JPS5860998A - インタ−フエロンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はインターフェロン（工ＦＮ）の製造法に関する
。さらに詳細には、本発明はヒト遺伝子ＤＮＡの断片？
導入した適当な細菌によって＆に芽細胞（βｊ型または
白血球（り型のヒトインターフェロンの大門生産方法に
関する。血球から直接取ったヒトＤＮＡは適当なλ−フ
ァージにクローン化される。 この組換え体λ−ファージによって感染された細菌中に
高インターフェロン生産が得られ、そのインターフェロ
ンはこの感采によって生じる細菌溶菌液から採取および
ね“製することができる。遺伝子ＤＮＡはまたプラスミ
ド発現ベクターを介して導入された細菌中で発現される
。 発明の背景 インターフェロン、とクニヒトインターフェロンは多分
野で重要性３壇しつつめるが、その年産は困Ｖで、生産
方法の改良が非富に１安になっている。 大腸シ（Ｅ、ｃｏｌｌ　）のような細−における哺乳・
■圏■−１關−―■−■−−１−− 動物遺伝子の発現は、通膚シ廼伝子の暗号配列を中断す
る介在配列の存在により妨けられる。しかしながら、９
イントロンを持たない遺伝子もかなり存在する。最近、
ナガタら（Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ　）１■−−一一
一訃−■■−―■Ｍ−− （１９８０）　（Ｎａｔｕｒｅ　２８７　、４０１−８
　）はヒトの白血球インターフェロン−ａ遺伝子がイン
トロンを欠くものの一つであることを示した。彼等は大
腸菌内でのこれら遺伝子の低レベル発現を見出した。 二Ｍ鎖ＲＮＡ　Ｋよって銹導されたヒト二倍体線維芽細
胞は少なくともインターフェロ？をコードする２つのｍ
ＲＭＡ　Ｙ含んでいる〔ワイゼンバッハら（Ｗｅｉｓｓ
ｅｎｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）、　　１９　ｆ３　Ｑ、
　　（ＰＮＡ８　）７７．７１５２−７１５６）。０．
９キロベース（ｘｂ）長（１１ｓ　）　ノｍＲＮＡはこ
れら細胞により生産される生インタ肘フエロン種工ＦＮ
−β□に相当するが、そのアミノ酸配列は部分的に決定
されている〔ナイトら（Ｋｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、
）　１９８０　。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２０７　、３２５−６　）。ベクター
として大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２％：用い、この工
Ｆトβ□ｍＲＮＡ　（Ｄ　ｃＤＮＡ　’ｉ’介するり日
−ニングが達成された〔ｐｌ”ｙデルら（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ　ｅｔ　ａｌ−）＋　１９８０　ｒＮｕｃｌｅｔｃ　
Ａｃｔａ　Ｒｅｅ、、　８　、４０５７−４０７５　）
。 これらＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は決定された
蛋白質配列に相当し、発現プラスミド生成後、ＩＩＦＮ
−β１　ｃＤＮＡは大腸菌内でのヒトインターフェロン
の合成を指令していると証明された。 本発明者らは、工ＦＮ−β□烟伝子〔モーリイら（Ｍｏ
ｒｙ　ａｔ　ｈｌ、）、　１９８１　、　Ｋｕｒ、Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、。 １２０．１９７−２０２）ならびに工ＦＮ−ａｃ遺伝子
を担うヒト遺伝子断片を単離した。これらの遺伝子はイ
ントロンを欠き、従って大腸菌内で直接発現させること
ができる。 発明の要約 本発明は、ヒト血球から抽出したヒト遺伝子ＤＮＡの特
定断片をバクテリオファージベクターにクローン化しそ
れを直接利用して細菌内で工ＦＮを合成させるよう処し
、その細菌を培養してインターフェロンを生産する一方
法に関する。従って、この方法では長い工程は必要なく
、ｍＲＮＡがら全長の相補的ＤＮＡ　（ＯＤＮＡ　）を
クローニングする必要がない。本発明に従えは、適当な
りＮＡ断片な容易に入手し得る白血球のようなヒト細胞
から直接取り、λ−ファージベクターにクローン化する
。目的の工１１ＩＮ遺伝子はイン）ｏンで中断されてお
らす、細菌内で工ＦＮ合成を指示できる。 工ＦＮ−β□遺伝子または工ＦＮ−’ｏ逼伝子を挿入し
たヒ）　ＤＮＡ　Ｙ含む組換え体λファージによって大
腸菌のような適当な細菌す感染、させることにより高Ｉ
ＦＮ活性を生産した、工ＦＮを感染によって生じる細菌
溶解液から採取、精製した。ファージは細菌にヒ）　Ｄ
ＮＡ断片を導入するための適当なベクターであることを
見出した。とくにλ（３ｈ−ａｒｏｎ　４　Ａファージ
は優れており、高工ＦＮ生産をもたらし！こ。 さらに本発明は強いプロモーターヲ備えたプラスミド発
現ベクターへのクローン化したヒト遺伝子ＤＮＡ断片の
導入に関する。この方法はイントロンを欠くものであれ
ばＩＰ’Ｎ−β１同様工ＦＮ−αでも実施できる。 一実施態様において、ヒト成人からのＤＮＡ　４Ｅｃｏ
Ｒ工消化で断片化し仁０ｈａｒｏｎ　４　Ａにクローン
化した。そのようゎにして得られたクローンを０１０ｎ
ｅ　Ｏ１５と名付けた。そのクローンには約１７ｘｂの
ヒ）　ＤＮＡ力１挿入されており、また、それは線維芽
細胞インターフェロンエＦＮ−β１に対応する遺伝子を
含んでいると同定した。制限地図作成は１．８に′ｂの
ＥｃｏＲＩ断片上に位置するこの遺伝子がイントロンに
よって中断されていないこと３示した。このヒト遺伝子
ＤＮＡ断片は大腸菌や他の適当な細ｍ円で活性を有する
ヒ）　ＩＦＮ−β□の合成を指令することができる。フ
ァージ溶菌液から高工ｖＮ活性が回収される。一定条件
下で、１０７単位／ノ程度の活性をファージ溶菌液から
回収した。 溶菌液をクロマトグラフィー、好ましくはシバク四ン・
デルｍ−セファｏ　−／＜　（Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　ｎｕ
ｓＳｅｐｈａｒｏｓθ）あるいはβ１様のカラムにかけ
る。かくして得られたインターフニーロンはヒト線維芽
細胞が生産する工ＦＮと同じ免疫学的性質および種特異
性？有している。１３Ｋｂのヒト遺伝子断片を含むクロ
ーン１８−３中に同定された遺伝子、■ＦＭ−ｇ。で同
様の結果を得た。 他の実施態様では、工Ｆトβ□あるいは工ＩＰＮ−ｇｏ
遺伝子？含むヒ）Ｍ公子ＤＭＡ断片を大ａｌｌのｒｏｅ
　Ａプロモーターを含むシラスミドｐＢｆｔ　３２２の
ようなシラスミドに導入した。これらの組換え体シラス
ミドによって形質転換された大腸菌の培養で、ナリジク
ス酸（ｎａｌｉｄｉｘｉｃ　ａｃｉｄ　）によりｒｏｅ
　Ａプロモーターを誘導したとき、著量のＩＦＮ−βあ
るいはＩＦＮ−１Ｋが生産されｔ、４．　ＩＦＮ−β１
遺伝子断片ケ成熟工ＦＮ−β１の最初のメチオニンに対
応管るコドンの瞬りで切り大腸菌１ａＣプロモーターの
りボゾーム私合部位に連結した。このｌａｃプロモータ
ーをトリットファンプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ
軸合部位を含むように改良した。この混成ｔｒｙｐ−１
ａｃプロモーターにより、遺伝子工ＦＮ−β□ＤＮＡは
大腸菌ミニセル、株ｐ６７９−５４ｐＨｌで１０８矩位
／、ｊ！の工ＦＮ−β１な生産することができた。−」
様に１１１’Ｎ−α。遺伝子をｔｒｙｐ−１ａｃプロモ
ーターに適切に継ぐことにより充分量の工１′Ｎ−α。 ナ得た。いずれの揚台も、工ＦＮ活性はリゾチームと３
０チプロピレングリコールで溶菌した細菌細胞から回収
し、ファージ溶菌液のときと同様疎水性クロマトグラフ
担体上で精製した。工ＦＮ−β１の好適な担体はシバク
ロ／・ブルー・セファロース（０１ｂａｃｒｏｎＢｌｕ
ｅ　Ｓθｐｈａｒｏｓｅ　）である。溶出はエチレング
リ：Ｉ−＃−？　好ましくはプロピレングリコールで行
なうことができる。工Ｆトβｌあるいはａｏのね製は、
さらにモノクロナール抗体カラム上の免疫親和性クロマ
トグラフィあるいは他の常法軒よって行なわれる。 上記から、ヒト遺伝子ＤＮＡ断片が大腸菌および他の適
当な宿主細菌中でヒトｌＰＮヲ高収率で生産するために
使えることは明らかである。 上述のごとく１本発明の方法は、ヒト遺伝子ＤＮＡの断
片なファージのような適当なベクターに導入し、細菌培
養物を該ファージで感染させることにより溶菌させ、溶
菌物中の生成インターフェロンな採取することからなる
。本発明はヒト遺伝子ＤＮＡの導入によって得られる新
規ファージ、と（Ｋ　工ＦＮ−ｊ、の生成に関与するｃ
ｌｏｎｅ　Ｏ１５＊工ＦＮ−ｇ。の生成に関与するクロ
ーン１８．６のようなλ−型の紹換え体ファージに関す
る。さらに本発明はヒト遺伝子ＤＮＡ　７適当なファー
ジに導入し、該ファージから適当なりＮＡ断片？採取し
、これを適当な細菌の発現プラスミドに導入し、該細菌
を培養して目的とするインターフェロンを採取すること
からなるインターフェロンの製造法に関する。 本発明の他の目的は下記詳細な記載から明らかになるが
、該記載は発明明賀制限するものではない。 本発明の重要な利点は健康人あるいは病人から得た遺伝
子の工ＦＮ生産性を比較し、て、■ＦＮ生、産における
遺伝的欠陥を研究半ることかできることにある。 の調製： 高分子量ＤＮＡ　７β−地中海貧血（β−ｔｈａｌａｓ
ｓｅｍｉａ　）の成人の末梢血球から調製した。ＤＮＡ
の一部（４０μｇ　）　鳴「　Ｆｌ：ｃｏＲ工　の　Ｉ
　　Ｏｏ　　、　　２０，０　　、　３００単位で６０
分分間側に消化し、６５℃で１０分間加熱し、前述した
ように一緒［１０〜４０％蔗糖勾配にかけた。１０〜２
０　Ｋ’ｂの間のＤＮＡ断片ｉ、マニアテイスら（Ｍａ
ｎｉａｔｉａ　ａｔ　ａｌ、）　（１９７８セ／Ｌ＝（
ｃｅｌｌ）　１５　、６８７−７０１　）の方法に促っ
てｌｌｆ：ｃｏＲ工消化により調製したλ０ｈａｒｏｎ
　４　Ａ−ＤＮＡアームに、モリイら（Ｍｏｒｙ　ａｔ
　ａｈ）（１９８０。 Ｌ（ｏｌ、Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｔ５　、２０３
−２　’０８　）の記述”に従ってＴ、ＤＮＡリガーゼ
で連結した。 試験管内パッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　）は、
ホーンおよびマビイ（Ｈｏｈｎ　ａｎｄ　Ｍｕｒｒａｙ
　）　（１９７７。 ＰＮＡＳ、、７４．３２５９−５２６３）の記述に従い
、連結反応液ＣＤ、５μｇのベクターＤＮＡおよび０．
１２５μｇのヒトＤＮＡ　）　８μノ数部を大腸菌ＢＩ
（Ｂ、２６８８　（Ｎ　２０５　ｒｅｃＡ−（２１ｍｍ
　４３４　ｃ工ｔ８ｂ　２　ｒｅｄ　３１ｉａｍ　４　
Ｈａｍ　７　）　／λ〕とＢＨＢ　２６９０（Ｎ　２０
５　ｒｅｃｈ−（２１ｍｍ　４３４　Ｑ工ｔｓ　ｂ、’
２　ｒｅｄ３　Ｄａｍ　１５　Ｓａｗ　７　）　／λ〕
め抽出物５０μノと混合することにより行なった。 組、換え体ＤＮＡ　１μｇ当り３　ｘ　Ｉ　Ｑ５ｐｆｕ
が得られた。−男手をつけていないλＤＮＡでは１０８
ｐｆｕ／＃ｇであった。総量で１．８　Ｘ　１０６０組
換え体ファージｖ　１　Ｑ　　１１１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−
ＢＯｊ　　（ｐＨ７−５）ｒ　　１　０　　ｍＭＭｇＳ
Ｏ，および０．０１　％セ゛ラチンを含む液６ｄで希釈
した。０．１ｄのクロロホルムを加え、破砕物をミクセ
フユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　）過心にて除き、ファ
ージな大＆１ｌＤＰ５０（レーダーら（Ｌｅｄｅｒに４
　ｘ　１０３ｐｆｕ　／　１５龜プレートの割で植えて
１０５倍に増やした。選１′別のために２Ｘ１いｐｆｕ
’ｒ１５１の７’レートに植え、二枚のニトロセルロー
スフィルターに、ベントンら（Ｂｅｎｔｏｎ　ｅｔ　’
ａ１．）（１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６．１８０
−１８２））の記述に従って；つづけて写した。この操
作はＰ３の封じ込め条件のもとに行なった。 工Ｆ’Ｎ−β、ｃＤＮＡＤＮＡア−ム：１００μｇ／ｌ
Ｅ／ポリ（ｒ工）　：　ＣＴＯ）と５０ｐｇ／ｄシクロ
ヘキシイミド（最後の１時間はｚｐｇ７ｗアクチノマイ
シンＤＹ含む）によつ′〔４時間帥尋したヒト包皮紗維
芽細胞ＰＳ１ｉからポリｈｅｗ調製し、ワイゼンバッハ
ら（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ　ａｔ　ａｌ、）１９７９
　、　（Ｅｕｒ、＋ｌｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、）　９８
　、１−８　）によって詳述されたＭ糖′勾配遠心分賭
によつ−（インターフェロンｍＲＮＡの２つのピークを
分画′シた。 ｉｉｓのｍＲＮＡ　（１，５４ｇ　）　’ｌ　請イ）　
！Ｊ　背’ｔｔｔｎ’Ｊ詠Ｗウイにス（Ａｖｉａｎ　ｍ
ｙｓｌｏｂｌａａｔｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ　）　（Ｊ。 Ｊ３ｅａｒｄ　）由来逆転写醇素およびオリゴ（ｃＬＴ
　）とともに先のワイゼンバツハら（Ｗｅｉａｅｅｎｂ
ａｃｈ　ｅｔ　ａｈ）（１９８０、ＰＮＡＳ　７７　、
７１５２−７１５６　）の方法に従ってＲＮＡ−ｃＤＮ
Ａハイブリッドヲ調製した。このＲＮＡ−ＣＤＮＡハイ
ブリッドをハイブリッドの鎖延長のための（１０ＴＰお
よび（ＩＧ−鎖延長しＰｓｔ工切餅切断ｐＢＲ３２２ベ
クター〔チャンら（Ｃｈａｎｇａｔ　ａｌ、）、　１９
７８　、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５　、６１７−６２４〕
を用い、ディンら（Ｚａｉｎ懸旦、）（１９７９、ａｅ
ｌｌｌ　６　、８５１−８６１　）に従って直接クロー
ン化した。ス゛テンランドら（５ｔｅｎｌｕｎｌ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、ン　（１９８０、Ｇｅｎａ　　１Ｑ　　。 ４７−５２）によって概説されたようにして総数１２．
