JPS60221094A - 発現ビヒクル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えＤＮＡ技術の分野、すなわち組換えＤＮ
Ａ技術で用いられる方法およびこれらの方法により得ら
れる生成物に関する。

さらに詳細には、本発明はヒト成熟白血球インタフエロ
ンのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、部分ア
ミノ酸配列Ｃｙｓ−へｌａ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｕ　−Ｖ
ａｌ　−Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−八Ｉａ　−Ｇｌｕ　−１
１ｅ　−Ｎｅｔ　−Ａｒｇ−３ｅｒを有することを特徴
とし、そして先行配列を伴なわない場合は、１６５−１
６６個のアミノ酸を有し、あるいはメチオニンが前記イ
ンタフエロンの第１番目のアミノ酸のＮ末端に結合して
いる場合は、１６６−１６７個のアミノ酸を有するポリ
ペプチドをコードする配列からなるＤＮＡ配列を含有す
ることを特徴とする複製しうる発現ビヒクルに関する。

本発明の背景についてまず記載する。ヒト白血球インタ
フエロン（ＬｅｌＦ）は、最初、ｌ５ａａｃｓおよびＬ
ｉｎｄｅｎｍａｎｎにより、きわめて粗な沈殿物として
、発見されそして調製された（Ｐｒｏｃ、Ｒ，Ｓｏｃ。

８１４７．２５８−２６７　（１９５７）：ｔｌ、Ｓ、
Ｐ。

３，６９９，２２２）。それを精製し特徴づける努力は
長く続りられ、正常または白血病の提供者から得た白血
球に由来する比較的均一な白血球インタフエロンの調製
にみちびいたくドイツ特許公報Ｎα２．９４７，１３４
）。これらのインタフエロンは、それらの標的１胞にウ
ィルス抵抗性の状態を付与する能ツノを有することの知
られている一群の蛋白質である。さらに、インクフエロ
ンは、細胞の増殖を阻止しそして免疫反応を調節するよ
うに作用しつる。これらの性質から、ウィルスの感染お
よび悪性腫瘍の治療に白血球インタノエロンを臨床的に
用いることが促進された。

白血球インタフエロンは、本質的に均一な状態に精製さ
れ（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７６、６４０−６４４　（１９７９）　：
ｚｏｏｎ等、同上、７６．５６０１−５６０５　（１９
７９））約１７，５００から約２１．０００の範囲の分
子量を右すると報告された。これらの調製物の比活性は
、きわめて高く、２ｘ１０８から１×１０９単位／■蛋
白質であるが、細胞培養法よりの収量はおそろしく低い
。しかし、蛋白質の配列をきめる技術の進歩で、部分的
アミノ酸配列が決定サレタ〔１０００等、５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２０７．５２７（１９８０）：Ｌｅｖｙ等、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ　。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７７．５１０２−５１０４　（１９８０）
）。

種々の白血球インクフエロンのグリコジル化は、現在完
全には明らかでないが、種類間におけるグリコジル化の
差のみでは、観察されている分子量の分布を説明しえな
い。その代わりに、白血球インクフエロンは、種類に従
いアミノ酸組成および配列において著しく差があり、ア
ミノ酸の相同性は、場合により８０％Ｊ：り低い。

提供者の白血球よりの分離で部分的な特徴付けおよび限
定された臨床的研究のための十分な量の、均一な白血球
インタフエロンを与えた番プれども、それだけでは、大
規模な臨床試験および広範な予防的および（または）治
療的使用に必要であるインタフエロンを提供するにはま
ったく不十分である。まさに、ヒト白血球由来のインタ
フエロンを抗腫瘍および抗ウィルスに用いる現在の臨床
試験では、粗く１％より低い）調整物を用いており、実
際的でない価格においてすら十分な量を生産するに至ら
ず、広範な領域での研究を遅らせて来た。

しかし、組換えＤＮＡ技術の出現にともなって、有用な
ポリペプチドのぎわめて多様な種類を、微生物により調
節生産することが可能になった。すでに、この技術によ
り修飾をうけて、ソマトスタチン、ヒトインシュリンの
ＡおよびＢ鎖およびヒト生長ホルモンのようなポリペプ
チド鎖を生産することが可能となった細菌が存在するに
至っている。

（Ｉｔａｋｕｒａ等、５ｃｉｅｎｃｅ　１９８．１０５
６−１０６３　（１９７７）：Ｇｏｃｄｄｅｌ等、Ｎａ
ｔＬＩｒｅ２８１．５４４−５４８　（１９７９））。

より最近になって、１］換えＤＮＡ技術が、プロインシ
ュリンおよびチモシンアルファ−１の生産を可能とし、
さらに、なん人かの著者は、ヒト白血球インクフエロン
をコードするＤＮＡの採取および、その結里得られる一
白面佳インＩｊ７エロン活性を右する蛋白質の生成につ
いて報告している（　Ｎａ（Ｉａｔａ等、Ｎａｔｕｒｅ
２８４，３１６−３２０　（１９８０）；Ｎａｎｔｅｉ
等、Ｇｅｎｅｌｏ、１−１０　（１９８０）：ｒａｎ＋
ｇｕｃｈｒ等、Ｎａｔｕｒｅ２８５　、５４７−５４９
（１９８０））。

組換えＤＮＡ技術の工作室は、細菌および他の微生物に
存在し、しばしば、細胞中に多数のコピーとして存在す
る、２重鎮ＤＮＡの非染色体性のループである、プラス
ミドである。プラスミドＤＮＡ中にコードされる情報に
は、娘細胞中にプラスミドを再生産するに必要な情報（
つまり、“レプリコン″）および、そして、ふつうは、
１種または１種より多くの選択特性、たとえば、細菌の
場合では、抗生物質に対する抵抗性の情報がある。この
情報により、対象とするプラスミドを含有する宿主細胞
のクローンを認識し、選択用の培地中に優先的に発育さ
すことが可能となる。プラスミドが有用なのは、プラス
ミドＤＮＡ上の異なる部位をそれぞれに認識する、ある
種類または別の種類の制限エンドヌクレアーゼまたは’
　Ｉｌ、ＩＪ　Ｉｌｊ！酸素″により、プラスミドが特
異的に切断されつるということである。そのあとで、切
断部位の両端か、切断部位に接して再構築した末端をむ
すびあわすことにより、異質の遺伝子または遺伝子断片
をプラスミド中に挿入しうる。ＤＮＡの組換えは、細胞
の外部で実施しうるが、生成する組換え″プラスミドは
、形質転換と称される方法により細胞内に導入され、そ
の転換細胞を発育ざずことにより、異質の遺伝子を含有
する組換えプラスミドを大量に生産しうる。さらに、そ
の異質遺伝子が、プラスミド内のコードされるＤＮＡ情
報の転写および翻訳を支配する部分に関して正しく挿入
されるならば、生成する発現ビヒクルは、挿入された遺
伝子のコードするポリペプチド配列を実際の生成つまり
発現と称されるプロセスに実際に使用されうる。

発現は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されそれが結合
する、プロモーターとして知られる領域において開始さ
れる。ある場合には、たとえば、本発明の実施において
有利とされるトリプトファンまたはｔｒｐ”プロモータ
ーのような場合には、プロモーター領域には、“′オペ
レーター″領域が重なり、結合された、プロモーター−
オペレーターとなっている。オペレーターは、特定のプ
ロモーターにおける転写開始の瀕度を調節する役割をす
る、いわゆるリプレッサー蛋白質により認識されるＤＮ
Ａ配列である。ＲＮＡボリメラ−１は、ＤＮＡに沿って
移動し、コード配列に含まれる情報を、その５′末端か
ら３′末端へと、メツセンジャーＲＮＡに転写し、つい
でそれは、ＤＮＡのコードするアミノ酸配列を有するポ
リペプチドへと翻訳される。それぞれのアミノ酸は、ヌ
クレオチドトリプレットまたは“コドン″によりコード
される。これらは、本発明の目的に関連して゛構造遺伝
子″と称される部分、つまり、発現される生成物のアミ
ノ酸配列をコードする部分に存在する。プロモーターに
結合したあと、ＲＮＡポリメラーゼは、まず、リボシー
、ム結合部位をフードするヌクレオチドを転写し、つい
で、翻訳開始またはパ開始シグナル″（ふつうはＡＴＧ
で、得られるメツセンジャＲＮＡではＡＬＪＧとなる）
を、ついで、構Ｂ　１仏子自体に存在するヌクレオチド
コドンを転写する。構造遺伝子の端においていわゆる停
止コドンが転写される。そのあとは、ポリメラーゼが、
メツセンジＡ７−　ＲＮΔの付加配列を形成することが
あっても、停止シグナルが存在するので、リボゾームに
より翻訳されないままとなる。

リボゾームは、ふつう、ｍＲＮＡが形成されつつある細
菌においてはメツセンジャーＲＮＡ上にある特定の接合
部位に結合する。そして、翻訳の開始シグナルに始まり
、前記した停止したシグナルで終了する、コードされた
ポリペプチドを生ずる。

リボゾーム結合部位をコードする配列が、ＡＵＧ開始コ
ドンに関して適切に位置し、そして、残りのコドンのす
べてが、インフェース（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）に開始コド
ンに従うならば、所望の生成物が生産される。得られた
生成物は、宿主細胞を融解させ、適当な精製法により他
の細菌蛋白質より生成物を採取することによりうること
ができる。

我々は、組換えＤＮＡ技術（つまり、インタフエロン遺
伝子を微生物発現どヒクルに挿入し、微生物遺伝子調節
要素の制御下にそれらを発現させること）の利用が、大
量の白血球インフェースを提供するもつとも有効な方法
と考えた。それは、ヒト由来の材料に特徴的なグリコジ
ル化の特性を欠如する番ノれども、広範囲に及びウィル
スおよび新生物による病気の治療に用いられるであろう
。

本発明の第１の白面法遺伝子を採取する方法は次の各段
階からなる。

（１）　均一な状態に精製されたヒト白血球インフェー
スの部分アミノ酸配列を用いて、部分アミノ酸配列をコ
ードしうる、可能なヌクレオチドの組合わせのすべてを
表わす、集合体としてのコドンを含む、合成りＮＡプロ
ーブのセットを描成づる。

（２）　誘導されたメツセンジャーＲＮＡがら相補ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）を含有する細菌コロニーバンクを調製す
る。放射ラベルされた別の誘導ｍＲＮＡを、このバンク
からのプラスミドＣＤＮＡとバイブリドとする。バイブ
リドとじたｍＲＮＡを溶出し、卵母細胞分析でインクフ
エロンへの翻訳について試験する。このようにして、イ
ンタフエロン活性を誘導することが示された］口二一よ
りのプラスミドＤＮＡを、上記（１）のように製造した
プローブに対するバイブリド形成について試験する。

（３）　上記（２）の工程と平行して、プラスミド中の
誘導されたｍＲＮＡに由来するｃＤ　Ｎ　Ａ　を用いて
、別の形質転換コロニーバンクを用意する。（１）のプ
ローブをバイブリド化プローブとして用いるための放射
ラベル１木鎖ｃＤ　Ｎ　Ａの合成を誘起するのに用いた
。合成プローブは鋳型としての誘導ｎ１ＲＮＡとバイブ
リドを形成し、逆転写により拡大されて、１６された、
放射ラベルｃＤ　Ｎ　Ａを形成する。このようにして得
られた放射ラベルｃＤＮＡに対してバイブリド化された
コロニーバンクよりのりＯ−ンについてさらに調べて、
完全長のインタフエロンコード遺伝子の存在を確かめる
。（１）また（２）で得られる部分長の推定される遺伝
子断片も、それら自体、完全長遺伝子のプローブに用い
うる。

（４）　上記に得られた完全長遺伝子は、成熟ポリペプ
チドの微生物による発現を妨げるかも知れないリーダ（
１ｅａｄｅｒ）配列があれば、それを除き、そして、微
生物プロモーターの開始シグナルおよびリボゾーム結合
部位に関して、発現ビヒクル中に適当に位置することを
可能とするように、合成りＮＡを用いて、仕立上げられ
た。発現されたインタフエロンは精製して、その特性を
確認し、活性を測定する。

（５）上記の方法で調製したインクフエロン遺伝子断片
それ自体は、他の部分的に相同な白血球インクフエロン
種の、バイブリド化によるプローブに用いられる。

上記に概要を示したＩ挽えＤＮＡ技術を応用することに
より、相当する先行配列またはその一部分を本質的にと
もなわな（＼、成熟ポリペプチドとしての１群の相同的
な白血球インクフエロン（グリコジル化されていない）
を、高収量、高純疫で、微生物的に生産することが可能
となった。これらのインタフエ臼ンは、動物およびヒ］
〜のウィルスおよび悪性腫瘍疾忠に用いるに適当なレベ
ルまで、直接発現させ、採取し、そして精製することが
できる。このように発現された、１群のインタフエロン
はイン　ビトロ試験で有効であることが示され、そして
、微生物的に生産された最初の白血球インタフエロンと
して、イン　ビボの試験でも、始めて、有効なことが示
されたのである。

本明細書中で用いられる゛′成熟白血球インタフエロン
°″の用語は、グリコジル基を欠如する、微生物的（た
とえば、細菌的に）生産されるインクフエロンを意味す
る。本発明の成熟白血球インクノエロンは天然生成物の
第１のアミノ酸コドンのすぐ前にある翻訳開始シグナル
（ＡＴＧ）より直ちに発現される。従って、この“成熟
″ポリペプチドはその配列中に第１のアミノ酸としてメ
チオニン（ＡＴＧがコードする）を含有ブるが、本質的
にその特性は影響されない。他方、微生物宿主（よ翻訳
生成物を加工して、最初のメチオニンを除きつる。成熟
白血球インタフエロンは、通常のリーダー以外の接合蛋
白質と一緒に発現されつるが、この接合物は、細胞外ま
たは細胞内の環境において特異的に除去しうる（英国特
許公報 Ｎα２００７６７６Ａをみよ〉。最後に、成熟インクフ
エロンは、接合物を細胞壁まで輸送する、微生物゛シグ
ナル″ペプチドとの接合物として生産されうる。細胞壁
においてシグナルは処理してはづされ、成熟ポリペプチ
ドが分泌される。

成熟白血球インタフエロンの°′発現″とは、ヒト白血
球インタノエロンゲノムのｍＲＮＡ１ｌ訳に直接に結果
する、グリコジル基または先行配列を含有しないインク
フエロン分子の細菌または伯の微生物による生産を意味
する。

特定の白血球インクフエロン蛋白質は、ここでは、決定
されたＤＮＡ遺伝子（表２および表４）および演綽的に
定められるアミノ酸配列（表３および表５）により定義
される。これらの特定のインタフエロン、実際ここに含
まれるすべての群の白血球インタフエロンタンパク質に
対して、天然の′対立遺伝子変異（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖ
ａｒｉａｔｉｏｎ　）が存在し、個体間にもおこりうる
。これらの変異は、配列全体にお（プるアミノ酸の相異
または、配列中のアミノ酸の欠落、置き代え、挿入、反
転または追加として表われる。本明細書で対象とする各
インクフエロン、標示されたＬｅｌＦ　ＡからＬｅＩＦ
　Ｊについて、そのような、対立遺伝子変異は、標示の
範囲内または、その定義内に含まれ、従って、本発明の
範囲内に含まれるとする。

つぎに、表および図について説明する。

表　１ ■） タンパク質　Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｒ
ｇ相補　３’　ＣＴＴ　ＴＡＧ　ＴＡＣＧＣ（ＤＮＡプ
ライマー　■ トリフ０シンペフ０チド（丁−１３） −−−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｇｌｎ−−−
表　３ ＡＩｌ　ＥＥＦＤ　ＱＦｑＫＡ　Ｉ　ＶＬＨＥ　！ＩＩ
Ｑ　ＦＮ１４　Ｔ１０　２０　３０　４０ ！ＳＡ　ＬＬ　Ｆ　ＥＬＱｑｊＱＤＥ　Ｑ」」」ｊｕ　
（７００００匡ＬＬ匡匡ヒいののり（ト）　２２２工２
　Ｍ　Ｍ　ｙソｙエエエエエ（！ｌ　Ｃ５Ｃ！５　（！
５　（！１１　０ＬＪ　ＬＬＩ　ＬＡＪ　ＬＡＪトトト
ｌ−）−＋００　Ｃ１０」」」ｊ　ｊ、−ｎ　（ｊ　Ｃ
Ｊ　ＣＪ　Ｌ）　＋ｊ　乙乙龜龜（Ｌ　）：３３１ズΦ
ｃ５００ロ　匡匡」匡−＋　＜＜＜＜＜〉」」」」　Ｏ
Ｉｊ、ＩＯαα　＜　＜　＜　＜　＜」」」ｊ　ｊ　Ｌ
）（Ｊ　Ｌ）Ｌ）（Ｊ　、Ｊ　ｊ　」」」＞＞　＞　＞
　＞　（／ｌ噴ｔ／＞りり　２２２２２」＞　」」ｊ　
ＬＬ　ＬＬ　１．ＬＬＬＬＬ　ＬＬＬＬＬＬＬ匡）−ｃ
Ｌ（１）　Ｃ／ｌの　＜＜＜＜ロ　」ｕ　、Ｊ　、Ｊ　
、Ｊ」」」ズ」　」ΣＪ　Ｊ　Ｊ　：＞　：＞　：＞　
））＜＜＜　＜　（」ｕ　」」」Ｑ＋ｔ／ｌ　ｔ／ｌに
）噴−ΣΣΣΣΣ　ΣΣＨｗ　＋　＋　ｗ　ｍ＋　＋＋
＋　＋く工Ｈ＋′）Ｏく工Ｈつυ　く工Ｈつ０」」」」
」 トヒトトＩ−ＬＩＪＯＯＯＯ ロピＣピ○ピ０とＣピ　υ１ＣピＣピＣピＯピＣｒ０Ｃ
ｒＣ７０匡■γＣピα ＬＬＬＬＬＬＬＬ　」」」」」 Ｘド２：１−と　（イ）γＨ口匡 ｙｙｙｙン　ＩＱ　１１１　ｙ’ｓとＳどｙＯピＣピＯ
と０と０１：　０００＞と０（’Ｊ　＞　＞　＞　＞　
＞　ｊ　」」」」＜　＜　＜　＜　＜　ｚ　ｚ　ｚ　ｚ
　ｚｊ　」ｊ　」」）−）−）−）−１− ψに）の匡り　」匡匡匡匡 ０００　Ｃ１０Ｌ／）　Ｃ／）　ｌ／ｌ　Ｍ　Ｌ／ＩＬ
ＩＪ田ＬＩＪＩＪＪ１）　匡」１」匡」ｙｚｚｚｚ　ｔ
／１ψのりめ ΣΣΣΣΣ　Ｉｊ′１ααααα 、、Ｊ　ｊ　」」、、Ｊ　ΣΣΣΣΣ ）−）−）−）−）−日田ＬＬＩ　ＬＩＪ　ＬＩＪＬＬ
Ｉｌ、ＬＩＬＡＪＬＩＪＬＩＪ＜＜＜＜＜）−ＬＩＪ　
ＬＩＪ　’ｗｅ　ＬＩＪ　ααααα〉〉Σ＞　＞　＞
　＞　＞　＞　＞ ΦΦΦ（ｊ　（ｊ　＞　＞　＞　＞　＞〉〉〉〉〉ＩＪ
ＪＬＬＩｌ、ＬＩＬＩＪ−ＣＪ　Ｌ）　（Ｊ　ＣＪ　（
Ｊ　ｔ／）　ｔ／）　ｔ／ｌのの＜　＜　＜　＜　＜　
＞　＞　＞　＞　＞１、ＬＪＬｌ、ＩＬＡ、ＩＬＩＪｌ
）　ンゾゾゾ×、Ｊ　」」」」　ゾ’ｌ　ｙ’ｌα ＯＯ２の０ＬＬＩＬＬＪ１．ＬＪＬＡＪＬＩＪｚｚｚｚ
２　ｙΣＩ−ΣＨ く工Ｈ１″）Ｏく工ｔ−１”’）　Ｌ）表１は、Ｔ−１
およびＴ−１３と称される、ヒト白血球より分離されそ
して均一に精製された、７ベでの種類のインフェースに
共通の２つのアミノ酸配列を示Ｊ。これらのペプチドを
コードする可能なｍＲＮ　Ａ配列のすべておよび対応す
るＤＮＡ配列を示Ｊ−０Δ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵの文字
は、それぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシン
およびウラシルの塩基を含有するヌクレオチドを示す。

文字Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｇ。

ＣおよびＵのいずれかを示す。ポリヌクレオチドは、５
′　（左側）から３′　（右側）の方向に読むように記
載されてれいる。そして、２重鎖（“’ｄ、ｓ、”　）
　Ｄ　Ｎ　Ａを示す時には、下側または非コード鎖につ
いては、順序は逆となる。第１図は、可能性のあるＬｅ
Ｉｆ’プラスミドと３２ｐ−ラベル合成デオキシオリゴ
ヌクレＡチドとのバイブリド化を示ずオートラジオグラ
ムである。

第２表は、それぞれ、“Ａ″から’　ｌ−１”までの記
号をイ」されている、白血球インフェースの発現のため
に候補として分離された８個の遺伝子断片のヌクレオチ
ド配列（コード鎖）を示Ｊ、それぞれのＬｅｌＦについ
て、ＡＴＧの翻訳開始コドンおよび終止トリプレットが
下線で示されている。停止コドンまたは終止コドンに続
いて３′の未翻訳領域が示されている。含まれているＬ
ｅｌＦ　への全道伝子長には、表２の第３列Ａラインに
示されｈるように、他のコドンには存在づ−るひとつの
コドンが欠如している。５′非翻訳域がリーダー配列に
先行している。分離したままの断片Ｅには、リーダーの
完全な先行配列は存在しない。しかし、仮定される成熟
ＬｅｌＦ　Ｅに対する全遺伝子を含有する。

分離されたままの断片Ｇは、コード配列が完全でない。

表３では、ヌクレオチド配列より示される８個のＬｅＥ
Ｆ蛋白質配列を比較している。ＩｔｌＰＡＣ−ｔ、ｔ１
８ＣＯｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅの提案による１文字省略
が用いられている。つまり、アラニンはＡで、システィ
ンはＣで、アスパラギン酸はＤで、グルタミン酸はＥで
、フェニルアラニンはＦで、グリシンはＧで、ヒスチジ
ンはＨで、イソロイシンはＩで、リジンはＫで、ロイシ
ンは１−で、メヂオニンはＭで、アスパラギンはＮで、
プロリンはＰで、グルタミンはＱで、アルギニンはＲで
、セリンはＳ１スレオニンは王で、バリンはＶで、トリ
プトファンはＷで、チロシンはＹで表わす。数はアミノ
酸の位置を示す。Ｓはシグナルペプチドを示ず。１６５
個のアミノ酸配列であるＬｃｌＦ　Ａ配列中の４４位の
ダッシュは、このＬｅｌＦ　Ａ配列を伯のＬｃｌＦの１
６６個のアミノ酸配列と一列にそろえるために入れであ
る。ＬｅｌＦ　Ｅの配列は、そのコード領域の余分のヌ
クレオチド（表２の位置１８７）を無視して定められて
いる。星印は、インフェースにある終止コドンを示す。

