JPS5865785A - 抗酸化剤の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 するもので，大豆蛋白質を加水分解し、得られたペプチ
ド中にアミノ酸のエステルを導入した新規な抗酸化剤の
製法を提供するものである。

従来より、食品特に油脂性食品の酸化を防止するため、
抗酸化剤を添加することは広く行なわれている。このと
き使用される抗酸化剤はプチルヒドロキシアニゾール、
ブチルヒドロキシトルエンが最も普通であるが，これら
の物質は毒性の面から安全性に問題があるとされており
、これに代る抗酸化剤として天然物、又はそれから誘導
した物質を使用せんとする研究も広く行なわれている。

これらの研究の中にはアミノ酸の抗酸化力に着目した研
究も行なわれ、例えば本発明者は先にメチオニン、トリ
プトファン、チロシン、及びヒスチジ／を構成分とする
ジペプチドの抗酸化力について発表した。

しかし、ジペプチドは高価であるところから、更に安価
にして強力な抗酸化剤を得んと研究を進めた結果、大豆
蛋白質の酵素氷解物が未処理の大豆分離蛋白質あるいは
同等のアミノ酸混合物より強い抗酸化力を示し，氷解塵
１０〜６０％では氷解塵の差による有意な抗酸化効果は
ないことに着目し、更に研究を進め、大豆蛋白質を部分
加水水解して得られるペプチドにメチオニン、フェニー
ルアラニン、又はチロシンより選ばれたアミノ酸のエス
テルを導入し、抗酸化力の強い抗酸化剤を開発すること
に成功したのである。

以下本発明を詳細災躾例により説明する。

先づ、本発明では出発原料として大豆蛋白質を使用する
が、該蛋白質は丸大豆、未変性脱脂大豆より抽出した蛋
白質を使用し、実用的には分離蛋白として市販されてい
る蛋白質を使用する。上記蛋白質はそのまま使用しても
よいが、好ましくは稀アルカリで溶解、変性後、酸を加
えてＰ　Ｈ４，５前後となし、等電点て沈澱する蛋白質
を集め、精製したものを使用するとよい。この蛋白質は
、そのまま、或は乾燥し、アルカリ、例えば炭酸緩衝剤
を加えてＰ　Ｈｇ、　０前後で溶解する。この溶液とは
別にアミノ酸のエステル、例えばメチルエステル、エチ
ルエステル等を溶解し、ＰＨ９，Ｑ前後とした溶液と、
反応をすすめる酵素としてパパインをメルカプトコタノ
ール等と共に溶解した溶液を？ｊｒ４ｉし、前記蛋白質
浴液と混合する。混合後３０〜４０℃で保持すると反応
が進行し、蛋白質は低分子化すると共に添加したアミノ
酸のエステルは生成したペプチドの中に漸次とりこまれ
る。所足の反応時間が経過すると、酸又はアルカリを加
えて酵素止めを行うが、こＣときアルカリにより酵素止
めを行ったものが製品としたとき強い抗酸化性を示すの
で好ましい。次いで反応液を精製するが、精製は脱塩水
で透析してもよくイオン交換樹脂によりクロマト的に分
離してもよいもので、情況により適宜判断して採用して
よい。

上記方法によると、アミノ酸のエステルがペプチドに導
入せられ、メチオニン、フェニールアラニン、チロジノ
、トリプトファン、ロイシンの外多くのアミノ酸は抗酸
化性を増強するが、なかでもフェニールアラニン、メチ
オニン、チロシンは特に強い抗酸化性を示すものである
。

以下この抗酸化性を実験に基いて説明する。実験に供し
た試料は、フェニールアラニン、メチオニン及びチロジ
ノの各アミノ酸全エチルエステルとし、前記方法に準拠
し種々反応時間を変えて調製したもので、得られたアミ
ノ酸エステル４人ペプチドの抗酸化性の測定はロダン鉄
性により行い、その結果は５００ｍｍの吸光度を測定し
た。得られた実験結果を第１図及び第２図に示すが、第
１図はフェニールアラニンで第２図はメチオニンの実験
結果である。第１図より判明するように、もとの蛋白質
（イ）にくらべ対照のペプチド（ロ）は倒れの反応時間
で得られたものでも吸光度は低下し、抗酸化性は向上す
ることが判明するが、更にフェニールアラニ／のエステ
ルを導入したペプチド、（７）は史に抗酸化性を向上略
すものである。又フェニールアラニン導入量に）は反応
時間が長くなるにつれ増加し、４時間反応時において導
入量が最も多い。

