JPS586476B2 - α−アミノ−３−クロロセフェム化合物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般式 （式中、Ｒはフエニルまたはヒドロキシフエニル基を示
す）で表わされるα−アミノー３−クロロセフエム化合
物の酵素的製法に関する。

α−アミノー３−クロロセフエム化合物（■）（以下ア
シル化合物〔■〕と略称する）およびそれらの薬理学的
に許容し得る無毒性塩は、混血哨乳動物のグラム陽性、
グラム陰性細菌に起因する疾患の治療に有用な価値ある
化合物であり、従来７−アミノー３−ヒドロキシ−３−
セフエム−４ーカルボン酸エステルに、任意の順序で塩
素化剤およびアシル化剤を反応させ、要すればそのカル
ボキシル保護基およびアミン保護基を脱離すること４に
より得られている（特開昭４９−１１０６８９）。

しかしながら、上記の化学的方法によれば、アシル化剤
のα−アミン基を保護基で保護し、アシル化の後はその
保護基を脱離する必要があること、種々の化学試薬を使
用するため目的化合物の精製が煩雑であり、その使用に
伴なう公害問題が生じることなど工業的に行なう場合に
は種々の欠点が挙げられる。

そこで、本発明者は、上記の欠点のない方法を見出すべ
く種々研究した結果、種々の細菌が７−アミノー３−ク
ロロ−３−セフエム−４−カルボン酸（以下７−ＡＣＣ
と略称する）と一般式（式中、Ｚはアミン、低級アルコ
キシまたは低級アルキルチオ基、Ｒは前記と同じ基を示
す）で表わされるα−アミノ酸誘導体とからアシル化合
物（■）を生成する能力を有することを見出し、これに
基いて種々研究を重ねて本発明を完成するに至った。

本発明は７−ＡＣＣとα−アミノ酸誘導体（■）を水性
媒体中アセトバクター属、アクロモバクター属、アエロ
モナス属、アルカリゲネス属、アース口バクター属、バ
チルス属、ベネケア属、プレビバクテリウム属、クロス
トリジウム属、コリネバクテリウム属、エツシエリヒア
属、フラボバクテリウム属、グルコノバクター属、クル
イベラ属、ミクロコツカス属、ノカルジア属、プロテウ
ス属、シュードモナス属、ロドシュードモナス属、スピ
リラム属、スタフイロコツカス属、ストレプトミセス属
またはキサントモナス属に属し、７−ＡＣＣとα−アミ
ノ酸誘導体（■）とからアシル化合物（■）を生成する
能力を有する微生物の培養物またはその処理物の存在下
で反応させることを特徴とするアシル化合物（■）の製
法であって、その目的とするところは、α−アミノ基お
よび４−カルボキシル基の保護基で保護する工程および
その脱離工程の必要がなく、有害な化学試薬の使用に伴
なう公害防止の問題がなく、連続的に反応が行なうこと
ができ、工業的に有利且つ安価にアシル化合物（■）を
製造することにある。

本発明における基質の１つである７−ＡＣＣは、従来公
知の化学的方法（特開昭４９−１１０６８９、同４９−
１１６０９５）によっても製造されるが、本発明者が見
出した７−フエニル（オキシ）アセトアミド−３−ハロ
ー３−セフエム−４−カルボン酸にその７−アミド結合
を分裂するアシラーゼの作用に付す酵素的方法（特開昭
５３−３８６９２号）によっても得られる。

この７−ＡＣＣはアシル化反応を妨害しないようなカチ
オンとの塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩などの塩
の形で使用することもできる。

本発明における他の基質であるα−アミノ酸誘導体（■
）としては、Ｒがフエニルまたはヒドロキシフエニル基
で示されるα−アミノ酸の誘導体である。

ヒドロキシフエニルは４−ヒドロキシフエニル、３−ヒ
ドロキシフエニル、２−ヒドロキシフエニル、３，４−
ジヒドロキシフエニル、２，４−ジヒドロキシフエニル
基のようなモノおよびジヒドロキシフエニル基を包含す
る。

上記のα−アミノ酸誘導体（■）のα位の炭素原子は不
斉炭素原子であり、従って、α−アミノ酸誘導体（■）
は２種の光学異性体（Ｄ−およびＬ−異性体）または２
種の光学異性体の混合物として存在し得るが、最も好適
なものはＤ−配置の異性体である。