５００のｔａｔｒａｍｐ’の大腸菌ＭＭ’２９４形質転
換株を得た。誘導したｐｓ１１細胞の１１８ｍＲＮＡ（
６μｇ）または非誘導細胞の総ポリＡ”−ＲＮＡ（３，
７μｇ）から転写した一３２ｐ＝ＱＤＮＡプローブでコ
ロニーハイブリッド化（ｃｏｌｏｎｙ　ｈｙｂｒｉ＋１
ｉｚａｔｉｏｎ　）を行なったｃ、ｃＤＮＡ合成は、合
成相補ゾライマー〔ナラングら（Ｎａｒａｎｇ　ｅｔ　
ａｌ、）、　１９７９　ｒＭｅｔｈｏｄｓ　Ｋｎｚｙｍ
ｏｌ、　６８　、９０−９８　＃照〕であ９、工ＦＮ−
βｌ配列のＢｇユ１部位な営む５’　ＧＡＧＡＴＯＴＴ
ＯＡＧＴＴＴ（３３’〜ｍｌ始した。ｊｇｐ　−５／禾
端ラベル〔ヒニートンら（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　ａｔ　ａ
ｍ、〕。 １９８０、＼Ｎｕｃ１．ムｃ、Ｒｅｓ　８　、１９１６
−１９６１４したプライ−ｒ　−ｆ用いて、予期した６
４０ヌクレオチド長のｃ　ＤＩＪＡがみられるのは誘導
したＲＮＡ　Ｙ餉型として用いたときだけでめった。ゾ
ロープをｉＡｄするために、２Ｑ　ｐ　ｍｏｌｅｓのノ
ラ（−？−’に４μ）の（７，４ＭＫＣＩ！　ｐで６０
℃６０分間Ｍ　ｆｌｌＪＡとアニール（ａｎｎｅａｌ　
）　Ｌ、各２００　ｐｏｉの”Ｐ−＋ｆｆ４ＡＴＰとｄ
ＯＴＰ　（両刃で４０００１／ｍｍｏｌＪ、各（Ｊ、５
ｍＭのｄＧＴＰとｄＴＴＰ、５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−
）（０）（ｐｉ−１８，６）、４　ｍＭ　ＭｇＯノｚｓ
５ｍＭゾチオスレイトール、５０μｇ／ｄアクチノマイ
シシＤ、４ｍＭピロ燐酸および６０率位の逆転写＃素の
混液２５μノ中６７℃で２時間インキュベートした。２
５μｇの大腸−１）ＮＡ　ン加えた後、０．３　Ｍ　Ｍ
ＡＯＨで７ｔＪ”０６０分間処理し

【反応を中和し、５
０　ｍＭ　ＴｒｉＢ−ＨＯＪ（ｐｔ＋ｓ）、０、　Ｉ　
Ｍ　Ｎａ０Ｊ、１Ｑ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ドデシ
に４ｍ６１Ｐ−ｔ！ファデックス（）　−５Ｑ　（ｄｅ
ｐｈａｄｅｘ　１）−５０）を通して濾過した。各ＲＮ
Ａから５　Ｘ　１０　’ｃｐｍ　ｃＤＮＡを得た。ニト
ロセルローズフィルター上に生育したコロニーを固定し
、’ＤｋＩＡ　’ｌサイヤー（Ｔｈａｙｅｒ）（１９７
９、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９８　、６０−６３
　）の記述に従って変性させた。各フィルター？６　Ｘ
　ＳＥＴ　（８ＫＴ−１５０ｍＭ　Ｎａ（！、ｉ！、２
ｍＭ　ＥＤＴＡ　。 ３　Ｑ　ｚＭ　Ｔｒｉａ−ＨＯＪ（ｐＨ８，））、１０
×デンハルツ溶液（Ｄｅｎｈａｒａでｓ　５ｏｌｕｔｉ
ｏｎ　）　（デンハＡ／ト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　）　１
９６６　、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ
。 Ｏｏｍｍ、２５，６４１−６４６））、０．１％ピロリ
ン酸ソーダ、０．１第ドデシル硫酸、５０ａｇ／ｄ変性
大腸菌、１７ＮＡの混液１０ＩＩｉ／Ｙ使い６７℃で４
時間プレハイブリッド化した。フィルター？各０．５　
Ｘ　１０’ｃｐｍ　／フィルターの二つの”Ｐ−ｃＤＮ
Ａゾロ・−ゾ、１０μｇ　／　ｗｌのポリＡおよび２．
５　ｐｇ　／ｄのポリＣ？有する同じ溶液中で６７℃、
１４−１８時間ハイブリッド化した。プレハイブリッド
化溶液中で６７℃、１時間、次Ｋ　３　Ｘ　ＳＥＴ　、
　Ｑ、１チピロリン酸、０．１％ドデ′シル倣酸で６７
℃、３０分間３回以上、ついで４　ｘ　’ＳＫＴで２５
℃、６０分−７０１参照〕。フィルターを乾燥させ、増
感紙をもったＡｇｆａ　０ｕｒｉｘ　＠−ｒａｙフィル
ムに一７０℃で１〜２日間感光させた。 選別にかけた３、５００コロニーのうち、１４個が誘導
１−たｍＲＮＡから鋳型化したｃ　ＤＮＡに優先的にハ
イブリッド化し、１３０個が非訴導ｍＲＮＡの鈎型化し
たｃＤＮＡにもハイブリッド化した。最初の群からのシ
ラスミドのＭＡ　（０，６μｇ）ケ、６ｘＳＳＯ１１０
×デンハルツ溶液中５′−末端３２Ｐラベルしたゾライ
マ　（０，３Ｑｍｏｌｅｇ、４ｘ１Ｑ’ｃｐｍ）でフィ
ルター〔カファトスら（Ｋａｆａｔｏｅ　ｅｔ　ａｌ、
）１９７９　、　ＮｕｏｌＡｃ、Ｒｅｓ、　７　、１５
４１−１５５２）上に３〜５℃で２１時間ハイブリッド
化し、ついで６５℃で６　Ｘ　８ｅＯ（９００ｍＭ　Ｎ
ａ０）、　９０　ｍＭグエ／酸ソーダ）で洗浄した。ク
ローンｌ−５−５は倍変の陽性でＤＮＡ配列決定〔マキ
サムら（Ｍａｘａｍｅ′ｔ　ａｌ、）　１９８０　、　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　］！ｉｎＺ７ｍｏ１．６５　、４９９
−５６０）Ｋよりそのクローンが工Ｆ’１Ｊ−８１配列
の３′−末端から約３７０ヌクレオチドを含んでいるこ
とがわかった。蔗糖勾配精製した訪・導ｍＲＮＡ由来ａ
ｃ鎖延長二重＠　ＤＮＡ　（ｄｏ−ｔａｉｌｅｄ　ｄａ
−ＤＮＡ　）　ｋｐＢＲ５２２のＰｓｔ　Ｔ部位に導入
することによって前記のように調製した他の５０，００
０のクローンを選別した：　ＩＦＮ−βｌクローンの割
合は０．１６％（８０クローン）であるのに比べて工Ｆ
トβ２クローンの割合は０．６５　％であることがわか
った。 上記したＦ　Ｂ　−１１ｍＲＮＡから調製されたクロー
ンエＦトβ１１−６−５はとトライブラリ−な選別する
のに使われた。 Ｍｏ♂、Ｂｉｏｌ、、　１１３　、２３７−２５１　）
に従い、工Ｆトβ□ｃＤＮＡからのシラスミドＤＮＡ　
Ｙ　ニックトランスレーションによって２　ｘ　１０８
ｃｐｍ　／　ｐｇ　ＤＮＡに標識し、ヒト遺伝子ライブ
ラリーＫ　Ｉ　Ｑ’ｃｐｍ／フィルターでハイブリッド
化した。フィルターの調製、　ＤＮＡ変性およびノ・イ
ゾリツド化扮作は上記のごとく行なった。ノーイブリッ
ド化陽性のプラ−りからのファージを９偽プレートに１
−２　Ｘ　１０２ｐｆｕの濃度で再び植え、６再選別を
行なった。この操作ｆ１３回繰返してプレート上のプラ
ークの９５チ以上を工ＦＮ−β］　ｃＤＮＡ　Ｋハイブ
リッド化した。 ファージクローンＣ１５をそのプラークの一つから単離
した。 ファージをデラトナーら（Ｂｌａｔｔｎｅｒ　ａｔ　ａ
ｌ、）−一−■１−−１）−−１―−ｈ−−―（１９７
７、５ｃｉｅｎｃｅ１９６．１６１−１６９）の記述に
従い液体培地に増殖させた。大腸菌ＤＰ５０Ｙ１％　　
ト　リ　プ　ト　ン、　９．５　４　　Ｍａｉｌ、　０
．５％醇母エキス、０．２％マルトース、０．２５％Ｍ
ｇＳＯ４，０，０１チジアミノビメリン酸、０．００４
　％チミジンで一夜増殖させた。約０．３ｄの培養物を
前吸着のためＫ　１０　ｍＭｕｇｓｏ、、１Ｑ　ｍＭ　
Ｃ！ａｏノ２および１０７フアージの混液０．３−と３
７℃で２０分間混合した。その培養物？Ｉ−２ノー２ノ
フラスコ中Ｚアミン、０．５　ｑ６酵母エキス、　　Ｑ
、５　％　Ｍａｉｌ、０．１％カテミ／酸、０．２５　
％　Ｍｇ８０４．０．０１　％ジアミノぎメリン酸およ
び０．００４　％チミジンを含み予備加熱した培地５０
