JPS6024450A - 生物学的に活性な物質の測定法 - Google Patents
生物学的に活性な物質の測定法Info
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- JPS6024450A JPS6024450A JP13089383A JP13089383A JPS6024450A JP S6024450 A JPS6024450 A JP S6024450A JP 13089383 A JP13089383 A JP 13089383A JP 13089383 A JP13089383 A JP 13089383A JP S6024450 A JPS6024450 A JP S6024450A
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- biotin
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物学的に活性な物質の測定法に関するもので
あり、さらに詳しくは、ビオチンどアビジンとの反応を
応用した発光免疫測定法に閏するものである。
あり、さらに詳しくは、ビオチンどアビジンとの反応を
応用した発光免疫測定法に閏するものである。
近年、抗原抗体反応を利用し、微量成分を定量的に測定
する方法が臨床検査および医学、獣医学、薬学、微生物
学などの研究分野において利用されてきている。
する方法が臨床検査および医学、獣医学、薬学、微生物
学などの研究分野において利用されてきている。
赤血球凝集反応や免疫拡散法などの古銭的方法に加えて
、最近では抗原・抗体反応により生じさせた免疫複合体
を光散乱により測定するネフエロメトリー、ルミネッヒ
ントや放射性同位元素または酵素などで抗体もしくは抗
原を標識し、抗原もしくは抗体を測定する標識免疫測定
法、さらに加えて合成ポリマー微粒子に抗原や抗体を固
定化し、抗体や抗原の存在でおこる微粒子の凝集の程度
をガラス板上やマイクロプレートで観察することや、凝
集にともなう光の透過度の変化を分光光度計で測定する
ことで抗体や抗原の測定をおこなう方法も開発されつつ
ある。
、最近では抗原・抗体反応により生じさせた免疫複合体
を光散乱により測定するネフエロメトリー、ルミネッヒ
ントや放射性同位元素または酵素などで抗体もしくは抗
原を標識し、抗原もしくは抗体を測定する標識免疫測定
法、さらに加えて合成ポリマー微粒子に抗原や抗体を固
定化し、抗体や抗原の存在でおこる微粒子の凝集の程度
をガラス板上やマイクロプレートで観察することや、凝
集にともなう光の透過度の変化を分光光度計で測定する
ことで抗体や抗原の測定をおこなう方法も開発されつつ
ある。
どりわけ、放射性同位元素を用いた免疫測定法（ＲＩＡ
）は、最も高感度の分析法として広く実用的に利用され
ているが、放射性同位元素を取り扱うため、被爆の危険
が伴うし、特別の施設も必要どなる。したがってＲＩＡ
にかわる高感度測定法の実現がめられている。
）は、最も高感度の分析法として広く実用的に利用され
ているが、放射性同位元素を取り扱うため、被爆の危険
が伴うし、特別の施設も必要どなる。したがってＲＩＡ
にかわる高感度測定法の実現がめられている。
ス
なかでも、ルミネッセント免疫測定法
（ＬＩＡ）はＲＩＡの利点を残し、放射性同位元素のか
わりにルミネッセントを利用する取り扱いやすい方法で
ある。しかし、現在のところＬＩＡはＲＩＡに比較して
、感度が低いので、適用範囲が限られている。また、一
部の物質については、ＲＩＡに匹敵する測定感度をあげ
ている測定法として酵素免疫測定法（ＥＩＡ）があるが
、必ずしも全ての物質についてＲＩＡと同様の感度をあ
げているわけでもなく、試薬も比較的高価であり、また
取り扱いもＲＩＡやＬＩＡはど容易ではないので、ＲＩ
Ａを浚駕するまでに至っていない。
わりにルミネッセントを利用する取り扱いやすい方法で
ある。しかし、現在のところＬＩＡはＲＩＡに比較して
、感度が低いので、適用範囲が限られている。また、一
部の物質については、ＲＩＡに匹敵する測定感度をあげ
ている測定法として酵素免疫測定法（ＥＩＡ）があるが
、必ずしも全ての物質についてＲＩＡと同様の感度をあ
げているわけでもなく、試薬も比較的高価であり、また
取り扱いもＲＩＡやＬＩＡはど容易ではないので、ＲＩ
Ａを浚駕するまでに至っていない。
一般にＲＩＡ法に代表される免疫測定法は原理的に２方
法に大別される。１つは競争法であり他の１つはサンド
ウィッチ法と称されている方法である。競争法とは、抗
原もしくは抗体である被測定物質を含む測定試料液と、
前もって放射性同位元素などの標識剤で標識しておいた
既知ｍｌの被測定物質を混合し、そこに抗体もしくは抗
原を混合し反応させると抗原−抗体複合物ができるが、
複合物または複合物を形成しなかった遊離物質には標識
された被測定物質と標識されていない被測定物質が含ま
れており、その比率を測定することで検体中の被測定物
質の測定をおこなう方法である。他の１つの方法である
サンドウィッチ法は、被測定物質と特異的に結合する結
合のパートナ−を固定化しておいた固相と、別に用意し
た被測定物質ど特異的に反応しうる物質を放射性同位元
素などで標識して得た標識した結合物質とで被測定物質
をサンドウィッチした後、同相もしくは液相中の標識物
質の測定をおこなうことにより、被測定物質の測定をお
こ（２つ方法である。
法に大別される。１つは競争法であり他の１つはサンド
ウィッチ法と称されている方法である。競争法とは、抗