づべてのＬ１３１Ｆに共通のアミノ酸（プソイド遺伝子
ＬｅｌＦ　Ｅを除く）もまた示されている。アンダーラ
インした残基は、ヒト線維芽インタフエロンにも存在す
るアミノ酸である。

第２図は、ＬｅｌＦクローン化ＣＤ　Ｎ　Ａの８個の型
（Ａから１１まで）の制限エンドヌクレアーゼ地図を示
す。バイブリドプラスミドは、ｄＣ：　ｄＧプーリング
法（Ｇｏｃｄｄｅ　ｌ　、　Ｄ、　Ｖ、等、Ｎａｔｕｒ
ｅ２８７　、４１１−４１６（１９８０））により構築
された。

それで、ＣＤＮＡ挿入物は、Ｐｓｔ　■を用いて切断し
うる。各ＣＤＮＡ挿入物の末端のラインは、側面に接す
るホモ重合ｄＣ：ｄＧテールを示ず。Ｐｖｕｌ［。

ＥｃｏＲＩおよびＢＩＪＩ　［の制限部位も示しである
。濃い領域は成熟ＬｅｌＦのコード配列を示づ。斜線の
部分はシグナルペプチドコード配列である。白い部分は
３′および５′非コ一ド配列である。

第３図は、成熟ＬｅｌＦ　Ａの直接的微生物合成を」−
ドする遺伝子の構築を示す。制限部位および残部が示さ
れている（“’ＰｓｔＩ”等）。“’ｂ、ｐ、”は塩基
対を示す。

第４図および第５図は、ＬｅＩＦ　Ｂ成熟白血球インフ
ェースを発現するに用いられる２つの遺伝子断片の制限
地図を示す。示したコドン配列・は、示した２つの場合
について制限酵素Ｓａｕ　３　ａで消化することで生成
するコード鎖末端である。

表４および表５は、タイプＩおよびＪを含めた、５個の
ＬｅｌＦ蛋白質の配列のＤＮＡおよびアミノ酸（省略符
号については、第３表に同じ）を示す。

第５表において、星印は対応するＤＮＡ配列にお（）る
終止］トンを示し、ハイフェンは配列にお１ノる欠落ま
たはギＶツブを示す。

つぎに、本発明を実施Ｊ−るための右利な具体例を示す
。

八　使用微生物 記載した実施においては、２種の微生物、つまり、υ、
Ｓ、Ｐ、４．１９０．４９５記載の［、Ｃ０１ｉＸ１７
７６およびＥ、ｃｏｌｉに−１２２９４株〈エンド八、
　ｔｌ＋ｉ−、ｈｓｒ−、ｈｓｍ＋、英国特許公報ＮＱ
ハ ２０５５３８２に記載）を用いている。それぞれ、ｔｌ
＋ｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｃ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣＮα３１５
３７および３１４４．６がイーされている。組換えＤＮ
Ａの実験のりべては、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔ
ｕｔｅ　ｏｆ　１ｌｃａｌｔｈの該当するガイドライン
に従って実施された。

本発明のもつとも有利な具体例は、上記定義の菌株Ｅ、
ｃｏｌｉｘ　１７７６および［、Ｃ０Ｉｉに一１２菌株
２９４のみならず、他の既知のＥ、ｃｏｌｉ株たとえば
Ｅ、Ｃ０１ｉ　Ｂを含めたＥ、ｃｏｌｉおよび他の微生
物株に関連して記載してゆくが、これらの多くは、ｔｈ
ｅ＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ　（八ＴＣＣ）のような、知られてい
る微生物寄託施設に寄託され−（おり入手可能である。

ドイツ特許２６４４４３″２もみられたい。これらの他
の微生物には、ＢａｃｉｌｌｕｓたとえばＢａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓおよび仙の腸内細菌たとえばＳ
ａｌｍＯｎｅｌｌａ　ｔｙｐｌ）ｉｍｕｒｉｕｍおにび
５ｅｒｒａｔｉｄ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓがあり、異質
遺伝子配列を発現しうる、複製しつるプラスミドを使用
する。酵母たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅもまた、酵母プロモーターの制御下に
、インタフエロンをコードする遺伝子を発現させること
によるインタフエロン蛋白質の製造に用いて有利であり
うる。

Ｂ、　’　Ｌａ１Ｆ　ｍＲＮ　Ａの原料および精製Ｌｅ
ＩＦ　ｍＲＮ　Ａは、ヒト白血球より採取しうる。

ふつうは、ドイツ特許ＮＱ２９４７１３４に記載のよう
に、５ｅｎｄａ　ｉウィルスまたはＮｅｗｃａｓｔｌｅ
病ウィルスでインタフエロンを生産するように誘導した
慢性骨ずい性白血病患省の白血球より得たものを使用す
る。特に右利な、本明細書の仕事に用いられる原料は、
急性骨ずい性白血病の１患者に由来Ｊ−るにＧ−１と称
するセルラインである。このセルラインは、にｏｅｆｆ
　ｌｅｒ、　Ｉｔ、　Ｐ、およびＧｏ　Ｉｄｅ、　Ｄ、
　Ｗ、　。

５ｃｉｅｎｃｅ　２００．１１５３　（１９７８）に記
載されティるように、ｎｐ旧（ｌｉｏｓａｗａｌｌ　Ｐ
ａｒｋ　ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　＞　１
６４０プラス１０％熱不活化ＦＣ３（牛胎児血清）、２
５ｍＨ肝ＰＥ５Ｍ１ｊ液（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−
ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）および５０
μ９／Ｉｄのゲンタマイシン含有培地に容易に発育し、
１週間に２度、継代培養（１から３スプリツト）しうる
。

上記の発育培地に１０％ジメチルスルホキザイドを加え
て、細胞は凍結させうる。ＫＧ−１は、ｔｈｅ八ｍへｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ　（八ＴＣＣＮＩｌｃＲＬ８０３１）に寄託され
ている。

ＫＧ−Ｉ　Ｍｌ胞は、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ等記載の方
法（ＰｒＯＣ。

Ｈａｔ　Ｉ　、へｃａｄ、ｓｃｉ、Ｉ１．ｓ、八、７６
、　６４０−６４４（１９７９））により、５Ｏｎｄａ
　ｉまたはＮｃｗｃａｓｔｌｅを生産するように誘導さ
れた。細胞は、誘導後５時間に採取しＲＮＡを、グアニ
ジンヂオシアネ−１・−グアニジン塩酸塩法（Ｃｈｉｒ
ｇｗｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｉｙ±８．５２９４
−５２９９（１９７９））により調製した。誘導しない
細胞からのＲＮＡも同様に調製した。オリゴデオキシチ
ミジン（ｄＴ）−セルローズク日７トグラフイーおよび
スクロースグラジェント超遠心を用いて、ポリ（Ａ）ｍ
ＲＮＡの１２８分画を得た。方法は、Ｇｒｅｅｎ　等　
（八ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、１　７
　２　、　７４−８９　（１９７６））および０ｋｕｙ
ｕ＋＋＋ａ等（八ｒｃｌｔＢｉｏｃｈｅＩ１１．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　１８８　、９８−１０４（１９７８））の
方法を用いた。このｍＲＮＡは、アフリカッメガエル卵
母細胞分析（（ａｙａＩ　ｉｅｒ　ｉ等、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、７４．３２８
７−３２９１　（１９７７））で８０００−１０．００
０単位／マイクログラムのインタフエロンタイターを示
す。

Ｃ３ＬｅｌＦ　ｃＤ　Ｎ　Ａ配列を含有づるコロニーバ
ンクの調製 ５μグのＩＲＮ　Ａを用い、標準方法（Ｗｉｃｋｅｎｓ
等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５３．２４８３−２４
９５（１９７８）おにびＧｏｃｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ２８１　。

５４４−５４８　（１９７９））により、２重鎖ＣＤ　
Ｎ　Ａ　ｆｉ：調製した。ｃＤＮＡは６％ポリアクリル
アミドゲル上での電気泳動により、大きさに従って分画
し、５００から１５００ｂ、ｐ、の大きさの材料２３　
Ｏｒ＋ｏを、電気溶出により得た。このｃＤＮＡの１０
０１１ｉＪ分を、デオキシシチジン（ｄＣ）残基Ｆ　チ
ー　’）　＞グしく　Ｃｈａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ２７
５　。

６１７−６２４　（７９７８ン、Ｐｓｔ　１部位におい
てデオキシグアノシン（ｄＧ）残塁でテーリング（ｔａ
ｉｌｉｎｇ　）　Ｌ、ｔた４７０ｎａのプラスミドｐＢ
Ｒ３２２とアニーリングしくＢｏｌｉｖａｒ等、Ｇｅｎ
ｅ、７　。

９５−１１３　（１９７７）＞、これを用いて、Ｅ、ｃ
ｏｌｉｘ　１７７６を形質転換した。ＣＤ　Ｎ　Ａ　ｎ
Ｑについて約１３０個のテトラサイクリン抵抗性で、ア
ンピシリン感受性の形質転換株を得た。

第２の同様の実験では、ｃＤＮＡｎＯについて、約１０
００個のテトラサイクリン抵抗性で、アンピシリン感受
性のＥ、ｃｏｌｉに一１２株２９４の転換株を得た。こ
の場合、６００から１３００ｂ、Ｉｌ、の範囲の、サイ
ズにより分画したｃＤＮＡＩ料を、電気溶出により採取
し、ｄＣでテーリングするのに用いた。

０、　合成オリゴヌクレオチドの調製およびその使用 ヒト白血球インクフエロンのいくつかのトリプシン分解
断片のアミノ酸配列についての知見は、ＬｅｌＦ　ｍＲ
Ｎ　Ａの種々の領域に対して相補的な合成デオキシオリ
ゴヌクレオチドのデザインを可能とした。２つのトリプ
シンペプチドＴ　１４３よびＴ１３を選んだ。その理由
は、それらのアミノ酸配列は、すべての可能なコード配
列（表１）を説明するのに、１２個および４個のウンデ
カマーを合成するだけですむからである。それぞれの配
列について、４組のデオキシオリゴメクレオチドプロー
ブを合成した。つまり各々三つ（Ｔ−ＩＡ。

Ｂ、Ｃ，Ｄ）または一つ（Ｔ−１３Ａ、Ｂ、Ｃ。

Ｄ）のＡリボヌクレオチドを含有Ｊる。示した相補的デ
オキシオリゴヌクレオチド１１塩基鎖艮は、ホスホトリ
エステル法で化学的に合成した（Ｃｒｅａ等、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ　ｌ　、へｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、へ　７
ＦΣ、５．７６５−５７６９　（１９７８））。■−１
３シリーズでは、４個の個々のプローブを調製した。表
１に示すにうに、３個のプローブの４プールとして、１
２個のＴ−１プローブを調製した。

Ｔ−１３シリーズゝの４個のそれぞれのプローブおよび
各３個のプライマーの４プールとして調製した１２個の
Ｔ−１プローブを、バイブリド化１０−ブに用いるため
の放射ラベル１重鎖ＣＤ　Ｎ　Ａの合成を誘導するため
に用いた。詩聖ｍＲＮ　Ａは、センダイ誘導ＫＧ−１細
Ｉｌｌ　（８０００単位ＩＦｇ性／μび）からの１２Ｓ
ＲＮＡまたは非誘導白血球（〈１Ｃ単位／μ９）に由来
する全ポリ（Ａ＞ｍＲＮＡである。３２ｐ−ラベルｃＤ
ＮＡを、既知の反応条件（Ｎｏｙｅｓ等、Ｐｒ０Ｃ，Ｎ
ａｔｌ、八ｃａｄ、　ｓｃ　ｉ　。

ｔｌ、ｓ、Ａ、７６．１７７０−１７７４　（１９７９
））を用いて、これらのプライマーより調製した。

２０１１８　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　（ｐＨ８，３＞　、
２０１ＩＩＨＫＣＩ、　８ｎ＋ＨＨｏＣＩ２．３０ｍＨ
β−メルカプトエタノール中で６０μｍ容最の反応をお
こなった。この反応は、各プライマーの１μｇ（つまり
、Ｔ−１シリースについては、全部で１２μｙ、Ｔ−１
３シリース゛については全部で４μ３ン、２μＵの“誘
導″された１２８分画ｍＲＮＡ（または、非誘導ポリ（
Ａ）ｍＲＮＡの１０μ９＞、０．５　ｍＨのｄ＾ＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、２　０　０　μＣｉ　（ａ　３２
ｐ　）　ｄＣＴＰ　（八ｍｅｒｓｈａｍ。

２−３０００Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌｅ＞および６Ｃ単位逆転
写醇索（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｉ？ｅｓｃａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。

生成物は、１０　ｄｓｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−５０カラム
上のゲル濾過により、結合されなかったラベルより分け
、７０℃で３０分間０　、３　Ｎ　Ｎａｏ＋＋ｒ処理し
、ＲＮＡを分解し、１１Ｃ１で中和した。バイブリド化
は、Ｋａ（ａｔｏｓ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ
ｅｓ。

７．１５４１−１５５２　（１９７９）記載に準じて実
施した。

Ｅ、ローン［１−［３０の０ ５００個のＥ、ｃｏｌｉに一１２株２９４形質転換株（
０項参照）のそれぞれより、プラスミドＤＮＡの１μグ
を調製するのに、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ等、ＮｕＣ１ｅ！１
ＣＡＣｉｄＳ　Ｒｅｓ、ヱ、１５１３−１５２３　（１
９７９）各 の迅速プラスミド分離操作を用いた。育Ｄ　Ｎ　Ａ試料
を変成させ、Ｋａｆａｔｏｓ等の上記引用の方法に従い
、３反復でニトロセルローズフィルター上につけた。

５００個のプラスミド試料を含有するニトロセルロース
フィルターの３組は、 ａ）プライマーのＴ−１のセラ１−でプライムされた誘
導ｃＤＮΔ。

ｂ）Ｔ−１３でプライムされた誘ｔｌｃＤＮＡおよび Ｃ）プライマーの両方のセットを用いて調製された非誘
５ＣＤＮＡとハイブリダイズした。非誘導プローブの全
体に対するよりも誘導されたｃＤ　Ｎ　ＡプＯ−ブの一
方または両方に対してより強くバイブリド化するならば
、クローンは陽性と考えた。５００個より３０個のパ陽
性″クローン（１）Ｌｌ　−１）Ｌ３０　）を選択し、
さらに分析した。

Ｆ、クローンｐ１３１−　ｐＬ３９の同定、ＬｃｌＦＴ
ｉ伝子断片を金子断片プラスミド（Ｎｏ、１０４）の分
離プローブとして３２ｐ−ラベル誘１３ｍＲＮＡ（Ｌ　
ｉ　ｌ　ｌａｎｈａｕｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　１５　、１８５８−１８６５　（１９７６））を用
いて、Ｑｐｕｎｓｔｅｉｎおよびｌｌｏｇｎｅｓｓのコ
ロニーバイブリド化法（ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾、７２．３９
６１−３９６５（１９７５））によりＥ、ｃｏｌｉｘ　
１７７６の形質転換株をスクリーニングした。非誘導細
胞よりの非ラベルｍＲＮＡを３２ｐ−ラベル調製物中に
存在り−る非誘導ｍＲＮＡと競合さすために、プローブ
に対して２００対１に混合した。ラベルされた１１ＲＮ
Ａのバイブリド化は、誘導された配列を含有するコロニ
ーに選択的に起るはづである。３つの群の形質転換株が
得られた。

（１）　コロニーの２から３％が３２ｐ−＋１ＲＮＡに
非常に強くバイブリド化した。

（ａ　１０％は、バイブリド化の程度が、上記（１）群
より著しく低かった。

（３）残りは、検出しつる程度のバイブリド化のシグナ
ルを示さなかった。

陽性のコロニー（第（１）および第（２）群）について
は、インクフエロンｍＲＮ　ＡがプラスミドＤＮＡに特
異的にバイブリド化することによる分析で、インタフエ
ロンに特異的な配列の存在について調べた。まず、テト
ラサイクリン（２０ｐ’Ｊ／ｍｌ＞、ジアミノピメリン
酸（１００μｇ／ｒｄ、）、チミジン（２０ｐｇ／ＩＩ
ｄｌ）おＪ：びｄ−ビオチン（１μグ／−）を加えたＭ
９培地の１００ｍに、６０個の強固性コロニー（第１群
）のそれぞれを個別的に発育させた。Ｍ９培地は、１リ
ツトルについて、Ｎａ　ＩＩＰＯ（６９）　、にｌｌ２
ＰＯ４（３ｇ）　、ＮａＣ１４ （０，５ｇ）みよびＮ１１４ＣＩ　（１ｇ＞を含有し、
オートクレーブしたあと、無菌Ｉ　ＨＨＱＳＯ４の１＃
Ｉｉ！および無菌０．０１ＨＣａＣ１２の１０ｄを添加
する。

１０個の培養物はプールし、Ｃｌｅｗｅｌｌ等、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９．４４２８−４４０　（１９７０
）記載のように、６個のプールよりプラスミドＩ）ＮΔ
ルイ）　ｌｌ１１１１．　ｔ−久プラスミドＩ’ＩＮＡ
プールの１０μ９は、Ｈｉｎｄｌｌｌ　テ切断し、変性
し、ＤＢＭ（ｄｉａｚｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ＋＋＋ｅｔ
ｈｙｌ　）紙に共有結合さ°せた。

誘導細胞よりの￥４製のｍＲＮ　Ａの１μびをそ才しぞ
れの濾紙にバイブリドさせた。バイブリドしな（ＸｍＲ
Ｎ　Ａは洗って除去した。特異的にｌ＼イブ１）１：さ
れたｍＲＮ　Ａは溶出し、アフリカッメガエルの卵母細
胞中で翻訳させた。この分析で、６Ｉｌｌｉｌのプール
はずべて陰性であった。偏置性のコロニー（第２群）の
５９個より、各１０コロニーの５プールと９コロニーの
１プールを調製し、それらのプールよりプラスミドを調
製し、上記のように調著しく超えるレベルで、インタフ
エロンｍＲＮＡにバイブリドした。特異的インタフエロ
ンｃＤ　Ｎ　Ａクローンを同定するために、ブ、−ルに
１０の９コロニーよりプラスミドＤＮＡを−製し、個別
的に調べた。９個のプラスミドのうち１Ｉ）２個（Ｎｏ
、１０１およびＮα１０４）がインクフエロンｗ＋ＲＮ
　Ａと、バックグラウンドレベルを十分に超えて結合し
た。プラスミドＮα１０４より、２６０ｂ、　ｐ、を含
有する、独特の８ＱＩ　Ｔｌ制限断片を分離した。これ
を、■ａｙ＋ｏｒ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、＾ｃｔａ４４２．３２４−３３０　（１９７６）の
方法により３２ｐでラベルし、その場でのコロニースク
リーニング法（ＧｒｕｎｓｔｃｉｎおよびＨｏｇｎｅｓ
ｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、八、Ｖ２．
　３９６１−３９６５　（１９７５））によりＥ、ｃｏ
ｌｉ２９４転換株の４００個を、個別的にスクリーニン
グするだめのプローブに用いた。

このプローブと種々の程度にバイブリド化する、９個の
コロニー（ｐＬ３１−ＩＬ３９　）を同定した。

さらに、ラベルされた２６０ｂ、Ｉ）、断片を用いて、
同様にして、４０００個のＥ、ｃｏｌｉ２９４転換株を
個別的にスクリーニングした。このプローブと極柱の程
良にバイブリドする５０個のコロニーを同定した。ひと
つは、ＬｅｌＦ　ＧＶＪＴ片を、ひとつは、ＬｃｌＦ　
Ｉｆ断片を、ひとつはＬｅｌＦ’ｌｌｌと称する断片（
みかけ上、ＬｅｌＦ　Ｈの対立遺伝子である）を含有し
た。生ずるバイブリドプラスミドは、ｐＬｅＴＦ１１″
等と称した。

６、最初の完全長ＬｅｌＦｍ伝子の分離および配列の　
− 全体で３９個の可能性のあるＬｅｌＦ　ｃ　ＤＮＡクロ
ーンよりプラスミドＤＮＡを調製した。そして、Ｋａｆ
ａｔＯ３等（上記引用）のバイブリド化操作により、同
じ２６０ｂ、ｔｌ、ＤＮＡプローブを用い再スクリーニ
ングした。このプローブと３個のプラスミド（ｐＬ４　
、　ｐＬ３１　、　ｐＬ３４　）は非常に強いバイブリ
ド化シグナルを与え、４個（ｐＬｌ　３　、　ｐＬ３０
　。

ｐＬ３２．ｐＬ３６）は中程度にバイブリド化し、３個
（１）Ｌ６　、１）１８　、　ＩＩＬｌ　４　）は、弱
くバイブリド化した。

３９個の可能性のあるＬｅｌＦ　ｃＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ］換
えプラスミドは、また、３２ｐ−ラベル合成ウンデカマ
ー（Ｔ−１プライマープールのそれぞれまたはＴ−１３
プライマーのそれぞれ）をじかにバイブリド化のプロー
ブに用いて検索した。検出しうるバイブリド化のシグナ
ルを与えるのに完全な塩基間の対が必要であるように、
バイブリド化の条件を選んだ（Ｗａｌｌａｃｅ等、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

β、３５４３−３５５７　（１９７９））、つまり、３
９個のクローンよりプラスミドＤＮＡを、標準上澄液法
（ｃｌｅａｒｅｄ　＋ｙｓａｔｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
、Ｃｌｅｗｅｌｌ等、−に記）で調製し、Ｂｉｏｒａｄ
　Ａｇａｒｏｓｅ＾−５０カラムクロマトグラフイーで
精製した。各調製物の試料（３μｇ）は、Ｅｃｏｌ？　
Ｉで処理して開環し、アルカリで変性させ、２枚の別々
の二］・ロセルロースフィルターにスポットした。１ス
ポツトについて１．５μｑとする。上記引用のＫａ’ｆ
ａｔＯ８等の文献をみよ。合成デオキシオリゴヌクレオ
チドプライマーおよびプライマープールのそれぞれは、
（γ３２Ｐ）ＡＴＰでつぎのようにリン酸化した。

５０　ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドおよび１００ｐ
１００ｐ　の　（７３２Ｐ　）　Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ｎｅｗ
　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、　２５００　Ｃｉ／
　ｍ　ｍｏｌｅ）を、５ＱｍＨの■四５−ＩＩｃＩ、　
１０ｍＨのＨｉＪＣ１２および１５＋＋＋Ｈのβ−メル
カプトエタノールの混合物の３０μｍ中で合併した。２
単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加し、３７℃
で３０分後２２ｐ−ラベルプライマーは、１０　ｒｒｔ
ｌ　５ｅｐｈａｄｅｘ　縣−５０カ５４上、。ウロマト
グラフイーで精製した。１１０６ｃｐのプラライ’？−
Ｔ−１３Ｃまたは３ｘ１６６ｃｐｍのプライマープール
Ｔ−ＩＣを用いてバイブリド化した。