０ｄで希釈し、よく通気しながら、３７℃で１５−１８
時間インキュベートした。溶菌完了後、細胞破砕物をツ
ルバールＧＳＡローター（Ｅｌｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡ　
ｒｏｔｏｒ　）中、冷却エム０００ｒｐｍで１５分間遠
心分離して除いた。この清澄溶菌液からファージを７チ
ポリエチレングリコール６０００で沈澱させ、続いて２
回塩化セシウム勾配を行って精製した。ファージＯ１５
ＤＮＡ　Ｙフェノール精製し、その構造を、制限酵素消
化、および２０　ｍＭ　）リス塩基、１ＱｍＭ酢酸ナト
リウム、１ｍＭ　ＫＤＴＡ中、０．５μｇ／ｄ−エチジ
ウム・ゾロマイｒｖ用いる水平型アガロースデル電気泳
動により分析し、ニトロセルロースフィルター〔プラー
ク（８０ｕｔｈｅｒｎ　）　、　１９７５　、　Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ｂｉｏｌ、９　ｓ、　１５０３−５１７）への転
写および上記したニック−トランスレーション化した工
ＰＮ−β、ｃＤＮＡへのハイブリッド化を行なった。Ｏ
１５ＤＮＡのＨａ　ｏＲ工断片をデ、ラスミドＤＮＡの
正確な制限地図作成のためにｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ工
部位に確立した操作〔ポリパー（Ｂｏｌｉｖａｒ　）、
　１９７９　、　ｈｉｅｔｈｏｄｓ　Ｅｉｎｚｙｍｏ’
ｌ。 ６８．２４５−２６７参照〕に従って二次クローン化し
た。 上記のごとく調製した清澄ファージ丁ＦＮ−β１０１５
浴す液’ｋ　ＩＪン酸緩衝化した食塩水ＣＰＢＳ　）　
Ｋ　７時間透析した。透析液Ｉ　Ｑ　ｗｌ　Ｖ　Ｃ１ｂ
ａｃｒｏｎ　Ｂ’１ｕｅ−Ｅｌｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ
　＜５　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｏｈｅ
ｍ、）の０．３　ｄカラム上忙乗せた。カラム’ｌ　１
０−１．５＋＋ｊの１Ｍ　Ｍａｉｌ、　　０．０２　Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）、ついド洗液中
５０％ゾロピレン・グリコール１０ｄで洗浄した。画分
（０，５１Ｍ１）Ｙ集め４℃で保存した。場合により０
．１チヒト血ｆＩｔアルブミンを安定化の為に加えた。 ワイゼンバツノ・ら（Ｗｅｉｅｓｅｎｂａｃｈ　ｅｔ　
！Ｌ１．）　（１９７９＋　１（！ｕｒ＋Ｊ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９８　＋’　ｔ　−’　８　）　’
の記述に従い、各画分な９５−ウェル−ミクロプレート
に連続的に希釈してインターフェロン活性を分析した。 各ウェルには　２−３　ｘ　１０’　ＩＦＳ　１１ヒト
線維芽絽胞ケ含ｔｊ’０．１ｓｄのミニマム・エッセン
シャル・メディウム（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｋｓｓｅｎｔｉ
ａｌ　Ｍｅｄｉｕ、ｍ　、　（）ｉｂｃｏ　）　、　５
チ胎生子牛血清（Ｆ′０８　）、　０．５４１”ンタミ
シンケ入れた。３７℃、１８時間後、培地を取り、水胞
性０炎ウィルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉ
ｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ。 ｖｓｖ　）　ｌｋ　２　％　ＦＯ１３含有培地に１　ｐ
ｆｕ　／細胞で加えた。細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔ
ｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　）の阻害を、ＩＦＮ−βＮ工Ｈ
４１１１Ｌａ０２３−９０２−５２７と比較して、感染
後３０〜４０時間記録した。また抗ウィルス活性は、先
に記述したごとく〔ワイゼンパツハら（Ｗｅｉｓｓｅｎ
ｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）、　１９７９　。 ｌｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９８　、１−８　、ｌ
　、　ｖｓｖ感゛染後の、３Ｈ−ウリジン取込みの減少
によって測った。 工ＰＨ−βの抗血清はウサギから得、先のごとく（Ｗｅ
ｉｇｓｅｎｂａｂｈ　ｅｔ　ａｌｅｙ　１９７９　、　
Ｆｆｕｒ、、ｒ、Ｂｉｏｃｈａｍ。 シーーｉ１．シ。 ９８．１−８）分析した。中和試験のために、０．１　
ｍの抗血清（力価１０４単位／ｄｌ）あるいは非免疫血
清をＰＢＢ中蛋白Ａ−セファローズビーズ（ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ａ−８ｅｐｈａｒｏｅｅ　ｂｅａｄｓ　）　（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　−ＩＰｉｎｅ　Ｏｈ＠ｍ、）の５０
チ懸濁液０．２　ｍと３７℃で１時間混合した。 ビーズＶ　ＰＢ８で２度洗い０．１−の細菌インターフ
ェロン（１００単位／ｄ）ｋ加えた。３７℃、２時間後
、ビーズを遠心分離し、上溝を分析してｖｓｖ　ｇ染細
胞中の３Ｈ−−リジン殿り込みの阻害をｄ、ちべた。 ゴヌクレオチドな使って直接ヒｌ伝子うイブラリー乞選
別した。該オリゴヌクレオチドは工ＦＮ−σ逼伝子の共
通配列に相補的で５′（！ＴＯＴＧＡＯＡＡＯＯＴＯＯ
Ｏ３’および５’　０ＣＴＴＯ’［’（）ｆ）ＡＡＯＴ
Ｇ３’の配列を有していた、これらオリがヌクレオチド
は上記のごと＜５′標識した後直接、またはセンダイウ
ィルス誘導したヒト白血病細胞からのＲＮＡ上ｃＤＮＡ
合成の為の紙型（ゾライｉ−１１−１ｐｒｉ　）として
使われた　３２ｐ−オリビヌクレオチｒあるゝいは鋳如
化したｃＤＮＡ　Ｉｆ上記のごとく総数５００，０００
の２組換え体ファージにハイブリッド化した。９ａ−ニ
トロセルロースフィルター当り約５　Ｘ　１０’　ｃｐ
ｍ使用した。ハイブリッド化はプラスチックの密封した
ｌＰ＋Ｐ＋袋用袋中最少容量で行なった。 １５塩基のプライマーでのハイブリッド化を以下のごと
く行なった。まず、６ｘＳＢ０．１０×デンハルト溶液
（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ　）中３７℃で４時間プレハイブ
リッド化、次いで、５ｘｓｓｃ、１０ｘデンハ７Ｌ／ト
溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ　）中６７℃で１８時間ハイ
ブリッド化し、６．ｘ　ｓｓａ中３７℃で各３０分間３
〜４回、洗液忙放射能が検出されなくなるまで洗浄した
。１３塩基のプライマーでのハイブリッド化では、ハイ
ブリッド化および洗浄の温度を３０℃に下けた。ハイブ
リッド化陽性を示した総数１６のファージをさらに制限
地図作成およびＩ）ＮＡ配列化により分析した。クロー
ン１８−３は３個の工ＦＮ−ｄ遺伝子？担い、そのうち