原もしくは抗体である被測定物質を含む測定試料液と、
前もって放射性同位元素などの標識剤で標識しておいた
既知ｍｌの被測定物質を混合し、そこに抗体もしくは抗
原を混合し反応させると抗原−抗体複合物ができるが、
複合物または複合物を形成しなかった遊離物質には標識
された被測定物質と標識されていない被測定物質が含ま
れており、その比率を測定することで検体中の被測定物
質の測定をおこなう方法である。他の１つの方法である
サンドウィッチ法は、被測定物質と特異的に結合する結
合のパートナ−を固定化しておいた固相と、別に用意し
た被測定物質ど特異的に反応しうる物質を放射性同位元
素などで標識して得た標識した結合物質とで被測定物質
をサンドウィッチした後、同相もしくは液相中の標識物
質の測定をおこなうことにより、被測定物質の測定をお
こ（２つ方法である。
本発明者らはＲＩＡにかわる安全で安価でしかも操作が
容易な高感度測定法を開発すべく検討した結果、本発明
に到達した。すなわち本発明は検体溶液中の生物学的に
活性な物質を免疫学的反応を利用して測定する方法にお
いて、被測定物質と特異的に結合する物質または被測定
物質と同一の物質に、ビオチンを結合させたどオチン結
合物質の存在下に該免疫学的反応を進行さけ、該免疫学
的反応によって生成した免疫複合体に、化学発光剤また
は生物発光剤を結合させた発光剤結合アビジンを反応さ
せ、ビオチン−アビジン結合により免疫複合体に結合し
た発光剤結合アビジンまたは免疫複合体に結合せず遊離
の状態で残った発光剤結合アビジンの発光反応による発
光量を測定することを特徴とする生物学的に活性な物質
の測定法に関する。
容易な高感度測定法を開発すべく検討した結果、本発明
に到達した。すなわち本発明は検体溶液中の生物学的に
活性な物質を免疫学的反応を利用して測定する方法にお
いて、被測定物質と特異的に結合する物質または被測定
物質と同一の物質に、ビオチンを結合させたどオチン結
合物質の存在下に該免疫学的反応を進行さけ、該免疫学
的反応によって生成した免疫複合体に、化学発光剤また
は生物発光剤を結合させた発光剤結合アビジンを反応さ
せ、ビオチン−アビジン結合により免疫複合体に結合し
た発光剤結合アビジンまたは免疫複合体に結合せず遊離
の状態で残った発光剤結合アビジンの発光反応による発
光量を測定することを特徴とする生物学的に活性な物質
の測定法に関する。
本発明の発光免疫測定は、微量成分の測定を可能にする
ものである。
ものである。
本発明の発光免疫測定法ではアビジンに多数の発光剤を
結合させることが可能であることから従来のＬＩＡのよ
うな被測定物質や被測定物質と特異的に反応する物質を
直接発光剤で標識する方法に比較して格段の感度を得る
ことができる。しかも、従来の方法においては感度をあ
げる為に標識する発光剤を無理に増やさざるを得ず、そ
のために、バックグランドが高クイ【す、かつ誤差も大
きくなってしまう欠点を有していたが、本方法では容易
に高感度をあげることができ、Ｓ／Ｎ比も小さくでき、
誤差も少くできる。
結合させることが可能であることから従来のＬＩＡのよ
うな被測定物質や被測定物質と特異的に反応する物質を
直接発光剤で標識する方法に比較して格段の感度を得る
ことができる。しかも、従来の方法においては感度をあ
げる為に標識する発光剤を無理に増やさざるを得ず、そ
のために、バックグランドが高クイ【す、かつ誤差も大
きくなってしまう欠点を有していたが、本方法では容易
に高感度をあげることができ、Ｓ／Ｎ比も小さくでき、
誤差も少くできる。
本発明の発光免疫測定法には代表的な方法としてサンド
ウィッチ法および競争法がある。
ウィッチ法および競争法がある。
サンドウィッチ法は、検体溶液中の生物学的に活性な被
測定物質と、被測定物質に特異的に結合する結合のパー
トナ−を固定化した固相、および被測定物質に特異的に
結合する性質がありかつビオチンを結合させたビオチン
結合物質を反応させた後、化学または生物発光剤を結合
させた発光剤アビジンを反応させ、ビオチン−アビジン
結合により固相に結合した、または結合しないで遊離の
状態で残った発光剤結合アビジンの発光反応による発光
量を測定することにより被測定物質を測定する方法であ
る。
測定物質と、被測定物質に特異的に結合する結合のパー
トナ−を固定化した固相、および被測定物質に特異的に
結合する性質がありかつビオチンを結合させたビオチン
結合物質を反応させた後、化学または生物発光剤を結合
させた発光剤アビジンを反応させ、ビオチン−アビジン
結合により固相に結合した、または結合しないで遊離の
状態で残った発光剤結合アビジンの発光反応による発光
量を測定することにより被測定物質を測定する方法であ
る。
競争法は、検体溶液中の生物学的に活性な被測定物質お
よびビオチンを結合させたビオチン結合 被測定物質を
、被測定物質に特異的に結合する結合のパートナ−を固
定化した固相に反応させた後、化学または生物発光剤を
結合させた発光剤結合アビジンを反応させ、ビオチン−
アビジン結合により同相に結合した、または結合しない
で遊離の状態で残った発光剤結合アビジンの発光反応に
よる発光量を測定することにより、被測定物質を測定す
る方法である。
よびビオチンを結合させたビオチン結合 被測定物質を
、被測定物質に特異的に結合する結合のパートナ−を固
定化した固相に反応させた後、化学または生物発光剤を
結合させた発光剤結合アビジンを反応させ、ビオチン−
アビジン結合により同相に結合した、または結合しない
