応させた後、液相に残
存した標識物質を測定することにより、被測定物質を測
定する方法において、標識剤として粒径０，０３μｍ〜
６μｍの微粒子を用いることを特徴とする生物学的に活
性な物質の測定法において、標識剤として粒径０，０３
〜３μｍの微粒子を用いることを特徴とする生物学的に
活性な物質の測定法およびそれに使用する標識剤に関す
る。
本発明の特徴は競争法で被測定物質を放射性同位元素や
酵素で標識した標識物質を使用するかわりに、粒径が０
．０６μｍ −３μｍの微粒子によって標識した標識物
質（以下活性微粒子と略記する）を使用したことである
。一定量の活性微粒子を、検体と同時か、検体を先に反
応させておいた、結合のパートナ−が固定化されている
固相と反応させた場合、検体溶液中の測定すくき被測定
物質の量が多くなればなるほど固１目に結合する、活性
微粒子の量は減少し、逆に液相に残る活性微粒子量は増
加する。この液相側に残った活性微粒子を計数すること
で、被測定物質を定量的に測定できる。計数方法として
は、活性微粒子分散液に光を照射して生じる散乱光の強
度を測定する方法、同様にして透過光を測定する方法、
粒子計数機により、活性粒子個数を計数する方法などが
ある。
酵素で標識した標識物質を使用するかわりに、粒径が０
．０６μｍ −３μｍの微粒子によって標識した標識物
質（以下活性微粒子と略記する）を使用したことである
。一定量の活性微粒子を、検体と同時か、検体を先に反
応させておいた、結合のパートナ−が固定化されている
固相と反応させた場合、検体溶液中の測定すくき被測定
物質の量が多くなればなるほど固１目に結合する、活性
微粒子の量は減少し、逆に液相に残る活性微粒子量は増
加する。この液相側に残った活性微粒子を計数すること
で、被測定物質を定量的に測定できる。計数方法として
は、活性微粒子分散液に光を照射して生じる散乱光の強
度を測定する方法、同様にして透過光を測定する方法、
粒子計数機により、活性粒子個数を計数する方法などが
ある。
本発明で使用する固相は、活性微粒子と分離可能な形状
もしくは材質のものが好ましい。
もしくは材質のものが好ましい。
すなわち、固相を活性微粒子よりも格段に太きい球や板
状の物質として活性微粒子との混合系からつまみ出せる
ようにしたり、固相を微粒子とした場合でも活性微粒子
より大きい粒径として、膜、フィルターまたは遠心分離
機などで分離できるようにしたり、粒径を変えなくとも
固相微粒子の比重を活性微粒子の比重より大きくして、
沈降しやすくし遠心操作により分離できるようにしたり
、または固相微粒子内部に感磁性物質を封入しておき磁
石で吸いつけることで分離できるようにしたりすること
が必要である。
状の物質として活性微粒子との混合系からつまみ出せる
ようにしたり、固相を微粒子とした場合でも活性微粒子
より大きい粒径として、膜、フィルターまたは遠心分離
機などで分離できるようにしたり、粒径を変えなくとも
固相微粒子の比重を活性微粒子の比重より大きくして、
沈降しやすくし遠心操作により分離できるようにしたり
、または固相微粒子内部に感磁性物質を封入しておき磁
石で吸いつけることで分離できるようにしたりすること
が必要である。
以上の具体例は、固相と活性微粒子との分離について理
解されやすいように記したのであり、特に固相を限定す
るものではない。固相の素材としては生体構成成分や金
属などでもよいが、形状を自由に調節できしかも安定な
有機高分子化合物が好ましい。例えばポリスチレン、ポ
リアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタ
クリル酸メチル、ポリ−ε−カプラミド、ポリエチレン
テレフタレートなどの疎水性重合体群、あるいはポリア
クリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−ビニ
ルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキ
シエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタ
クリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリ
レート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレ
ート、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架
橋した親水性重合体群、もしくは両方の性質を持つ共電
体群がある。また固相の形状は板、試験管、マイクロプ
レートなどでもよいが、微粒子または線条を固相とすれ
ば表面積を容易に増加させることができる。
解されやすいように記したのであり、特に固相を限定す
るものではない。固相の素材としては生体構成成分や金
属などでもよいが、形状を自由に調節できしかも安定な
有機高分子化合物が好ましい。例えばポリスチレン、ポ
リアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタ
クリル酸メチル、ポリ−ε−カプラミド、ポリエチレン
テレフタレートなどの疎水性重合体群、あるいはポリア
クリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−ビニ
ルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキ
シエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタ
クリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリ
レート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレ
ート、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架
橋した親水性重合体群、もしくは両方の性質を持つ共電
体群がある。また固相の形状は板、試験管、マイクロプ
レートなどでもよいが、微粒子または線条を固相とすれ
ば表面積を容易に増加させることができる。
固相への結合のパートナ−の固定化方法としては、物理
吸着と化学結合がある。例えば疎水的な固相には蛋白質
などは物理吸着で固定化できるし、アミノ基やカルボキ
シル基が官能基として存在する固相にはカルボジイミド
でカルボキシル基やアミノ基を有する物質を共有結合で
固定化できるし、アミノ基を有する固相にはアミン基を
有する物質をグルタルアルデヒドで共有結合により固定
化できるし、ヒドロキシル基を有する固相には臭化シア
ンによりアミノ基を有する物質を共有結合で固定化でき
る。固相の洗浄に界面活性剤を含有させた洗浄液を使用
することもあり、固定化方法としては固定化した物質が
脱離する危険のある物理吸着法に比して共有結合法が好
ましい。
吸着と化学結合がある。例えば疎水的な固相には蛋白質
などは物理吸着で固定化できるし、アミノ基やカルボキ
シル基が官能基として存在する固相にはカルボジイミド
でカルボキシル基やアミノ基を有する物質を共有結合で
固定化できるし、アミノ基を有する固相にはアミン基を
有する物質をグルタルアルデヒドで共有結合により固定
化できるし、ヒドロキシル基を有する固相には臭化シア
ンによりアミノ基を有する物質を共有結合で固定化でき
る。固相の洗浄に界面活性剤を含有させた洗浄液を使用
することもあり、固定化方法としては固定化した物質が
脱離する危険のある物理吸着法に比して共有結合法が好
ましい。
本発明で使用する結合のパートナ−とは被測定物質に特
異的に結合しうる物質である。例えば、被測定物質が抗
原、抗体、ホルモン、抗原抗体複合体、糖類、免疫グロ
ブリン、リンフ才力イン、補体などの場合には順に抗体
、抗原、該ホルモンリセプター、リューマチ因子、レク
チン、プロティンＡ１該リンフオカインリセプター、該
補体リセプターなどとの組み合わせがそれぞれ被測定物
質と結合のパートナ−の組み合わせになりうる。
異的に結合しうる物質である。例えば、被測定物質が抗
原、抗体、ホルモン、抗原抗体複合体、糖類、免疫グロ
ブリン、リンフ才力イン、補体などの場合には順に抗体
、抗原、該ホルモンリセプター、リューマチ因子、レク
チン、プロティンＡ１該リンフオカインリセプター、該
補体リセプターなどとの組み合わせがそれぞれ被測定物
質と結合のパートナ−の組み合わせになりうる。