の１個は。 ｒラブルら（（ｋｏｅａｔｌｅｌｅｔ　ａｌ、）　［１
９８１。 Ｎａｔｕｒｅ、　２９０　、２０−２５　）のｃＤＮＡ
クローン−８と同じ配列ケ持っていることが証明された
。 クローン１８−６は上記クローン０１５と同様に精製し
た。クローン１８−６のλバｌ　ｆ　ＩＪ　、ｔ　７ア
ージ中での発現および発現プラスミドベクター中に挿入
後の発現を下記「結果」で説明する。 結果 フ了−ゾクローンヶＥｃｒＲ工そ部分消化しλ０ｈａｒ
ｏｎ　４　Ａのアームにクローン化したヒトＤＩＪＡの
ライブラリーから分離した。該クローンはヒトｌｆＭ　
＃４＝芽細胞の二様のｍＲＮＡ画分から別々に＾装した
二つの異なる工ＦＮ−β１ｃＤＮＡプローブｔｉｃ　５
１１！（ハイブリッド化した。ＥｃｏＲ工にょる該ファ
ージＤＮＡの消化は、２つのλアームに加えて、１２，
２．６＋１．８４および０．６　ｐ　Ｏベース（Ｍ　Ｉ
　Ａ　１ｉ４１）のｌｒ片を示した。サデーン（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ　）　［１９７ｂ。 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ・９８，５０３−５１７）の方法
によるニトロセルロースへの転写および工Ｆ’Ｒ−βｌ
ｌ−６−５ｃＤＮＡりＴ：１−　：／　カ６ニックート
ランスレーション化したＤＮＡとのバイブ】ノット化シ
で、【す１．８４Ｋｂ断片がＩＦＮ−βｌ遂伝子を含む
ことがわかった。 このＥｃａＲＩ断片？　ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部係
に再クローン化した。この１．８４１亜クローンのＢｇ
：Ｌ　ＩＩＰｖｕ　ｌ　、　Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｍｉｎｅ
　ｌおよびＴａｑ　Ｉによる制限酸素分析および部分な
いし児全長ＩＦＮ−ｆｊＩ　ＱＤＮＡゾロープとのハイ
ブリッド化により工ＦＮ−β、ル蛋白のコード配列（Ｈ
ｌｎａ　１部位）はＢｃｏＲＩ部位から約３５０ヌクレ
オチドでｔＡｉ筐るとｉｂした（第１Ａ図）。遺伝子Ｄ
ＮＡ中の種々の制限酵素部位の間の距離は集彫ｉｈ差の
顧Ｊ四でｃ’ＤＮＡ配列のそれと同じである（＃１東）
。 制限部位　　　β１ｃＤＮＡ配列　　β、遺伝子ＤＮＡ
ヌクレオチド−ヌクレオチド Ｔａｑ　ｒ−Ｐｖｕ　ｎ　　　　　　２５５　　　　　
　　　２５０Ｈ１ｎｅ　Ｉ−Ｐｖｕ　Ｈ２０４２１０Ｈ
１ｎＣＩ−Ｂｇｌ　Ｉ　　　　５７０　　　　　　５７
０ｐｖｕ　ｌ−Ｂｇｌ　ｍ−３６６６６０ジーｙ　（Ｇ
ｅｎｅ　Ｊ　１０　（１１−１５）による。 ’）＋　　１．８４　Ｋｂ、ＫｃｏＲ工断片から泪１１
定。 考地したＨｌｎｃ　ｌとＴａｑ　１部イ算は遺伝子の５
′末端に最も接近したものである。 予期しない制限酵素部位はＩＦＮ−β１コード領域のど
こにも見出せなかつ趙。辷れは検出できる介在配列（ｉ
ｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇｓθｑｕｅｎｅθ）が存在しない
ことケ示している。 Ｏｌ　５　ＤＮＡのＲａｏＲ工部分油部分消化、’６　
Ｋｂ　１ｃｏＲＩ醇Ｉ片が１．８４と２．（５Ｋｂ　１
ｌｉｃｏＲ工断片の間に位置することを示した。Ｂａｍ
Ｈ工部位が２．６　Ｋｂ中に１１ｉ！１ｌＰ９ｒ見出さ
れたが挿入したヒ）　ＤＮＡの他のＥｃｏＲ工断片には
見出されなかった。工？Ｎ−β、ｃＤＮＡ　Ｉｃハイブ
リッド化する１、８４’　Ｋｌ）のＫｃｏＲ工断片はＯ
ｌ　５　ＤＮＡの９，６Ｋｂ　ＢａｍＨ工断片上に見出
された。第１図に示したとおり、この断片はλ右アーム
（Ｋｃｏｌ’Ｈから５．１　Ｋ１：＋　）のＢａｍＨ工
部位からのみ由来し、挿入したヒトＤＮＡのＫｃｏＲニ
ーＢａｍＭ工断片に当る４、５　Ｋｂを遊離しているが
、このことは１．８４　Ｋｂ　ＥｉｃｏＲ工断片がλ右
アームに隣接しているに−ちがいないことを示している
。遺伝子方向づけ（第１Ａ図）は以下のごとく決定した
。０１５　ＤＮＡ　４　Ｐｖｕ　Ｉで切断して工ＰＮ−
β１　ｃＤＮＡの児全長または３′側半分にノ・イブリ
ッド化したとき、工ＦＮ−β１の５′末端にのみハイブ
リッド化している０、６６　Ｋｌ）断片が見出された。 しかし、１．８４　Ｋｂ　ＥｃｏＲ工断片Ｙ　Ｐｖｕ　
Ｉで切断したときは、工ＦＮ−β、の５′末端が、より
小さい０．５４　Ｋｂ断片上に見られた。挿入したヒ）
　ＤＮＡの−０，６Ｋｂ　Ｎｅｏｎ工断片にはＰｖｕ　
１部位は見出されないので、０，６６　ｘｂ　Ｐｖｕ　
ｌ　ｌｌ１ｌ′１片はλ右アームで終るはずであり、従
って工ＦＮ−β、の５′末端はλ右アームに最も接近し
ている。第１Ａ図に示される樽造は、Ｈｌｎｄ　Ｉ　％
８ｍａ　ＩおよびＢｇｌ　ＩＩ消化な用いる数種の他の
制限地図作製実験からも確認される。クローン０１５中
の工Ｆトβ１遺伝子のコード配列は、従って、左方向転
写な調節する強力なλＰＬプロモーター〔ウィリアムス
ら（Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔ　ａｌ、）、　１９８０　、
　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｆｉｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ
ｌ。 ｐｐ２０１−２８１．プレナム社（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｃｏ
ｒｐ））から約１，７７５ヌクレオチド離れて、適切な
左方向性に挿入されていた。このことが検出可能なイン
トロンの不在とともにａｌ５組換え体ファージ感染大腸
菌でインターフェロンを生産する可能性の検討を促した
。 クローンａ１５からのファージをメソッズ（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　）　Ｋ記載のとおり大＆１ＤＰ５０の培養液５０
０ｄで増殖させた。清溌溶菌液１０ｄケ透析し、０１ｂ
ａｃｒ’ｏｎ　Ｂｌｕｅ−８ｅｐｈａｒｏａｅ小カラム
（０，３ｄ　）にのせ、画分を水胞性ロ内炎つイ、ルス
（ＶＳｖ　）細胞変性効果の阻害について、標準工ＦＮ
−βを対照として用いて、分析した。溶菌液中のファー
ジ濃度１．３　×１０１’フアージ／ｄで行なった一実
験例におけるインターフェロン活性バターノ？第２１図
に示した。カラムから５ｏｓゾロピレングリコール−１
Ｍ　Ｎａ０Ｊで溶出した両分中に総ｆｆｉ　７，５００
単位の工ＦＮ活性？回収し、た。これは溶菌液１ノ当り
０．７５　、１０’単位に相当する。 しかし粗溶菌液中では測定可能な活性が非常に低く、そ
のことは溶菌液中の物質が工ＦＮ活性の正確な分析を妨
けていることを示唆している。再造成実験で、標準ヒト
エＦＮ−βを野生型λＣｈａｒｏｎ　４　Ａ溶菌液に加
えたとき、活性は投入したものの１０分の１であった。 この混合物をＢｌｕｅ−８θｐｈａｒｏｓｅカラムに通
すと、投入活性の７５チが回収された。 対照として１１Ｍ添加しない野生型λ０ｈａｒｏｎ　４
　Ａファージからの溶菌液を分析したが、■ＦＮ活性は