バイブリド化は、Δａｌｌａｃｅ等の上記引用の方法に
従って、６ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝０．１５ＨＮａＣＩ
、０．０１５８　＜えん酸す１−リウム、ｐｔ＋７、２
）　、１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔｓ　（０，２％牛血ｍア
ルブミン、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％Ｆ
ｉｃｏｌｌ）溶液中で、１５℃で１４時間バイブリド化
した。フィルターは６ｘＳＳＣ中Ｏ°Ｃで５分間宛３度
洗った。乾燥し、Ｘ−線フイルムに２ さらした。結果は、第１図に、　ｐ−プライマープール
Ｔ−１３Ｇおよびプライマー−Ｔ−Ｉ　Ｃの場合につい
て示しである。

クローン１０４からのプラスミドＤＮＡは、プライマー
プールＴ−ＩＣおよびプライマーＴ−１３０と頻署にバ
イブリド化した。しかし、他のウンデカマーとは、検出
しつる程のバイブリド化は示さなかった。第１図に示す
ように、３９個の可面性のあるＬｅｌＦプラスミドのう
ちのいくらが（ｐＬ２．４，１３．１７．２０．３０，
３１゜３４）はこれらのプローブの両方とバイブリド化
した。しかし、制限分析から、これらのプラスミドのう
ちのひとつだ番ノ、１）１３１が２６０ｂ、ｐ、内部Ｂ
ｇ１　［断片をも含有した。ｐ［３１をＰｓｔ　工で消
化した結果、ＣＤＮＡ挿入物の大きさは約１０００ｂ、
ｐであった。

ｐ［３１のＰｓｔ　■挿入物全体の配列を、Ｈａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ化学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｚｙＩ
ｌｌｏｌ、　６５．　、４９９−５６０　（１９８０）
）およびジデオキシ鎖末端化方法（Ｓｍ１ｔｌ＋、Ｈｃ
ｔｌ＋ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５　、５６０−５
８０　（１９８０）’）で決定した。その際、５ａｕ３
　ａｆ！６片を８１３ベクター中にサブクローン化して
Ｊ５いた。ＤＮＡ配列は表２の′Ａ″に示しである。入
手しつる蛋白質配列についての情報、既知のｔｅｌ［分
子量の範囲、３個の可能な読み枠における停止トリプレ
ットの相対的な存在より適当な翻訳読み枠が示唆された
。それから、プレーまたはシグナルペプチドを含めてＬ
ｅｌＦアミノ酸全配列が示された。第１のＡ　Ｔ　Ｇ　
Ｉｌｌ訳聞始コドンは、配列の５′末端より６０番目の
ヌクレオチドに存在し、１８８コドンあとに、ＴＧＡ終
止トリプレットが存在する。３′末端には３４２個の非
翻訳ヌクレオチドがあり、ついでポリ（Ａ）配列がつづ
く。

仮定されるシグナルペプチド（おそらく、白血球よりの
成熟ＬｅＩｒの分泌にあづかるのであろう）は２３アミ
ノ酸長である。成熟ＬｅｌＦを構成する１６５アミノ酸
の分子量の計算値は、 １９．３９０である。我々は、この１）Ｌ３１によりコ
ードされたＬｅｌＦを“’　ＬｅｌＦ八′′へ称しｌこ
。８３の配列データ（”Ａ”）より、ＬｅｌＦ　Ｂのト
リプシンペプチドＴ１およびＴ１３は、ＬｅｌＦへの１
４５＝１４９および５７−６１にそれぞれ相当すること
が分る。これらの２つの領域に見出される実際のＤＮＡ
コード配列は、プライマープールＴＩ−Ｃおよびプライ
マー７１３−Ｃに表されるものである（表４をみよ）。

１１、成熟白血球インクフエロンＡ（ＬｅｌＦＡ）の直
接発母 ＬｅｌＦ　Ａを成熟インタフェロンポリペプチドとして
直接に発現させるための操作は、合成（Ｎ−末端）およ
び相補的ＤＮＡの組合せを包含する点でヒト生長ホルモ
ンに用いられｌｃｈ法（Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ２８１．５４４−５４８　（１９７９）の−変形であ
る。

第３図に示すように、５ａｕ３ａ制限工ンドヌクレアー
ピ部位は、便宜なことに、ＬｅｌＦへのコドン１および
３とのあいだに存在する。ＡＴＧ翻訳聞始」トンを含有
し、アミノ酸１（システィン）に対するコドンを修復し
、ＥＣ０ＲＩ粘着末端を新しく作製することを包含する
、２つの合成デオキシオリゴメクレオチドをデザインし
た。これらのオリゴ７−は、ｐ［３１の３４ｂ、ｐ、Ｓ
ａｕ　３ａ　−Ａｖａ　ＩＩ断片に連結した。生ずる４
５ｂ、ｐ、生成物は２つの追加のＤＮＡ断片に連結させ
、８６５ｂ、Ｄ、合成−天然雑種遺伝子とした。これは
、ＬｅｌＦＡをコードし、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ　Ｉ
制限部位によりはさまれている。この遺伝子は、Ｅｃｏ
Ｒ工およびＰｓｔ　■部位のあいだにおいて、ｐＢＲ３
２２に挿入し、プラスミドｐＬｅ［ＦΔ１とした。

？、トリプトファン調節要素（Ｅ、ｃｏｌｉ　ｔｒｐプ
ロモーター、オペレーターおよびｔｒｐリーダーリボゾ
ーム結合部位を含有するが翻訳開始のためのＡＴＧ配列
を欠如する）の構築 プラスミドρＧ旧は、欠失ΔＬＥ　１４１３を含有する
Ｅ、ｃｏｌｉｌ−リプトファンオペロンを担う（旧ｏｚ
ｚａｒｉ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙｌ　３３　
、１４５７−１４６６（１９７８））。それゆえに、ｔ
ｒｐリーダーの最初の６個のアミノ酸そしてｔｒｐ　Ｅ
ポリペプチドのおよそ最後の１／３（以降、あわせてＬ
Ｅ’　と称する）ならびにｔｒｐ　Ｄポリペプチドの全
体を含有する融合蛋白質を発現する。これはすべてｔｒ
ｐプロモーター−オペレーターシステムの調節下にある
。このプラスミド２０μ３を制限酵素ＰＶｕ　Ｉ［で消
化した。これは、プラスミドを５個の部位において切断
する。この遺伝子断片はついＴ−ＥｃｏＲＩ　！Ｊ　＞
　ｈ　−（＋）ＣＡＴＧＡＡＩＴＣＡＴＧ　（７）自己
相補性のオリゴヌクレオチドより成立つ）と結合させ、
アト力ら、ＥｃｏＲ工部位含有プラスミド中にクローン
化するためのＥＣＯＲＩ切断部位とする。Ｉ）Ｇ旧より
得られるＤＮＡ断片の２０μ９を、２００　ｐｍｏｌｅ
の５１−リン酸化合成オリゴヌクレオチドｐｃＡＴＧＡ
ＡＴ１ｃＡＴＧの存在で、２０μＩ　Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ緩衝液（２０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，６，０，５ｍｌ
　ＡＴＰ、　１０ｉ＋ＨＨｏＣ１２，５ｍＭジチオスレ
イトール）中で１０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼで４℃１夜
処理した。溶液はついで７０℃で１０分間加熱し、連結
を停止させた。リンカ−はＥｃｏＲＩ消化で切断し、Ｅ
ｃｏＲ■末端を有する断片を５パーセントポリアクリル
アミドゲル電気泳動（以降ＰＡＧＥと称する）を用いて
分け、大きい方の３個の断片を、エチジウムブロマイド
でまず染色し、紫外線で断片の位置を定め、ゲルより対
象となる部分を切り取る方法で分離した。各ゲル断片（
３００μｌ　０．１ｘＴＢＥ）を透析バッグに入れ、そ
して、０．１　ｘＴＢＥ緩衝１ｆｆｌ　（ＴＢＥＩＩ！
１ｉ１４．ｔｌｏ、８ＳＦのＩｒ１ｓ塩基、５．５ｇの
ホウ酸、０．０９９のＮａ２ＥＤＴＡを１リツトルの８
２０中に含有）中で１００Ｖ１時間電気泳動した。透析
バッグより水溶液を採取し、フェノール抽出、クロロホ
ルム抽出、０．２Ｍ塩化ナトリウム濃度とし、エタノー
ル沈殿復水中にＤＮＡを採取した。ＥｃｏＲ：［粘着末
端を有するｔｒｐプロモーターーーオペレーター含有遺
伝子は、つぎに記載する操作で同定した。つまり、テト
ラサイクリン感受性プラスミドに断片を挿入し、これは
、プロモーター−オペレーターの挿入で、テトラサイク
リン抵抗性とした。

プラスミドｐＢＲＨ１（ＲｏｄｒｉｇｕｅＺ等、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、旦、３２６７−３２８７
　（１９７９））は、アンピシリン抵抗性を発現しそし
て、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を含有する。しかし
、それに組合わされたプロモーターが存在しないので、
その抵抗性を発現しない。このプラスミドは従ってテト
ラサイクリン感受性である。このＥｃｏＲ工部位にプロ
モーター−オペレーターシステムを導入することにより
、プラスミドをテトラサイクリン抵抗性となしうる。

ＤＢＲＩＩＩをＥｃｏＲ：［で消化し、酵素はフェノー
ル抽出クロロホルム抽出で除去し、エタノール沈殿させ
て水中につる。別々の反応混合物中に存在する生成りＮ
Ａ分子は、上記に得られたβ個のＤＮＡ断片のそれぞれ
と合併し、そして、前記のように、■４ＤＮＡリガーピ
で連結させた。反応混合物中に存在するＤＮＡを用いて
、標準方法 （Ｉｌｅｒｓｈｆｉｅｌｃｌ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、Δｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

７１．３４５５−３４５９　（１９７４））によりＤＮ
Ａとり込み能のあるＥ、Ｃ０１ｔに一１２株２９４を形
質転換し、この細菌を、２０μ９／＃ｌｉ！のアンピシ
リンおよび５μｇ／ｌｅのテトラサイクリンを含有する
ＬＢ　（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　）プレートニ接
種した。いくつかのテトラサイクリン抵抗性コロニーを
選び、プラスミドＤＮＡを分離しそして、望む断片の存
在を制限酵素分析で確かめた。生ずるプラスミドをｐＢ
ＲＨｔｒｐと称する。

肝炎ＢのウィルスゲノムのＥｃｏＲ■およびＢａｍ１ｌ
ｌ消化生成物を常法により採取し、プラスミドｐＧ１１
６のＥｃｏＲ：［およびＢａｍ１　Ｉ部位にクローン化
しく　Ｇｏｅｄｄｃｌ等、Ｎａｔｕｒｅ２８１　、５４
４（１９７９））、プラスミドｐＨｓ　３２とする。プ
ラスミドｐＨ３３２をＸｂａ　Ｉで切断し、フェノール
抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。

沈殿は、０　、１　ｍＷ　ｄＴＴＰおよび０．１１ＩＩ
ＨｄＣＴＰを含有する３０μ！ポリメラーピ緩衝液（５
０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７，４，７ＩＩＩＨＨｇＣ１
２１ｍＨβ−メルカプトエタノール）中で、１μＩＥ、
ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■、ｘ＋ｅｎｏｗ断
片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｈａｎｎｈｅｉｍ　）で、
０℃で３０分、ついで３７℃で２時間処理した。この処
理でＸｂａ　Ｉ切断部位の５′突出末端に相補的な４個
のヌクレオチドのうちの２個がみたされる。

５’　ＣＴＡＧＡ−５’　ＣＴＡＧＡ−３’　Ｔ−ＴＣ
Ｔ− ２つのヌクレオチドｄＣおよびｄＴが組込まれて２つの
突出する５′ヌクレオチドを有する末端を与える。プラ
スミドｌｌｌｌ３３２　（フェノールおよびクロロホル
ム抽出後エタノール沈殿させて水に取る）のこの直鎖残
基を、ＥｃｏＲＩで切断した。大型プラスミド断片を、
ＰＡＧＥで、より小さいＥｃｏＲ：［−Ｘｂａ　Ｉ断片
より分け、電気溶出により分離した。ｐＨｓ　３２　（
０，２μ３）よりのこのＤＮＡ断片は、上記に類似の条
件で、ｐＢＲＨｔｒｐに由来するトリプトファンオペロ
ン（約０．０１μｇ）のＥｃｏＲＩ−Ｔａｑ　Ｉ断片に
連結した。

上記＋７）ｐＨ３３２（７）断片をＩＥｃｏＲＩ　−ｒ
ａｑ　Ｉ　ＩＦｉ片に連結するこの方法において、完全
なワトソンークリック塩基対ではないけれども、Ｔａｇ
　Ｉの突出する末端をＸｂａ　Ｉの残存する突出末端に
連結する。

この連結反応混合物の１部はＥ、ｃｏｌｉ２９４細胞の
変換に用い、熱処理し、アンピシリン含有ＬＢプレート
中に塗作した。２４個のコロニーを選択し、３　ｒｔｄ
ｌ　Ｌ　Ｂ　（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　）中で発
育させ、プラスミドを分離した。これらのコロニーのう
ちの６個が、Ｅ、ｃｏｌｉによるＤＮＡ修復および複製
により再生されたＸｂａ　Ｉ部位を有することが分った
。

一丁ＣＴＡＧＡ−＝−ＴＣＴＡＧＡ− −ＡＧＣＴＣＴ−−ＡＧＡＴＣＴ− これらのプラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＨＤａ　Ｉの
両方で切断されて、期待される制限断片を与えることも
分った。ｐｌｒｐｌ　４と称するひとつのプラスミドを
、つぎに論議するように異質のポリペプチドを発現さす
のに用いた。

プラスミドＩ）ＨＧＨＩ　Ｏ７（Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎ
ａｔＬＩｒｅ２８１．５４４　（１９７９））は、合成
りＮＡ断片より生成された２３個のアミノ酸コドンおよ
びヒト生長ホルモンメツセンジャーＲＮＡの逆転写で生
成される相補的ＤＮＡより得られる１６３個のアミノ酸
コドンより成立つヒト生長ホルモンに対する遺伝子を含
んでいる。この遺伝子は、ヒト生長ホルモンの“先行″
配列のコドンを欠如するけれども、ＡＴＣｔＪｌ訳開始
コドンを含有する。この遺伝子は、１０μｐＨＧＨ１０
７より、ＥｃｏＲＩ処理、それに続く、上記のようなＥ
、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋ１０ｎＯＷ断
片およびｄＴＩＰおよびｄＡＴＰ処理を経て分離した。

フェノールおよびクロロホルム抽出のあとエタノール沈
殿させたプラスミドをＢａＩＩＩＨｌで処理した。

ヒト生長ホルモン（ＨＧＨ）ｍ伝子含有断片は、ＰＡＧ
Ｅ、つづいて電気溶出により分離した。生ずるＤＮＡ断
片は、テトラサイクリンプロモーター−オペレーターシ
ステムを欠如するが、テトラ勺イクリン抵抗性構造遺伝
子の最初の３５０個のヌクレオチドをも含有するので、
引きつづき発現プラスミド中にクローン化したときに、
その挿入物を含有するプラスミドは、テトラサイクリン
抵抗性の回復により見定め得る。断片のＥｃｏＲ■末端
は、にＩｅｎｏｗボリメラーピ工法でみたされであるの
で、この断片は、ひとつの平滑末端（旧ｕｎｔ　ｅｎｄ
　）およびひとつの粘着末端を有する。それで、あとか
ら発現プラスミドに挿入されても正しい配向が確実にな
る。

発現プラスミドｐＴｒｐｌ　４を、ついで、上記調製の
ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｈ遺伝子含有断片を受け入れるように調製
した。すなわち、ｐＴｒｐｌ　４をＸｂａ　Ｉ消化し、
生ずる粘着性末端を、ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰｌｄＧＴＰ
およびｄＣＴＰを用いるにＩｅｎｏｗボリメラーゼ工法
でみたした。フェノールおよびクロロホルム抽出および
エタノール沈殿のあと、生ずるＤＮＡはＢａｍ　ＨＩで
処理し、生ずる大型プラスミド断片をＰＡＧＥおよび電
気溶出で分離した。ｐＴｒｐｌ　４由来の断片は１個の
切断末端および１個の粘着末端を有し、前記した１−Ｉ
　Ｇ　ｌ−１遺伝子含有断片と正しい配向で再結合覆る
ことを可能とした。

ＨＧＨ遺伝子断片とＩ）ＴｒＤｌ　４ΔＸｂａ−ＢａＩ
ｌｌＨ１断片とは、上記と類似の条件で、合併し相互に
、連結した。みたされたＸｂａ　ＩおよびＥｃｏＲＩ末
端は、平滑末端による連結で、Ｘｂａ　Ｉ部位およびＥ
ｃｏＲＩ部位の両方を再構成した。

みたされたＸｂａ　Ｉ　みたされたＥｃｏＲＩ　１ｌＧ
ＩＩ３ｉ伝子聞始Ｘｂａ　Ｉ　ＥｃｏＲＩ この構築はまたテトラサイクリン抵抗性遺伝子をも創出
する。プラスミドＥＩＨＧｔｆｌ　Ｏ７は、１−ＩＧＨ
ｉ仏子より上流に存在するプロモーター（ｌａｃプロモ
ーター）よりテトラサイクリン抵抗性を発現するので、
ｐＨＧ１１２０７と称するこの構築は、トリプトファン
プロモーター−オペレーターの調節下でのテトラサイク
リン抵抗性遺伝子の発現を可能とする。ついで、連結混
合物でＥ、ｃｏｌｉ２９４を転換し、５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含有するＬＢプレート上でコロニーを
選択した。

プラスミドｐＨＣ１１２０７はＥｃｏＲ１消化し、ｔｒ
ｐプロモーター−オペレーターおよびｔｒｐリーダーリ
ボゾーム結合部位を含有するが翻訳開始のためのＡＴＧ
配列を欠如する３００ｂ、Ｐ、断片を、ＰＡＧＥそれに
つづく電気溶出で採取した。この［）ＮＡ％片はｐＬｅ
ｌＦへのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。上記の変型
ｔｒｐレギユロン（ｒｅｏｕｔｏｎ　）（発現レベルを
高めるように調節するためにアテニュエータ配列を欠失
させたＥ、　ｃｏｌｉ　ｔｒｐオペロン）を含有する発
現プラスミドは、プロモーター−オペレーターシステム
を抑制す°るに十分量のトリプトファン添加培地にあら
かじめ定めたレベルまで発育させうる。ついで、トリプ
トファンを除去しシステムの抑制を除けば、目的とする
生成物が発現されうる。

より具体的に示すと、第３図を参照にして、２５０μ９
のプラスミドｐＬ３１をｐｓｔ　Ｉで消化し、１０００
ｂ、Ｐ、の挿入物を６％ポリアクリルアミドゲル上のゲ
ル電気泳動で分離した。約４０μ３の挿入物をゲルより
電気溶出し、３つに分けて、つぎのようにさらに消化し
た。ａ）この断片の１６μシ試料を、３７℃で４５分間
Ｂ（７１■の４０単位で部分的に消化し、反応混合物は
６％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。望む６７０
ｂ、Ｅｌ、の断片約２μグを採取した。ｂ）　１０００
　ｂ、ｐ、Ｐｓｔ　Ｉ挿入物の別の試料（８μｇ）をＡ
ｖａ　ＩｔおよびＤＩ　ＩＩで消化した。ゲル電気泳動
のあとに、上記の１５０ｂ、Ｄ、の断片１μグを得た。

Ｃ）１００　ｏｂ、ｐ。

片の１６μ９を５ａｕ３ａおよびＡｖａ　ＩＩで処理し
た。

１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動したアト、
約０．２５μ９　（１０１）ｍｏｌｅ　）の３４ｂ、ｌ
）。

断片を得た。２つの示したデオキシオリゴヌク“レオチ
ド、５　’　−ｄＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴ　（断片１）
および５　’　−ｄＧＡＴＣＡＣＡＣＡＴＧ　（断片２
）はホスホトリエステル法で合成した。断片２はつぎの
ようにリン酸２ 化した。、２００μｍ　（約４０　ｐｍｏｌｅ　）の（
７Ｐ）Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ａｍｅｒｓ１＋ａｍ、　５０００
Ｃｉ／ｍ１ｌｌｏｔｅ　）を乾燥し、５ＱｍＨのＴｒｉ
ｓ−１１ｃＩ　（ｐＨ８）　、１０ｍＭのＨｇＣｌ２．
１５　ｍＨβ−メルカプトエタノールより成立ツ、１０
０　ｐｍｏｌｅのＤＮＡ断片および２単位のＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ含有溶液３０μｍに再り濁した。３
７℃で１５分後、１μｍの１０ｍＭのＡＴＰを添加し、
反応はさらに１５分進行させた。混合物はついで７０℃
で１５分加熱し、１００　ｐｍｏｌｅの５′−〇Ｈ断片
１および１０ｐｍｏｌｅの３４　ｂ、ｔｌ、Ｓａｕ　３
　ａ　Ａｖａ　ＩＩ断片と合併した。

２０１８　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃＩ　（ａｌ１７．５）　、
１０ｍＭ）１ｏｃｌ　、１０ａｌｌジチオスレイトール
、Ｑ、５ｍＭＡＴＰおよび１０単位Ｔ　４　’Ｄ　Ｎ　
Ａリガーゼの５０μｍ中で５Ｆｉ間４℃で連結させた。

混合物ｔよ６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し
、４５ｂ、　ｐ、生成物を電気溶出で採取した。４５ｔ
１．Ｄ、生成物の３０ｎｏ　（１ｐＩＩｌｏｔｅ　）を
、１５０　ｂ、ｐ、Ａｖａ　ＩＦ　−ｈｌ　ＩＦ断片の
０．５ｕ９　（５μｍｏｌｅ　）および６７０ｂ、ｐ、
ＢｇＩ　ｎ−ｐｓｔ　Ｉ断片の１μｇ（２μｍｏｔｅ　
）と合併した。２０単位のＴ４ＤＮＡリガーぜを用いて
２０℃１６時間連結処理した。６５℃で１０分間加熱し
てリガーゼを不活化した。混合物はＥｃｏＲＩおよびＰ
ｓｔ　Ｉで消化して遺伝子の重合体を除去した。混合物
は６％ＰＡＧＥで精製した。約２０ｒ＋（Ｊ　（０，０
４ｐｍｏｌｅ　）の８６５ｂ、ｌ）、生成物を分離した
。これの半分＜１０ｎｇ）を、ｐＨ１１２２（０，３μ
ｇ）のＥｃｏＲＩおよびｐｓｔ　Ｉ部位のあいだに挿入
した。Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４を形質転換すると７０個
のテトラサイクリン抵抗性、アンピ・シリン感受性の転
換株を与えた。これらのうちの１８個からプラスミドＤ
ＮＡを分離し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ　Ｉで消化した
。１８個のプラスミドのうち、１６個が８６５ｔ１．１
）、長のＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ　Ｉｉ片を有した。