固相に対して検体中の被測定物質と競争的に反応させる
活性微粒子の担体となる微粒子は測定の精度を出すうえ
で、均一な粒径、形状であることか好ましい。反応効率
の点から粒径は小さいほどよく、少くともブラウン運動
をおこす程度の粒径すなわち３μｍ以下であることが好
ましい。しかしＡあまり粒径が小さくとも操作上および
測定上適当ではないので、粒径ば０．０６μｍ〜６μｍ
の範囲であることが適当であり、特に０．１μｒｒｔ−
ｏ、８μｍの粒径が好ましい。
活性微粒子の担体となる微粒子は測定の精度を出すうえ
で、均一な粒径、形状であることか好ましい。反応効率
の点から粒径は小さいほどよく、少くともブラウン運動
をおこす程度の粒径すなわち３μｍ以下であることが好
ましい。しかしＡあまり粒径が小さくとも操作上および
測定上適当ではないので、粒径ば０．０６μｍ〜６μｍ
の範囲であることが適当であり、特に０．１μｒｒｔ−
ｏ、８μｍの粒径が好ましい。
活性微粒子の素材は均一で適当な粒径の微粒子を得る目
的から有機高分子重合体が好ましい。
的から有機高分子重合体が好ましい。
例えば前記の固相と同様の疎水性重合体、親水性重合体
、両者の共重合体群がある。本発明の微粒子は乳化重合
や沈澱重合により調製できる。
、両者の共重合体群がある。本発明の微粒子は乳化重合
や沈澱重合により調製できる。
これらの重合法は均一な粒径および形状の微粒子を得る
のに適した方決である。特に乳化重合は乳化剤やモノマ
ー濃度を調節することで粒径が１μｍ〜０．０５μｍの
範囲の均一な粒径の微粒子を調製できる重合法で、目的
とする微粒子を得るには適した重合法である。被測定物
質は、物理吸着や化学結合により微粒子に結合させるこ
とができる。本微粒子は分散性がよくなければならず、
しかも固相への被測定物質を介さない結合があってはな
らないので、固相と同様に親水性の有機高分子化合物に
結合性物質を共有結合で結合させて調製した微粒子が特
に好ましい。
のに適した方決である。特に乳化重合は乳化剤やモノマ
ー濃度を調節することで粒径が１μｍ〜０．０５μｍの
範囲の均一な粒径の微粒子を調製できる重合法で、目的
とする微粒子を得るには適した重合法である。被測定物
質は、物理吸着や化学結合により微粒子に結合させるこ
とができる。本微粒子は分散性がよくなければならず、
しかも固相への被測定物質を介さない結合があってはな
らないので、固相と同様に親水性の有機高分子化合物に
結合性物質を共有結合で結合させて調製した微粒子が特
に好ましい。
本発明において被測定物質となりうる物質は、生物学的
に特異的な親和性を有する物質を対物質として有してい
る物質であり、具体的には例えば連鎖球菌、ブドウ球菌
、ジフテリア菌、サルモネラ菌、赤痢菌などの細菌およ
びその構成成分に対する抗体；梅毒トレポネーマなどの
スピロヘータおよびその構成成分に対する抗体；マイコ
プラズマおよびその構成成分に対する抗体；マラリア原
虫などの原虫類およびその構成成分に対する抗体；リチ
ツチャアおよびその構成成分に対する抗体；インフルエ
ンザ、アデノウィルス、ポリオーマ、麻疹、風疹、肝炎
、おたふくかぜなどのウィルスおよびその構成成分なら
びにそれらに対する抗体；多糖類、ヒトアルブミン、卵
白アルブミンなどの異種抗原ならびにそれらに対する抗
体；インシュリン、サイロイドホルモン、絨毛性ゴナド
トロピンなどのホルモン；リボヌクレアーゼ、タレアチ
ンホスホキナーゼ、アスパラギナーゼなどの酵素；腎臓
細胞膜、肝臓細胞膜、α−フェトプロティン、ＯＥＡな
どの脂管固有の抗原またはりセプター；コラーゲン、ア
ミロイドなどの結合組織成分；赤血球、血小板などの血
球抗原、またはりセプター；フィブリン、プラスミノー
ゲンなどの血繁タンパク質；リューマチ因子や０反応性
タンパク質などの病理グロブリン；免疫複合体；細胞膜
などに対する自己抗体−などがある。
に特異的な親和性を有する物質を対物質として有してい
る物質であり、具体的には例えば連鎖球菌、ブドウ球菌
、ジフテリア菌、サルモネラ菌、赤痢菌などの細菌およ
びその構成成分に対する抗体；梅毒トレポネーマなどの
スピロヘータおよびその構成成分に対する抗体；マイコ
プラズマおよびその構成成分に対する抗体；マラリア原