上記のα−アミノ酸誘導体（■）は、上記の属に属し、
７−ＡＣＣとα−アミノ酸誘導体（■）とからアシル化
合物（■）を生成する能力を有する微生物の培養物また
はその処理物の存在により７−ＡＣＣの７位のアミノ基
と縮合してアミド基を形成する基であればα−アミノ酸
のカルボキシル基が如何なる基で置換されていてもよい
誘導体を表わす。

この誘導体としては、アミド、低級アルカノール、例え
ばメタノール、エタノールなどのエステルまたは低級ア
ルキルメルカプタン、例えばメチルメルカプタン、エチ
ルメルカプタンなどとのチオエステルなどが挙げられる
。

上記の誘導体が水に不溶性である場合、例えば低級アル
キルエステルのような場合は、アシル化酵素反応に悪影
響を与えないような水溶性塩を形成する酸、例えば塩酸
などとの塩の形で使用される。

本発明においては、アセトバクター属、アクロモバクタ
ー属、アエロモナス属、アルカリゲネス属、アースロバ
クター属、バチルス属、ベネケア属、ブレビバクテリウ
ム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エ
ツシエリヒア属、フラボバクテリウム属、グルコノバク
ター属、クルイベラ属、ミクロコツカス属、ノカルジア
属、プロテウス属、シュードモナス属、ロドシュードモ
ナス属、スピリラム属、スタフイロコツカス属、ストレ
プトミセス属またはキサントモナス属に属し、７−ＡＣ
Ｃとα−アミノ酸誘導体（■）とからアシル化合物（■
）を生成する能力を有する微生物（■）を生成する能力
を有する微生物が適宜利用される。

適当な微生物の菌株は、土壌中から分離することにより
選ぶこともできるし、菌株寄託機関に寄託されている菌
株の中から選ぶことができる。

例えば下記の菌株を挙げることができるが、上記の属に
属し、７−ＡＣＣとα−アミノ酸誘導体（■）とからア
シル化合物〔■）を生成する能力を有する微２生物であ
れば、自然株でも変異株でもすべて本発明において使用
することができる。