これらのうちのひとつｐＬｅｌＦ　Ａｔの１μ８をＥＣ
ＯＲＩで消化し、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｔｒｐプロモーター
およびｔｒｐリーダーリボゾーム結合部位を有する、上
記製造のような３００　ｔｌ、１１．［：Ｃ０ＲＩ断片
（０，１μｇ）に連結させた。ｔｒｐプロモーターを含
有する転換物は、ＧｒｕｎＳｔｅｉｌｌ−１＋００ｎｅ
ｓｓ　：１０　ニースクリーニング法と組合わせて、３
２Ｐｔｒｐプ日−ブを用いて同定した。ｔｒｐ断片中の
非対称的に位置しているＸｂａ　Ｉ部位は、ｔｒｐプロ
モーターが、ＬｅｌＦ　Ａ遺伝子の方向に配向している
、組換え生成物の同定を可能とした。

１、ＬｅｌＦ　ＡのインヒトＯおよびインビボ活性ＩＦ
分析のための抽出物をつぎのように調製した。培養物の
１ｍｌを５μｇ／ｄのテトラサイクリンを含有するしブ
ロス中で発育させ、Ａ３５ｏ値を約１．０とし、ついで
、５μｇ／ｄのテトラサイクリンを含有するＭ９培地２
５ｄ中に希釈した。

Ａ　５５０が１．０に達した時に１０ｍの試料を遠心採
取し、細胞塊を、１５％スクロース、５０ｍＨＴｒ　ｉ
　５−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　、５０１１１８ＥＤＴ
Ａの１１ｄ中に懸濁させた。１　ｍ９のリゾチームを添
加し、０℃５分のあと、細胞は超音波処理で破壊した。

試料は１０分間（１５，０００ｒｐｍ　：で遠心し、上
清中のインタフエロン活性を、ｌ１ｌＩ１１変性効果（
ＣＰＥ）の阻止分析により、標準ＬｅｌＦと比較して測
定した。細胞あたりのＩＦ分子数を測定するためには、
４Ｘ１０８単位／りのＬｅＩＦ比活性を用いた。

表６に示すように、ｔｒｐプロモーターを望む配向に挿
入したりＤ−ンｔｌＬｅｌＦ　Ａ　ｔｒｐ　２５は高い
活性（２，５Ｘ１０８単位／１）を示した。表７に示す
ように、Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ　−１２株２９４／　ｐＬｅ
ｌＦ　Ａｔｒｐ２５の生成するＩＦは、ヒトｔｅｌ［標
品と同様に挙動した。ｐ１１２での処理に対し安定で、
ウサギ抗ヒト白血球抗体により中和される。このインタ
フエロンの見かけの分子量は約２０，０００である。ク
ローンｐＬｅｌＦ　Ａ　ｔｒｐ　２５はアメリカンタイ
プカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されてい
る。

インクフエロンのインビボでの効果には、マクロファー
ジおよびナチュラルキラー（ＮＫ）ＩＩＩ胞が必要であ
る。そしてインビボでの作用は、これらのＩＩｌ胞の刺
激を含むようにみえる。それで、［。

ｃｏｌｔ２９４　／　Ｉ）ＬｅｌＦ　Ａ　２５により生
産されるインタフエＯンは、細胞培養の分析では抗ウィ
ルス活性を有するが、感染動物では無効である可能性が
ある。さらに、細菌より生産された、非グリコシレート
化ＬｅｌＦへのインビボ・抗ウィルス作用は、ヒト“バ
フィーコート（ｂｕＨｙ　ｃｏａｔ）　”白血球に由来
するグリコシレート化ＬｅｌＦとは異なることがありう
る。それで細菌により合成されたＬｅｌＦ八（２％純度
）の生物活性を、スクィレルモンキー（リスザル）への
致死量の脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣ）ｉ染において、バ
フィーコートＬｅｌＦ（８％純度）と比較してみた（表
８）。

表６　Ｅ、ｃｏｌｉ抽出物のインクフエロン活性コ 表７　Ｅ、ｃｏｌｔ２９４　／ｐＬｅｔＦ　Ａ　２５抽
出物と標準ＬｅＩＦ”との活性比較 本人６に記載のＥ、ｃｏｌｔ２９４　／　ｐＬｅｌＦ　
Ａ　ｔｒｐ　２５の抽出物−あたり２５０，０００単位
を、最小必須培地で５００倍希釈し、５００単位／＃Ｉ
ｉ！の比活性とした。白血球インタフエロン標準（１４
ａｄ　１ｅｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）をあらかじめＮＩＨ
白血球インタフエロン標単に対して、タイターをめて、
やは゛す５００ＬＪ／ａｔ！＋７）最終濃度に希釈シタ
。１ｄｌｆｆｌヲ１ＨＨＣＩで１）８２とし、′４℃で
５２時間インキュベートし、ＮａＯＨを添加中和し、Ｉ
Ｆ活性を標準ＣＰＥｌ１ｆｌ止分析で測定した。５００
単位／ＩＩ！１！試料（未処理）の２５μｍ分を２５μ
ｍのウサギ抗−ヒト白血球インタフエロンと３７℃で６
０分インキュベートし、１２，０００Ｘｇで５分遠心し
、上清を分析した。

表８　スクイジルモンキー（リスザル）のＥＭＣウィル
ス感染に対する種々のＬｅｌＦ調整物の抗ウイルス効果 サルはすべて雄（平均体重７１３Ｊ）で、感染前には、
ＥＭＣウィルス抗体は有しない。サルには、１００×Ｌ
Ｄ５゜ＥＭＣウィルス（マウスで測定）を筋肉内感染さ
せた。対照感染サルは、感染後１３４．１５８．１６４
時間に死亡した。

１０６単位インクフエロン処理は、感染前４時間、感染
後２．２３．２９．４８．７２．１６８および２４０時
間目に静脈内投与した。細菌性白血球インタフエロンは
、Ｅ、ｃｏｌｉ２９４　／　ＤＬｅｌＦ＾２５の融解物
よりのカラムクロマド分画で、比活性７．４Ｘ１０６単
位／り蛋白質であった。対照細菌蛋白質は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ２９４／ｐＢＲ３２２ｍＷｌ物、に。

りの相当するカラム分画で、２倍の全蛋白質聞とした。

白血球インクフエロン標準は、クロントゲラフイーで、
３２×１０６単位／■蛋白質の比活性に精製した、正常
のヒトバッフイーコート″細胞よりの５ｅｎｄａ　ｉウ
ィルス誘導インタフ１０ンであった。

対照のサルは、序々に進行する昏睡、バランスの消失、
後肢の弛緩、まひそして死亡前８時間頃より開始する涙
の流出を示した。インクフエロン処理サルは、これらの
異常はまったく示さず、常時活動的で、ウィルス血症に
よる症状を示さなかった。４日までウィルス血症を示さ
なかった対照中の１頭のサルは、もつとも遅れて死ｌυ
だ（感染１６４時間後）、シかし、死後、心臓および脳
に高タイターでライ奮シを検出した。インクフエロン投
与ザルは、感染後１４および２１日の検査でＥＭＣウィ
ルスに対する抗体を生成しなかった。

れうることを示す。理由は、夾雑する蛋白質は、細菌と
バッフイー」−ト調製物ではまったく異なるからである
。さらに、これらの結果は、ＬｅＩＦ　Ａのインビボ抗
つイスル活性にグリコジル化が不要であることを示す。

Ｊ、　その他の白血球インクフエロンに対するＣＤ　Ｎ
　Ａの分離 完全に特徴づけられたＬｅｌＦ　Ａ　ｃＤ　Ｎ　Ａ含有
プラスミドよりのＤＮＡを、Ｐｓｔ　Ｉで切断し、電気
泳動により分離し、３２ｐでラベルした。生ずる放射ラ
ベルＤＮＡをプローブに用い、上記のＧｒｕｎｓｔｅｉ
ｎおよびｌｌｏｇｎｅｓｓのインジトウーコロニースク
リーニング法により、上記０項にお【プると同様に得ら
れた、追加のＥ、ｃｏｌｉ２９４の転換株をスクリーニ
ングした。種々の程良にプローブにバイブリド化したコ
ロニーを単離した。これらの］口ニーからのプラスミド
ＤＮＡおよび上記Ｇ項に示した１０個のバイブリド化コ
ロニーからのプラスミドＤＮＡを、Ｐｓｔ　Ｉ切断によ
り分離し、３つの方法で特徴づけた。第１に、これらの
Ｐｓｔ　１１７ｉ片を、酵素Ｂｏｌ　Ｉｆ、Ｐｖｕ　Ｔ
ＬおよびＥｃｏＲＩを用いる制限エンドヌクレアーゼ消
化パターンで特徴づ番ノだ。

搭分析は、第２図に示したー、少なくとも８種の異なる
型（ＬｅｌＦ　Ａ、　ＬｅｌＦ　Ｂ、　ＬｅｌＦ　Ｃ，
ＬｅｌＦ　ＤｌＬｅｌＦ　Ｅ、ＬｅｌＦ　Ｆ、　Ｌｅｌ
Ｆ　ＧおよびＬｅｌＦ　Ｈ）の分類を可能とした。これ
は、これまでに知られているＬｅｌＦ　Ａの先行配列お
よびコード配列に関する、種々の制限切断点のおおよそ
の位置を示している。

これらのうちのひとつＬｅｌＦ　Ｄは、Ｎａｇａｔａ等
がＮａｔｕｒｅ　２８４．３１６−３２０（１９８０）
に報告したのと同じと信ぜられる。

第２に、それらＤＮＡのいくつかについて、ポリーＡ含
有ＫＧ　ＩＩＤＩＩＩＲＮＡより、ＬｅｌＦｍＲＮ　Ａ
を選択的に除去づる能力について、Ｃ１ｃｖｃｌａｎｄ
　等がＣｅ１ｌ　２０．９５−１０５（１９８０）に記
載したハイブリッド化選択分析により調べた。ＬｃｌＦ
　Ａ、　Ｂ　、　Ｃおよび［はこの分析で陽性であった
。第３に、これらのＰｓｔ　Ｉｌｉ片を発現プラスミド
に挿入し、Ｅ、ｃｏｌｉ　２９４をそのプラスミドで形
質転換し、断片を発現させた。プレインクフエロンと信
ぜられる発現生成物は、ＬｅｌＦ　Ｆ断片がかろうじて
陽性以外は、イタフエロン活性に対するＣＰＥ分析です
べて陽性であった。

上記に加えて、上記のＬＯＩＦ型のすべてについて配列
を定めた。

Ｋ、　第２の成熟白血球インタフエロン（ＬｅｌＦｆｉ
）の直接弁 成熟ＬｅｌＦ　Ｂに対する遺伝子を含有する分離断片プ
ロモーター−オペレーター、リボゾーム結合部位および
ｔｅｌＦ　Ａ（＝８　）　３ｍ仏子の開始を有する断片
をｐＬｅｌＦ　Ａ２５より分離し、発現プラスミドにお
いてＢ配列の残りの部分と結合させた。ｐＬ　４（第２
図に示したＬＯＩＦ　Ｂ　ｐｓｔ末’１Ｍ３Ｍ仏子を含
有図にそれぞれ示す。

第４叛図の配列によりＰｓｔ　Ｉ断片に対しておおよそ
９５０ｂ、ｐ、のｓａｕ　３　ａ−ｐｓｔ　１断片ヲウ
ルニは、１個または１個より多（の介在するＳａｕ　３
　ａ制限部位が存在するので、いクラかの段階が必要で
ある。つまり、つぎのＪ：うになる。

１、　つきの断片を分離した。

ａ）　Ｓａｕ　３　ａからＥｃｏＲＩまでの１１０ｂ　
ｂ、ｐ、　：ｂ）　ＥｃｏＲＩからＸｂａまでの１３２
ｂ、ｐ。

ｃ）　ｘｂａからＰＳｔまでの＞７００ｂ、ρ。

２、　断片（１ａ）および（１ｂ）を連結させＸｂａお
よびＢ（ＩＩＩＩＴ’切断して、Ｓａｕ　３　ａおよび
Ｘｂａ末端を経由する自己重合を防いだく関連するＳａ
ｕ　３　ａ部位はＢｇｌＩＩ部位内にあり：ｌ１０１１
［切断はＳａｕ　３　ａ粘着性末端を残した）。２４２
ｂ、ｐ、断片を分離した。

３、＋２１および（１Ｃ）の生成物を連結させ、ふたた
び自己重合を防ぐために、Ｐｓｔ　Ｉおよび［ｊｇｌ　
ＩＩで切断した。Ｓａｕ　３　ａからｐｓｔ　Ｉまでの
（第４飄図）約９５０ｂ、ｐ、断片を分離した。この断
片は、ＬｅｌＦ　Ａに共通していない、ＬｅｌＦ　Ｂｉ
仏子の部分を含有した。

４、ＬｅｌＦ　Ａのｔｒｐプロモーター−オペレーター
、リボゾーム結合部位、ＡＴＧ開始シグナルおよびシス
ティンコドンを含有する 約３００ｂ、Ｉ）、断片（ｌｌｉｎｃｌｍからＳａｕ　
３　ａまで）を、ｐＬｅｌＦ２５より分離した。

５、ＰＳｔ　ＩからＨｉｎｄｎｌまでの約３６００ｂ、
ｐ。

断片をＩＩＢ　Ｒ３２２より分離した。レプリコンおよ
びテトラサイクリン抵抗性がコードされているが、アン
ピシリン抵抗性は含有しない。

６、　段階３．４および５で得られた断片番トリプル連
結し、生ずるプラスミドでＥ、ｃｏｌｉＫ−１２株２９
４を転換した。

転換株はミニスクリーニング（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ等、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３−
１５２３（１９７９））に処し、プラスミド試料はＥｃ
ｏＲ］：で消化した。消化物は３個の断片を与えたが、
それらの特徴は、１）ＥｃＯＲＩ　−ＥＣ０ＲＩ　ｔｒ
ｐプロモーター断片；２）ｐＬ４の内部ＥｃｏＲＩ　−
ＥｃｏＲＪ断片：および、３）ｐＬ４の蛋白質翻訳開始
シグナル−Ｅｃａｌｌ　工断片。

ＣＰＥ分析で、上記のように調製したクローンより細菌
抽出物は、代表的には、Ａ３５０””’で約１０×１０
６単位／１のインクフエロン活性を与えた。このように
調製されたひとつの代表的なりローンは、［、ｃｏｌｉ
２９４／　ｐＬｅｌｒ　Ｂ　ｔｒｐ　７である。このク
ローンはＡＴＣＣに寄託されている。

［、さらに別の成熟白血球インクフエロン（ＬｅｌＦＣ
１Ｄ　、　Ｆ　、　ＩＩ　、　！およびＪ）の直接発現
他のＬｅｌＦタイプを含有する追加の完全長遺伝子断片
は、ｔｅｌＦ　Ａにおけると同様に、ティラーし発現の
ための発現ビヒクル中におきうる。成熟除去し、先行配
列除去で失なわれたＮ−末端アミノ酸コドンを合成りＮ
Ａ断片の連結でおき代えるという、便利な方法がとれる
かどうかを決めうるよう、成熟インタフエロンタイプの
第１のアミノ酸コドンに十分に近く制限部位が存在する
かどうかは、従来法による完全な配列決定から分るであ
ろう。それがうまくいかなければ、つぎの操作を用いう
る。要するに、成熟ポリペプチドの第１のアミノ酸に対
するコドンの開始する点にり正確に前のところで先行配
列含有断片を切断する。つまり １　その点をとりまく領域内において２正鎖ＤＮＡを１
重鎖ＤＮＡに変える： ２、　段階（１）で生成し７ｃ１重鎖の領域に目的とす
る切断部位と結合するヌクレオチドと反対側にプライマ
ーの５′末端が位置するようにして、１重鎖ＤＮＡの相
補的なプライマーをバイブリド化する。

３、　プライマーより３′の方向にある、段階１で除か
れた第２の鎖の部分を、アデニン、ヂミン、グアニンお
よびシトシン含有デオキシヌクレオチドトリボスフエー
トの存在でのＤＮＡポリメラーゼを用いる反応で恢復さ
せる。

４、　切断しようとする点をこえて突出している、残存
する１重鎖ＤＮＡを消化する。

翻訳開始シグナルＡＴＧを、コード鎖の３′末端に有す
る短鎖長合成りＮＡを、ついで、得られた成熟インクフ
エロンのために仕立上げられた遺伝子に、たとえば平滑
末端連結で連結し、そしてこの遺伝子を発現プラスミド
に挿入し、プロモーターおよびそれに組合わされたりボ
ゾーム結合部位による調節下におく。

上記のに項で用いたのと同様にして、ＬｅｌＦ　Ｃａ３
よびＬｅｌＦ　Ｄをコードする遺伝子断片を、直接的細
菌による発現のために適当に配列した。これらの追加の
白面球インタフエロンの発現のための戦略として、それ
ぞれの場合について、ｐＬｅｌＦ　Ａ２５よりのＬｅＩ
Ｆ　Ａのｔｒｐプロモーター−オペレーター、リボゾー
ム結合部位、ＡＴＧ開始シグナルおよびシスティンコド
ンを含有する、約３００ｂ、ｐ、の断片（ｌｌｉｎｄｌ
ｌ［からＳａｕ　３　ａまで）を用いる。これに対して
、すべてに共通である最初のシスティンより向うの、そ
れぞれのアミノ酸配列をコードするその他のインクフエ
ロン道伝子よりの遺伝子断片を結合する。得られたそれ
ぞれのプラスミドを用いてＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株
２９４を転換した。それぞれの遺伝子を形成り−るため
の結合は次のようである。

ＬｅＩＦ　Ｃ ｐＬｅｌＦ　Ｃより次の断片を分離する：（ａ）　Ｓａ
ｕ　３　ａから５ａｕ９６までの３５ｂ、ｌ）。

（ｂ）　Ｓａｕ　９６からｐｓｔ　Ｉまでの＞９００ｂ
、ｐ。

（Ｃ）上記Ｋ（４）項におけるように、ｐＬｅｌＦＡ−
２５より約３００ｂ、Ｉ）、の断片（ｔｌｉｎｄ［ｌ−
３ａｕ３　ａ）を分離する。

（ｄ）上記Ｋ（５）項の約３６００ｂ、ｐ、の断片を分
１１１１１する。

性！ （１）　（ａ）および（Ｃ）を連結Ｊ−る。Ｂｇｌ　ｆ
ｌ　、　ｔｌｉｎｄ■で切断し、約３３５　ｂ、ｐ、の
生成物を分離する。

（２）　（１）　＋（ｂ）　＋（ｄ）とトリプル連結し
、生ずるプラスミドでＥ、ｃｏｌｉを転換する。

このように調製された代表的なりローンはＥ、ｃｏｌｉ
　Ｋ　−１２株２９４　／　１）ＬｅＩＦ　ｃｔｒｐ　
３５である。このクローンはＡＴＣＣに寄託されている
。

ＬｅＩＦ　Ｄ ｐＬｅｌＦ　Ｄよりつぎのように分離する：ａ）　Ｓａ
ｕ　３　ａからＡｖａ　Ｉ［までの３５ｂ、１１゜ｂ）
ＡｖａｌｌよりＢ！ＩＩＩ　ＩＩまでの１５０ｂ、１１
゜ｃ）　Ｂ（＋１　Ｉ［よりＰｓｔ　Ｉまで約７００ｂ
、ｐ。

ｐＬｅｌＦ　Ａ２５より、つぎの断片を分離する＝ｄ）
　ＨｉｎｄＩ［よりｓａｕ　３　ａまで３００ｂ、ｌ）
。

ｐＢＲ３２２よりつぎの断片を分離Ｊる：ｅ）　、１Ｉ
ｉｎｄＩ［［よりＰＳｔ　Ｉまで約３６００ｂ、ｐ。

亀碧 （１）　（ａ）　＋　（ｂ）を連結し、Ｂ（ＩＩ　ＩＩ
で切断し、１８５ｂ、＋１．生成物（１）を精製する。

（２）　（１）　＋（ｄ）を連結し、１ｌｉｎｄｌｌ、
Ｂ（ＩＩ　Ｉ［で切断し、そして、約５００ｂ、Ｉ）、
生成物（２）を精製する。

（３）　（２）　＋（ｃ）　＋（ｅ）を連結し、生ずる
プラスミドでＥ、ｃｏｌｉを転換する。

このようにして調製された代表的クローンは、Ｅ、ｃｏ
ｉｌ　Ｋ　−１２株２９４／　１）ＬｅｌＦ　Ｄ　ｔｒ
ｐｌｌである。このクローンはＡＴＣＣに寄託されてい
る。

ＬｃｌＦ　Ｆ ＬｅＩＦ　Ｆを含有り゛る断片は、ＬｃｌＦ　Ｂおよび
ＬｅｌＦ　Ｆの１から１３までのアミノ酸が完全に相同
であることを利用する再構成で直接的に発現するよう仕
立上げることができる。上記のｐｔ−ＩＧＨ２，０７よ
り、Ｐｓｔ　ＩおよびＸｂａ　Ｉ消化を経由し、ついで
約１０５０ｂ、ｐ、の断片を分離することにより５、適
当な配列末端を右するｔｒｐプロモーター含有断片（ａ
）をつる。第２の断片（ｂ）は、プラスミドｐＨＫＹ１
０のＰｓｔ　Ｉおよび８ｇ＋　１ｉ消化より生ずる断片
の大きい方としてつる。断片（ａ）はアンピシリン抵抗
性をコードする遺伝子の約半分を含有し；断片（ｂ）は
、その遺伝子の残りを含有し、また、組合わされたプロ
モーター以外のテトラサイクリン遺伝子のすべてを含有
する。断片（ａ）および（ｂ）はＴ４リガーゼにより結
合し、生成物を、Ｘｂａ　ＩおよびＢ（１１ＩＩで処理
して、二聞化がおこらぬようにし、ｔ＋”ｐプロモータ
ー−オペレーターおよびテトラサイクリンおよびアンピ
シリン抵抗性の遺伝子を含有する断片（Ｃ）とする。

約５８０ｂ、Ｉｌ、の断片（ｄ）はｐＬｅＩＦ　ＦのＡ
ｖａ　ＩＩおよびｈｌ　ＩＩの消化で得られる。これは
、ＬｅｌＦ　Ｆの１４から１６６までのアミノ酸に対す
るコドンを含有する。

断片（ｅ）　（４９ｂ、ｐ、）は、０ＬｅｌＦ　Ｂ（７
）Ｘｂａ　Ｉ　＃よびＡｖａ　Ｉ［消化で得られる。断
片（（３＞はＬｅＩＦ　ＦのアミノＭ１から１３をコー
ドする。