で遊離の状態で残った発光剤結合アビジンの発光反応に
よる発光量を測定することにより、被測定物質を測定す
る方法である。
本発明で使用するアビジンは卵白中に存在する分子量約
６８０００の塩基性糖蛋白質であり、Ｉ（ の構造を持つ物質である。
６８０００の塩基性糖蛋白質であり、Ｉ（ の構造を持つ物質である。
アビジンとビオチンとは極めて強い親和性を有しており
、その親和定数は１０”Ｍ−１である。
、その親和定数は１０”Ｍ−１である。
本発明はこのアビジン−ビオチン結合を利用して、発光
免疫測定をおこなうことを特徴とするものである。
免疫測定をおこなうことを特徴とするものである。
本発明で同相と検体の反応をおこなう場合に使用する固
相は特に限定はない。形状は球状、微粒子状、棒状、板
状、膜状など適当な形状のものでよい。粒子状の同相を
使用すれば、同相をカラムにつめて測定の操作をフロー
形式でおこなうことも可能となる。固相の素材は生体構
成成分や金属などでもよいが、形状を自由に調節でき、
しかも安定である有機高分子化合物が好ましい。例えば
ポリスチレン、ポリアクリロ二１〜リル、ポリメタクリ
ロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリ−ε−カプ
ラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合
体群、あるいはポリアクリルアミド、ポリメタクリルア
ミド、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、ポリ（２−オキシ：Ｌプルアクリレート）、ポリ
（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−
ジオキシプ［１ビルアクリレート）、ポＩＪ（２，３−
ジ１キシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリ
コールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体群、
もしくは両方の性質を持つ共重合体群がある。
相は特に限定はない。形状は球状、微粒子状、棒状、板
状、膜状など適当な形状のものでよい。粒子状の同相を
使用すれば、同相をカラムにつめて測定の操作をフロー
形式でおこなうことも可能となる。固相の素材は生体構
成成分や金属などでもよいが、形状を自由に調節でき、
しかも安定である有機高分子化合物が好ましい。例えば
ポリスチレン、ポリアクリロ二１〜リル、ポリメタクリ
ロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリ−ε−カプ
ラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合
体群、あるいはポリアクリルアミド、ポリメタクリルア
ミド、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、ポリ（２−オキシ：Ｌプルアクリレート）、ポリ
（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−
ジオキシプ［１ビルアクリレート）、ポＩＪ（２，３−
ジ１キシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリ
コールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体群、
もしくは両方の性質を持つ共重合体群がある。
検体中の物質、ビオチン結合物質または発光剤結合アビ
ジンなどの非特異的吸着を少くし、Ｓ／Ｎ比を高くする
為には親水性重合体群もしくは共重合体群が好ましい。
ジンなどの非特異的吸着を少くし、Ｓ／Ｎ比を高くする
為には親水性重合体群もしくは共重合体群が好ましい。
また同相の形状は板、試験管、マイクロプレートなどで
もよいが、微粒子を固相とすれば表面積を容易に増加さ
せることができる。
もよいが、微粒子を固相とすれば表面積を容易に増加さ
せることができる。
同相への結合のパートナ−の固定化方法としては、物理
吸着と化学結合がある。例えば疎水的な同相には蛋白な
どは物理吸着で固定化できるし、アミノ基やカルボキシ
ル基が官能基として存在する固相にはカルボジイミドで
カルボキシル基やアミノ基を有する物質を共有結合で固
定化できるし、アミノ基またはカルバモイル基を有する
固相にはアミノ基を有する物質をグルタルアルデヒドな
どのポリアルデヒドで共有結合により固定化できるし、
ヒドロキシル基を有する固相には臭化シアンによりアミ
ノ基を有する物質を共有結合で固定化できる。また、ア
ルデヒド基またはエポキシ基を有する固相にはアミノ基
を有する物質を直接反応させて共有結合により固定化で
きる。
吸着と化学結合がある。例えば疎水的な同相には蛋白な
どは物理吸着で固定化できるし、アミノ基やカルボキシ
ル基が官能基として存在する固相にはカルボジイミドで
カルボキシル基やアミノ基を有する物質を共有結合で固
定化できるし、アミノ基またはカルバモイル基を有する
固相にはアミノ基を有する物質をグルタルアルデヒドな
どのポリアルデヒドで共有結合により固定化できるし、
ヒドロキシル基を有する固相には臭化シアンによりアミ
ノ基を有する物質を共有結合で固定化できる。また、ア
ルデヒド基またはエポキシ基を有する固相にはアミノ基
を有する物質を直接反応させて共有結合により固定化で
きる。
またメルカプト基を有する同相には、メルカプト基を有