虫などの原虫類およびその構成成分に対する抗体；リチ
ツチャアおよびその構成成分に対する抗体；インフルエ
ンザ、アデノウィルス、ポリオーマ、麻疹、風疹、肝炎
、おたふくかぜなどのウィルスおよびその構成成分なら
びにそれらに対する抗体；多糖類、ヒトアルブミン、卵
白アルブミンなどの異種抗原ならびにそれらに対する抗
体；インシュリン、サイロイドホルモン、絨毛性ゴナド
トロピンなどのホルモン；リボヌクレアーゼ、タレアチ
ンホスホキナーゼ、アスパラギナーゼなどの酵素；腎臓
細胞膜、肝臓細胞膜、α−フェトプロティン、ＯＥＡな
どの脂管固有の抗原またはりセプター；コラーゲン、ア
ミロイドなどの結合組織成分；赤血球、血小板などの血
球抗原、またはりセプター；フィブリン、プラスミノー
ゲンなどの血繁タンパク質；リューマチ因子や０反応性
タンパク質などの病理グロブリン；免疫複合体；細胞膜
などに対する自己抗体−などがある。
固相と被測定物質および活性微粒子との反応後、固相に
結合しなかった残存活性微粒子数を測定する。測定法は
微粒子の定量的測定ができるどのような方法でもよい。
結合しなかった残存活性微粒子数を測定する。測定法は
微粒子の定量的測定ができるどのような方法でもよい。
なかでも微粒子による散乱光の強度を測定する方法は、
微粒子に微粒子の粒径と同じくらいの波長の光を照射し
、そのミー散乱と呼ばれる照射した光の波長と同波長の
散乱光を測定する方法であり、高感度測定が可能な方法
である。
微粒子に微粒子の粒径と同じくらいの波長の光を照射し
、そのミー散乱と呼ばれる照射した光の波長と同波長の
散乱光を測定する方法であり、高感度測定が可能な方法
である。
以下に本発明の理解を容易にする為に若干の実施例を示
した。
した。
実施例１
（インシュリンの測定）
（固相用微粒子の調製）
固相として使用した微粒子は特願昭５５−４３６１８に
配したように、グリシジルメタクリレート、２−オキ７
エチルメタクリレート、およびトリエチレングリコール
ジメタクリレートの６者を８５．７ ： ９．５ ：
４．８のモル比で混合し重合した微粒子をアミン化し、
加水分解することにより調製した、平均粒径４．３μｍ
の親水性微粒子である。
配したように、グリシジルメタクリレート、２−オキ７
エチルメタクリレート、およびトリエチレングリコール
ジメタクリレートの６者を８５．７ ： ９．５ ：
４．８のモル比で混合し重合した微粒子をアミン化し、
加水分解することにより調製した、平均粒径４．３μｍ
の親水性微粒子である。
（抗ブタインシュリン抗血清固宝化固相の調製）アミノ
化加水分解処理微粒子を特願昭５５−４３６１８に記載
の方法に準じてグルタルアルデヒドで活性化し、ＰＨ７
，２の０．１５モル生理リン酸緩衝液（ＰＢｓ）中に濃
度が１％になるように分散させた。この分散液と提ブタ
インシュリン抗血清（Ｍｉｌｅｓ ）を等量混合し、！
Ｉ０℃で５時間反応させた後、さらに牛血清アルーブミ
ン（以下、ＢＳＡと略記する。）を粒子分散液中で１％
となるように加え、さらに１時間反応させ、さらに３０
００ｒｐｍの遠心操作による洗浄の後、０．１９６のＢ
ＳＡを含むＰＢｓ中に分散させ、抗ブタインシュリン抗
血清固定化微粒子固相を調製した。
化加水分解処理微粒子を特願昭５５−４３６１８に記載
の方法に準じてグルタルアルデヒドで活性化し、ＰＨ７
，２の０．１５モル生理リン酸緩衝液（ＰＢｓ）中に濃
度が１％になるように分散させた。この分散液と提ブタ
インシュリン抗血清（Ｍｉｌｅｓ ）を等量混合し、！
Ｉ０℃で５時間反応させた後、さらに牛血清アルーブミ
ン（以下、ＢＳＡと略記する。）を粒子分散液中で１％
となるように加え、さらに１時間反応させ、さらに３０
００ｒｐｍの遠心操作による洗浄の後、０．１９６のＢ
ＳＡを含むＰＢｓ中に分散させ、抗ブタインシュリン抗
血清固定化微粒子固相を調製した。
（活性微粒子用微粒子の調製）
グリシジルメタクリレート、メタクリル酸、エチレング
リコールジメタクリレートを８５：１０：５のモル比で
混合し、ドデシル硫酸ナトリウムを０．１％、過硫酸ア
ンモニウムｏ、ｏｉモル／ｌを含む水溶液に加え、七ツ
マー濃度１０ ％ （Ｗ／Ｖ）の水溶液として、アルゴ
ンガス雰囲気下で６０℃、２２時間反応させた後、生成
した微粒子を固相微粒子と同様にして、アミン化、加水