見出せなかった（第２図）。 クローン０１５の溶菌液からの１１！′Ｎのクロマトグ
ラフ挙動は一定でない。ファージ濃度が３　Ｘ　１０”
ｐｆｎ　７　ｗｔの実験では、工ＦＮ活性は高いが、Ｂ
ｌｕｅ−８６ｐｈａｒｏｓｅカラムには保持されなかっ
た。この実験で、カラムから回収された総活性は１０−
の溶菌液（７−８×１０６単位／））の投入九対し７０
−８０，０００単位の工ＦＮであった。 溶出画分を第２のＢｌｕｅ−８ｅｐｈａｒｏｓｅカラム
に再吸着させた。このときは活性がカラムに保持された
が、ＰＢＢでカラムを洗うと再び溶出さ、れた。ヒトＩ
ＦＮ−βｌは通常疎水性溶媒によってのみＢｌｕｅ−Ｅ
ｉｅｐｈａｒｏｓｅから溶出されるはずである〔ナイー
トら（Ｋｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｍ、）、　１９８０　、
５ｃｉｅｎｃｅ　２　Ｑ　７　。 ―■−■−−−―−−−−■■−■− ５２５−５２６）、従って標準ヒトエＩｌ’Ｎ−βを同
じファージ溶菌液と混合しカラムにかけた。活性の６０
％が保持されず、活性のυ１収は２５チに丁きなかった
。このことはｌこ９の溶菌液の成分が工Ｆトβ、特に細
菌によって生産される工ＦＮ−βとＢ１１１θ−８ｅｐ
ｈａｒｏｓθの相互作用を不安定化したことケ示唆して
いる。 インターフェロンはカラムに保持されなかったが、溶菌
液の蛋白質の９０チ以上が比活性４−５　Ｘ　１０”単
位／”１１蛋白質を有する活性画分から取除かれたあこ
の部分精製は粗溶融液中の活性を隠蔽した化学物質な取
り除くために欠かせない。別の実験では、また溶菌液を
カルボキシメチル−セファロース　クロマトグラフィー
にかけてクローン０１５工？Ｎ活性を回収した（図には
示さない）。 ロンの性質 クロマトグラフ処理で回収したインターフェロン活性は
アクチノマイシンＤで処理したｖｓｖ−ｇ梁ヒト細胞中
の３Ｈ−ウリジンの取り込みケ減少させた〔ワイゼンバ
７　ハ（Ｗｅｉｓａｅｎｂａｃｈ　）　＋　１９７９　
＊Ｋｕｒ、、Ｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９８　、１−８　
）ｏ　Ｎｈｋ工ＦＮ−βで得られた力価曲線は標準ヒト
エＦＩＪ−βで得られたものと同じであった（第６図）
。細菌工ＦＮの免疫学的性質な胸べるために、部分驕製
物をウサギ抗工ＰＮ−β血清（工ＦＮ−には不活性）ま
たは蛋白質ムーセファｏ　−ｘ　（ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ
−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　）に予備結合したウナギ非免役
血清と混合した。遠心分離後、上滑の工ＦＮ活性ン分析
した。抗工ＦＮ−βｍ消はインターフェロン活性な全て
取除いたが非免疫血清？用いたときは活性が残った（第
６図り。 細劇ＩＦＮ　（２０単位７ｍ１）は細胞培養物上で技工
Ｆトβ（２θ単位／−）と混合するだけで同様に中和さ
れ、■５ｖ１１ｉ１１ＩＪＪｌｌ！ｌ変性効果の阻害に
よって分析された。 細菌インターフェロンの種特異性を褌々のｈ版型の比較
により分析した。 第２表　遺伝子１ＦＮ−β１ｃ１５クローンにより生産
された細菌インターフェロンの釉特黄インターフェロン
カ価単位／Ｍｔ ヒ　ト　　　プル　　ウシ　マウス　マウスイア、Ｊ−
７！　ｏ７起源　’ＦＳｉｉ　　ＢＥＣ−ｉ　　ＭＤＭ
　　　Ｌ　　　Ａ９細胞　細胞　細胞細胞細胞 １、ヒトＦ１３１１細胞　　　１．５００　　３２　　
　３２　　　＜４　　　＜４２．１５クローン感染大腸
菌’１．０００　　３２　　　　３２　　　＜４　　　
＜４細菌工ＦＮは第２図のようにＣ１５溶菌液のＣ１ｂ
ａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ−８ｅｐｈａｒＯａｅ上クロマト
グラフイー後に用いた。 ヒトエＦＮ−βとしてのクローン０１５感染大脱自生産
物の活性はプル腎＃胞ｇｓＣ−１およびウシＭＤＢＫ細
胞ではヒト細胞の場合の１０％以下であった。 マウスＬあるいはＡ９細胞については検出可能な抗ウィ
ルス活性はなかった。クローン０１５によって生産され
る細菌工ＦＮ　６，０００単位／ｄでも同じ結果が得ら
れた。 本発明は、従ってヒト遺伝子ＤＮＡのＥｃｏ’Ｒ工部分
消化断片からλ０ｈａｒｏｎ　４Ａ中へのクローニング
によって直接単離されたＩＰ’Ｎ−βｘ３に伝子が発現
可能で培養物の溶菌液中に著量のＩＰ’Ｎ活性を蓄積さ
せることができることを示した。生産された活性は免疫
学的性質ならびに程特異性から明らかに紐維芽細胞イン
ターフェロン（β）である。活性ハエＦＮ−β１ｃｆ５
ファージクローンによる感染細菌ケ培養したときにだけ
生産される。大腸菌中のクローン０１５によって生産さ
れる工ＦＮ活性は０１ｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ　５ｅｐｈ
ａｒｏｓθ上のクロマトグラフにおける性質がヒトエＦ
トβとよく似ている。細菌溶菌液から高活性（７Ｘ　１
０’単位／））を回収するためにはクロマトグラフ処理
が必須である。インターフェロンは、従？て一個体の遺
伝子から直接採取したヒ）　ＤＮＡ断片の指示のもとに
細菌により生産される生物学的活性蛋白質の最初の例と
なる。 クローンを、化学合成された短いオリゴヌクレオゴドの
１Ｉｌｉ！ハイブリツド化によって、ＩＦＮ−αの配列
に相補的であると１４定した。組直・０．５×１０ｃ′
の遺伝子中１６のクローンがハイブリッド化陽性であっ
た。オリゴヌクレオチドにハイブリッド化するＲｃｏＲ
工断片の配列を調べた結果、クローン１８−３は、第１
Ｂ図に示したように、工ＦＮ−ａｃのｊ１伝子が位置す
る２　Ｋｂ　ＨＣＯＲ工断片１８．−１３（第１ＢＥＲ
Ｉの挿入部分）を含んでいることがわかった。この遺伝
子は、明らかにｒラブルら（Ｇｏｅｄｄｅ：Ｌ　ｅｔ　
ａｌ、）’　（１９８１、Ｎａｔｕｒｅ　２９０　。 ２Ｏ−２５）によって＠皆されたＩｒ　Ｎ−’　ｃクロ
ーンを生じるｍＲＮＡの起源である。クローン５−１は
知複するＤＮＡ断片を表わす。クローン５−１およびク
ローン１８−３はともに、工ＦＮ−１ｉｏに加えて、ａ
−４およびａ　−６４と名付けた二つの他の工ＦＮ−ｆ
ｆ遺伝子？担っている（第１’ＢＩ＆Ｉ）。　　”―片
の発現 ｒｅｃＡプロモーターは最強の大胆−プロモーターのひ
とつと考えられている。通常、ｐＢＲ３２２のような多
数コピープラスミド上に存在するときでいる。ｒｅｃＡ
プロモーターは損傷を受けたＤＮＡの存在下にそれ自身
の抑制体ケ切貼して誘導され、誘導は非常に高い程度ま
で行なわれる。 〔サンカーおよびラップ（５ａｎｃａｒ　ａｎｄ　Ｒｕ
ｐｐ　）。 １９７９　、　ＰＮＡ８７６　、６１４４−３１４８　
）。 ｒｅ　ｃＡの槓準討導物餐はＤＮＡ合成を妨けるナリジ
クス酸あるいはＤＮＡ　ｋ交叉連結するマイトマイシン
０である。 約１キロベースのＴａｑ　Ｉ　−Ｂａｎ）ｉＩ断片上の
プロモーターを分離するためにクローン化したｒａｃＡ
な含むシラスミドｐＤＲ１４５３ｋ使った。これを０１
ａ　ＩおよびＢａｎ　ｌで開裂したｐＢＲ３２２に連結