次に、本発明で使用される菌株の一例を次の通り挙げる
。

尚、特記しない限り菌株名の後の〔〕の記号は次のカタ
ログを示し、数字はその菌株名ヌが掲載されている頁数
を示す。

Ａ；ＬＩＳＴ ＯＦ ＣＵＬＴＵＲＥＳ １９７２，
ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯ
Ｎ，ＯＳＡＫＡ Ｂ；ＴＨＥ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＴＹＰＥ ＣＵＬＴＵ
ＲＥ冫ＣＯＲＲＥＣＴＩＯＮ，ＣＡＴＡＬＯＧＵＥ Ｏ
ＦＳＴＲＡＩＮＳ，Ｅｌｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ，１９７４Ｃ； ＴＨＥ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＴＹＰ
Ｅ ＣＵＬＴＵＲＥＣＯＲＲＥＣＴＩＯＮ，ＣＡＴＡＬ
ＯＧＵＥ ＯＦＳＴＲＡＩＮＳ，Ｔｗｅｌｆ １アセトバクター・オウランチウム （Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒａｎｔｉｕｍ）ＩＦ
Ｏ ３２４９（Ａ１９７） アセトバクター・バスツリアヌス （Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ
）ＩＦＯ３２２３（Ａ１９８〕 アセトバクター・ツルビダンス （Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｂｉｄａｎｓ）ＩＦ
Ｏ ３２２５（Ａ１９８） アクロモバクター・リクイダム （Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌ ｉｑｕ ｉｄｕｍ
）ＩＦＯ３０８４（Ａｌ９） アクロモバクター・リキファシエンス （Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）ＡＴＣＣ１５７１６（Ｂ１５） アクロモバクター・スピーシーズ （Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｂ−４０２−
２（ＦＥＲＭ−Ｐ１０９５）（特開昭４８−３５０９０
号〕アエロモナス・ヒドロフイラ （Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ
３８２０（Ａ１９９〕 アルカリゲネス・フエカリス （Ａｔｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣ
Ｃ８７５０（Ｂ２１〕 アルカリゲネス・フエカリスＡＴＣＣ２５０９４（Ｂ２
１） アースロバクター・シンプレツクス （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ）ＩＦ０
１２０６９（Ａ２００） バチルス・メガテリウム （Ｂａｃｉｆｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）Ｂ−４０
０（ＦＥＲＭ−Ｐ−７４８）（特公昭５０−６５５１号
〕ベネケア・ヒペロプチカ （Ｂｅｎｅｃｋｅａ ｈｙｐｅｒｏｐｔｉｃａ）ＡＴＣ
Ｃ１５８０３（Ｂ３３） ブレビバクテリウム・セリナム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｒｉｎｕｍ）Ａ
ＴＣＣ１５１１２（Ｂ３５） クロストリジウム・ブチリカム （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＩＦ
０３８４７（Ａ２０７） コリネバクテリウム・トリチシ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒｉｔｉｃｉ）
ＩＦＯ１２１６４（Ａ２０７） エツシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌ
ｉ）ＡＴＣＣ１１１０５（Ｂ５２） エツシエリヒア・コリＡＴＣＣ１３２８１（Ｂ５２）エ
ツシエリヒア・コリＩＦＯ３５４３（Ａ２０８）フラボ
バクテリウム・カプスラタム （Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ’ｉｕｍ ｃａｐｓｕｌａｔ
ｕｍ）ＩＦＯ１２５３３（Ａ２０８） グルコノバクター・メラノゲナス （Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕ
ｓ）ＩＦＯ３２９３（Ａ２１０〕 クルイベラ・シトロフイラ （Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ
２１２８５（Ｂ６３） ミクロコツカス・ウレアエ （Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｅａｅ）ＡＴＣＣ２１
２８８（Ｂ７１） ノカルジア・グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂ
ｅｒｕ−ｌａ）ＡＴＣＣ２１２９２（Ｂ８３） プロテウス・レトゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅ
ｒｉ）ＡＴＣＣ１４５０５（Ｂ８７） シュードモナス・アエルギノサ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ａ
ＴＣＣ１５２４６（Ｂ８８） シュードモナス・メラノゲナム （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｍ）
ＡＴＣＣ１７８０８（Ｂ９４） ロドシュードモナス・スフエロイデス （Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉ
ｄｅｓ）ＡＴＣＣ２１２８６（Ｂ９９） １スピリラム・メタモルファム （Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍｍｅｔａｍｏｒｐｈｕｍ）ＩＦＯ
１２０１２（Ａ２１９） スタフイロコツカス・アウレウス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＩＦ
Ｏ３０６０（Ａ２２０） ストレプトミセス・アルプス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）ＡＴＣＣ２
１２９０（Ｂ１１２） キサントモナス・オリゼエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏ
ｒｙｚａｅ）ＩＦＯ３９９５ （Ａ２２２）本発明を実
施するには、先ず上記の属に属し、７−ＡＣＣとα−ア
ミノ酸誘導体（■）とからアシル化合物（■）を生成す
る（以下アシル化合物（■）生成と称する）能力を有す
る微生物を培養し、得られる培養物またはその処理物の
存在下に７−ＡＣＣとα−アミノ酸誘導体（■）とを適
当な条件下で反応させればよい。

培養物を得るための培養方法としては、通常好気的培養
が望ましく、好適には液体通気攪拌培養により行なわれ
る。

培地組成としては、通常細菌の培養に使用される培地、
例えば肉エキス、酵母エキス、ペプトン、大豆蛋白分解
物、大豆浸出液、コーン・スチープ・リカーなとの窒素
源、糖蜜、馬鈴薯汁、ブドウ糖、グリセリン、デキスト
リンなどの炭素源、リン酸塩、マグネシウム塩、食塩、
その他の金属イオン類または各種ビタミン類などの生長
促進物質などを適宜含有する栄養培地が調製される。

培地のｐＨや培養温度はアシル化合物（■）生成能力を
有する微生物の種類によって異な１るが、通常ｐＨ６〜
９、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃
の範囲で適宜選ばれる。

培養時間は培養条件特に培養装置、培養組成、培養温度
などにより異なるが、アシル化合物（■）生成活性が最
大を示す時点はアシル化合物（■）生成能力を有する微
生物の種類によって異なり、各々の菌株で最適培養時間
を選択するのが好ましい。

このようにして得られた培養物またはその処理物がアシ
ル化合物（■）の生成反応に使用されるが、こゝでいう
培養物の処理物とは、培養物に適当な処理を加えてアシ
ル化合物（■）生成活性を高め、アシル化合物〔■〕の
生成に有利な形態にしたものを指す。