断片（Ｃ）　、（ｄ）および（ｅ）は、Ｔ４リガーゼの
存在で、トリプル連結する。それぞれ断片の接着末端は
、複合プラスミドが正しく環状となり、テトラサイクリ
ン抵抗性遺伝子が成熟ＬｅｌＦ　Ｆの遺伝子とあわせて
、ｔｒｐプロモーター−オペレーターの調節下に入るよ
うになっており、それで、望むプラスミドで転換した細
菌は、テトラサイシリン含有プレート上で選択しうる。

このように調製さはＡＴＣＣに寄託されている。

ＬｃｌＦ　Ｈ 完全ＬｅｌＦ　Ｉｌ遺伝子を、成熟白血球インタフエロ
ンとして発現さすために、つぎのように配列しうる。

１、プラスミドｐＬｅｌＦ　１１をＨａｅ　ＩＩおよび
Ｒｓａ　Ｉ消化に処して、シグナルペプチドアミノ１１
１０から３′非コード領域までに及ぶ８１　ｅｂ、ｐ、
ｉ片を分離する。− ２、この断片を変性し、ＤＮＡポリメラーゼ■のにｌ　
ｅｎｏｗ断片（ＫＩｅｎＯＷ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ八、−（ミー１５１．１．６８　（１９７０）　
）により、合成デオキシリボオリゴヌクレオチドプライ
マー５’　−ｄＡＴＧ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＣＴＧＴＣＴ
を用いて修複合成に処する。

３、得られた生成物をＳａｕ　３　ａで切断し、１がら
１５０のアミノ酸を現わす４５２　ｂ、ｐ、［！ｌｉ片
を分離する。

４．３ａｕ３ａおよびＰｓｔ　Ｉ　１’　１）ＬｅｌＦ
　Ｈを浦化し、得られた５００ｂ、ｐ、断片を分離し、
１５０番目のアミノ酸からコード配列の最後までをコー
ドする遺伝子をうる。

５　段階（３）および（４）で分離した断片を連結して
、断片 １　１６６ １ｅｔ　Ｃｙｓ　ａＳｐ停止 ＡＴＧ　ＴＧＴ−−−−−−・・・ＧＡＴ　ＴＧＡ−−
・−−Ｐｓｔ　ｌ５ａｕ　３　ａ をうる。これはＬｅｌＦ　Ｈの１６６個のアミノ酸をロ
ードする。

６、　０ＬｅｌＦ　Ａ　ｔｒｐ　２５をＸｂａｌＦ消化
し、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑末端とし、生成
物をＰｓｔ　Ｉで消化する。得られた大型新井を分離し
、段階（５）の生成物と連結させて発現プラスミドとし
うる。これは、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株２９４また
は他の宿主細菌の転換に用いて、成熟Ｌｃｌ「ＩＩを発
現しうる。

ＬｅｌＦ　Ｉ Ｌａｗｎ等により構成されたヒトゲノムのフェースλ　
Ｃｈａｒｏｎ　４　Ａ組換えライブラリー（Ｃｅｌｌ。

１支、１１５７　（１９７８））を、上記引用のＬａｗ
ｎ等の方法およびＨａｎｉａｔｉＳ等、Ｃｅ１ｌ　１上
。

６８７　（１９７８）の方法により、白血球インタフ１
０ンに関してスクリーニングした。ＣＤＮＡクローンＬ
ｅｌＦ　Ａに由来Ｊる放射性ＬｅＩＦプローブを用いて
、約５００．０００個のプラークをスクリーニングした
。６個のＬｅｌＦゲノムクローンを選び出した。再スク
リーニングおよびプラーク精製につづいて、これらのク
ローンのうちのびとつλＩＩＬｅｌＦ　２を選びさらに
分析した。

上記の方法を用いて、仙のプローブも、ヒトゲノムから
その他のＬｅｌＦクローンを分離するのに有利に用いう
る。ついで、これらは、本発明によるその他の白血球イ
ンタフ１０ン蛋白質を製造するのに用いうる。

１、　クローンλＨＬｅｌＦ　２の２０００ｂ、ｌｌ、
ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲ■部位においてｐＢＲ３２
５中へ、サブクローン化した。得られたプラスミドＬｅ
ｌＦ　ＩをＥｃｏＲ工で切断し、２０００ｂ、ｐ、断片
を分離した。

この２０００　ｂ、ｐ、ＥｃｏＲＩ断片にデオキシオリ
ゴヌクレオチドｄＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧ　（ＥｃｏＲＩ
−ｐｓｔ　Ｉコンバーター）を連結した。得られた生成
物をＰａｔ　Ｉで切断し、Ｐｓｔ　Ｉ未満を有する２０
００ｂ、ｐ、断片とした。これをＳａｕ　９６　テ切断
した。ひとつのＰｓｔ　工およびひとつの５ａｕ９６末
端を有する１１００ｂ、ｐ、断片を分離した。

２、　プラスミドｐＬｅＩＦ　ＣｔｒＤ　３５をＰｓｔ
　ＩおよびＸｂａ　Ｉで消化した。大型断片を分離した
。

３、　ｐＬｅｌＦ　Ｃｔｒｐ　３５よりの小型ＸｂａＩ
−ｐｓｔ　Ｉ断片をＸｂａ　Ｉおよび５ａｕ９６で消化
した。

４０　ｂ、ｐ、Ｘｂａ　Ｉ　−ｓａｕ　９６断片を分離
１．　ｔｃ。

４、　段階（１）　、　（２）および（３）より分離し
た断片を連結して、ｐＬｅＩＦＩ　ｔｒｐ　１発現プラ
スミドとした。このクローンはＡＴＣＣに寄託されてい
る。

しｃｌＦ　Ｊ １、　プラスミドｐＬｃＩＦ　Ｊは、ＬｅｌＦ　Ｊ遺伝
子配列を含有するヒトゲノムＤＮＡの３．８キロベース
１１ｉｎｄｌ［ｌ断片を含有する。このプラスミドから
７６０　ｂ、ｐ、Ｄｄｅ　Ｉ−Ｒｓａ　Ｉ断片を分離し
た。

２、　プラスミドｐＬｅｌＦ　Ｂ　ｔｒｐ　７を１Ｉｉ
ｎｄｉ［およびＤｄｅＩｒ切断し、３４０ｂ、ｐ、旧ｎ
ｄｌ［［−０ｄｅ　Ｉ断片を分離した。

３、　プラスミドｐＢＲ３２２をＰＳｔ　Ｉで切断し、
ＤＮＡポリメラーゼエとインキュベ−１〜し、平滑末端
とし、＜　Ｋ　Ｉｅｎｏｗ　１ｇｉ片）、ツいで１目ｎ
ｄｌｎｒ消化した。大型（約３６００ｂ、ｌ）、）断片
を分離した。

４、　段階（１）　、　（２）および（３）で分離した
断片を連結して、発現プラスミド１ｌＬｅｌＦ　Ｊ　ｔ
ｒｉ）　１とした。このクローンはＡＴＣＣに寄託され
ている。

Ｈ３精製 細菌抽出物中の白血球インタフ１０ン含有聞は、つぎの
ようにして、増加させつる。

１、　ポリエチレン−イミン沈殿。ここで、インタフ１
０ンを含めた細胞蛋白質の大部分は上清に留まる。

２、　硫酸アンモニウム分画。ここで、インタフ１０ン
は、５５％飽和硫酸アンモニウムの溶液中から析出する
。

３、　硫酸アンモニウムペレットを０．０６Ｍリン酸カ
リウム、１０　ＩＩＩＨＴｒｉｓ−ｔｌｃｌ　、　ｐＨ
７，２に懸濁させ、２５　ｍＨＴｒｉｓ　−ｌｌＣｌ、
ｐＨ７，９に対して透析する。インタフ１０ン活性は溶
液中に残る。

４、　上記の上清をｐＨ８，５に調整してＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムでクロントゲラフイーを行う（２５１ｎ
ＨＴｒｉｓ　−ＨＣＩ、ｐＨ８，５中０から０．２Ｍ　
ＮａＣｌの直線勾配で溶出）。

５、Ｃｉｂａｃｈｒｏｍｅ　３１ｕｅ　−Ａ　ｇａｒｏ
ｓｅまたは１１ｙｄｒｏｘｙｌａＤａｔｉｔｅに吸着さ
せ、１．５８ＫＣＩまたは０．２Ｍリン酸塩で溶出する
（必要により実施）。

６、　５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−７５カラムで分子をサイ
ズ分けする。

７、　ｐＨ１５，０の２５　ｍＨＩ￥：酸アンモニウム
中ＣＭ−セルローズ上陽イオン交換クロマトグラフィー
を行う。酢酸アンモニウム勾配（０，２Ｍ酢酸アンモニ
ウムまで）で展開する。

上記の方法で〉９５％純度の生成物を得る。

この物質はまた、サイズ排斥クロマトグラフィー、逆相
（ＲＰ−８＞高圧液体クロマトグラフィー。

または固定化抗インタフエロン抗体上のアフィニｊイク
ロントグラフィ〜で精製しつる。

別法として、上記の段階４よりの物質をＨｉｌｓｔｅｉ
ｎ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　２４
３．６６（１９８０）記載のように調整したモノクロナ
ル抗体カラムに加え、０．２Ｍ酢酸、０．１％Ｔｒｉｔ
ｏｎおよび０．１５ＨＮａＣｌ　ｔ−溶出ｔ、、ウル。

別様の有利な具体例として、上記操作で製造した白血球
インタフ１０ンをっぎの段階で精製しうる。

１、　発現された白血球インクフェロンを含有する凍結
細胞塊を、手作業または適当な粉砕装置で砕く。部分的
にとけた細胞を、ｐＨ７，５−８，０に調整した０、　
１Ｍ　ｌ’ｒｉｓ、　１Ｑ％（ｗ／ｖ）　スフ０−ス、
０．２ＨＮａＣＩ　、５　ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＨＰ
ＭＳＦおよび１０−１００１１１８　８（ｌｃＩ２含有
緩衝液Ａの４容量中に懸濁させる。懸濁液は約４℃に保
つ。

懸濁液は、約６０００ｐＳｉでホモジナイザーを通し、
ついで、１０００ｐｓｉ以下で２度目を通す。

両方の通過よりのホモジナイザーからの流出液は、水浴
中で冷却する。

２、　ホモジネートにポリエチレン−イミンをゆっくり
と添加して、約０．３５％濃度とし、約３０分放置する
。固型物は遠心または濾過で除去する。この段階は、温
度を調節するがまたは！、上清（濾液）を１０℃より低
く保つように十分にすみやかに実施する。上清（濾液）
を限外濾過で濃縮して、もとの容量の約１／１ｏとする
。粒状物またはにごりを認めたら、ミクロポアメンブレ
ンのような適当なフィルターで除去しつる。

３、　澄明化溶液は、５−８ｃｍ／時間（たとえば、直
径２．６ｃＩｎのカラムで、２５−４０　ｒｒｔｌ／時
間）でモノクロナル抗体カラムに直接流す。ついでこの
カラムを約１０カラム容吊の２０１１＋８　Ｔｒｉｓ　
−ＨＣｌ、ｐＨ７，５−８，５（ＮａＣｌ　（０，５Ｍ
）およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（０，２％）または
同等の表面活性剤含有）で洗う。洗ったあと、このカラ
ムに０．１５ＨＮａＣＩおよびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０
０（０，１％）または同等の表面活性剤を含有する約１
０カラム容量の溶液を通す。このカラムをＴｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００（０，１％）または同等の表面活性剤を含
有する０、２Ｍ＃酸で溶出する。モノクロナル抗体カラ
ムよりの蛋白質ピーク（ＵＶ吸収またはその他の方法で
測定）を集め、１ＮＮａＯＨまたは１．０Ｍ　Ｔｒｉｓ
塩基でｐｌ＋を約４．５に調整する。

４、　プールされたインクフエロンビークを、適当な緩
衝液たとえば酢酸アンモニウムｐＨ４、５（５０ｍＭ）
で平衡させたｌａｔｍａｎ　ＣＭ　５２撞 セルロースまたは同等の甫イオン交換体に加える。

加えたあと、カラムを平衡のための緩衝液で洗い、流出
液のＵＶ吸収がたいらとなるに至らせ、カラムからはほ
とんど蛋白質が溶出しない状態とする。

カラムをついで、２５ｍＭ酢酸アンモニウム１０．１２
Ｍ塩化ナトリウムまたはインクフエロンの回収を最高と
する組合わせで溶出し、満足な外観および溶解性を有す
る凍結乾燥ケーキとづる。

上記したこの有利な具体例におけるモノクロナル抗体は
、５ｔａ（！１ＩＱＩｉｎ等がＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７８．１８４８−５２　（１９８１）　ニ
記載した方法で調製しうる。モノクロプル抗体は、下記
するように、精製し、Ａｆｆｉｇｃｌ　−１０に共有結
合させる。

腹水液よりのモノクロナル抗体の調製および精製１１Ｂ
ａｌｂ／ｃマウス５頭のそれぞれに、対数増殖期の中間
でとったハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）細胞
の５−１０Ｘ１０６個を接種した。マウスの生成する腹
水液から得た約５×１０６個の生育しうる細胞を、１０
または１０頭より多くのマウスのそれぞれに腹腔内接様
した。この腹水液を各マウスより反復″（２から４回）
採取した。ひとつの群のマウスからつぎの群のマウスに
、３回まで、多しかえおよび採取を行なった。それぞれ
の移しかえ毎に、採取腹水液をプールした。

低速遠心（５００−１０００Ｘ９）で１５分間処理し、
腹水液よりｌ１ｌｌ胞および残渣を除いた。ついで１８
．ＯＯＯｒｐｍで９０分遠心した。上清を凍結させマイ
ナス２０℃に貯蔵した。融解させてから、３５．ＯＱＱ
ｒｐｍで９０分間遠心し、さらにフィブリンおよび粒状
物を除いた。各移しかえごとの腹水液のバッチについて
、固体相抗体結合試験（５ｔａｅｈｅ　ｌ　ｉ　ｎ等、
上記引用文献）により特異抗体活性を試験し、満足なら
ばプールした。

プールされた溶液中の蛋白質濃度は、１　ｍ！ｊの蛋白
質が１．０ｃｍの厚さのキュベツトで２８０　ｒｉｍで
１．２の吸光値を示すという近似法で測定した。

高濃度の抗体を有する腹水液は３０−３５　ｍｙ蛋白質
／ｒｄを含有する。これは、４−７　ｍｙ特異抗体／ｄ
に相当する。この液体をＰＢＳ　（０，ＯＩＭリン酸ノ
トリウム、　ｌ）Ｉ＋７．３．０．　１５Ｍ　ＮａＣ１
）で希釈し、１０から１２ｍ９／ｍｆｌの蛋白質濃度と
した。

希釈溶液の各１００ｍ１に、室温で飽和した硫酸アンモ
ニウム溶液９０ｄを、０℃ではげしくかくはんしながら
添加した。懸濁液を４０から６０分間水中に保った。つ
いで、４℃で、１０．００Ｏｒｐｍで１５分遠心した。

上清をけいしやしで除き、十分に液を切った。蛋白質塊
を０．０２Ｍ　ＴｒｉＳｌｌｃｌ　（ｐＨ７，９）１０
．０４Ｍ　ＮａＣ１（緩衝液工）に溶解した。蛋白質溶
液を、１００容量の緩衝液■に対して、室温で１６から
１８時間透析した。その間、少なくとも１度緩衝液を交
換した。

透析溶液を１５．００Ｏｒ１１１１１で１０分間遠心シ
、不溶物を除いた。腹水中の全蛋白質の最初の量の約３
０から３５％が、２８Ｏｒ＋ｍの吸光値より概算して採
取された。

次いで、１ｄについて３０−’４０１ｎ９の蛋白質を含
有する溶液を３ｕＨｃｒ　Ｉで平衡させたＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムに加えた。添加する蛋白質１グラムにつ
いて少なくとも１００ｄのカラム床容量とした。０．０
２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ７、９中ＮａＣｌを０．
０４Ｍから０．５Ｍ　ＮａＣｌ１度に直線状にＮａＣ１
濃度を変化させて、カラムより抗体を溶出した。０．０
６から０．　ＩＭ　ＮａＣｌのピーク分画をプールし、
等容量の硫酸アンモニウム飽和溶液（室温）を加え沈殿
遠心し、濃縮した。蛋白質塊を０．２Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯ
３（ｐＨ約８．０）１０、３Ｍ　ＮａＣ１（緩衝液■）
に溶解し、室温で、同じ緩衝液（３度交換）に対して透
析した。透析した溶液を２０．ＯＯＯＸｇで１５分遠心
し、不溶物を除いた。蛋白質濃度を緩衝液■で２０から
２５ｍｇ／ｍｆｌとした。

免疫吸着剤の調製 八ｆｆｉｇｅｌ　−１０（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）をグラス
フィルター上で水冷イソプロパツールで３度洗い、つい
で水冷蒸留水で３度洗った。ゲルスラリー（冷水巾約５
０％）をプラスチックチューブに移し、短時間遠心して
沈降させた。上清をアスピレータ−で除き、パックされ
たゲルを等容Ｑの精製抗体溶液と混合し、４℃で５時間
、長軸が円状に廻転するように回転した。反応後、ゲル
を遠心し、緩衝液■（０゜Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯ３／　
０．１５Ｍ　ＮａＣＩ）で２度洗い、非結合抗体を除い
た。洗液を合Ｕ（Ｌ蛋白質を測定すると、９０％以上の
抗体がゲルに結合していた。

未反応の部分をふさぐために、ゲルを等容量の０．１Ｍ
エタノールアミン・ｌｌＣｌ　（１）Ｈ８）と混合し、
長軸を円こ状に回転さけて室温で６０分・処理した。ゲ
ルスラリーよりＰＢＳで洗浄して反応剤を除ぎ、４℃で
０．０２％（ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムの存在でＰＢ
Ｓに貯蔵した。

Ｎ非経口投与 ＬｅｌＦは、抗腫瘍または抗ウイルス治療を要覆る患者
に非経口投与しつる。また、免疫抑制状態を示ず患者に
も投与しうる。投与量および投与ｖｊ合は、ヒト由来の
物質について現在臨床的に行なわれているのと同様にす
る。たとえば、約（１−１０）ＸＩＯ６単位／日で１％
より人の純度の場合には、たとえば５×１０７単位／日
に及びうる。

非経日投与用の形態とした本質的に均一な細菌性Ｌｅｌ
Ｆの適当な投与形態では、たとえば、２×１０８単位／
ｌｌ１ｇノ比活性ｃ７）　ＬｅｌＦ３　＃ＩＳＦを２５
ｄの５Ｎヒト血清アルブミンに溶解し、この溶液を生　
４゜物学的フィルターを通し、濾過溶液を無菌的に１０
０本のびんに分Ｃプで、非経口投与に適当なように、１
本が６×１０６単位純インクフエロンを含有するように
する。これらのびんは、使用前は冷所（−２０℃）に保
つのが望ましい。

本発明の化合物は、医薬として有用な組成物を調製する
ための既知の方法に従って製剤化できる。

その際、このポリペプチドは、医薬として許容されうる
担体ビヒクルと混合する。適当なビヒクルおよびそれら
の製剤化については、［，１ＨａｒｔｉｎによるＲｅｍ
１ｎｑｔｏｎ’ｓ　ｐＨａｒｍａＣｅｕｔｉＣａｌ　５
ｃｉｅｎｃｅｓに記載されているとおりである。これを
、本明細書の参考文献として引用する。これらの組成物
では、インタフ１０ン蛋白質の有効量と適当な量のビヒ
クルとをあわせて、宿主に対して効果的な投与と−する
に適当な、医薬として許容されうる組成物とする。ひと
つの有利な投与形態は非経口投与である。