この導入量は反応時間の延長と共に更に増加するが、実
用的には１〜４時間の反応で停止させるとよい。次にメ
チオニンの例を示す第２図ではメチオニンエステル導入
ペプチド（ホ）が対照ペプチド（へ）より常に強い抗酸
化性を示し、メチオニンエステルの導入量（ト）はフェ
ニールアラニンのそれと態様を異にし、１時間反応が最
高で爾後低下する。又第１図ではフェニールアラニンエ
ステルのとりこみが縦筒の４時間反応で最も強い抗酸化
性を示し、第２図ではメチオニンエステルのとり込みが
最も多い１時間反応で最も強い抗酸化性を示すところか
ら抗酸化性の増強はアミノ酸エステルのとり込みにより
増強したものと判断されるが、更に第３図のようにメチ
オニンを単に混合したペプチド（ホ）やフェニールアラ
ニンを単に混合したペプチド（１ハでは、それぞれの対
象のペプチドに）、（ロ）にくらべ例ら抗酸化性を増加
させずメチオニンエステルを導入したペプチド（（ホ）
と７エニールアラニンエステルを導入したペプチド（・
つは常に増加を示す所より抗酸化性能の強加はアミノ酸
エステル導入ペプチドとすることにより行なわれるので
ある。

次に第４図に示すようにメチオニンエステル導入ペプチ
ドの徹加量を増加させると当然のこととして抗酸化力は
増大するもので、図中ａＦｉＯ■、ムは２ｍｇ、Ｃはｌ
ｏｍｙ、ｄは２０ｍ２、ｅは３０ｍ＠。

ｆは５０ｍｙの添加量を示している。

本発明は上記の如くアミノ酸エステルをペプチドに導入
させて抗酸化性を増加するものであるが、前記反応にお
いて使用したパパインは他の蛋白質分解酵素に代えても
可能である。反応の進行により蛋白質は次第に低分化す
るが、前記の如く母体とするペプチドの分解度の差が抗
酸化性に影簀を与えない所から抗酸化性の強弱は導入し
たアミノ酸エステルの菫によってのみ支配されることに
なる。従って、その製造方法はアミノ酸エステルの導入
量のみに配慮して製造すれば良いので製造管理も容易で
あり、且つ安価な材料を使用するので安価な抗酸化剤と
なる。

本発明の方法により得られた抗酸化剤は大豆油、バター
、牛脂、魚油等の動物性油脂、マーガリン、ショートニ
ング、硬化油等の如き加工油脂、或はあげせんべい、チ
ョコレート等の菓子類に直接又は間接添加して商品の酸
化による劣化を防止する効果を奏するものである。

以下実□施例により説明する。

実験例１ 大豆分離蛋白質・１００９（不二製油製）を怖アルカＩ
Ｊ　１　ｉに溶解し変性させ、攪拌しながら塩酸を加え
Ｐ　Ｈ４，５となし生成した沈澱を分離した。

この蛋白質を凍結乾燥し、その１２をＰ　Ｈ９，Ｑの１
Ｍ　ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２’ＣＯａ緩衝液６ｍｌに分散
させた。次いで前記緩衝液に２５７７１Ｍのフェニール
アラニンエチルエステルを溶解した液２ｍｌと、１ｍρ
パパインのメルカプトエタノール１０μＭの溶液２ｍｌ
を加え、３７℃で４時間反応させフェニ−／ｌ／　７ラ
ニンエチルエステルをペプチドの中にとりこませた。こ
のときのとり込み量はフェニールアラニンとして約１５
ｍｔＴあった。反応液はｌＮ−ＮａＯＨ１０ｍｇを加え
て酵素反応を止め、３７℃で１時間保持した。次いで大
量の脱塩水中で１昼夜透析を行い精製した。このときの
収量は０．６Ｐであった。精製後の分析結果を第１表に
示す。