する物質をシマレイミドをバインダーとして結合させる
ことができる。固相の洗浄に界面活性剤を含有させた洗
浄液を使用することもあり、固定化方法としては固定化
した物質が脱離する危険のある物理吸着法に比して共有
結合法が好ましい。
する物質をシマレイミドをバインダーとして結合させる
ことができる。固相の洗浄に界面活性剤を含有させた洗
浄液を使用することもあり、固定化方法としては固定化
した物質が脱離する危険のある物理吸着法に比して共有
結合法が好ましい。
本発明で使用する結合のパートナ−とは被測定物質に特
異的に結合しうる物質である。例えば、被測定物質が抗
原、抗体、ホルモン、抗原抗体複合体、糖類、免疫グロ
ブリン、リンフ才力イン、補体などの場合には順に抗体
、抗原、該ホルモンリセブター、リューマチ因子、レク
チン、プロティンＡ１該リンフオカインリセブター、該
補体リヒプターなどとの組み合わせがそれぞれ被測定物
質と結合のパートナ−の組み合せになりうる。また全て
の物質について、特異抗体が存在する場合には、その特
異抗体おにび対応する抗原パー１〜ナーとなりうる。
異的に結合しうる物質である。例えば、被測定物質が抗
原、抗体、ホルモン、抗原抗体複合体、糖類、免疫グロ
ブリン、リンフ才力イン、補体などの場合には順に抗体
、抗原、該ホルモンリセブター、リューマチ因子、レク
チン、プロティンＡ１該リンフオカインリセブター、該
補体リヒプターなどとの組み合わせがそれぞれ被測定物
質と結合のパートナ−の組み合せになりうる。また全て
の物質について、特異抗体が存在する場合には、その特
異抗体おにび対応する抗原パー１〜ナーとなりうる。
１ノ゛ンドウインチ法では、一般にはまず結合のパート
ナ−を固定化した固相と検体とを反応させ次に、被測定
物質が結合のパートナ−を介して結合した固相とビオチ
ン結合物質とを反応させる。この後にサンドウィッチ法
では一般的に固相と液相どを分離し洗浄する操作がある
。しかし、固相側とビオチン結合物質側とに同一物質に
対するしかも別の抗原結定部位に対する抗体を結合させ
るなどして、１段階の反応で同相とビオチン結合物質に
よって被測定物質をサンドウイッヂすることによりこの
段階での分離およびａ浄操作をはふくことも可能である
。
ナ−を固定化した固相と検体とを反応させ次に、被測定
物質が結合のパートナ−を介して結合した固相とビオチ
ン結合物質とを反応させる。この後にサンドウィッチ法
では一般的に固相と液相どを分離し洗浄する操作がある
。しかし、固相側とビオチン結合物質側とに同一物質に
対するしかも別の抗原結定部位に対する抗体を結合させ
るなどして、１段階の反応で同相とビオチン結合物質に
よって被測定物質をサンドウイッヂすることによりこの
段階での分離およびａ浄操作をはふくことも可能である
。
一方、競争法でも検体とビオチン結合物質とを同時に加
えないで、検体と固相との反応後にビオチン結合物質を
加えることがあるが、どちらにしてもビオチン結合物質
を固相の結合のパートナ−と反応させている。
えないで、検体と固相との反応後にビオチン結合物質を
加えることがあるが、どちらにしてもビオチン結合物質
を固相の結合のパートナ−と反応させている。
本発明のサンドウィッチ法で使用り−るビオチン結合物
質は被測定物質と特異的に結合づる物質であればよく、
同相に固定化した結合のパートナ−と同一物質であって
もかまわないし、異なる物質であってもかまわない。
質は被測定物質と特異的に結合づる物質であればよく、
同相に固定化した結合のパートナ−と同一物質であって
もかまわないし、異なる物質であってもかまわない。
例えば被測定物質がイムノグロブリンの場合、同相に結
合さＶる結合のパートナ−どしてプ［１テインＡを用い
、ビオチン結合物質どして抗イムノグロブリン抗体を用
いてもよいし、また両者共に抗イムノグロブリン抗体を
用いてもよい。
合さＶる結合のパートナ−どしてプ［１テインＡを用い
、ビオチン結合物質どして抗イムノグロブリン抗体を用
いてもよいし、また両者共に抗イムノグロブリン抗体を
用いてもよい。
被測定物質と特異的に結合する物質または被測定物質と
同一の物質へのビオチンの結合は、アどジンとビオチン
との親和性が極めＣ強いことから、共有結合が最も好ま
しい。具体的には、ビオチンのカルボキシル基をスクシ
イミジル化するか、もしくはそのままでカルボジイミド
を用いて結合させる方法等が好ましく使用される。
同一の物質へのビオチンの結合は、アどジンとビオチン
との親和性が極めＣ強いことから、共有結合が最も好ま
しい。具体的には、ビオチンのカルボキシル基をスクシ
イミジル化するか、もしくはそのままでカルボジイミド
を用いて結合させる方法等が好ましく使用される。
本発明において被測定物質となりうる物質は、生物学的
に特異的な親和性を有する物質をバー］〜ナーとして有
している物質であり、具体的には例えば連鎖球菌、ブド
ウ球菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、赤痢菌などの細
菌およびその構成成分に対する抗体；梅毒トレポネーマ
などのスピロヘータおよびその構成成分に対する抗体：
マイコプラズマおよびその構成成分に対する抗体：マラ
リア原虫などの原虫類およびその構成成分に対する抗体
：リケツチャアおよびその構成成分に対する抗体；イン
フルエンザ、アデノウィルス、ポリオーマ、麻疹、風疹
、肝炎、おたふくかぜなどのウィルスおよびその構成成
分ならびにそれらに対する抗体；多糖類、ヒトアルブミ