【図面の簡単な説明】

第１図は可能性のあるＬｅｌＦプラスミドと３２ｐラベ
ル合成デオキシオリゴヌクレオチドとのバイブリド化を
示すオートラジオグラムである。 第２図は、ＬｅｌＦクローン化ＣＤＮＡの８個の型（Ａ
からト１まで）の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。 第３図は、成熟ＬｅｌＦ　Ａの直接的微生物合成をコー
ドする遺伝子の構築を示す。 第４図および第５図はＬｅｌＦ　Ｂ成熟白血球インター
ノ１０ンを発現するために用いられる２つの遺伝子断片
の制限地図を示す。 代理人　浅　村　皓 図面の洋鶏（内容に（更なＬ） ”２Ｐ−Ｔ−１３ｃプローブ　び− 第１０　。− 裟 図 く　ｃＯ００ＬＬＩ　Ｌ　Ｑ　工 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　０１９ＥＭＥ９月８日０米国（Ｕ　Ｓ）［株］ｌ澗
９０９０１ｇ８咋１１月１０日［相］米国（ＵＳ）［株
］２０５５７８６１９８１年４月２１日［相］米国（Ｕ
　Ｓ　）＠２５６２０４［相］発　明　者　シドニイ　
ペスト力　アメリカ合衆国ル、ブルツクサ ＠出　願　人　ゲネンテツク、インコ　アメリカ合衆国
−ボレーテッド　スコ　ポイント ニューシャーシー州ノース　カルドウエイド　テラス　
８２ カリフォルニア州　サウス　サンフランジサン　プルノ
　ブールバード　４６０ 手続補正補正力式） 昭和１０年り月〕３日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和９９年特許願第ユ’；、！、９−ｅ７　号２、発明
の名称 附槻６・乙／７１し ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 図　面と糖１困） ３、発明の詳細な説明 本発明は組換えＤＮＡ技術の分野、すなわち組換えＤＮ
Ａ技術で用いられる方法およびこれらの方法により得ら
れる生成物に関する。 さらに詳細には、本発明はヒト成熟白血球インクフエＯ
ンのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、部分ア
ミノ酸配列Ｃｙｓ−へｌａ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｕ　−Ｖ
ａｌ　−Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ｇｌｕ　−１
１ｅ　−−ｒｇ−３ｅｒを有することを特徴とし、そし
て先行配列を伴なわない場合は、１６５−１６６ミノ酸
を有し、あるいはメチオニンが前記７エロンの第１番目
のアミノ酸のＮ末端に１．、−−ている場合は、１’６
６−１６７個のアミノ′″−一↑るポリペプチドをコー
ドする配列からなＡ配列を含有することを特徴とする複
製し１ビヒクルに関する。 ］の背景についてまず記載する。ヒト白面１フエロン（
ＬｅｌＦ）は、最初、アイザツクス（ｌ５ａａｃｓ）お
よびリンデンマン（Ｌｉｎｄｅｎｍａｎ口）きわめて粗
な沈殿物として、発見されそして調製された（ブロク、
アール、ソシ、　（Ｐｒｏｃｒｔ、ｓｏｃ、　） Ｂ１４７，２５８−２６７　（１９５７）；ｕ、ｓ、ｐ
。 ３．６９９．２２２＞。それを精製し特徴づける努力は
長く続けられ、正常または白血病の提供者から得た白血
球に由来する比較的均一な白血球インタフエロンの調製
にみちびいた（ドイツ特許公報Ｎｏ、　２　、９４７　
、１３４　）　、これらノインクフエロンは、それらの
標的細胞にウィルス抵抗性の状態を付与する能力を有す
ることの知られている一群の蛋白質である。さらに、イ
ンクフエロンは、細胞の増殖を阻止しそして免疫反応を
調節するように作用しつる。これらの性質から、ウィル
スの感染および悪性腫瘍の治療に白血球インクフエロン
を臨床的に用いることが促進された。 白血球インクフエロンは、本質的に均一な状態ニｌｉ製
すレ（ルピンスティン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）等、ブ
ロク、ナトル、アカド、サイ、米国（ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、八、）　７６
、　６４．０−６４４（１９７９）；Ｚｏｏｎ等、同上
、７６．５６０１−５６０５　（１９７９））約１７，
５００から約２１．０００の範囲の分子量を有すると報
告された。これらの調製物の比活性は、きわめて高く、
２×１０８から１× １０９単位／ｍｇ蛋白質であるが、細胞培養法よりの収
量はおそろしく低い。しかし、蛋白質の配列をきめる技
術の進歩で、部分的アミノ酸配列が決定された〔ゾーン
（Ｚｏｏｎ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）２０
７．５２７　（１９８０）ニレビイ（Ｌｅｖｙ）等、ブ
ロク、ナトル、アカド、サイ。 米国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、
Ｓ、八、）Ｌユ。 ５１０２−５１０４　（１９８０））。種々の白血球イ
ンタフエロンのグリコジル化は、現在完全には明らかで
ないが、種類間におけるグリコジル化の差のみでは、観
察されている分子ｍの分布を説明しえない。その代わり
に、白血球インタフエロンは、種類に従いアミノ酸組成
および配列において著しく差があり、アミノ酸の相同性
は、場合により８０％より低い。 提供者の白血球よりの分離で部分的な特徴付けおよび限
定された臨床的研究のための十分な量の、均一な白血球
インタフエロンを与えたけれども、それだけでは、大規
模な臨床試験および広範な予防的および（または）治療
的使用に必要であるインタフエロンを提供するにはまっ
たく不十分である。まさに、ヒト白血球由来のインクフ
エロンを抗腫瘍および抗ウィルスに用いる現在の臨床試
験では、粗く１％より低い）調整物を用いており、実際
的でない価格においてすら十分な量を生産するに至らず
、広範な領域での研究を遅らせて来た。 しかし、組換えＤＮＡ技術の出現にともなって、有用な
ポリペプチドのきわめて多様な種類を、微生物により調
節生産することが可能になった。すでに、この技術によ
り修飾をうけて、ソマトスタチン、ヒトインシュリンの
ＡおよびＢ鎖およびヒト生長ホルモンのようなポリペプ
チド鎖を生産することが可能となった細菌が存在するに
至っている。 （イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ　）等、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ　）　１９８．１０５６−１０６３（１９７
７）；ゴデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ　）等、ネーチャー　（
Ｎａｔｕｒｅ）２８．１．５４４−５４８　（１９７９
））。 より最近になって、組換えＤＮＡ技術が、プロインシュ
リンおよびチモシンアルファ−１の生産を可能とし、さ
らに、なん人かの著者は、ヒト白血球インタフエロンを
コードするＤＮＡの採取および、その結果前られる、白
血球インタフエロン活性を有 する蛋白質の生成について報告している（）−ガタ（Ｎ
ａｑａｔａ）等、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２８４
　。 ３１６−３２０　（１９８０）：ナンテイ（Ｎａｎｔｃ
ｉ）等、ジエイン（Ｇｅｎｅ）１０．１−１０　（１９
８０）タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　＞等、ネーチ１
７−　（Ｎａｔｕｒｅ）２８５．５４７−５４９　（１
９８０））　。 組換えＤＮＡ技術の工作室は、細菌および他の微生物に
存在し、しばしば、細胞中に多数のコピーとして存在す
る、２重鎮ＤＮＡの非染色体性のループである、プラス
ミドである。プラスミドＤＮＡ中にコードされる情報に
は、娘細胞中にプラスミドを再生産するに必要な情報（
つまり、“レプリコン″）および、そして、ふつうは、
１種または１種より多くの選択特性、たとえば、細菌の
場合では、抗生物質に対Ｊ゛る抵抗性の情報がある。こ
の情報により、対象とするプラスミドを含有する宿主１
胞のクローンを認識し、選択用の培地中に優先的に発育
さすことが可能となる。プラスミドが有用なのは、プラ
スミドＤＮＡ上の奴なる部位をそれぞれに認識する、あ
る種類または別の種類の制限エンドヌクレアーゼまたは
“制限Ｓｌ　５１０　５２０　’　５２〕 ＡＩｌ　ＥＥ’ＦＤ　（ＩＦＱＫＡ’　ｌ　ＶＬＨＥ　
！ＩＱ　ＦＮ１４＋０　２０　１０　４０ Ｈ５Ｌ　ＲＲＬ　Ｌ　ＱＭ　Ｉｓ　ＳＣＬ　Ｄ旦ＨＤＦ
　旦ＱＩＺｔ０　１５０　１６０　＋６６ Ｅ　ＫＹＳ　ＣＡｌ！！ＥＶＶｊ３ＡＥＩＭＲ５Ｓ　Ｓ
　Ｑ　’Ｌ　’　Ｋハのヌクレオヂド配列（コード鎖）
を示す。それぞれのＬｅｌＦについて、ＡＴＧの翻訳開
始コドンおよび終止トリプレットが下線で示されている
。停止コドンまたは終止コドンに続いて３′の未翻訳領
域が示されている。含まれているＬｅｌＦ　Ａの全遺伝
子長には、表２の第３列Ａラインに示されるように、他
のコドンには存在するひとつのコドンが欠如している。 ５′非翻訳域がリーダー配列に先行している。分離した
ままの断片Ｅには、リーダーの完全な先行配列は存在し
ない。しかし、仮定される成熟Ｌｅｆｔ　Ｅに対する全
遺伝子を含有する。 分離されたままの断片Ｇは、コード配列が完全でない。 表３では、ヌクレオヂド配列より示される８個のＬｅｌ
Ｆ蛋白質配列を比較している。ＩＵＰＡＣ−ＬＵＢコミ
ッション　オン　バイオケミカル　ノーメンカルヂャー
（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌＮＯｍｌＣｌａｔｕｒｅ）の提案による１文字省略が
用いられている。つまり、アラニンはＡで、システィン
はＣで、アスパラギン酸はＤで、グルタミン酸はＥで、
フェニルアラニンはＦで、グリシンはＧで、ヒスチジン
はＨで、 レグ法（ゴデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、　）等、ネ
ーチＡ７−（Ｎａｔｕｒｅ）２８７，４１１−４１６　
（１９８０））により構築された。 それで、ＣＤ　Ｎ　Ａ挿入物は、Ｐｓｔ　Ｉを用いて切
断しうる。各ｃＤＮＡ挿入物の末端のラインは、側面に
接するホモ重合ｄＣ：ｄＧテールを示す。Ｐｖｕ［。 ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ　Ｉｔの制限部位も示しである
。濃い領域は成熟ＬｅｌＦのコード配列を示す。斜線の
部分はシグナルペプチドコード配列である。白い部分は
３′および５′非コ一ド配列である。 第３図は、成熟ＬｅｌＦ　への直接的微生物合成をコー
ドする遺伝子の構築を示す。制限部位および残部が示さ
れている（　”　Ｐｓｔ　Ｉ　”等）。Ｉｌ　ｂ、　ｐ
、　１１は塩基対を示す。 第４図および第５図は、ＬｅｌＦ　Ｂ成熟白血球インク
フエロンを発現するに用いられる２つの遺伝子断片の制
限地図を示す。示したコドン配列は、示した２つの場合
について制限酵素ｓａｕ　３　ａで消化することで生成
するコード鎖末端である。 表４および表５は、タイプＩおよびＪを含めた、５個の
ＬｅｌＦ蛋白質の配列のＤＮＡおよびアミノ酸（省略符
号については、第３表に同じ）を示す。 第５表において、星印は対応するＤＮＡ配列におｔノる
終止コドンを示し、ハイフェンは配列における欠落また
はギャップを示１゜ つぎに、本発明を実施するための有利な具体例を示す。 八　使用微生物 記載した実施においては、２種の微生物、つまり、米国
特許（Ｕ、Ｓ、Ｐ、）４．１９０．４９５記載のイー、
コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｘ　１７７６およびイー。 ］す（Ｅ、ｃｏｌｉ）　に−１２２９４株（エン２０５
５３８２に記載）を用いている。それぞれ、ザ　アメリ
カン　タイプ　カルチャー　コレクション（ｔｈｅ　Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、ＡＴＣＣＮｏ、　３１５３
７および３１４４６が付されている。組換えＤＮＡの実
験のＪべては、ナショナル　インスチチュート　オブ　
ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ
　Ｈｅａｌｔｈ）の該当するガイドラインに従って実施
された。 本発明のもつとも有利な具体例は、上記定義の菌株イー
、」す（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ｘ　１７７６およびイー。 コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　に−１２菌株 ２９４のみならず、他の既知のイー、コリ（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）株（以下［、ｃｏｌｉで示す）たとえば［、ｃｏｌ
ｉ　Ｂを含めた［、Ｃ０１ｉおよび他の微生物株に関連
して記載してゆくが、これらの多くは、ザ　アメリカン
　タイプ　カルチャー　コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）のような、知られている微生物
寄託施設に寄託されており入手可能である。ドイツ特許
２６４４４３２もみられたい。これらの他の微生物には
、 バチルス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）たとえばバチルス　
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）
および他の腸内細菌たとえばサルモネラ　チフイムリウ
ム （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）お
よびセラチア　マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａ
ｒｃｃｓｃｅｎｓ　）があり、異質遺伝子配列を発現し
うる、複製しうるプラスミドを使用する。酵母たとえば
サッカロスマイセスｔ？Ｌ／ビシ７Ｉ　（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もまた、酵母
プロモーターの制御下に、インクフエＯンをコードする
遺伝子を発現させることによるインタフエロン蛋白質の
製造に用いて右利でありうる。 Ｂ、ＬｅＩＦ　ｍＲＮΔの原料および精製Ｌｅｌ’Ｆ　
ｍＲＮ　Ａは、ヒト白血球より採取しうる。 ふつうは、ドイツ特許Ｎｏ、　２９４７１３４に記載の
ように、レンダイ（５ｅｎｄａ　ｉ　）ウィルスまたは
ニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　）病ウィルスで
インタフエロンを生産するように誘導した 慢１’ｌ骨ずい性白血病患者の白血球より得たものを使
用づる。・特に有利な、本明細書の仕事に用いられる原
料は、急性骨ずい性白血病の１患者に由来１６ＫＧ−１
と称するセルラインである。このセルラインは、］フラ
ー（にｏｅＨｌｅｒ、１１．Ｐ、　）およびゴルデ（Ｇ
ｏｌｄｅ、Ｄ、Ｗ、、　）ザイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
　）２００．１１５３　（１９７８）に記載されている
ように、〔ローズウオル　パーク　メモリアルインスチ
チュートＲＰＨＩ　（ｌｌｏｓｅｗａｌｌ　Ｐａｒｋ　
ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　）　）　１６４
０プラス１０％熱不活化ＦＣ３（牛胎児血清）　、２５
　ｍＮ　ＩＩＥＰＥｓ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチ
ル−ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン１ｍ）Ｊ３
よび５０μ９／ｄのゲンタマイシン含有培地に容易に発
育し、１週間に２度、継代培善（１から３スプリツト）
しうる。 上記の発育培地に１０％ジメヂルスル小専サイドを加え
て、細胞は凍結きぜうる。ＫＧ−１は、ザアメリカン　
タイプ　カルチャー　コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ）（八１ＣＣＮｏＣＲＬ　８０３１　）に寄託さ
れている。 にＧ−１細胞は、ルピンスティン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉ
ｎ）等記載の方法ブロク、ナトル、アカド、サイ、米国
　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ　ｉ　、Ｕ、
Ｓ、＾、＞７６゜６４０−６４４　（１９７９））によ
り、レンダイ（５Ｏｎｄａｉ　）またはニューカッスル
（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　）病ウィルスを用い、白血球イ
ンクフエロンｌｌｌＲＮＡを生産するように誘導された
。細胞は、誘導後５時間に採取しＲＮＡを、グアニジン
チオシアネート−グアニジン塩酸塩法（チャーウィン（
Ｃ１１ｉｒｇｗｉｎ）等、バイオケミストリイ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１８　、　ｂ　２９４−５２９
９（１９７９））により調製した。誘導しない細胞から
のＲＮＡも同様に調製した。オリゴデオキシチミジン（
ｄＴ）−ｔルローズクロマトグラフイーおよびスクロー
スグラジエン１〜超遠心を用いて、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ
の１２Ｓ分画を得た。方法は、グリーン（Ｇｒｅｅｎ　
）等（アーク、バイオケミ、パイオフィス（Ａｒｃｈ、
Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　＞　１７２　。 ７１８９　（１９７６））およびオクユマ（Ｏｋｕｙｕ
ｍａ　）等（アーチ。バイオケミ、パイオフィス、（八
ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　＞　１
８８　、９８−１０４　（１９７８））の方法を用いた
。このｍＲＮＡは、アフリカッメガエル卵母細胞分析（
カバリーリ（Ｃａｖａｌ　１ｃｒｉ　）等、ブＯり、ナ
トル。 アカド、サイ、米国（Ｐ、ｒｏｃ、　Ｈａｔ　Ｉ　、八
ｃａｄ、Ｓｃｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、）７４．３２８７−３２９１　（１９７７
）　）で８０００−１０．０００単位／マイクログラム
のインタフエロンタイターを示す。 Ｃ，ＬｅＩＦ　ＣＤ　Ｎ　Ａ配列を含有するコロニーバ
ンクの調製 ５μ７のｍＲＮ　Ａを用い、標準方法ライケンス（Ｗｉ
ｃｋｅｎｓ　）等、ジエイ、パイオル、ケミ、（Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５３　、２４８３−２　ＩＩ
　９５（１９７８）およびゴデル（Ｇｏｅｄｄｅ　ｌ　
）等、ネーヂャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２８１　、５４４
−５４８（１９７９））により、２重鎮ｃＤ　Ｎ　Ａを
調製した。ＣＤ　Ｎ　Ａは６％ポリアクリルアミドゲル
上での電気泳動により、大きさに従って分画し、５００
から１５００ｂ、ｐ、の大きさの材料２３０　ｎ（］を
、電気溶出ににり得た。このＣＤ　Ｎ　Ａの１１００ｎ
分を、デオキシチミジン（ｄＣ）残基でテーリングしく
チャンク（Ｃｈａｎａ　）等、ネーヂャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）２７５．６１７−６２４　（１９７８）、Ｐｓｔ■
部位においてデオキシグアノシン（ｄＧ）残塁でプーリ
ング（ｔａｉｌｉｎｏ　）　Ｌ／た４７０ｎｕのプラス
ミドｐＢｌｌ　３２２とアニーリングしくポリバー（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ　）等、ジエイン（Ｇｅｎｅ）　２．９５
−１１３（１９７’７））、これを用いてＥ、ｃｏｌｉ
ｘ　１７７６を形質転換した。ｃＤ　Ｎ　Ａ　ｎｏにつ
いて約１３０個のテトラサイクリン抵抗性で、アンピシ
リン感受性の形質転換株を得た。 Ｂ、Ｃ，Ｄ＞または一つ（−ｒ−１３Ａ、［３，Ｃ。 Ｄ）のオリゴヌクレオチドを含有する。示した相補的デ
オキシオリゴヌクレオチド１１塩す鎖長は、ホスホトリ
エステル法で化学的に合成しｌ〔（フレア（Ｃｒｃａ）
’Ｊ、ブロク、す１ヘル、アカド、サイ。 米国　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、八ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ
、ｓ　八、）　７＼−５、５７６５−５７６９（１９７
８））。Ｔ　−１３シリーズでは、４個の個々のプ１］
−ブを調製した。表１に示すように、３個のプローブの
４プールとして、１２個のＴ−１プローブを調製した。 Ｔ−１３シリーズの４個のそれぞれのプローブおよび各
３個のプライマーの４プールとして調製した１２個の１
−−１プローブを、バイブリド化プローブに用いるため
の放射ラベル１重鎮ＣＩ）ＮＡの合成を誘導するために
用いた。鋳型ｍＲＮ　Ａは、センダイ誘導ＫＧ−１細胞
（８０００単位Ｉ［活性／μ９）からの１２ＳＲＮＡま
たは非誘導白血球（〈１０単位／μｇ）に由来する全ポ
リ（Ａ）ｍＲＮＡである。３２ｐ−ラベルＣＤ　Ｎ　Ａ
を、既知の反応条件（ノイズ（Ｎｏｙｅｓ　）等、ブロ
ク、ナトル、アカド、ザイ、米国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、、）７６．１７７０−１７７４　（１９７
９））を用いて、これらのブライＹ−より調製した。 ２０ｍＨｔ−リス（Ｔｒｉｓ）　（以下Ｔｒｉｓで示す
）　−１１ｃＩ（１１１１８，３）　、２０ｍＨＫＣｌ
、　８ｍＨＨｇＣｌ２．３０ｍＨβ−メルカプトエタノ
ール中で６０μｍ容量の反応をおこなった。この反応は
、各プライマーの１μｇ（つまり、−「−１シリースに
ついては、全部で１２μｙ、Ｔ−１３シリースについて
は全部で４μｇ）、２μｑの゛誘導″された１２８分画
ｍＲＮＡ（または、非誘導ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ３０００
　Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌｅ）および６０単位逆転写酵素〔ベ
レスダ　リリーーヂ　ラボラトリイス（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　
）である。 生成物は、１０威セフアデツクス（５ｅｐｈａｄｅｘ■
）■ （以下Ｓ　ｅ　ｐ　ｌ＋　ａ　ｄ　ｅ　ｘで示ｔ）Ｇ−
５０カラム上のゲル濾過により、結合されなかったラベ
ルより分け、７０’Ｃで３０分間０．３ＮＮａ叶で処理
し、ＲＮＡを分解し、ＩＩｃＩで中和した。バイブリド
化は、カファーヘス（にａｆａｔｏｓ　）等、ヌクレイ
ツク　アシトリ１ナーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　
Ｒｅｓ、　）ヱ、１５４１−１５５２　（１９７９）記
載に準じて実施した。 ［、り［１−ンｐＬ１−ｐＬ３０の同定５００個の［、
ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株２９４形質転換株〈０項参照）
のそれぞれより、プラスミドＤＮＡの１μ９を調製する
のに、バーンボイム（Ｂｉｌ’ｎｌｌＯｉｍ）　′８、
ヌクレイツク　アシド　リサーチ“　（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　７　、　１　５　１　３　