本アシル化合物〔■〕生成活性体は、アシル化合物（■
）生成能力を有する微生物によりその存在形態が異なり
、菌体内にあるいは菌体外に存在する。

従って、本アシル化合物〔Ｉ〕生成活性体が菌体内に存
在する場合は、アシル化合物〔■〕生成能力を有する微
生物の培養物そのまゝか、あるいは培養物から集菌して
得た生菌体またはその懸濁液の形態でアシル化合物〔■
〕生成反応に使用される。

さらにまた物理的または化学的方法による菌体処理生成
物、例えばアセトン、メタノール、エタノールなどの親
水性有機溶媒処理による乾燥菌体、これらの菌体を磨砕
、超音波などの処理により得た菌体破壊物、菌体をセチ
ルピリジウムクロライド、界面活性剤などの処理により
得た菌体溶解液、あるいはこれらの菌体破壊物、菌体溶
解液を塩析、分画沈澱、透析、吸着クロマトグラフイー
、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル涙過などの公知
の酵素分離精製手段により得たアシル化合物（■）生成
活性体など、目的とするアシル化合物（■）生成活性を
保持している限り如何なる形態においても本発明におい
て使用できる。

また、本アシル化合物〔■〕生成活性体が菌体外に存在
する場合は、アシル化合物（■）生成能力を有する微生
物の培養物そのまゝか、あるいは培養物を除菌して得た
培養ろ液の形態でアシル化合物〔■〕生成反応に用いる
。

さらにまた培養ろ液を酵素分離精製に通常用いる手段、
例えば親水性有機溶媒による分画沈澱、塩析、透析、吸
着クロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフイー
、ゲル涙過などの手段を適宜使用することにより種々の
段階に精製したアシル化合物（■）生成活性体など、目
的とするアシル化合物（■）生成活性を保持している限
り如何なる形態においても本発明において使用できる。

これらの培養物またはその処理物を用いて７−ＡＣＣと
α−アミノ酸誘導体（■）とからアシル化合物〔■〕を
製造する場合、そのアシル化合物〔■〕生成反応は、両
基質を水または緩衝液に溶解した水性媒体中で行なわれ
る。

基質濃度は主としてアシル化合物〔■〕生成活性の強さ
との関係で決められるが、通常７−ＡＣＣの濃度は０．
１〜２％、好適には０．２〜１％程度である。

α−アミノ酸誘導体（■）の使用量は通常７−ＡＣＣに
対して２〜１０倍モル、好適には３〜６倍モル量である
。

反応温度はアシル化合物〔■〕生成活性体生産菌由来に
より異なるが、一般的には２５〜４５°Ｃ、好適には３
０〜４０℃で行なわれる。

反応液のｐＨもアシル化合物（■）生成活性体の生産菌
由来により異なるが、アシル化合物（■）生成活性体の
至適ｐＨ内で行なうのが好ましく、通常はｐＨ５〜８、
好ましくは６〜７に保持して行なうのがよい。

反応時間は基質濃度、アシル化合物〔■〕生成活性の強
さ、アシル化合物（■）生成活性体の存在形態、反応温
度などにより異なるが、通常１〜１０時間程度であって
、アシル化合物（■）が最高に生成される時期を検討し
て適当な時期に反応を終了すればよい。

本発明においては、上記アシル化合物〔■〕生成反応を
固定化剤系の状態で行なうと、生成するアンル化合物（
Ｉ）回収率、分離精製、アシル化合物（■）生成反応の
連続化などの点で有利である。

本アシル化合物（■）生成活性体の固定化方法としては
、アシル化合物〔■〕生成能力を有する微生物の菌体ま
たはそれから誘導されたアシル化合物（■）生成活性体
を半透性膜を形成することのできるポリマー、例えばセ
ルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルロ
ーストリアセテート、ポリアクリルニトリル、ポリビニ
ルホリマール、ポリスチレンなどのポリマーで被覆する
ことにより得た微小球（マイクロカプセル）、中空糸ま
たはフイルムの形態で使用することができる。

これらの形態は公知の方法、例えば米国特許第３７１４
０６５、特開昭４８−７３３７８、同４９−２５１２８
、同４９−７１７０、同４９−３１９１３などの方法に
従って製造することができる。

また菌体から分離精製して得たアシル化合物〔■〕生成
活性溶液にアシル化合物（■）生成活性を不活化させず
、各基質に対して不活性であり、且つアシル化合物〔■
〕を吸着しにくいような担体に吸着させ、その担体中で
上記アシル化合物（■）生成反応を行なわせてもよい。