ン、卵白アルブミンなどの異種抗原ならびにそ、れらに
対する抗体；インシュリン、サイロイドホルモン、絨毛
性ゴナドトロピンなどのホルモン；リボヌクレアーゼ、
タレアチンホスホキナーゼ、アスパラギナーゼなどの酵
素；腎臓細胞膜、肝臓細胞膜、α−フエトブ［１テイン
、ＣＥＡなどの器管固有の抗原またはりセプター；コラ
ーゲン、アミロイドなどの結合組織成分；赤血球、血小
板などの血球抗原、またはりセプター；フィブリン、プ
ラスミノーゲンなどの血漿タンパク質；リューマチ因子
やＣ反応性タンパク質などの病理グロブリン；免疫複合
体；細胞膜などに対する自己抗体：などがある。
に特異的な親和性を有する物質をバー］〜ナーとして有
している物質であり、具体的には例えば連鎖球菌、ブド
ウ球菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、赤痢菌などの細
菌およびその構成成分に対する抗体；梅毒トレポネーマ
などのスピロヘータおよびその構成成分に対する抗体：
マイコプラズマおよびその構成成分に対する抗体：マラ
リア原虫などの原虫類およびその構成成分に対する抗体
：リケツチャアおよびその構成成分に対する抗体；イン
フルエンザ、アデノウィルス、ポリオーマ、麻疹、風疹
、肝炎、おたふくかぜなどのウィルスおよびその構成成
分ならびにそれらに対する抗体；多糖類、ヒトアルブミ
ン、卵白アルブミンなどの異種抗原ならびにそ、れらに
対する抗体；インシュリン、サイロイドホルモン、絨毛
性ゴナドトロピンなどのホルモン；リボヌクレアーゼ、
タレアチンホスホキナーゼ、アスパラギナーゼなどの酵
素；腎臓細胞膜、肝臓細胞膜、α−フエトブ［１テイン
、ＣＥＡなどの器管固有の抗原またはりセプター；コラ
ーゲン、アミロイドなどの結合組織成分；赤血球、血小
板などの血球抗原、またはりセプター；フィブリン、プ
ラスミノーゲンなどの血漿タンパク質；リューマチ因子
やＣ反応性タンパク質などの病理グロブリン；免疫複合
体；細胞膜などに対する自己抗体：などがある。
ビオチン結合物質と検体が結合した固相を反応させた後
、発光剤結合アビジンを加えて反応させる。ビオチン結
合物質と発光剤結合アビジンは検体溶液に同時に加えて
もよいが、後で発光剤結合アビジンを加えた方が、誤差
が少なくなり好ましい。
、発光剤結合アビジンを加えて反応させる。ビオチン結
合物質と発光剤結合アビジンは検体溶液に同時に加えて
もよいが、後で発光剤結合アビジンを加えた方が、誤差
が少なくなり好ましい。
アビジンに結合させる発光剤は化学発光剤でも生物発光
剤でもかまわない。生物発光剤にはルシフェリンなどが
あるが、酵素などの生体物質を使用するので反応も煩雑
かつ複雑となり、特に生体物質を免疫反応により測定す
る時には測定誤差を与える可能性もある。したがって発
光剤としては化学発光剤の方が好ましい。化学発光剤と
しては、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、ルシ
ゲニシなどがあるが、発光の量子効率、安定性、操作性
などの点を考慮すると、ルミノール、イソルミノールお
よびその誘導体が好ましい。
剤でもかまわない。生物発光剤にはルシフェリンなどが
あるが、酵素などの生体物質を使用するので反応も煩雑
かつ複雑となり、特に生体物質を免疫反応により測定す
る時には測定誤差を与える可能性もある。したがって発
光剤としては化学発光剤の方が好ましい。化学発光剤と
しては、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、ルシ
ゲニシなどがあるが、発光の量子効率、安定性、操作性
などの点を考慮すると、ルミノール、イソルミノールお
よびその誘導体が好ましい。
発光剤のアビジンへの結合はアビジンのビオチンへの結
合力を弱めない方法であればどのような結合方法でもよ
いが、操作中に発光剤がアビジンから遊離し、検査値が
変動したりしない為には共有結合が最も好ましい。具体
的には、アビジンが塩基性蛋白でありアミン基を多数有
していることからこのアミノ基を利用して、あるいは発
光剤の官能基（たとえばルミノール、イソルミノールま
たはそれらの誘導体の場合はアミノ基）を利用して、グ
ルタルアルデヒド、ジスクシミジル酒石酸、ジスクシミ
ジルスベレート、エチレングリコールビス（スフシミジ
ルスクシネート）、Ｎ−ヒドロキシスフシミジル−（４
−アジドフェニル）−１，３’ −ジチオピロピオネ−
１〜等の両末端にアルデヒド基、スフシミジル基、アジ
ド基等を有する結合剤を用いる方法等が好ましく使用さ
れる。
合力を弱めない方法であればどのような結合方法でもよ
いが、操作中に発光剤がアビジンから遊離し、検査値が
変動したりしない為には共有結合が最も好ましい。具体
的には、アビジンが塩基性蛋白でありアミン基を多数有
していることからこのアミノ基を利用して、あるいは発
光剤の官能基（たとえばルミノール、イソルミノールま
たはそれらの誘導体の場合はアミノ基）を利用して、グ
ルタルアルデヒド、ジスクシミジル酒石酸、ジスクシミ
ジルスベレート、エチレングリコールビス（スフシミジ
ルスクシネート）、Ｎ−ヒドロキシスフシミジル−（４
−アジドフェニル）−１，３’ −ジチオピロピオネ−
１〜等の両末端にアルデヒド基、スフシミジル基、アジ
ド基等を有する結合剤を用いる方法等が好ましく使用さ
れる。
ビオチン結合物質が結合した固相ど発光剤結合アビジン
との反応後、液相ど固相どを分前し、どちらかの発光を
測定する。アビジンに結合した発光剤を発光させる方法