分解して粒径が０．２７μｍの均一な微粒子を調製した
。
リコールジメタクリレートを８５：１０：５のモル比で
混合し、ドデシル硫酸ナトリウムを０．１％、過硫酸ア
ンモニウムｏ、ｏｉモル／ｌを含む水溶液に加え、七ツ
マー濃度１０ ％ （Ｗ／Ｖ）の水溶液として、アルゴ
ンガス雰囲気下で６０℃、２２時間反応させた後、生成
した微粒子を固相微粒子と同様にして、アミン化、加水
分解して粒径が０．２７μｍの均一な微粒子を調製した
。
（インシュリン固定化活性微粒子の調製）固相用微粒子
への抗ブタインシュＩＪ ７抗血清の固定化の方法に準
じて、インシュリンの固定化をおこなった。すなわち、
グルタルアルデヒド処理した濃度１％の微粒子分散液と
４Ｄ単位／−のブタインシュＩＪ ン（Ｎ０ＶＯ）を等
量混合し、３０℃で２時間反応させ、さらにＢＳＡを１
％となるように加え、６０℃で１時間反応を続け、１１
００００ｒｐで３０分遠心することで微粒子の洗浄をお
こなった後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に粒子濃度
１％になるように分散させ、ブタインシュリン固定化活
性微粒子を調製した。
への抗ブタインシュＩＪ ７抗血清の固定化の方法に準
じて、インシュリンの固定化をおこなった。すなわち、
グルタルアルデヒド処理した濃度１％の微粒子分散液と
４Ｄ単位／−のブタインシュＩＪ ン（Ｎ０ＶＯ）を等
量混合し、３０℃で２時間反応させ、さらにＢＳＡを１
％となるように加え、６０℃で１時間反応を続け、１１
００００ｒｐで３０分遠心することで微粒子の洗浄をお
こなった後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に粒子濃度
１％になるように分散させ、ブタインシュリン固定化活
性微粒子を調製した。
（インシュリンの測定）
ブタインシュリンを２５μＵ／７．１２．５μＵ／ｄ、
６．２５μＵ／ゴ含むＰＢＳ溶液１００μｔに抗ブタイ
ンシュリン抗血清固定化固相微粒子１チ公散液を１００
／ノ２加えて、２５℃で２時間反応させてから、さらに
インシュリン固定化活性微粒子（ｏ、ｏｉチ分散液）１
０μｔを加え、さらに２５℃で一晩反応させた。反応液
に２．５−のＰＢＳを加え、３０００ ｒ ｐｍの遠心
操作で固相および固相と反応した活性微粒子を沈降させ
、上清として固相と反応しなかった微粒子分散液を？Ｕ
／ど。、活性微粒子分散液の光散乱強度をアミンコ・
ポーマン社の螢光光度計を用いて４００ Ｉｎの光を照
射することで測定した。光散乱強度は微粒子数と比例し
ているので、予め作成した検量線を用いて光散乱強度よ
り微粒子数を求めた。第１図に示したようにイン７ュリ
ンが２５μＵ ／ｍｌ 〜６．２５ ｐ Ｕ、／ｍｌの
範囲で定ｔ［Ｋ測定できることがわかる。
６．２５μＵ／ゴ含むＰＢＳ溶液１００μｔに抗ブタイ
ンシュリン抗血清固定化固相微粒子１チ公散液を１００
／ノ２加えて、２５℃で２時間反応させてから、さらに
インシュリン固定化活性微粒子（ｏ、ｏｉチ分散液）１
０μｔを加え、さらに２５℃で一晩反応させた。反応液
に２．５−のＰＢＳを加え、３０００ ｒ ｐｍの遠心
操作で固相および固相と反応した活性微粒子を沈降させ
、上清として固相と反応しなかった微粒子分散液を？Ｕ
／ど。、活性微粒子分散液の光散乱強度をアミンコ・
ポーマン社の螢光光度計を用いて４００ Ｉｎの光を照
射することで測定した。光散乱強度は微粒子数と比例し
ているので、予め作成した検量線を用いて光散乱強度よ
り微粒子数を求めた。第１図に示したようにイン７ュリ
ンが２５μＵ ／ｍｌ 〜６．２５ ｐ Ｕ、／ｍｌの
範囲で定ｔ［Ｋ測定できることがわかる。
実施例２
１Ｂ８Ａの測定）
（抗ＢＳＡ抗血清固定化固相の調製）
嘗
実施例２と同様にして調製したグルタルアルデヒド処理
をした固相用微粒子１チ分散液と抗ＢＳＡ抗血清（Ｍｉ
ｌｅｓ ）を等量混合し、３０℃で６時間反応させた後
、さらに、ヒト血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記す
る。）を粒子分散液中で１チとなるように加え、さらに
１時間反応させ、５０００ｒｐｍの遠心操作による洗浄