このような担体としては、活性アルミナ、セライト、珪
藻士、酸性白土、活性白土、カオリン、リン酸カルシウ
ム、ハイドロオキシアパタイドなどが使用し得る。

上記の担体吸着操作はカラム式でもバッチ式でも差しつ
かえない。

担体の使用量は、アシル化合物〔■〕生成活性、その量
およびアシル化合物〔■〕生成活性体に対する担体の吸
着度などにより異なるが、一般にはアシル化合物〔■〕
生成活性溶液に対して５〜１５％程度用いればよい。

上記のアシル化合物（■）生成活性体吸着担体は水ある
いはアシル化合物〔■〕生成活性体の至適ｐＨと同じｐ
Ｈの緩衝液で予め湿潤させておくのがよい。

上記の担体は乾燥させるとアシル化合物〔■〕生成活性
が失活する恐れがあるので、湿潤した状態でアシル化合
物〔■〕生成反応に使用するのがよい。

上記のアシル化合物〔■〕生成活性体担体吸着処理は、
アシル化合物〔■〕生成活性体が菌体外に存在するよう
なアシル化合物〔■〕生成能力を有する微生物の培養ろ
液についても、同様に行なうことにより、培養ろ液から
担体吸着アシル化合物〔■〕生成活性体の形でアシル化
合物〔■〕生成活性体を分離精製することができ、アシ
ル化合物〔■〕生成反応に使用することができる。

このようにして得られるアシル化合物〔■〕生成反応液
からアシル化合物〔■〕を採取するのであるが、公知の
方法に従って行なうことができる。

例えば反応液を活性炭、吸着樹脂に通して反応液中のア
シル化合物〔■〕を吸着させ、酸性水、親水性有機溶媒
、例えばアセトン水などの適当な溶媒で溶出し、アシル
化合物〔■〕を含む区分を濃縮して等電点沈澱させる方
法などにより高純度に分離精製することができる。

次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

尚、実施例中のアシル化合物〔■〕生成活性およびアシ
ル化合物〔■〕量は次の測定法により算定した。

アシル化合物〔■〕生成活性の測定法 試料（培養物などを希釈するような場合には、０．１Ｍ
酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈）１ｍｌに７−アミ
ノー３−メチル−３−セフエム−４−カルボン酸の水溶
液（１０ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌ、Ｄ−フエニルグリシ
ンメチルエステル塩酸塩の水溶液（１００■／ｍｌ）０
．５ｍＡ’および０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）
Ｑ，５ｍＡ’を加え、３７℃で２０分間振盪した後、そ
の反応液に１Ｎ−ＮａＯＨ１ｍｌを加え、室温で１時間
放置する。

これを４７０ｍμの吸光度を測定し、標準セファレキシ
ンの検量線からセファレキシン量を算定し、１００γ／
ｍｌのセファレキシンを生成するアシル化合物〔１〕生
成活性を１００単位（Ｕ）とする。

アシル化合物〔■〕の定量法 検液をバチルス・ズブチリスＰＣＩ−２０９を検定菌と
してペーパー・ディスク法またはカップ法により微生物
検定を行ない、その生育阻止円の直径を測定し、７−（
Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３−セフ
エム−４−カルボン酸の検量線から検液中のアシル化合
物〔■〕量を算定する。

さらに尚、実施例中の薄層クロマトグラフイー（ＴＬＣ
）は、特にことわりがない限り、次の担体および展開溶
媒を用いた。

担体；キーゼルゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）展開溶
媒；ｎ−ブタノールー酢酸一水（３：１：１）実施例
１ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミドＦ）−３一クロロ−
３−セフエム−４−カルポン酸 グルコース３％、酵母エキス０．５％、ペプトン０．５
％、Ｋ２ＨＰＯ４０．１％、ＫＣ１０．０５％、ＭｇＳ
０４・７Ｈ２００．０５％、ＦｅＳＯ４ ０．００１％
を含む液体培養基（ｐＨ７．０）１ｌを５ｌ容丸底フラ
スコに入れ、１２０℃、２０分間蒸気滅菌後、これに予
め上記と同一組成培地に２４時間培養しておいたアクロ
モバクター・エスピーＢ−４０２−２の種培養物２０ｍ
ｌを移植し、２６℃で４８時間振盪培養する。