は、＠離の発光ハ１１の場合と同様である。発光剤が生
物発光剤の場合には酵素、例えばルシフエリンルシフ■
ラーピや補酵素、例えばＡ’ＴＰを添加し測定する。化
学発光剤の場合には触媒の存在下に酸化剤を加えて反応
させる。
との反応後、液相ど固相どを分前し、どちらかの発光を
測定する。アビジンに結合した発光剤を発光させる方法
は、＠離の発光ハ１１の場合と同様である。発光剤が生
物発光剤の場合には酵素、例えばルシフエリンルシフ■
ラーピや補酵素、例えばＡ’ＴＰを添加し測定する。化
学発光剤の場合には触媒の存在下に酸化剤を加えて反応
させる。
酸化剤としては例えば過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウ
ム、過硫酸アンモニウム、過ホウ酸ナトリウム、ヨウ素
、過ヨウ素酸す１〜リウム、分子状酸素、過酸化カリウ
ム、過マンガン酸カリウムなどを挙げることができる。
ム、過硫酸アンモニウム、過ホウ酸ナトリウム、ヨウ素
、過ヨウ素酸す１〜リウム、分子状酸素、過酸化カリウ
ム、過マンガン酸カリウムなどを挙げることができる。
触媒は一般に金属化合物で、例えば赤血塩、ヘモグ［１
ビン、ヘマチン、ヘミン、フェリチン、ポルフィリン、
塩化第一］バルト、酢酸銅、チトクロームＣなどをはじ
め、ニッケル、マンガン、クロムなどの塩類、錯塩類お
よび有機金属化合物を使用することができる。
ビン、ヘマチン、ヘミン、フェリチン、ポルフィリン、
塩化第一］バルト、酢酸銅、チトクロームＣなどをはじ
め、ニッケル、マンガン、クロムなどの塩類、錯塩類お
よび有機金属化合物を使用することができる。
発光ωの測定には、フォトンカウンター、シンヂレーシ
ョンノＪウンターなど発生した光子数を計測できる装置
を使用することがのぞましい。
ョンノＪウンターなど発生した光子数を計測できる装置
を使用することがのぞましい。
既知１１１１度の被測定物質を本方法で測定し、被測定
物賀淵度ど発光強度との関係をめておき、未知濶庶の被
測定物質の発光強度から逆に被測定物質の定量をおこな
う。本方法は発光剤結合アビジンの発光強度を増大させ
ることで測定感度を高くすることが可能な方法である。
物賀淵度ど発光強度との関係をめておき、未知濶庶の被
測定物質の発光強度から逆に被測定物質の定量をおこな
う。本方法は発光剤結合アビジンの発光強度を増大させ
ることで測定感度を高くすることが可能な方法である。
以下に本発明の理解を容易にする為に若干の実施例を示
した。
した。
実施例１
（ウリギイムノグロブリンＧ （ＲＧＧ）の測定）固相
の調製 グリシジルメタクリレート４．４２ｇ、２−ヒドロ４ニ
シエヂルメタクリレート０．４６ ｇ、トリエチレング
リコールジメタクリレート□５ｇをプロピオン酸］−チ
ル５ｇ、四塩化病素５ｇの混合溶媒に溶かして２．２′
−アゾヒス（２，４−ジメチルバレロニトリル＞１０ｎ
ｏを加え４０℃で３時間重合した。得られた微粒子をア
ンモニアで処理しアミン基を導入した後１１２８０４で
残存エポキシ基を加水分解し直径約６μの親水性アミノ
化微粒子を得た。
の調製 グリシジルメタクリレート４．４２ｇ、２−ヒドロ４ニ
シエヂルメタクリレート０．４６ ｇ、トリエチレング
リコールジメタクリレート□５ｇをプロピオン酸］−チ
ル５ｇ、四塩化病素５ｇの混合溶媒に溶かして２．２′
−アゾヒス（２，４−ジメチルバレロニトリル＞１０ｎ
ｏを加え４０℃で３時間重合した。得られた微粒子をア
ンモニアで処理しアミン基を導入した後１１２８０４で
残存エポキシ基を加水分解し直径約６μの親水性アミノ
化微粒子を得た。
抗ＲＧＧ抗体固定化固相
デキス］−ランＴ ７０ （Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）
ｌ ｏｍｙ ト過ヨウ素酸すトリウム５■を１ ｍＱの
水に溶解し、４０℃で１．５時間反応させ、デキス］・
ランの一部をアルデヒド化した。１０ ｍｊＦ ／ ｎ
ｒｅのアルデヒド化デキストラン容器１０ｍと１％のア
ミン化微粒子分散液５ｍとを混合し、ｌ１ｌ−１８，０
にて３０℃で１時間反応させた。このようにしで得たデ
キストラン化微粒子を２００μＵ ／ ｍｅになるよう
に溶解した抗ＲＧＧ （Ｂ １ｏｒａｄ ）抗体溶液に
分散し、１）Ｈ８，０にて３０ ℃で３０分反応させ、
さらにウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略−３＋−＞
（Ｍ １ｌｅｓ）を１０ｍ９／ｍＱとなル、ｋ ウ１
ｍ加え、４０℃で一晩反応させた。さらに０．１ ＶＴ
ＲｌＳ−１−１ｃｉＩ液（ｐＨ８，０）を等間加え、室
温で１時間反応させた後、シアン水素化ホウ素ナトリウ
ムを２ ＩＱ ／ ｄとなるように加え、苗渇′ｃ１時
間反応させた。ＰＢＳで微粒子を洗浄し、１％のＢＳＡ
を含む生理リン酸食塩水（以下ＰＢＳと略す）に保存し
た。
ｌ ｏｍｙ ト過ヨウ素酸すトリウム５■を１ ｍＱの
水に溶解し、４０℃で１．５時間反応させ、デキス］・
ランの一部をアルデヒド化した。１０ ｍｊＦ ／ ｎ
ｒｅのアルデヒド化デキストラン容器１０ｍと１％のア
ミン化微粒子分散液５ｍとを混合し、ｌ１ｌ−１８，０
にて３０℃で１時間反応させた。このようにしで得たデ
キストラン化微粒子を２００μＵ ／ ｍｅになるよう
に溶解した抗ＲＧＧ （Ｂ １ｏｒａｄ ）抗体溶液に
分散し、１）Ｈ８，０にて３０ ℃で３０分反応させ、
さらにウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略−３＋−＞