しシラスミドｆｔＡＰ−１’ｒ造成した。この場合Ｔａ
ｑ　１−Ｏｌａ　１結合はＯｌａ　１部位を回復し、そ
の結果グラスミドはｒｏｅム遺伝子の第３番目のコドン
中で唯一開裂されることを可能にした。ＲＡＰ−２はＲ
ＡＰ−１ｋ　１ａｏＲＩおよびＣ１ａ　Ｉで切断し、粘
着末端な埋め込み（ｆｉｌｌｉｎｇ　ｉｎ　）、Ｒ工部
位を回（３１！する再伸結を行なって造成した。ＲＡＰ
−２ケＲ工部位で開裂し、外来ＤＮＡ　ｖｒｅａＡ　Ｉ
Ｍ白す第３番目のコドンＫ　Ｊ４・入することができる
。 ＲＡＰ−１ベクターｔヒト遺伝子ライブラリー・からの
遺伝子断片によるインターフェロン活性の間接発明に使
った。工ＦＮ−β１迫伝子および数個の単離したａ　亜
種の工ＩＦＮ−α遺伝子はとのプラスミ・ドに挿入した
とき、槓準抗ウィルス分析によると強φインターフェロ
ン１活性を生産することが認められた。これらの遺伝子
が存在するＤＮＡのＲＩ断片（第１ＡおよびＢ図）　Ｖ
　ＲＡＰ−１シラスミドのＲＩ部位に二次クローン化し
た。該プラスミドをｒｅＣＡ＋宿」、菌株に入れ、該細
菌を培養し、ナリジクス酸で誘導し、細胞を採集し、′
リゾチームおよび３０％プロぎレンゲリコールで溶菌し
、抽出物０抗ウイルス活性を分析した。活性の程度は明
らかにナリジクス酸（よる誘導に依存し、に、高５０μ
ｇ　／　ｄであった（第６表）。 １、ｎＡｐ−１（１８５３）−工Ｆ’Ｎ−直。　　＋ナ
リゾクス酸　　　　　５００ｕ４ｐ−１（１８３３）−
工ＦＮ−４０−ナリジクス酸　　　　〈６２２、　ＲＡ
Ｐ−１（１８３３）−工７Ｎ−ａｏ　　右方向　　１０
００ＲＡＰ−１（６！＋１）−工ＦＮ−８１右方向　　
３０００ＲＡＰ−１（６３１）−工Ｆトβ１　逆方向　
　７５０クローンＲＡＰ−１（１８３３）は工ＦＮ−α
。遺伝子を持つＩＣｃｏＲ工断片を含む（第１Ｂ図１）
クローンＲＡＰ−１（６３１）は工ＦＮ−βｌ遺伝子を
持つＫｃｏＲ工断片を含む（第１Ａ図） 断片はｒｅｃＡ遺伝子の始めに導入した。方向はｒｅｃ
ムプロモーター配向に関するものである。 興味深いことＫは、遺伝子断片はｒｅｃＡプロモーター
に関連する二つの可能な配向で活性？生産するとともあ
る。活性を示す工ＦＮ−β１および工ＰＮ−ａ遺伝子は
丁ぺて１．８−２キロベースのＤＮＡ　ＢｃｏＲ工断片
上に位置していたので１．プロモーターからインターフ
ェロン遺伝子のＡＴＧ開始コドンまでの距離はおよそ数
百ヌクレオチドである。 これらの実験からプロモーターが予期したとおり機能す
ることは明らかであり、遺伝子ライブラリーからのイン
ターフェロン様遺伝子の活性、の有無を迅速に決定する
ことが可能である。 シラスミドｐｂ、ｒ　３　（：ジョンスラド（Ｊｏｈｎ
ｓｒｕｄ）。 ｐＮＡｓ、１９７８．７５．５３１４−５３１８）は関
連のない９５ヌクレオチドで隔てられた各９５地基対長
の２つの１ａｃプロモーターを含んでいる。 この２８５ヌクレオチド断片をシラスミドＰＭＢ　９の
Ｅｃｏ１１部位に挿入する。９５塩基対長のｌａｃ配列
はオペレーターおよびプロモーター配列を含み、β−ガ
ラクトシダーゼのＡＴＧの直前で停止する。 β−ガラクトシダーゼのリボゾーム結合部位から適当な
距離に挿入した、ＡＴＧ開始コドンを有するコード化Ｄ
ＮＡ配列は大腸菌細胞中で正確に発現されるはずである
。２８５塩基対のＢＣｏＲ工断片を１）ＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＩ部位に再クローン化した。組換え体１に４０４
ｇ　／　ｄ　Ｘ−ｇａ’ｌおよび１５μｇ　／　ｄテト
ラサイクリン含有プレートで細胞を増殖させて選別した
。陽性の青色コロニーだけを集めＤＮＡ　７塩化セシウ
ム勾配遠心で精製した。 ｌａａプロモーターにはｐＢＲ３２２のアンピシリン遺
伝子方向とテトラサイクリン遺伝子方向の二方向が予期
できる。本廃明著らの興味はｌａｃ　！Ｊポゾーム結合
部位とｐＢＲ３２２配列の間に位置するＦｆｃｏＲＩ部
位のみを得ることにあるので、プラスミドＤＮＡ　Ｋ　
ＲＮＡボリメラーゼケ結合することによってこの部位を
保睦し、一方末梢部位なＩｃｏＲ工制限で開裂し、ＤＮ
Ａ／リメラーゼのクレノー７ラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ
　ｆｒａｇｍｅｎｔ　）で埋め込みを行ない、再結合し
た。ＭＭ２９４大＆抛細胞を形質転換後、ゾラ不ミドを
分離し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨ工部
位の間の距離を測った。３７５塩基対断片を含むプラス
ミドは１ａＣプロモーターがテトラサイクリン遺伝子方
向で、６７０＃Ａ基対断片（６７５±２９５　ｂ、ｐ、
）　ｋ含ψむプラスミドはｌａｃプロモーターがアンぎ
シリン遺伝子方向であった、ＩＦＮ−β１遺伝子断片の
ＥｃｏＲＩ１−８４　ｘｂ二次クローンから、本発明者
らはブレインターフェロン配列ケ含むＨｌｎｃｌ　−Ｂ
ｇｌｌ断片を切出した。成熟ＩＦＮ−β□蛋白はそのア
ミノ基末端に大腸ｉ内η開始コドンとし・て用いること
ができるメチオニンを含んでいる。このｊＡＴＧコドン
に接して１６ヌクレオテド隔てられた２つのＡｌｕ　１
部位がある、１つはＡＴＧの前８ヌクレオチド、他はＡ
ＴＧの後２ヌクレメチドである。部分的Ａ’ｌｕ　Ｔ消
化Ｙ　Ｈｌｎｃｌ−Ｂｇ１ｍ１片で行ない、約５１０塩
基対の断片ケアガロ−スプルで単離した。テトラサイク
リン遺伝子方向の１８．Ｃプロモーターを含むベクター
ｆ７ＥｃｏＲ工で制限し、制限部位７　ＤＮＡ　ｙｊｅ
　ＩＪメラーゼで埋め込みケ行ないＢａｍＨ工で再切断
した。Ａｌｕｌ−Ｂｇ１ｍ断片と埋め込みを行なったＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩベクターの連結でＷＱＯＲ工部位
が回復したｃＡＴＧコドンを含むクローン（１６ヌクレ
オチド長）の間の区別を可能にするために得られたクロ
ーン５　ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで制限し、予期した１５
１塩基対の断片を含むクローンの配列を決めた。次いで
ＫｃｏＲ工部位Ｙ　Ｍ　ｌｍ１４裂し、リボゾーム結合
部位とＡＴＧの間のｋｍをＢａｌ　３’　１消化と再結
合で短くした。これらのプラスミドで形質転換した大腸
菌はＩＦＮ−β、生産により選別した。 クローン、Ｌ−１１は約３　×１０’単位／ノの工Ｆト
βを生産した。このクローン中のｌａｃプロモーター領
域をＨｐａＨ工で、すなわちｍＲＮＡ開始前１７ヌクレ
オチドで切断した。工ＦＮ−β、退伝子を切出すため、
酵素８ａｕ　３　ａ　ｖ用いそのＤＮＡ　７ａ−■ＦＮ
−β１の停止コｒ：／′Ｊｇｔ越えて３ヌクレオチドで
切断した。 このＨｐａトＳａｕ　３ａ　１ａｃ−工ＦＮ−βｌ断片
を下記のごとく、に調製したｔｒｙｐプロモータープラ
スミドの０１＆　１部位とＨｌｎｄ　１部位の間に等大
した。ｔｒｙｐ址ＮＡの開始前−２１〜−２０１の１８
０ヌクレオチＶ長のＴａｑ　Ｉ−ＴａｑＩ断片をｔｒｙ
ｐプラスミドｐＢＰ　１２１−２２１から切出し、ｐＢ
ｐ　３２２の０１ａ　Ｔ部位にクローン化した。本発明
者らは、ｔｒｙｐプロモーター断片が時計方向に向いた
配向のものケ運んだ。この操作にｆすｔｒｙｐプロモー