培養物を遠心分離（一万回転，１０分）シ、得られる菌
体を０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．ｏ）５０ｍｌに懸
濁する（アシル化合物〔■〕生成活性４万単位／ｍｌ）
。

７−アミノー３−クロロ−３−セフエム−４−カルポン
酸（７−ＡＣＣ）１．４ｏｇを０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（
ｐＨ６．０）２８０ｍｌに溶解し、これにＤ−フエニル
グリシンメチルエステル塩酸塩４．７Ｉを加え、ｐＨ６
．０に調整した後、前記の菌体懸濁液を加え、３７℃で
３時間振盪する。

反応液を遠心分離して除菌し、そのろ液を吸着樹脂ＨＰ
−２０（三菱化成社製）１２５ｍＡのカラムに充填し、
水洗する。

次いで３０％アセトン水で！出し、その活性区分をｐＨ
４．５に調整した後、約１０倍に減圧濃縮する。

析出物を含む濃縮液に当量のアセトンを加えて水冷し、
生成物の析出を完成させる。

析出物を沢取し、アセトンで洗浄、乾燥して標題の目的
化合物を得る。

白色結晶１．３１（収率５９．２％） 融点；１５０°Ｃより着色し、１９２〜１９３°Ｃ（分
解） ＩＲ； ３４００ ，３２００ ，３０３０ ，１７６
５（β−ラクタム）、１６８０，１６０３ ，１３９０
１３５０ ，１２５５ｃｍ−１ ＮＭＲ（ＣＦ３ＣＯＯＨ）； ３．７ ５ （ ｄ ，
２Ｈ）、５．３６（ｄ，１Ｈ）、５．６５（ｍ，１Ｈ）
、５．９６（ｐ，１Ｈ） ＴＬＣ ； Ｒｆ＝０．５ ３ 除菌した菌体は、さらに別のアシル化合物（■）の生成
反応に再使用される。

実施例 ２ ７−（Ｄ−ｐ−ヒドロキシフエニルクリシルアミｌ’）
−３−クロロー３−セフエム−４−カルポン酸 実施例１において、Ｄ−フエニルグリシンメチルエステ
ル塩酸塩の代りにＤ−ｐ−ヒドロキシフエニルグリシン
メチルエステル塩酸塩を用いて目的物質１ｇ（収率４３
．８％）を得る。

元素分析〔Ｃ１５Ｈ１４Ｎ３０５ＳＣｌ・Ｈ２０として
〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 計算値 ４４．８３ ４．０１ １０．４６
測定値 ４５．０２ ４．２３ １０．３１
実施例 ３ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−ク四ロ−３
−セフエム−４−カルボン酸 実施例１において、アクロモバクター・スピーシーズＢ
−４０２−２の代りにベネケア・ヒペロプテイカＡＴＣ
Ｃ１５８０３を用いて目的物質１．２５ｇ（収率５７．
０％）を得る。

実施例 ４ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３
−セフエム−４−カルポン酸 ヘフトン０．５％、肉エキス０．５％、コーンスチープ
リカ−２％、食塩０．１５％を含む液体培養基（ｐＨ７
．０ ）１ ０ ０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコニ
分注し、１２０℃、３０分間蒸気滅菌した後、エツシエ
リヒア・ユリＡＴＣＣ１１１０５を接種し、３０゜Ｃで
２４時間往復振盪培養する。

培養後、５本分の培養物を遠心分離して集菌し、０．０
５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、その菌体を
７−ＡＣＣ０．３％、Ｄ−フエニルグリシンメチルエス
テル塩酸塩１．５％を含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）２５０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間振盪し
た後、菌体を遠心分離して除菌した反応液中の目的物質
の生成率を測定すると６２％であった。

この反応液のＴＬＣは、目的物質のＲｆは０．５３附近
、未反応の７−ＡＣＣのＲｆは０．３０附近にスポット
を認めた。

実施例 ５ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３
−セフエム−４−カルボン酸 クルコース３％、ペフトン１％、肉エキス１％、酵母エ
キス０．５％、グルタミン酸ナトリウム０，５％、食塩
０．２５％を含む液体培養基（ｐＨ７．３）１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコニ分注し、１２０℃、３０
分間蒸気滅菌した後、シュードモナス・メラノゲナムＡ
ＴＣＣ１７８０８を接種し、３０℃で２４時間往復振盪
培養する。