（Ｍ １ｌｅｓ）を１０ｍ９／ｍＱとなル、ｋ ウ１
ｍ加え、４０℃で一晩反応させた。さらに０．１ ＶＴ
ＲｌＳ−１−１ｃｉＩ液（ｐＨ８，０）を等間加え、室
温で１時間反応させた後、シアン水素化ホウ素ナトリウ
ムを２ ＩＱ ／ ｄとなるように加え、苗渇′ｃ１時
間反応させた。ＰＢＳで微粒子を洗浄し、１％のＢＳＡ
を含む生理リン酸食塩水（以下ＰＢＳと略す）に保存し
た。
ルミノール結合アビジンの調製
ルミノール（手打化学＞１．ＯｎＯとアビジン（Ｖ ｅ
ｃｔｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） ２１Ｒ１
Ｊを０． ＯＩ ＭＮａ ＨＣＯ３−ＨＣｌ、Ｍ！！ｉ
液（ｒｌＨ８，０）Ｉｄ中で溶解し、ジスクシミジル酒
石＠ （ｐ １ｅｒｃｃ ）を加えて４℃で３日間反応
させた。反応後０． ＩＭＴ’ＲＩＳ −ト１ｃ ｔ
ＩＩ！ｉ 液 （Ｉ））−１８，０＞ を５００μ名加
え４℃で２日反応させた。
ｃｔｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） ２１Ｒ１
Ｊを０． ＯＩ ＭＮａ ＨＣＯ３−ＨＣｌ、Ｍ！！ｉ
液（ｒｌＨ８，０）Ｉｄ中で溶解し、ジスクシミジル酒
石＠ （ｐ １ｅｒｃｃ ）を加えて４℃で３日間反応
させた。反応後０． ＩＭＴ’ＲＩＳ −ト１ｃ ｔ
ＩＩ！ｉ 液 （Ｉ））−１８，０＞ を５００μ名加
え４℃で２日反応させた。
ルミノール結合アビジンはＳ ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −
し ２５ （Ｐ ｈａｒｌｌ郵１ａ）によるゲルン濾過をお
こなし１精製した。
し ２５ （Ｐ ｈａｒｌｌ郵１ａ）によるゲルン濾過をお
こなし１精製した。
ＲＧＧの測定
ＲＧ Ｇを１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍ずつ稀釈し
て検体溶液どした。検体９０μ℃に１％の抗ＲＧＧ固定
化固相分散液５０μ℃を加え、室温で２時間反応さけた
。
て検体溶液どした。検体９０μ℃に１％の抗ＲＧＧ固定
化固相分散液５０μ℃を加え、室温で２時間反応さけた
。
させ、再分散させる操作により、洗浄した後、０．１５
１１１．９／ｄのビオチン結合抗ＲＧＧ抗体（４１Ｆｅ
ｃｔｏｒ ｌ−ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） １００
ＩＩ ｔに固相を分散させ室温で２時間反応させた。洗
浄後、２２ ｒｌ（１／ ｍＱのルミノール結合アビジ
ン１００μｔを加え、室温で１時間反応させた。
１１１．９／ｄのビオチン結合抗ＲＧＧ抗体（４１Ｆｅ
ｃｔｏｒ ｌ−ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） １００
ＩＩ ｔに固相を分散させ室温で２時間反応させた。洗
浄後、２２ ｒｌ（１／ ｍＱのルミノール結合アビジ
ン１００μｔを加え、室温で１時間反応させた。
反応後、固相ど液相を遠心操作により分〜］し、固相を
１００倍に稀釈した同相分散液１００μ℃に０．００１
６％の塩化第一コバルト溶液１００μえおよび２５％の
原液を３００倍に稀釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液１
００ ／ｌｆを加えてその発光を測定した。測定はＬＵ
ＭＡＣ（ＬＵＭＡＣＳＹＳＴＥＭＳ Δ、Ｇ、）により
おこなった。結果を第；図に示した。
１００倍に稀釈した同相分散液１００μ℃に０．００１
６％の塩化第一コバルト溶液１００μえおよび２５％の
原液を３００倍に稀釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液１
００ ／ｌｆを加えてその発光を測定した。測定はＬＵ
ＭＡＣ（ＬＵＭＡＣＳＹＳＴＥＭＳ Δ、Ｇ、）により
おこなった。結果を第；図に示した。
第１図は実施例１のサンドウィッチ法によるＲＧＧ測定
結果を示す。 特許出願人 東 し 株 式 会 社
結果を示す。 特許出願人 東 し 株 式 会 社
Claims (1)
- （１） 検体溶液中の生物学的に活性な物質を免疫学的
反応を利用して測定する方法において、被測定物質と特
異的に結合する物質または被測定物質と同一の物質にビ
オチンを結合させたピオチン結合物質の存在下に該免疫
学的反応を進行させ、該免疫学的反応によって生成した
免疫複合体に、化学発光剤または生物発光剤を結合させ
た発光剤結合アビジンを反応させ、ビＡチンーアごジン
結合により免疫複合体に結合した発光剤結合アビジンま
たは免疫複合体に結合せずｉ離の状態で残った発光剤結
合アビジンの発光反応による発光量を測定Ｊることを特
徴とする生物学的に活性な物質 の 租り 定 ンム
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13089383A JPS6024450A (ja) | 1983-07-20 | 1983-07-20 | 生物学的に活性な物質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13089383A JPS6024450A (ja) | 1983-07-20 | 1983-07-20 | 生物学的に活性な物質の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6024450A true JPS6024450A (ja) | 1985-02-07 |