−１５２３　（１９７９）の迅速プラスミド分離操作を
用いた。各ＤＮＡ試料を変成させ、カファトス（Ｋａｆ
ａｔｏｓ　）等の上記引用の方法に従い、３反１ｕｒ二
］〜ロセルローズフイルター上につけた。 ５００個のプラスミド試料を含有Ｊるニトロゼルロース
フィルターの３相は、 ａ）プライマーのＴ−１のセットでプライムされた誘導
ＣＤ　Ｎ　Ａ　。 ｂ）Ｔ−１３でプライムされた誘導ＣＤ　Ｎ　Ａおよび Ｃ）プライマーの両方のセラ１〜を用いて調製された非
誘導ｃＤ　Ｎ　Ａとハイブリダイズした。非誘導プロー
ブの全体に対づ−るＪ、りも誘導されたｃＤ　Ｎ　Ａプ
ローブの一方または両方に対してより強くバイブリド化
するならば、クローンは陽性と考えた。５００個より３
０個の゛陽性”′クローン１）Ｌ　１−１）Ｌ３０　）
を選択し、さらに分析した。 「クローンｐＬ３１−１）Ｌ３９の同定、ＬｅｌＦｉ伝
予断１１を含有するプラスミド（Ｎｏ、１０４）の分離
プローブとして３２ｐ−ラベル誘導＋＋＋ＲＮＡリーレ
ンホーグ（Ｌｉ　ｌ　ｌｅｎｈａｕｇ　）等、バイオケ
ミストリー（（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　）　１５
．１８５８−１８６５　（１９７６）’）を用いて、グ
ランスティン（Ｇｒｕｎｓｔｃｉｎ　）および小グネス
（ｌｌｏｇｎｅｓｓ　）のコロニーバイブリド化法（ブ
ロク、ナトル、アカド、サイ、米国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ　、　Ｕ、　Ｓ、八、）五２
．３９６１−３９６５　（１９７５））によりＦ、ｃｏ
ｌｉｘ　１７７６の形質転換株をスクリーニングした。 非誘導細胞よりの非ラベルｍＲＮＡを３２ｐ−ラベル調
製物中に存在する非誘導ｍＲＮ　Ａと競合さすために、
プローブに対して２００対１に混合した。ラベルされた １１１ＲＮＡのバイブリド化は、誘導された配列を含Ｒ
−Ｊるコロニーに選択的に起るはづである。３つのｌ！
Ｔの形質転換株が得られた。 （１）コロニーの２から３％が３２１）−ｎ＋ＲＮＡに
非常に強くバイブリド化した。 （２１１０％は、バイブリド化の程度が、上記１１１１
！’ｌ’より著しく低かった。 （３）　残りは、検出しつる程度のバイブリド化のシグ
ナルを示さなかった。 陽性のコロニー（第（１）および第（２）群）について
は、インタフエロンｍＲＮＡがプラスミドＤＮＡに特異
的にバイブリド化することによる分析で、インクフエロ
ンに特異的な配列の存在について調べた。まず、テトラ
リイクリン（２０μｇ／ｉｆり、ジアミノピメリンＭ（
１００μｙ、”＊＞　、チミジン（２０μ’ｊ／ｒｄ＞
およびｄ−ビオチン（１μ９／ｄ）を加えたＭ９培地の
１００ｄに、６０個の強固性コロニー（第１群）のそれ
ぞれを個別的に発育させた。Ｍ９培地は、１リツトルに
ついて、Ｎａ　ＩＩＰＯ（６ｇ＞、にｌｌ２ＰＯ４（３
９）　、ＮａＣ１４ （０，５１および１ｎ４ｃｌ（ｉｓ）を含有し、オー１
−クレーブしたあと、無菌１１４ＨｇＳ０４の１ｄおよ
び無菌０．　ＯＩ　ＨＣａＣｌ２の１０ｎｌｉ！を添加
する。 １０個の培養物はプールし、フレベル（Ｎｅｗａｌｌ）
等、バイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｂｃ＋ｎ１ｓｔｒｙ
）　９　。 ４４２８−４４０　（１９７０）記載のように、６個の
プールよりプラスミドＤＮＡを分離した。各プラスミド
ＤＮＡプールの １０μ９は、１ｌｉｎｄｌｌｌで切断し、変性し、ＤＢ
Ｍ（ジアゾベンジルオキイメチル）紙に共有結合さＩ！
Ｉこ。誘導細胞よりの粘製のｍＲＮ　Ａの１μ９をそれ
ぞれの濾紙にバイブリドさせた。バイブリドしないｍＲ
ＮＡは洗って除去した。特異的にバイブリドされたｍＲ
Ｎ　Ａは溶出し、アフリカッメガエルの卵母細胞中で翻
訳さｌだ。この分析で、６個のプールはづべて陰性であ
った。装置性のコロニー（第２群）の５９個より、各１
０コロニーの５プールと９コロニーの１プールを調製し
、それらのプールよりプラスミドを調製し、上記のよう
に調べた。試験した６個のプールのうち、１個（ＫＩＯ
）は、試験の度に、バックグラウンドレベルを著しく超
えるレベルで、インクフエロンｍＲＮＡにバイブリドし
た。、特異的インタフエロンｃＤＮＡクローンを同定す
るために、プールに１０の９コロニーよりプラスミドＤ
ＮＡを調製し、個別的に調べた。９個のプラスミドのう
ちの２個（Ｎ（１，１０１およびＮｏ、　１０４　）が
インクフエロン＋１１ＲＮ　Ａと、バックグラウンドレ
ベルを十分に超えて結合した。プラスミドＮｏ、　１０
４より、２６０ｂ、　ｐ、を含有する、独特のＢ（１１
ｍ制限断片を分離し１ｃ０これを、ティラー（Ｔａｙｌ
ｏｒ）等、バイオケミ。 パイオフィス、アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、八ｃｔａ）４４２．３２４−３３０　（１９７６）
の方法によ２ リ　ｐでラベルし、その場でのコロニースクリーニング
法（グランスーｒイン等（ｃｒｕｎｓｔｃｉｎ　ａｎｄ
ｌｌｏ（］ｎｅＳＳ）、プ［］り、ナトル、サイ、米国
（ＰｒｏｃＮａｔｌ、ＳＣｉ、Ｕ、Ｓ、八、）　７２．
　３９６１−３９６５（１９７５））ににすＥ、ｃｏｌ
ｉ　２９４転換株の４００個を、個別的にスクリーニン
グするためのプローブに用いた。このプローブと種々の
程度にバイブリド化する、９個のコロニー（ｐＬ３１−
ｐＬ３９　）を同定した。 さらに、ラベルされた２６０ｂ、ｌ）、断片を用いて、
同様にして、４０００個の［：、Ｃ０１ｉ２９４転換株
を個別的にスクリーニングした。このプローブと秤種の
程度にバイブリドする５０個のコロニーを同定した。ひ
とつは、ＬｅｌＦ　Ｇ断片を、ひとつは、ＬｅｌＦ　Ｈ
断片を、ひとつはＬｅｌＦ旧と称する断片くみかけ上、
ＬｅｌＦ　Ｉｆの対立遺伝子である）を含有した。生ず
るバイブリドプラスミドは、ｐＬｃｌＦ１１°′等と称
した。 Ｇ、最初の完全長ＬｅＩＦ３ｕ伝子の分離および配列の
決定 全体で３９個の可能性のあるＬｅｌＦ　ｃＤ　Ｎ　Ａク
ローンよりプラスミドＤＮＡを調製した。そして、カフ
ァトス（Ｋａｆａｔｏｓ　）等（上記引用）のバイブリ
ド化操作により、同じ２６０ｂ、ｐ、ＤＮＡブ［１−ブ
を用い再スクリーニングした。このプローブと３個のプ
ラスミド（ｐＬ４　、　ｐＬ３１　、　ｐＬ３４　）は
非常に強いバイブリド化シグナルを与え、４個（ｐＬｌ
　３．　ｐＬ３０．　ｐＬ３２．　ｐＬ３６）は中程度
にバイブリド化し、３個（ｐＬ６　、　ｐＬ８　、　ｐ
Ｌｌ　４　）は７、弱くバイブリド化した。 ３９個の可能性のあるＬｅｌＦ　ｃＤ　Ｎ　Ａ組換えプ
ラスミドは、また、３２ｐ−ラベル合成ウンデカマー（
Ｔ−１プライマープールのそれぞれまＩＣはＴ−１３プ
ライマーのそれぞれ）をじかにバイブリド化のプローブ
に用いて検索した。検出しうるハイ　。 ブリド化のシグナルを与えるのに完全な塩基間の対が必
要であるように、バイブリド化の条件を選んだ（ワラン
ス（Ｗａｌｌａｃｅ　）等、ヌクレイツクアシド　リリ
ーーヂ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　）旦、
３５４３−３５５７　（１９７９））。つまり、３９個
のクローンよりプラスミドＤＮＡを、標準上澄液法（ｃ
ｌｅａｒｅｄ　＋ｙｓａｔｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；フ
レベル（Ｃｌｅｗｅｌｌ）等、上記）で調製し、バイオ
ラド　アガロ−ス（Ｂｉｏｒａｄ　Ａｇａｒｏｓｅ）　
Ａ−５０カラムクロマトグラフイーで精製した。各調製
物の試料（３μｇ）は、ＥｃｏＲ■で処理して開環し、
アルノＪりで変性させ、２枚の別々のニトロしルロース
フィルターにスポットした。１スポツトについて１．５
μりとする。上記引用のカフ７１ヘス（にａｒａｔｏｓ
　）等の文献をみよ。合成デオキシオリゴヌクレンチド
プライマーおよびプライマープールのそれぞれは、（γ
３２Ｐ）ＡＴＰでつぎのようにリン酸化した。５　Ｑ　
ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドおよび１００　ｐｍｏ
ｌｅの（７３２Ｐ）ＡＴＰにュー　イングランド　ニュ
ーフレア−（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）
、２５００Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌｅ）を、５０ｎ＋ＨのＴｒ
ｉｓ−ＩＣ！、　１０ｍＨのＨｇＣ１，および１５ｍＭ
のβ−メルカプトエタノールの混合物の３０μｍ中で合
併した。２単位のＴ４ポリヌクレオヂドキナーゼを添加
し、３７℃で３０分後３２ｐ−ラベルプライマーは、１
０Ｉｄセフアデツクス（５ｅｐｈａｄｅｘ■）Ｇ−５０
カラム上でのク ロマトグラフィーで精製した。１Ｑ６ｃｐｍのブラライ
マーＴ−１３Ｃまたは３ｘ１６６ｃｐｍのプライマープ
ールＴ−１０を用いてバイブリド化した。 バイブリド化は、ワランス（Ｗａｌｌａｃｅ　）等の上
記引用の方法に従って、６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０、
１５ＨＮａＣ１，０，０１５８＜えん酸ナトリウム、ａ
ｌ１７．２）　、１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔｓ　（０，２
％生血清アルブミン、０．２％ポリビニルピロリドン、
０．２％Ｆｉｃｏｌｌ）溶液中で、１５℃で１４時間バ
イブリド化した。フィルターは６ＸＳＳＣＸＳＳＣ中介
間宛３度洗った。乾燥し、Ｘ−線フイルムにさらした。 結果は、第１図に、３２ｐ−プライマープールＴ−１３
Ｇおよびプライマー−Ｔ−ＩＣの場合について示しであ
る。 クローン１０４からのプラスミドＤＮＡは、プライマー
プールＴ　−Ｉ　Ｃ，およびプライマー−「−１３Ｃと
顕著にバイブリド化した。しかし、他のウンデカマーと
は、検出しうる程のバイブリド化は示さなかった。第１
図に示すように、３９個の面性のあるＬｅｌｌ−プラス
ミドのうちのいくらか（ｐＬ２．　Ａ、、１３．　１　
７．　２０．　３０．　３１゜３４）はこれらのプロー
ブの両方とバイブリド化した。しかし、制限分析から、
これらのプラスミドのうちのひとつたり、　１１１３１
が２６０ｂ、ｐ内部Ｂ（１１■断片をも含有した。ｐＬ
３１をＰｓｔ　Ｉで浦化した結果、ＣＤ　Ｎ　Ａ挿入物
の大きさは約１０００ｂ１）、であった。 ｐ［３１のＰｓｔ　Ｉ挿入物全体の配列を、マキシム−
ギルバート（１４ａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ　）化学法
（メソード　エン９７１モル、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、　）　５５　。 ／１．９９−５６０　（１９８０））おにびジブ第４ニ
ジ鎮末端化方法（スミス、メソード　エンｌアイセル（
Ｓｍｉｔｂ　１４ｅｔｈｏｄｓ　［ｎｚｙｍｏｌ、　）
　６５　、５６０−５８０　（１９８０））で決定した
。その際、５ａＵ３　ａ断片を８１３ベクター中にサブ
クローン化しＣおいた。ＤＮＡ配列は表２のＡ″に示し
である。入手しうる蛋白質配列についての情報、既知の
ＬｅＩＦ分子ｍ分子間、３個の可能な読み枠における停
止トリプシン１〜の相対的な存在にり適当なｉｌｌ訳読
み枠が示唆された。それから、プレーまｌｃはシグナル
ペプチドを含めてＬｅｌＦアミノ酸全配列が示された。 第１のＡＴＧ翻訳間始］トンは、配列ＬｃｌＦ　Ａを成
熟インクフエ０ンポリペプチドとして直接に発現させる
ための操作は、合成〈Ｎ−末端）および相補的ＤＮＡの
組合せを包含する点でヒト生長ホルモンに用いられた方
法（ゴデル（Ｇｏｃｄｄｅｌ　）等、ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　２８１　。 ５４４−５４８　（１９７９）の−変形である。 第３図に示すように、ｓａｕ　３’ａ制限工ンドヌクレ
アーゼ部位は、便宜なことに、ＬｅｌＦ　Ａのコドン１
および３どのあいだに存在Ｊる。ＡＴＧ翻訳聞始］トン
を含有し、アミノ酸１（システィン）に対するコドンを
修復し、ＥｃｏＲＩ粘着末端を新しく作製Ｊ゛ることを
包含Ｊる、２つの合成デオキシオリゴヌクレオヂドをデ
ザインしに０これらのオリゴマーは、ｐ［３１の３４ｂ
、ｐ、Ｓａｕ　３ａ　−Ａｖａ　ＩＩ断ト冒こ連結した
。生ずる４５ｂ、ｐ、生成物は２つの追加のＤＮＡ断片
に連結させ、８６５ｂ、Ｉ）、合成−天然雑種遺伝子と
した。これは、ＬｅｌＦ　Ａを］−ドし、ＥｃｏＲ：［
およびＰＳｔ　Ｉ制限部位によりはさまれている。この
遺伝子は、Ｅｃｏｌｔ　ＩおにびＰｓｔ　Ｉ部位のあい
だにおいて、ｐＢｌｌ　３２２に挿入し、プラスミドｐ
ＬｅｌＦ　ＡＩとした。 ２、トリプトファン調節要素（Ｅ、ｃｏｌｉ　ｔｒＤプ
ロモーター、オペレーターおよびｔｒｐリーダーリボゾ
ーム結合部位を含有するが翻訳開始のためのＡＴＧ配列
を欠如する）の構築 プラスミドルＧ旧は、欠失ΔＬＥ　１４１３を含有する
Ｅ、Ｃ０１ｉｌ−リプトファンオペロンを担う（ミオザ
リ（旧ｏｚｚａｒｉ　）等、ジエイ、バクテリオロジイ
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ（ｌｙ）　１３３　、１４
５７−１４６６　（１９７８））。それゆえに、ｔｒｐ
リーダーの最初の６個のアミノ酸モしてｔｒＤ　Ｅポリ
ペプチドのおよそ最後の１／３　（以降、あわせてＬＥ
’　と称する）ならびにｔｒｌｌ　Ｄポリペプチドの全
体を含有する融合蛋白質を発現する。これはサベてｔｒ
ｐプロモーター−オペレーターシステムの調節下にある
。このプラスミド２０μ３を制限酵素ＰＶＬＩ　Ｉ［で
消化した。これは、プラスミドを５個の部位において切
１ｇｉする。この遺伝子断片はついでＥｃｏＲＩリンカ
−（ＤＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧの自己相補性のオリゴ
ヌクレオチドより成立つ）と結合させ、あとから、Ｅｃ
ｏＲｌ：部位含有プラスミド中にクローた。透析バッグ
より水溶液を採取し、フェノール抽出、クロロホルム抽
出、０．２Ｍｍ化す１〜リウム濃度とし、エタノール沈
殿後水中にＤＮＡを採取した。ＥｃｏＲＩ粘着末端を有
するｔｒｐプロモーター−オペレーター含有遺伝子は、
つぎに記載りる操作で同定した。つまり、テトラサイク
リン感受性プラスミドに断片を挿入し、これは、プロモ
ーター−オペレーターの挿入で、テトラサイクリン抵抗
性とした。 プラスミドｐＢＲ旧　（ロドリゲズ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅ
ｚ　）等、ヌクレイツク　アシド　リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｃｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、＞　６．３２６７−３２８
７　（１９７９））は、アンピシリン抵抗性を発現しそ
して、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を含有する。しか
し、それに組合わされたプロモーターが存在しないので
、その抵抗性を発現しない。このプラスミドは従ってテ
トラサイクリン感受性である。このＥｃｏＲＩ部位にプ
ロモーター−オペレーターシステムを導入することによ
り、プラスミドをテトラサイクリン抵抗性となしうる。 ｐＢＲｌｌｌをＥｃｏＲＩで消化し、酵素はフェノール
抽出クロロホルム抽出で除去し、エタノール沈殿させて
水中にうる。別々の反応混合物中に存在する生成りＮＡ
分子は、上記に得られた３個のＩ）　Ｎ　Ａ断片のそれ
ぞれと合併し、そして、前記のように、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結させた。反応混合物中に存在するＤＮＡを用
いて、標準方法 （バーシュフィールド（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ）等、ブ
ロク。 ナトル、アカド、サイ、米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　）　７１．３４
５５−３４５９（１９７４））によりＤＮＡとり込み能
のある［。 ｃｏｌｉに一１２株２９４を形質転換し、この細菌を、
２０μ９／ｍｅのアンピシリンおよび５μｇ／ｄのテト
ラサイクリンを含有するＬ　Ｂ　（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒ
ｔａｎｉ　）プレートに接種した。いくつかのテトラサ
イクリン抵抗性コロニーを選び、プラスミドＤＮＡを分
離しそして、望む断片の存在を制限酵素分析で確かめた
。生ずるプラスミドをｐＢ旧Ｉ　ｔｒｐと称する。 肝炎Ｂのウィルスゲノムの［ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
消化生成物を常法により採取し、プラスミドｐＧＩＩ６
のＥｃｏＲ■およびＢａｍｌｌＩ部位にクローン化しく
ゴデル（Ｇｏｅｄｄｅ　ｌ　）等、ネーチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）２８１．５４４ （１９７９））、プラスミドｐＨ３３２とする。プラス
ミドｐＨｓ　３２をｘｂａ　Ｉで切断し、フェノール抽
出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。沈
殿は、０　、１　ｍＨｄＴＴＰおよびＱ、１ｍＨｄＣＴ
Ｐを含有する３０μｍポリメラーゼ緩衝液（５０ｎ＋Ｍ
リン酸カリウムｐＨ７，４，７１１１８８（ＩＣＩ２゜
〔ベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−
Ｈａｎｎｈｅｉｍ）　）で、０℃で３０分、ついで３７
℃で２時間処理した。この処理でｘｂａ　Ｉ切断部位の
５′突出末端に相補的な４個のヌクレオチドのうちの２
個がみたされる。 ５’　ＣＴＡＧＡ−５’　ＣＴＡＧＡ−３’　Ｔ−ＴＣ
Ｔ− ２つのヌクレオチドｄＣおよびｄＴが組込まれて２つの
突出する５′ヌクレオチドを有する末端を与える。プラ
スミド１１１１５３２　（フェノールおよびクロロホル
ム抽出後エタノール沈殿させて水に取る）のこの直鎖残
基を、ＥｃｏＲＩで切断した。人型プラスミド断片を、
ＰＡＧＥで、より小さい−ＴＣＴＡＧＡ−−ＴＣＴＡＧ
Ａ− −ＡＧＣＴＣＴ−−ＡＧＡＴＣＴ− これらのプラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａ　Ｉの
両方で切断されて、期待される制限断片を与えることも
分った。１ｌＴｒｌ）１４と称するひとつのプラスミド
を、つぎに論議するように異質のポリベブヂドを発現さ
１のに用いた。 プラスミドｐＨＧＩ＋１０７　（ゴデル（Ｇｏｅｄｄｅ
　ｌ　）等、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８１．５４
４　（１９７９）は、合成りＮＡ断片より生成された２
３個のアミノｌ１ｍｍ］トンおよびヒト生長ホルモンメ
ツセンジＡ７−ＲＮＡの逆転写で生成される相補的ＤＮ
Ａよりｊｕられる１６３個のアミノ酸コドンより成立つ
ヒト生長ホルモンに対する遺伝子を含んでいる。この遺
伝子は、ヒト生長ホルモンの゛先行″配列のコドンを欠
如Ｊるけれども、ＡＴＣ翻訳開始コドンを含有する。こ
の遺伝子は、１０μｐＨＧ１１１０７より、ＥｃｏＲＩ
処理、それに続く、上記のような［。 ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩクレノー（にＩｅ！ｎ０
Ｗ）（以下にｌｅｎｏｗで示す）断片およびｄＴＴＰお
よびｄＡＴＰ処理を経て分−１した。フェノールおよび
クロロホルム抽 ５’−ｄＧＡＴＣＡＣＡＣ＾ＴＧ（断片２）はホスホト
リエステル法で合成しｌＣ０断片２はつぎのようにリン
酸化した。２００μｌ　（約４０ｐｍｏｌｅ　）　（７
）　（７３２Ｐ　）ＡＴＰ　（７メルシヤム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）　、　５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ　）を乾燥
し、５ＱｍＨのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８）　、１０ｍ
ＨのＨ（ＩＣ＋２．１５ｍＨβ−メルカプトエタノール
より成立つ、１００ｐｍｏｌｅ　（７）Ｄ　Ｎ　Ａ断片
および２単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ含有溶液
３０μＩに再懸濁した。３７℃で１５分後、１μｍの１
Ｏｎ＋ＨのＡＴＰを添加し、反応はさらに１５分進行さ
せた。混合物はついで７０℃で１５分加熱し、１００１
）ｍｏｌｅの５’　−ＯＨ断片１およびｌ　Ｑ　ｐｌｏ
ｌｅの３４　ｂ、ｐ、Ｓａｕ　３　ａ　Ａｖａ　ＩＩ　
ｔ！ｌｉ片と合併した。２０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（
ｐＨ７，５）、１０１１１８　８（ＩＣ＋２．１０ｍ１
ｌジチオスレイトール、０．５ｍＨＡＴＰおよび１０単
位Ｔ４ＤＮＡリガーゼの５０μｍ中で５時間４℃で連結
させた。混合物は６％ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動し、４５　ｂ、ｐ、生成物を電気溶出で採取した。 ４５ｂ、　ｐ、生成物の３０ｎｇ（１ｐｍｏｌｅ　）を
、１５０ｂ、ｐ　八ｖａｌ− （０，１μｇ）に連結させた。ｔｒｐプロモーターを含
有する転換物は、グランステインーホグネス（ＧｒＬＩ
ｎＳｔＱｉｎ−１１０（ｌｎＯ３ｓ　）　：］ロニース
クリーニング法と組合わせて、３２Ｐｔｒｐプローブを
用いて同定した。（ｒｐ　Ｉｔ柱片中非対称的に位置し
ているＸｂａＩ部位は、ｔｒｐプロモーターが、Ｌｅｌ
Ｆ　Ａｆｉ伝子の方向に配向している、組換え生成物の
同定を可能とした。 １、ＬｅｌＦ　Ａのインビトロおよびインビボ活性ＩＦ
分析のための抽出物をつぎのように調製した。培養物の
１蔵を５μｇ／ｄのテトラサイクリンを含有するＬブロ
ス中で発育させ、Ａ　５５０値を約１．０とし、ついで
、５μ５１／ｄのテトラサイクリンを含有するＭ９培地
２５ｄ中に希釈した。 Ａ３５ｏが１．０に達した時に１０Ｉｄの試料を遠心採
取し、細胞塊を、１５％スクロース、５ＱｍＨＴｒ　ｉ
　５−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　、５０ｍＭＥＤＴＡの
”ｆｌｎＲ中に懸濁させた。１　ｍｙのリゾチームを添
加し、０℃５分のあと、細胞は超音波処理で破壊した。 試料は１０分間（１５，ＯＯＯｒｐｍ　）て遠心し、上
清中のインクフエロン活性を、細胞表７　Ｅ、ｃｏｌｉ
２９４／ｐＬｅｌＦ八２５抽出物と標準ＬｅｌＦ＊との
活性比較 本人６に記載のＥ、ｃｏｌｉ２９４　／　ｐＬｅｌＦ　
八ｔｒｐ　２５の抽出物ｄあたり２５０．０００単位を
、最小必須培地で５００倍希釈し、５００単位／Ｉｄの
比活性とした。白血球インタフエロン標準〔ワドレイイ
ンスチチュート（Ｗａｄｌｅｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）
　）をあらかじめＮＩＨ白血白血球インタフンロン標準
して、タイターをめて、やはり５００１Ｊ／ｍ１の最終
濃度に希釈した。１ｄ量をｌＮ１ｌＣｌでｐ１１２とし
、４　’Ｃで５２時間インキュベートし、Ｎ　ａ　ＯＨ
を添加中和し、ＩＦ活性を標準ＣＰＥ阻止分析で測定し
ＩＣ０５００単位／ｄ試料（未処理）の２５μｍ分を２
５μｍのウサギ抗− は、１００×しＤ５ｏＥＭＣウィルス（マウスで測定）
を筋肉内感染させた。対照感染サルは、感染後１３４．
１５８．１６４時間に死亡した。 １０６単位インクフエロン処理は、感染前４時間、感染