の後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に分散させ、抗
ＢＳＡ抗血清固定化微粒子を調製した。
をした固相用微粒子１チ分散液と抗ＢＳＡ抗血清（Ｍｉ
ｌｅｓ ）を等量混合し、３０℃で６時間反応させた後
、さらに、ヒト血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記す
る。）を粒子分散液中で１チとなるように加え、さらに
１時間反応させ、５０００ｒｐｍの遠心操作による洗浄
の後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に分散させ、抗
ＢＳＡ抗血清固定化微粒子を調製した。
（ＢＳＡ固定化活性微粒子の作製）
実施例１と同様にして調製したグルタルアルデヒド処理
をした粒径０，２７μｍの活性微粒子１％分散液にＢＳ
Ａを１０μｔ１ｇ／ｍｌになるように加え、３０℃で３
時間反応させ、１１００００ｒｐの遠心操作による洗浄
の後、０．１チのＢＳＡを含むＰＢＳ中に分散させ、Ｂ
ＳＡ固定化活性微粒子を調製した。
をした粒径０，２７μｍの活性微粒子１％分散液にＢＳ
Ａを１０μｔ１ｇ／ｍｌになるように加え、３０℃で３
時間反応させ、１１００００ｒｐの遠心操作による洗浄
の後、０．１チのＢＳＡを含むＰＢＳ中に分散させ、Ｂ
ＳＡ固定化活性微粒子を調製した。
（ＢＳＡの測定）
ＢＳＡを１０μｇ／ｍｊ！、 １１１ｇ／ｍｌ、 １０
０℃ｇ／ｍ／。
０℃ｇ／ｍ／。
１０■／−含むＰＢ８溶液９０μｔに抗ＢＳＡ抗血清固
定化固相微粒子１％分散液を１００μを加え、１時間５
０℃で反応させた後に、ＢＳＡ固定化活性微粒子を加え
、さらに−晩３０℃で反応させた。反応液に２．５−の
ＰＢＳを加え、１．２μｍの径の穴がおいている膜（ミ
リポアフィルタ−ＲＡ）で面相に結合しなかつた活性微
粒子を、固相と固相に結合した？占性微粒子から分離し
、実施例１と同様にして散た。
定化固相微粒子１％分散液を１００μを加え、１時間５
０℃で反応させた後に、ＢＳＡ固定化活性微粒子を加え
、さらに−晩３０℃で反応させた。反応液に２．５−の
ＰＢＳを加え、１．２μｍの径の穴がおいている膜（ミ
リポアフィルタ−ＲＡ）で面相に結合しなかつた活性微
粒子を、固相と固相に結合した？占性微粒子から分離し
、実施例１と同様にして散た。
た。
実施例６
（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＯＧと略す）の測定）
） （抗ＨＯＧ抗血清固定化同相の調製） 実施例１と同様にして調製したグルタルアルデヒド処理
をしだ固相用微粒子１チ分散液と抗ＨＯＯ抗血清１６０
００ Ｉ Ｕ／ｄ （Ｍｉ １ｅｓ）を等量混合し、３
０℃で６時間反応させた後、さらにＢＳＡを粒子分散液
中で１チになるように加え、さらに１時間反応させ、３
０００ｒｐｍの遠心操作による洗浄の後、０．１％のＢ
ＳＡを含むｐＢｓ中に分散させ、抗ＨＯＧ抗血清固定化
微粒子固相を調製した。
） （抗ＨＯＧ抗血清固定化同相の調製） 実施例１と同様にして調製したグルタルアルデヒド処理
をしだ固相用微粒子１チ分散液と抗ＨＯＯ抗血清１６０
００ Ｉ Ｕ／ｄ （Ｍｉ １ｅｓ）を等量混合し、３
０℃で６時間反応させた後、さらにＢＳＡを粒子分散液
中で１チになるように加え、さらに１時間反応させ、３
０００ｒｐｍの遠心操作による洗浄の後、０．１％のＢ
ＳＡを含むｐＢｓ中に分散させ、抗ＨＯＧ抗血清固定化
微粒子固相を調製した。
（活性微粒子用微粒子の調製）
グリシジルメタクリレート、エチレングリコールジメタ
クリレートスルホプロピルメ！クリレートナトリウム塩
を８８：ＩＧ＋２０モル比で混合し、ドデシル硫酸ナト
リウムを０．１２５チ、過硫酸アンモニウム０．０１モ
ル／ｌを含む水溶液に加え、モノマー濃度１０％（Ｗ／
Ｖ）の水溶液として、アルゴンガス雰囲気下で６０℃で
６時間反応させた後、生成した微粒子を１１０００ｏｒ
ｐの遠心操作で洗浄をおこない、固相微粒子と同様にア
ミノ化、加水分解して粒径が０．１μｍの均一な微粒子
を調製した。
クリレートスルホプロピルメ！クリレートナトリウム塩
を８８：ＩＧ＋２０モル比で混合し、ドデシル硫酸ナト
リウムを０．１２５チ、過硫酸アンモニウム０．０１モ