Family
ID=15045172
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13089383A Pending JPS6024450A (ja) | 1983-07-20 | 1983-07-20 | 生物学的に活性な物質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6024450A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01105162A (ja) * | 1986-02-28 | 1989-04-21 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 鶏伝染性喉頭気管炎の抗体測定方法 |
| US5354574A (en) * | 1992-06-23 | 1994-10-11 | Ibiden Co., Ltd. | Method for producing optical fiber having formyl groups on core surface thereof |
| US5401469A (en) * | 1989-04-19 | 1995-03-28 | Ibiden Co., Ltd. | Plastic optical biomaterials assay device |
| WO2001023891A1 (en) * | 1999-09-29 | 2001-04-05 | Japan Science And Technology Corporation | High sensitive immunoassay |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5537949A (en) * | 1978-09-12 | 1980-03-17 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Measuring method for substance |
| JPS5592693A (en) * | 1978-09-21 | 1980-07-14 | Hoechst Japan Kk | Determination of ligand |
| JPS5830667A (ja) * | 1981-08-05 | 1983-02-23 | エフ・ホフマン−ラ・ロシユ・ウント・コンパニ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 標識化免疫学的活性物質 |
-
1983
- 1983-07-20 JP JP13089383A patent/JPS6024450A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5537949A (en) * | 1978-09-12 | 1980-03-17 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Measuring method for substance |
| JPS5592693A (en) * | 1978-09-21 | 1980-07-14 | Hoechst Japan Kk | Determination of ligand |
| JPS5830667A (ja) * | 1981-08-05 | 1983-02-23 | エフ・ホフマン−ラ・ロシユ・ウント・コンパニ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 標識化免疫学的活性物質 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01105162A (ja) * | 1986-02-28 | 1989-04-21 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 鶏伝染性喉頭気管炎の抗体測定方法 |
| US5401469A (en) * | 1989-04-19 | 1995-03-28 | Ibiden Co., Ltd. | Plastic optical biomaterials assay device |
| US5354574A (en) * | 1992-06-23 | 1994-10-11 | Ibiden Co., Ltd. | Method for producing optical fiber having formyl groups on core surface thereof |
| WO2001023891A1 (en) * | 1999-09-29 | 2001-04-05 | Japan Science And Technology Corporation | High sensitive immunoassay |
| US7255998B1 (en) | 1999-09-29 | 2007-08-14 | Japan Science And Technology Corporation | High sensitivity immunoassay method |
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