培養後、５本分の培養物を遠心分離して集菌し、０．９
％食塩水で洗浄後、その菌体を７−ＡＣＣＯ．３％、Ｄ
−フエニルグリシンメチルエステル塩酸塩１．５％を含
む０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）２５０ｍｌに懸
濁し、３７℃で１時間振盪する。

遠心分離により除菌した反応液中の目的物質の生成率を
測定すると９１％であった。

実施例 ６ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３
−セフエム−４−カルボン酸 実施例１記載と同一組成の培地１００ｄを５００属容三
角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した
後、下記の菌株を接種し、２６℃で７２時間振盪培養す
る。

培養物５本分をｐＨ６．５に調整し、遠心分離により集
菌する。

この菌体を蒸留水３ｍｌに懸濁し、これにアセトン１０
０ｍｌを加え、集菌して乾燥菌体を得る。

この菌体１ｇを７−ＡＣＣ０．１５％、Ｄ−フエニルグ
リシンメチルエステル塩酸塩０．８％を含む０．１Ｍ酢
酸塩緩衝液（ｐＨ６．０ ）２ ５０ｍｌに懸濁し、３
７℃で３時間振盪する。

除菌した反応液中の目的物質の生成率を測定すると下記
の通りである。

菌株名 生成率％アルカリ
ゲネス・フエカリス ２３ＡＴＣＣ８７５０ 実施例 ７ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３
−セフエム−４−カルボン酸 グルコース２％、ペフトン０．５％、 酵母エキス０．
５％、グルタミン酸ナトリウム０．２％、食塩０．２５
％を含む液体培養基（ｐＨ７．２ ） １ ０ ０ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃで２
０分間蒸気滅菌した後、下記の菌株を接種し、２８℃で
２４時間振盪する。

培養物から遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍ酢酸
塩緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した後、その菌体を７＝
ＡＣＣ０．３％、Ｄ−フエニルグリシンメチルエステル
塩酸塩１，５％を含む０． １ Ｍ酢酸塩緩衝液（ ｐ
Ｈ ６、０）５０ｍに懸濁し、３７℃で１時間振盪しな
がら反応させる。

反応後、遠心分離により除菌し、反応ろ液中の目的物質
の生成率を測定すると下記の通りであった。

菌株名 生成率％アセトバク
ター・パスツリアヌス ３５ＩＦＯ３２２３ キサントモナス・オリゼエ ４０ＩＦＯ３
９９５ 実施例 ８ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３
−セフエム−４−カルボン酸 クルコース２％、ペプトン１％、肉エキス１％、酵母エ
キス０．５％、食塩０．３％を含む液体培養基（ｐＨ７
．２ ） １ ０ ０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃、２０分間蒸気滅菌後、下記の菌株
を接種し、２８℃で４８時間振盪培養する。

培養物から遠心分離により集菌し、０．９％食塩水で洗
浄後、その菌体を７−ＡＣＣ０．５％、Ｄ−フエニルグ
リシンメチルエステル塩酸塩２％を含む０．０５Ｍ酢酸
塩緩衝液（ｐＨ６．０ ）１００ｍｌに懸濁し、３７℃
で５時間振盪する。

遠心分離により除菌した反応液中の目的物質の生成率を
測定すると下記の通りである。

菌株名 生成率％クルイベラ
・シトロフイラ ３２ＡＴＣＣ２１２８
５ エツシエリヒア・コリ ６３．５ＡＴ
ＣＣ１３２８１ プロテウス・レトゲリ ６０ＡＴＣＣ
１４５０５ ミクロコツカス・ウレアエ ４１ＡＴＣＣ
２１２８８ ロドシューモナス・スフエロイデス ４７ＡＴＣＣ
２１２８６ 実施例 ９ ７−ＣＤ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３
−セフエム−４−カルボン酸 可溶性澱粉３％、大豆粉２％、酵母エキス０．５％、ペ
プトン０．５％、食塩０．２％を含む液体培養１基（ｐ
Ｈ７． ３ ）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃、２０分間蒸気滅菌した後、下記の
菌株を接種し、３０℃で９６時間振盪培養する。

培養物から遠心分離して集菌し、０．９％食塩水で洗浄
した後、その菌体を７−ＡＣＣ０．１５％、Ｄ−フエニ
ルグリシンメチルエステル塩酸塩１％を含む０．１Ｍリ
ン酸塩緩衝液（ ｐＨ６．８）５０ｍｌに懸濁し、３７
℃で５時間振盪する。