ル／ｌを含む水溶液に加え、モノマー濃度１０％（Ｗ／
Ｖ）の水溶液として、アルゴンガス雰囲気下で６０℃で
６時間反応させた後、生成した微粒子を１１０００ｏｒ
ｐの遠心操作で洗浄をおこない、固相微粒子と同様にア
ミノ化、加水分解して粒径が０．１μｍの均一な微粒子
を調製した。
（ＨＯＧ固定化活性微粒子の調製）
固相用微粒子へのＢＳＡの固定化の方法に準じて、ＨＣ
Ｇの固定化をおこなった。すなわち、グルタルアルデヒ
ド処理した濃度０．１％Ｏ微粒子分散液にＨＯＧ （Ｓ
ｉｇｍａ）を６２００ＩＵ／１ｎＩ！、になるように混
合し、３０℃で３時間反応させた後、８８人を粒子分散
液中で１チとなるように加え、さらに１時間反応させた
。１５０００ｒｐｍで６０分遠心することで洗浄をおこ
なった後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に分散させ
、ＨＣＧ固定化活性微粒子を調製した。
Ｇの固定化をおこなった。すなわち、グルタルアルデヒ
ド処理した濃度０．１％Ｏ微粒子分散液にＨＯＧ （Ｓ
ｉｇｍａ）を６２００ＩＵ／１ｎＩ！、になるように混
合し、３０℃で３時間反応させた後、８８人を粒子分散
液中で１チとなるように加え、さらに１時間反応させた
。１５０００ｒｐｍで６０分遠心することで洗浄をおこ
なった後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に分散させ
、ＨＣＧ固定化活性微粒子を調製した。
（ＨＯＧの測定）
ＨＯＧの１０４〜１０２製／ｌまでの１０倍稀釈系列（
各９０μｔ）を作製し、ガラス試験管内で１％の抗ＨＯ
Ｇ固定化固相微粒子分散液５０１１ｔおよび０．０１％
のＨＯＧ微粒子分散液を１０μを加え、２５℃で一晩反
応させた。反応液に２．５−のＰＢ８を加え、実施例２
と同様にして膜により、固相に結合しなかった活性微粒
子を分離し、散乱光強度を測定し、強度から微粒子数を
求めた。
各９０μｔ）を作製し、ガラス試験管内で１％の抗ＨＯ
Ｇ固定化固相微粒子分散液５０１１ｔおよび０．０１％
のＨＯＧ微粒子分散液を１０μを加え、２５℃で一晩反
応させた。反応液に２．５−のＰＢ８を加え、実施例２
と同様にして膜により、固相に結合しなかった活性微粒
子を分離し、散乱光強度を測定し、強度から微粒子数を
求めた。
υ υ
ＨＯＧ１ｏ’蓼／ｌ〜１０２む／ｌの範囲におけるＨ
ＣＧ濃度と散乱光強度の関係を第３図に示した。
ＣＧ濃度と散乱光強度の関係を第３図に示した。
第１図〜第３図は、各々実施例１〜３の測定結果を示す
ものであり、第１図はインシュリンの測定を、第２図は
ＢＳＡの測定を、第３図は揮刀の測定を示す。 特許出願人 東 し 株 式 会 社易１図 インシュリン浸漬と７Ｕ／ｍｒｌｌ） 晃２区 （ｘｌＯ７コ／、） ＢＳＡづ濃度（Ｊ鷹） 鳥３図 （ｘｌｏ’鴨区） Ｈｃｃｒ濃７！（ｖ／１．）
ものであり、第１図はインシュリンの測定を、第２図は
ＢＳＡの測定を、第３図は揮刀の測定を示す。 特許出願人 東 し 株 式 会 社易１図 インシュリン浸漬と７Ｕ／ｍｒｌｌ） 晃２区 （ｘｌＯ７コ／、） ＢＳＡづ濃度（Ｊ鷹） 鳥３図 （ｘｌｏ’鴨区） Ｈｃｃｒ濃７！（ｖ／１．）
Claims (2)
- （１） 検体溶液中の生物学的に活性な被測定物質、
および標識剤で標識された既知量の被測定物質を、被測
定物質に特異的に結合する結合のパートナ−を固定化し
た固相に反応させた後、液相に残存した標識物質を測定
することにより被測定物質を測定する方法において、標
識剤として粒径０．０３μｍ〜３μｍの微粒子を用いる
ことを特徴とする生物学的に活性な物質の測定法。 - （２）粒径０．０３μｍ〜３μｍの微粒子からなる競争
的免疫測定用標識剤。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15819381A JPS5860256A (ja) | 1981-10-06 | 1981-10-06 | 生物学的に活性な物質の測定法およびそれに使用する標識剤 |
| EP19820106379 EP0070527B1 (en) | 1981-07-17 | 1982-07-15 | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor |
| DE8282106379T DE3264269D1 (en) | 1981-07-17 | 1982-07-15 | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor |
| CA000407452A CA1194416A (en) | 1981-07-17 | 1982-07-16 | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15819381A JPS5860256A (ja) | 1981-10-06 | 1981-10-06 | 生物学的に活性な物質の測定法およびそれに使用する標識剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5860256A true JPS5860256A (ja) | 1983-04-09 |
Family
ID=15666297
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15819381A Pending JPS5860256A (ja) | 1981-07-17 | 1981-10-06 | 生物学的に活性な物質の測定法およびそれに使用する標識剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5860256A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60253870A (ja) * | 1984-05-08 | 1985-12-14 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫学的診断方法 |
| JPS6148764A (ja) * | 1984-08-14 | 1986-03-10 | デューク サイエンティフィック コーポレーション | 特異物質用水性試料の検定方法およびキツト |
| JPH01273584A (ja) * | 1988-04-26 | 1989-11-01 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 検体捕集方法及び捕集装置 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50160423A (ja) * | 1974-05-29 | 1975-12-25 | ||
| JPS56151357A (en) * | 1980-04-25 | 1981-11-24 | Hitachi Ltd | Immunoassay method |
-
1981
- 1981-10-06 JP JP15819381A patent/JPS5860256A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50160423A (ja) * | 1974-05-29 | 1975-12-25 | ||
| JPS56151357A (en) * | 1980-04-25 | 1981-11-24 | Hitachi Ltd | Immunoassay method |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60253870A (ja) * | 1984-05-08 | 1985-12-14 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫学的診断方法 |
| JPS6148764A (ja) * | 1984-08-14 | 1986-03-10 | デューク サイエンティフィック コーポレーション | 特異物質用水性試料の検定方法およびキツト |
| JPH01273584A (ja) * | 1988-04-26 | 1989-11-01 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 検体捕集方法及び捕集装置 |
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