ターの−２１の位ｔにＯｌａ　１部位が回０１ｌｊる。 １ａｃ−工ＦＮ−βｌ断片に連結後、混成プロモーター
ｔｒｙｐ−１ａｃが工ＰＮ−β□遺伝子の前に形成され
る。このプラスミドＴＬ〜１１を大腸菌ＭＭ２９４ある
いは大腸シミニセル株ｐ６７９−５４の形質転換に使っ
た。 これらの細菌はＯＤ６．。１０の発＃軌丸イ；で１０８
単位／ｊ！の工ＦＮＪｌを生産する。己のことはこの工
ＰＮ−βｌ遺伝子ＤＮＡ断片が高い活性を有することを
示している（第４図）。

【図面の簡単な説明】

丸 （ａｔ　　λＣ！ｈａｒｏｎ　４Ａの模式図。２つのア
ームは後編で示す。 （ｂｌ　　クローン０１５に挿入したヒトＤ′ｉ軸の情
動。 黒塗部分は工ＦＮ−β］ｃＤＮＡにノ・イブリッド化す
るＥｃｏＲ工断片ン示す。 ｌｃ）　　ｂからの黒塗断片の拡大は−ａ線として示す
。 単線はλ右アームの部分である。ＰＬはλ左方向プロモ
ーターである。 （ｔｌ）　　工ＦＮ−β１ｍＲＮＡの位置、上方の目盛
りは（ａｌと（ｂｌに対応する。下方の目盛りは（Ｑｌ
と（ｃｌ）に対応する。 詳細は本文参照。 ２つのλ０ｈａｒｏｎ　４Ａクロ一ン挿入部分の制限地
図Ｙ示す。工ｙｙ−ａｃ遺伝子は矢印アルファーｃ４に
で示される。他の２つの工ＦＮ−ｆｆ遺伝子が工Ｆトσ
。の近くに存在する。挿入部分ば工ＦＮ−ａ８３に伝子
ゲ含み、本文に説明したようにｒｅｃＡプラスミド中に
クローン化した１ｃｏＲ工２に１）フラグメント１８−
３３を示す。制限酵素一部位に対応する記号ケ示す。 ５ｅｐｈａｒｏｓｅでの分析 ファージ０１５感染大腸菌ＤＰ５Ｑの粗溶菌液を１材料
および方法”に１敞のごとく分画し、工ＦＮ活性を各両
分について分析した（トー１）。蛋白濃度を同じ画分に
ついて細った（　１−−−−・）。 λ０ｈａｒｏｎ　４Ａ　７アージからの溶菌液の平行う
ロマトグラフイと分析を示すにト“ぺ）、 第６図１：遺伝子クローンエＦＮ−β１ｃ１５インター
フェロンの力価 第２図のカラムからのファージ０１５１ＦＮの画分（約
１０３ｊ１位／＊／）？／１　：　４０に希釈シ、ツい
でＶＳＶ　ＲＮＡ合成の希釈による工ＦＨの分相の、為
にミクロプレート上で連続的に希釈した（）−■ル標準
ヒト線維芽細胞インターフェロン２５単位／ｍｌ　ｆ平
行して分析した（　１−−−−−・）。ＶＥＩＶなしの
対照（０）およびＶＳＶあり工Ｆ’Ｎなしの対照（−）
ヲ示す０右の２つのカラムは”方法”で示したように、
固定化した技工ＦＮ−βまたは非免役工ｇＧに吸着後の
ファージ０１５工ＦＮの残存活性（最終希釈’１：４０
）を示す。 工ＦＮ生産 ＴＬｌ　１プラスミドは本文に示したことく混成ｔｒｙ
ｐ〜］、ａＣゾロモーターおよびヒト逼伝°子断片由来
成熟ヒトエＦＮ−β１をコードする配列を含んでいる。 細’ｄＭｋ１１ｔのニュー・デルンスウィック発醇４＠
　（ｌｉｅｗ　Ｂｒｕｎａｗｉｃｋ　ｆｅｒｍｅｎｔｏ
ｒ　）中で増殖し、指示した時間に、細菌をリゾチーム
−プロピレングリコールで細菌し、ＶＥＪＶＫヒト細胞
を攻撃させて工ＦＮ活性を測定した。ｌ’Ｎ活性は細菌
培養物１−当りで計算する。 代理人　浅　村　　　皓 外４名 」２１辺 イ３１」 傭　４．ｉ別 第１頁の続き ０発　明　者　ルイセ・チェノ イスラエル国うマット・アビブ ・タゴール・ストリート５２ ０発　明　者　ジェルトン・イスラエル・フエインステ
イン アメリカ合衆国コネチカット州 ニュー・ヘブン・ファーンハム ・アベニュー３３ 手続補正書（方式） 昭和ごら２２年１月ンー日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和−！ニア年特許願第θｚ２９ん号 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和３２年７２月４日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の浄コ　（内容に変更なし） ８、補正の内容　　別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ヒト遺伝子ＤＮＡな適当なファージに導入し
   。 そのファージ組換え体で適当な細菌を感染させるか、そ
   のファージから適当なりＮＡ断片を採取し。 これを適当な細菌の発現プラスミドに導入して得られる
   細Ｗｉヲ培奪し、インターフェロンを採取することを特
   徴とする、線維芽ｍ胞（β）型および白血球（−１型ヒ
   トインターフエロンの製造法。 （２）　　インターフェロンが（β）型であり、用いる
   ファージがλ型である、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 （３１ファージがａｌｏｎｓ　０１５と命名したクロー
   ンの生成に関与するλ□ｈａｒｏｎ　４　Ａである、特
   許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 （４）生産されるインターフェロンが（−）型で、用い
   るファージがλ型である、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 （５）　　ファージがＣｌ０ｎ０１８−６の生成に関与
   するλ−０ｈａｒｏｎ　４　Ａである、特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 （６）　　感染に用いるファージがλ型で、感染される
   細菌が大腸菌（Ｆ！、ｃｏｌｉ　）である、特許請求の
   範囲第１項から第５項のいずれが１項に記載の方法。 （７ン　ファージがλ−０ｈａｒｏｎ　４　Ａで、細菌
   が大腸菌ＤＰ−５Ｑである、特許請求の範囲第６項記載
   の方法。 （８）　　ヒト遺伝子ＤＮＡ画分をファージから採取し
   、適当な細菌のプラスミド発現ベクターに導入して、該
   細菌な培養し、インターフェロンを特徴する特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 （９）　　ＤＮＡが強力なゾ目モーターを偏えたプラス
   ミド中に導入する、特許請求の範囲第８項記載の方法。 時　用いるプラスミドがＩ）ＩＩＲ３２２で、導入する
   遺伝子が工Ｆ’Ｎ−βｌまたは工ＩＦＮ−α。遺伝子で
   ある、特許請求の範囲第８項記載の方法。 ０１）　　シラスミｒが大腸餉のｒθｃＡ　７’νモー
   ターな含むｐＢＲ５２２である、特許請求の範囲第１０
   項記載の方法。 α２　工ＦＮ−ｇまたは工ＦＮ−β遺伝子ヲもむヒト遺
   伝子ＤＮＡ断片ｔファージまたはプラスミドから取り。 トリットファンプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ結合
   部位を含むように改良された大腸菌１ａｃプロモーター
   のりボゾーム結合部位に連結した成熟工ＦＨの最初のメ
   チオニンに対当するコドンの隣りを切断し１混成ｔｒｙ
   ｐ唯ａｃプロモーター１Ｌ該プラスミドを細菌に再導入
   し、該細菌を培養してインターフェロンを生産すること
   を特徴とする特許ａｈ氷の範囲第８項または第１０項記
   載の方法の誓法。