遠心分離により除菌した反応液中の目的物質の生成率を
測定すると下記の通りである。

菌株名 生成率％ストレフト
ミセス・アルプス ４５ＡＴＣＣ２１２９０ ノカルジア・グロベルラ ６８．５ＡＴ
ＣＣ２１２９２ 実施例 １０ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３
−セフエム−４−カルポン酸 実施例６において、菌株としてアクロモバクター・リキ
ファシエンスＡＴＣＣ１５７１６を使用し、Ｄ−フエニ
ルグリシンメチルエステル塩酸塩の代りにＤ−フエニル
グリシンアミドを使用して、目的物質を得た。

生成率５９．５％実施例 １１ ７−（Ｄ−フエニルグリシルアミド）−３−クロロ−３
−セフエム−４−カルボン酸 グルコース２％、ペプトン１％、肉エキス１％、食塩０
． ５％を含む液体培養基（ｐＨ７．０）１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃ、２０
分間蒸気滅菌後、バチルス・メガテリウムＢ−４００を
接種し、３０℃で４８時間振盪培養する。

培養後、１０本分の培養物を遠心分離（１万回転，１０
分）により除菌して培養ｐ液を得る。

ｐＨを６に調整した後一セライト（Ａ５５６０Ｊｏｈｎ
ｅ−Ｍａｎｖｉｌｌｅ Ｓａｌｅｓ社製）１０ｇを加え
、約３０分間攪拌する。

この懸濁液を瀘取し、０．０ ５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）でする。

このアシル化酵素吸着セライトを７−ＡＣＣ０．２％、
Ｄ−フエニルグリシンメチルエステル塩酸塩１．５％を
含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０ ） ２５０
ｍｌに加え、３７℃で３時間振盪する。

アシル化合物（■）生成活性体吸着セライトをろ別した
反応液のＴＬＣはＲｆ値０．５３附近に目的物質のスポ
ットが確認された。

目的物質の生成率を測定すると７２．５％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ７−アミノー３−クロロ−３−セフエム−４−カル
   ポン酸と一般式 （式中、Ｒはフエニルまたはヒドロキシフエニル基、Ｚ
   はアミノ、低級アルコキシまたは低級アルキルチオ基を
   示す）で表わされるα−アミノ酸誘導体を水性媒体中ア
   セトバクター属、アクロモバクター属、アエロモナス属
   、アルカリゲネス属、アースロバクター属、バチルス属
   、ベネケア属、プレビバクテリウム属、クロストリジウ
   ム属、コリネバクテリウム属、エツシエリヒア属、フラ
   ボバクテリウム属、グルコノバクター属、クルイベラ属
   、ミクロコツカス属、ノカルジア属、プロテウス属、シ
   ュードモナス属、ロドシュードモナス属、スピリラム属
   、スタフイロコツカス属、ストレプトミセス属またはキ
   サントモナス属に属し、７−アミノー３−クロロ−３−
   セフエム−４−カルボン酸とα−アミノ酸誘導体（■）
   とから一般式 （式中、Ｒは前記と同じ基を示す）で表わされるα−ア
   ミノ−３−クロロセフエム化合物を生成する能力を有す
   る微生物の培養物またはその処理物の存在下で反応させ
   ることを特徴とするα−アミノー３−クロロセフエム化
   合物（１）の製法。 ２ 低級アルコキシ基がメトキシ基である特許請求の範
   囲第１項記載の製法。 ３ 処理物が培養物から除菌した培養ろ液；培養物から
   集菌した生菌体またはその乾燥菌体；培養沖液、生菌体
   または乾燥菌体から分離または精製した、７−アミノー
   ３−クロロ−３−セフエムー４−カルボン酸とα−アミ
   ノ酸誘導体〔■〕とからα−アミノー３−クロロセフエ
   ム化合物（■）を生成する能力を有する活性体；あるい
   は該活性体を水不溶性担体に固定化した固定剤である特
   許請求の範囲第１項記載の製法。 ４ 固定剤が培養ろ液または該活性体を担体吸着処理し
   た該活性体吸着担体；該活性体を半透性膜を形成するこ
   とのできるポリマーで被覆したポリマー被覆該活性体；
   あるいは生菌体または乾燥菌体を半透性膜を形成するこ
   とのできるポリマーで被覆したポリマー被覆菌体である
   特許請求の範囲第３項記載の製法。