後２．２３．２９．４８．７２．１６８および２４０時
間目に静脈内投与した。細菌性白血球インクフエロンは
、Ｅ、ｃｏｌｉ２９４／ＤＬｅｌＦ　Ａ　２５の融解物
よりのカラムクロマト分画で、比活性７．４Ｘ１０６単
位／■蛋白質であった。対照細菌蛋白質は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　２９４　／ρＢＲ３２２融解物にりの相当するカラ
ム分画で、２倍の全蛋白質量とした。白血球インクフエ
ロン標準は、クロマトグラフィーで、３２Ｘ１０６単位
／ｍｙ蛋白質の比活性にＮ’Ｈした、正常のヒト“バッ
フイー］−ト″細胞よりのセンダイ（５ｅｎｄａ　ｉ　
）ウィルス誘導インタフエロンであった。 対照のサルは、序々に進行する昏睡、バランスの消失、
後肢の弛緩、まひそして死亡前８時間頃より開始する涙
の流出を示した。インタフエロン処理サルは、これらの
異常はまったく示さず、常グランスティン（Ｇｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ　）およびホグネス（ｔｌｏｇｎｅｓｓ　）の
インシト１クーコロニースクリーニング法により、上記
０項におけると同様に得られた、追加のＥ、ｃｏｌｉ２
９４の転換株をスクリーニングした。種々の程度にプロ
ーブにバイブリド化したコロニーを単離した。これらの
コロニーからのプラスミドＤＮＡおよび上記Ｇ項に示し
た１０個のバイブリド化コロニーからのプラスミドＤＮ
Ａを、Ｐｓｔ　Ｉ切断により分離し、３つの方法で特徴
づりた。第１に、これらのＰｓｔ断片を、酵素Ｂｇｌ■
、Ｐｖｕ　ｌ［およびＥｃｏＲＩを用いる制限エンドメ
クレアーゼ消化パターンで特徴づりた。この分析は、第
２図に示した、少なくとも８種の異なる型（ＬｅｌＦ＾
、ＬｅｌｒＢ、　ＬｅｌＦ　Ｃ，ＬｅｌＦ　Ｄ、　Ｌｅ
ｌＦ　Ｅ。 ＬｅｌＦ　Ｆ、ＬｅｌＦ　ＧおよびＬｅｌＦ　Ｉｆ）の
分類を可能とした。これは、これまでに知られているＬ
ｅｌＦ　Ａの先行配列およびコード配列に関する、種々
の制限切面点のおおよその位置を示している。これらの
うちのびとツＬｅｌＦＤは、ナガタ（Ｎａｇａｔａ　）
等がネーヂャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２　Ｂ　４．３１６
−３２０（１９８０）に報告したのと同じと信ぜられる
。 第２に、それらＤＮＡのいくつかについて、ポリーＡ含
有ＫＧ−１１１１１胞ＲＮΔより、［ｅＩＦｍＲＮΔを
選択的に除去する能力について、クリーブランド（Ｃ１
ｅｖｅｌａｎｄ　）等がセル（Ｃｅｌｌ）−と川、９５
−１０５　（１９８０）に記載したハイブリッド化選択
分析により調べた。ＬｅｌＦ八、Ｂ、Ｃおよび「はこの
分析で陽性であった。第３に、これらのＰｓｔ　ｆＩｌ
ｉ片を発現プラスミドに挿入し、Ｅ。 ｃｏｌｉ　２９４をそのプラスミドで形質転換し、断片
を発現させた。プレインクフエロンと信ぜられる発現生
成物は、ＬｅｌＦ　ＦＩｇｉ片がかろうじて陽性以外は
、イタフエＯン活性に対するＣＰＥ分析ですべて陽性で
あった。上記に加えて、上記のＬｅｌＦ型の１べてにつ
いて配列を定めた。 Ｋ、第２の成熟白血球インクフエロン（ＬｅｌＦ　Ｂ）
の直接発現 成熟ｔｅｌＦ　Ｂに対する）真仏子を含有する分離断片
の配列は、型ＡおよびＢの最初の１４個のヌクレオチド
が同じであることを示す。、それで、ｔｒｐ　−プロモ
ーター−オペレーター、リボゾーム結合部に一１２株２
９４を転換した。 転換株はミニスクリーニング（バーンボイム（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ）等、ヌクレイツク　アシド　リ゛ｌ少−チ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）ヱ、１５１
３−１５２３　（１９７９））に処し、プラスミド試料
はＥｃｏＲＩで消化した。消化物は３個のｒｇＩハを与
えたが、それらの特徴は、１）ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
　ｔｒｐプロモーター断片；２）ＤＬ４の内部ＥｃｏＲ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片；および３）Ｉ）Ｌ４の蛋白質翻訳
開始シグナル−ＥｃｏＲＩ　ｌｌｉ片。 ＣＰＥ分析で、上記のように［Ｊしたクローンより細菌
抽出物は、代表的には、Ａ３５０−１で約１０×１０６
単位／１のインタフエロン活性を与えた。このように調
製されたひとつの代表的なりローンは、Ｅ、ｃｏｌｉ２
９４／　ｐＬｅｌＦ　Ｂ　ｔｒｐ　７である。このクロ
ーンはＡＴＣＣに寄託されている。 ［、さらに別の成熟白血球インクフエＯン（ｔｅｌＦＣ
、［）　、Ｆ　、１１　、ＩおよびＪ）の直接発現他の
ＬｅｌＦタイプを含有する追加の完全長遺伝子断片は、
ＬｅｌＦ　Ａにおけると同様に、ティラーし発現のため
の発現ビヒクル中におきつる。成熟トラサイクリン抵抗
性遺伝子が成熟ＬｅｌＦ　Ｆの遺伝子とあわせて、ｔｒ
ｐプロモーター−オペレーターの調節下に入るようにな
っており、それで、望むプラスミドで転換した細菌は、
テトラサイクリン含有プレート上で選択しうる。このよ
うに調製された代表的クローンは、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−
１２株２９４／　ｐＬｅｌＦ　Ｆ　ｔｒｐ　１である。 このクローンはＡＴＣＣに寄託されている。 ＬｅｌＦ　Ｈ 完全ＬｅｌＦ　Ｉｌｌｌｌ金子成熟白血球インタフエ［
１ンとして発現さずために、つぎのように配列しつる。 １、プラスミドｐＬｅＩＦ　ＨをＨａｅ　［およびＲｓ
ａ　Ｉ消化に処して、シグナルペプチドアミノ酸１０か
ら３′非コード領域までに及ぶ８１６ｂ、ｐ、断片を分
離する。 ２、この断片を変性し、ＤＮＡポリメラーゼエのＫｌｅ
ｎｏｗｉ片（クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）等、ブロク、ナ
トル、アカド、ザイ、米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八
ｃａｄ　。 Ｓｃｉ、Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　）　６５．１６８（１９７０
））により、合成デオキシリボオリゴヌクレオチドプラ
イマー離し、段階（５）の生成物と連結させて発現プラ
スミドとしうる。これは、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株
２９４または他の宿主細菌の転換に用いて、成熟Ｌｅｌ
Ｆ　Ｈを発現しうる。 ｅｌＦ　Ｉ ローン（Ｌａｗｎ）等により構成されたヒ１−ゲノムの
フェースλ　Ｃｈａｒｏｎ　４　Ａ組換えライブラリー
（セ）Ｌｔ　（Ｃｅｌｌ）　、上５，１１５７（１９７
８））を、上記引用のローン（Ｌａｗｎ）等の方法およ
びマニアチス（Ｈａｎｉａｔｉｓ）等、セル（Ｃｅｌｌ
）１支。 ６８７　（１９７８）の方法により、白血球インタフエ
ロンに関してスクリーニングした。ＣＤ　Ｎ　Ａクロー
ンＬｅｆ「Ａに由来する放射性ＬｅｌＦプローブを用い
て、約５００．０００個のプラークをスクリーニングし
た。６個のＬｅｌＦゲノムクローンを選び出し１＝、亘
スクリーニングおよびプラーク精製につづいて、これら
のクローンのうちのひとつλＩＩＬｅｌＦ　２を選びさ
らに分析した。 上記の方法を用いて、他のプローブも、ヒ１−ゲノムか
らその他のＬｅｌＦクローンを分離するのに有利に用い
うる。ついで、これらは、本発明によるタフエロンを含
めた細胞蛋白質の大部分は上清に留まる。 ２、　硫酸アンモニウム分画。ここで、インクフエロン
は、５５％飽和硫酸アンモニウムの溶液中から析出する
。 ３、硫酸アンモニウムベレットを０．０６Ｍリン酸カリ
ウム、１０　ＩＮ　Ｔｒｉｓ　−ＩＩｃＩ　、ｐＨ７，
２に懸濁させ、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７
，９に対して透析する。インタフエロン活性は溶液中に
残る。 ４、　上記の上清をｐＨ８，５に調整してＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムでクロマトグラフィーを行う（２５ｍＨ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　１ｐＨａ、　５中Ｏから０．２Ｍ　
ＮａＣｌの直線勾配で溶出）。 ５、　チバクロムーブルーーアガロース（Ｃｉｂａｃｈ
ｒｏｍｅ　Ｂ　ｌｕｅ　−Ａｇａｒｏｓｅ）またはヒド
ロキシルアバタイｌ−（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔ
ｅ　）に吸着させ、１．５８ＫＣＩまたは０．２Ｍリン
酸塩で溶出する（必要により実施）。 ６、　セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘｏ）　Ｇ　−
７５力ラムで分子をサイズ分けする。 ７．　ｐＨ１５，０の２５ｍＮ酢酸アンモニウム中ＣＭ
−セルローズ上陽イオン交換りＯマドグラフィーを行う
。酢酸アンモニウム勾配（０，２Ｍ酢酸アンモニウムま
で）で展開する。 上記の方法で〉９５％純度の生成物を得る。 この物質はまた、サイズ排斥クロマトグラフィー、逆相
（ＲＰ−８）高圧液体クロマトグラフィー、または固定
化抗インタフエロン抗体上のアフイニテイクロマトグラ
フイーで精製しうる。 別法として、上記の段階４よりの物質をミルスティン（
旧１ｓｔｅｉｎ）　、サイエンティフィック　アメリカ
ン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ）　２４
３．６６（１９８０）記載のように調整したモノクロナ
ル抗体カラムに加え、０．２Ｍ酢酸、０．１％トリトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）および０．１５ＨＮａＣｌで溶出しう
る。 別様の有利な具体例として、上記操作で製造した白血球
インタフエロンをつぎの段階で精製しうる。 １、　発現された白血球インタフエロンを含有Ｊる凍結
細胞塊を、手作業または適当な粉砕装置で砕く。部分的
にと番ノだ細胞を、ｐＨ７，５−８，０に調整し／＝０
．ＩＭ　Ｔｒｉｓ、　１０％のカラムを約１０カラム容
量の２０　ｍ１４　Ｔｒｉｓ　−１１０１、ＤＨ７，５
−８，５（ＮａＣｌ　（０，５Ｍ）およびトリトン（Ｔ
ｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００（０，２％）または同等の
表面活性剤含有）で洗う。洗つｌ〔あと、このカラムに
０．１５ＨＮａＣ１およびトリ１〜ン（Ｔｒｉｔｏｎ）
　Ｘ　−１００（０，１％）または同等の表面活性剤を
含有Ｊ”る約１０カラム容量の溶液を通す。このカラム
をトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（０，１％）ま
たは同等の表面活性剤を含有する０、２Ｍ酢酸で溶出す
る。モノクロナル抗体カラムよりの蛋白質ピーク（ＵＶ
吸収またはその他の方法で測定）を集め、ｌＮＮａ叶ま
たは１、ＯＭ　Ｔｒｉｓ塩基で０１１を約４．５に調整
する。 ４、　プールされたインタフエロンピークを、適当な緩
衝液たとえば酢酸アンモニウム１ｕｌ１４、５　（５０
ｍＭ＞で平衡させたホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）
　ＣＭ　５２セルロースまたは同等の陽イオン交換体に
加える。加えたあと、カラムを平衡のための緩衝液で洗
い、流出液のＵＶ吸収がたいらとなるに至らせ、カラム
からはほとんど蛋白質が溶出しない状態とする。 カラムをついで、２５ｍＭ酢酸アンモニウム１０．１２
Ｍ塩化す１−リウムまたはインタフエロンの回収を最高
とする組合わせで溶出し、満足な外観および溶解性を有
する凍結乾燥ケーキとり−る。 上記したこの有利な具体例におけるモノクロナル抗体は
、スト−へリン（Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ　＞等がブロク、
ナトルー６フカド、サイ、米国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、＞　７８．１８４
８−５２（１９８１）に記載した方法で調製しうる。モ
ノクロナル抗体は、下記するように、￥ａ”Ａし、アフ
ィゲル（＾ｆｆｉｇｅｌ　）　−１０に共有結合させる
。 腹水液よりのモノクロナル抗体の調製おＪ：び１製ＢＢ
ａ＋ｂ、’ｃマウス５頭のそれぞれに、対数増殖期の中
間でとったハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）細
胞の５−１０Ｘ１０６個を接種した。マウスの生成する
腹水液から得た約５Ｘ１０’個の生育しうる細胞を、１
０または１０頭より多くのマウスのそれぞれに腹腔内接
種した。この腹水液を各マウスより反復（２から４回）
採取した。ひとつの群のマウスからつぎの群のマウスに
、３回まで、移しかえおよび採取を行なった。それぞれ
の移しかえ毎に、採取腹水液をプールした。 低速遠心（５００−１０００ｘｇ）で１５分間処理し、
腹水液より細胞および残渣を除いた。ついで１８．ＯＯ
Ｏｒｐｍで９０分遠心した。上清を凍結させマイナス２
０℃に貯蔵した。融解させてから、３５．ＯＯＯｒｐｍ
で９０分間遠心し、さらにフィブリンおよび粒状物を除
いた。８移しかえどとの腹水液のバッチについて、固体
相抗体結合試験（スト−へリン（Ｓｔａｅｈ’ｅｌｉｎ
　）等、上記引用文献）により特異抗体活性を試験し、
満足ならばプールした。 プールされた溶液中の蛋白質′ｆ！を度は、１　ｍ９の
蛋白質が１．０ｃｍの厚さのキュベツトで２８０　ｎｍ
で１．２の吸光値を示すという近似法で測定した。 高濃度の抗体を有する腹水液は３０−３５　ｍｓ蛋白質
／ｄを含有する。これは、４−７ｇ＃特異抗体／威に相
当する。この液体をＰＢＳ　（０，０１Ｍリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７、３，０，１５Ｍ　ＮａＣ１）で希釈し、
１０から１２＃ｌｆｆ／ｌｄの蛋白質濃度とした。 希釈溶液の各１００ｄに、室温で飽和した硫酸アンモニ
ウム溶液９０ｄを、０℃ではげしくかくはんしながら添
加した。懸濁液を４０から６０分間水中に保った。つい
で、４℃で、ｉｏ、ｏｏ。 ｒｐＩＩｌで１５分遠心した。上清をりいしヤして除き
、十分に液を切った。蛋白質塊を０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ
ＨＣＩ　（ｐＨ７，９＞１０．０４Ｍ　ＮａＣ１（緩′
ｆｊＪ′ａ■）に溶解した。蛋白質溶液を、１００容酪
の緩衝液■に対して、室温で１６から１８時間透析した
。その間、少なくとも１度緩衝液を交換した。 透析溶液をｉ５．ｏｏｏｒｐ＋ｎで１０分間遠心し、不
溶物を除いた。腹水中の全蛋白質の最初の遇の約３０か
ら３５％が、２ＢＯｎｌｌｌの吸光値より概評して採取
された。 次いで、１ｍ１ｌについて３０−４０１１７９の蛋白質
を含有する溶液をバッファー（Ｂｕｆｆｅｒ　）　Ｉで
平衡させたＤＥＡＥ−セルロースカラムに加えた。添加
する蛋白質１グラムについて少なくとも１００ｍ１（Ｄ
カラム床容量トシタ。０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｌＩｃｌ
ｐＨ７，９中ＮａＣｌを０．０４Ｍから０．５ＭＮａＣ
ｌｌ１度に直線状に１４ａＣｌ濃度を変化させて、カラ
ムより抗体を溶 出した。０．０６から０．１Ｍ　ＮａＣｌのピーク分画
をプールし、等容色の硫酸アンモニウム飽和溶液（室温
）を加え沈殿遠心し、濃縮した。蛋白質塊を０．２Ｍ　
Ｎａ１ｌＣ０３（ａｌｌ約８．０）１０、３Ｍ　ｔｌａ
ｃｌ（緩ｖｆＪ液■）に溶解し、室温で、同じ緩衝液（
３度交換）に対して透析した。透析した溶液を２０．Ｏ
ＯＯＸｇで１５分遠心し、不溶物を除いた。蛋白質濃度
を緩衝液■で２０から２５■／　ｎｄｌとした。 度１１１亙左１１ アフィゲル（八ｆｆｉｇｅｌ　）　−１０（バイオ　ラ
ドラボラトリイス、リッチモンド、カリポルニア（Ｂｉ
ｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈ−
ｔｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）をグラスフィルタ
ー上で水冷イソプロパノールで３度洗い、ついで水冷蒸
留水で３度洗った。ゲルスラリー（冷水巾約５０％）を
プラスチックチューブに移し、短時間遠心して沈降さ１
！１〔。上清をアスピレータ−で除き、バックされたゲ
ルを等容量の精製抗体溶液と混合し、４℃で５　ｖＩ間
、長袖が円状に廻転するように回転した。反応後、ゲル
を遠心し、緩衝液ｍ　（０、Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯ３１
０，１５Ｍ　ＮａＣＩ）　ｒ２ ５Ｎヒト血清アルブミンに溶解し、この溶液を生物学的
フィルターを通し、濾過溶液を無菌的に１００本のびん
に分けて、非経口投与に適当なように、１本が６Ｘ１０
６単位純インタフエロンを含有するように１−る。これ
らのびんは、使用前は冷所（−２０℃）に保つのが望ま
しい。 本発明の化合物は、医薬として有用な組成物を調製する
ための既知の方法に従って製剤化できる。 その際、このポリペプチドは、医薬として許容されうる
担体ビヒクルと混合する。適当なビヒクルおよびそれら
の製剤化については、マーヂン（［。 １４．８ａｒｔｉｎ）によるレミントンズ　ファーマセ
ウチカル　サイエンス（Ｉｌｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）に記載
されているとおりである。これを、本明細四の参考文献
として引用する。これらの組成物では、インクフエロン
蛋白質の有効量と適当な量のどヒクルとをあわせて、宿
主に対して効果的な投与とするに適当な、医薬として許
容されうる組成物とする。ひとつの有利な投与形態は非
経口投与である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒト成熟白血球インクフエロンのアミノ酸配列
   を含むポリペプチドであって、部分アミノ酸配列Ｃｙｓ
   −へＩａ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　
   −＾ｒｇ　−Ａｌａ　−Ｇｌｕ　−１１ｅ　−Ｎｅｔ　
   −Ａｒｇ−３ｅｒを有することを特徴とし、そして先行
   配列を伴なわない場合は、１６５−１６６個のアミノ酸
   を有し、あるいはメチｉ−ニンが前記インタフエロンの
   第１番目のアミノ酸のＮ末端に結合している場合は、１
   ６６−１６７個のアミノ酸を有するポリペプチドをコー
   ドする配列からなる［）ＮＡ配列を含有することを特徴
   とする複製しうる発現ビヒクル。 （２）　先行配列を伴なわない場合は１１４位にアミノ
   １１ｆＡｓｐ　、　ＧｌｕまたはＶａｌを有し、あルイ
   ハメヂオニンがインタフエロンの第１番目のアミノ酸の
   Ｎ末端に結合している場合は、１１５位にアミノ酸Ａｓ
   ｐ　、　ＧｌｕまたはＶａｔを有するポリペプチドをコ
   ードする配列からなるＤＮＡ配列を含有することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （３）　ヒト白血球インタフエロンＡ　（ＬｅｌＦ　Ａ
   ）をコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項の発坦ビヒクル。 （４）　ヒト白血球インタフエロンＢ　（ＬｅｌＦ　Ｂ
   ）をコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （５）　ヒト白血球インタフエロンＣ（ＬｅＩＦ　Ｃ）
   をコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （６）　ヒト白血球インクフエロンＤ　（ＬＯＩＦ　Ｄ
   ）をコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （７）　ヒト白血球インクフエロンＦ　（ＬｅｌＦ　Ｆ
   ＞をコードするＤＮＡ配列を含有す、ることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （８）　ヒト白血球インタフエ白ンＨ（ＬｅｌＦ　Ｉｆ
   ）をコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （９）　ヒト白血球インクフエロンＩ　（ＬｅｌＦ　Ｉ
   ）をコードするＤＮＡ配列を含有Ｊることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （１０）　ヒト白血球インタフエロンＪ　（ＬｅｌＦ　
   Ｊ）をコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （１１）　特許請求の範囲第３項〜第１０項のいずれか
   一つのポリペプチドの対立道伝子変異によるポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （１２）　ＬｅｌＦＡの対立遺伝子変異によるポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （１３）　ＬｅｌＦＡと１個だけアミノ酸が異るポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （１４）　ＬｅｌＦ　Ａと２３位のアミノ酸が異るポリ
   ペプチドをコードづ−るＤＮＡ配列を含有することを特
   徴とする特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル。 （１５）’　２３位にＡｒｇを含有する点でＬｅｌＦＡ
   と異るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項の発現ビヒクル
   。 （１６）　発現ビヒクルがプラスミドである、特許請求
   の範囲第１項〜第１５項のいずれが一つの発現ビヒクル
   。 （１７）　プラスミドｐＬｅｌＦ　Ａ　ｔｒｐ　２５、
   ｐＬｅｌＦ　Ｂ　ｔｒｐ　７、およびｐＬｅｌＦ　Ｆ　
   ｔｒｐ　１より成立つ群から選択した特許請求の範囲第
   １６項の発現ビヒクル。 （１８）　プラスミドｐＬｅｌＦ　Ｃｔｒｐ　３５およ
   びｐＬｅｌＦ　Ｄ　ｔｒｐ　１１より成立つ群から選択
   した特許請求の範囲第１６項の発現ビヒクル。 （１９）　プラスミドｐＬｅｌＦ　ＧおよびｐＬｅＩＦ
   　Ｉｆより成立つ群から選択した特許請求の範囲第１６
   項の発現ビヒクル。 （２０）　プラスミドｐＬｃｌＦ　Ｉ　ｔｒｐ　１およ
   び　３゜ｐＬｅｌＦ　Ｊ　ｔｒｐ　１　より成立つ群か
   ら選択した特許請求の範囲第１６項の発現ビヒクル。 （２１）　ヒト成熟白血球インクフエロンのアミノ酸配
   列を含むポリペプチドであって、部分アミノ酸配列Ｃｙ
   ｓ−へｌａ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ
   　−Ａｒｇ−八ｌａ　−Ｇｌｕ　−１１ｅ−Ｎｅｔ−＾
   ｒｇ−３ｅｐを有することを特徴とし、そして先行配列
   を伴なわない場合は、１６５−１６６個のアミノ酸を有
   し、あるいはメチオニンが前記インタフエロンの第１番
   目のアミノ酸のＮ末端に結合している場合は、１６６−
   １６７個のアミノ酸を有するボペプチド２１項の微生物
   。 （２３）　微生物がＥ、ＣＯ１＋の株である特許請求の
   範囲第２２項の微生物。 （２４）　微生物がＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株２９４
   である特許請求の範囲第２３項の微生物。