第　　　１　　　表　　　　７ 蛋　　　　白　　　　質　　　　　　１０　％ア　　　
　ミ　　　　ノ　　　酸　　　　　　　　　２　５　ｒ
ｎ、Ｍパ　　　パ　　　イ　　　ン　　　　　　　　　
１／１０００メルカプトエタノール　　　　　　１０ｍ
Ｍ上記フェニールアラニンエステル導入ペプチドは強力
な抗酸化性を有し、バター１００ｆに対し２０ｍｙ８’
Ｓ加し試験を行った結果極めて良好な成績を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はフェニールアラニンを使用した場合の抗酸化性
を示し、左側数値は５００１ｍにおける吸光度、右側数
値は導入量を示す。第２図はメチオニンを使用した場合
の抗酸化性で、数値の表示は第１図と同じである。第３
図は本発明の方法により反応させた製剤と反応させず混
合した場合の抗酸化性を示す。数値は５ＱＱｎｍにおけ
る吸光度を示す。第４図はメチオニンエステル導入ペプ
チドの添加量と抗酸化性の関係を示し、数値は、５００
ｎｍにおける吸光度である。 ７０１ 廣　２−１ｍ １４　　１２　　　　　１　　　　４．ｈｒ１／４　１
／２　　　　　　１　　　　４　　ｈｒｏ、Ｄ、５００
ｎｍ ０　　　　１２　　　　２４ｈｒ 手続補正書 昭和５６年１２月ＦＬｇ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ３、補正をする者 ５補正の対象　　　明細書及び図面 ６補正の内容 （１）　　明細書全文を別紙の通り補正する。 全文訂正明細書 １発明の名称　　　抗酸化剤の製法 ２、特許請求の範囲 法。 ３、発明の詳細な説明 するもので、蛋白質を分解し、得られたペプチド中にア
ミノ酸のエステルを導入した新規な抗酸化剤の製法を提
供するものである。 従来より、食品特に油脂性食品の酸化を防止するため、
抗酸化剤を添加することは広く行なわれている。このと
き使用される抗酸化剤はプチルヒドロキシアニゾール、
フチルヒドロキシトルエンが最も普通であるが、これら
の物質は毒性の面から安全性に問題があるとされており
、これに代る抗酸化剤として、天然物又はそれから誘導
した物質を使用せんとする研究も広く行なわれている。 これらの研究の中にはアミノ酸の抗酸化力に着目した研
究も行なわれ、例えば本発明者は先にメチオニン、トリ
プトファン、チロシン、及ヒヒスチジンを構成分とする
ジペプチドの抗酸化力につぃて発表した。 しかし、ジペプチドは高価であるところから、更に安価
にして強力な抗酸化剤を得んと研究を進めた結果、動植
物蛋白質の酵素氷解物が未処理の大豆分離蛋白質あるい
は同等のアミノ酸混合物より強い抗酸化力を示し、氷解
度１０〜６０％では氷解度の差による有意な抗酸化効果
はないことに着目し、更に研究を進め，蛋白質にメチオ
ニン、フェニールアラニン又はチロシンより選ばれたア
ミノ酸のエステルの存在下で蛋白分解酵素を作用させア
ミノ酸エステルを導入した抗酸化力の増強されたペプチ
ドとすることにより解決したのである。 以下本発明を詳細実験例により説明する。 先づ、本発明では出発原料として蛋白質を使用するが、
蛋白質としては植物起源のものは何れも使用でき、植物
起源のものとしては、大豆、小麦粉等よシ抽出した分ｍ
蛋白をあげることができ、動物起源のものとしてはアル
ブミン、ゼラチン等をあげることができる。又、場合に
よっては微生物より抽出した蛋白を使用しても差支えな
いものである。上記蛋白質はそのま＼使用してもよいが
、好ましくは稀アルカリで溶解、変性後、酸を加えて１
月４４５前後となし、等電点で沈諏する蛋白質を果め、
精製したものを使用するとよい。この蛋白質は、そのま
＼或は乾燥し、アルカリ、例えば炭酸緩衝剤を加えてＰ
　Ｈ　９，　Ｑ前後で溶解する。この溶液とは別にアミ
ノ酸のエステル、例えばメチルエステル、エチルエステ
ル等ヲ溶解Ｌ、ＰＨ９．０前後とした溶液と反応をすす
める酵素としてパパインをメルカプトエタノール等と共
に溶解した溶液を調製し、ｍＩ記蛋白質溶液と混合する
。混合後３０〜４０℃で保持すると反応が進行し、蛋白
質は低分子化すると共に添加したアミノ酸のエステルは
生成したペプチドの中に漸次とりこまれる。 所定の反応時間が経過すると、酸又はアルカリを加える
とかその他適宜の方法で酵素止めを行うが、このときア
ルカリにより酵素止めを行ったものが製品としたとき強
い抗酸化性を示すので好捷しい。 次いで反応液を精製するが、精製は脱塩水で透析しても
よくイオン交換樹脂によりクロマト的に分離してもよい
もので、情況により適宜判断して採用してよい。 上記方法によると、アミノ酸のエステルがペプチドに導
入せられ、メチオニ／、フェニールアラニン、チロシン
、トリプトファン、ロイシンの外多くのアミノ酸は抗酸
化性を増強するが、なかでモフェニールアラニン、メチ
オニン、チロシンは特に強い抗酸化性を示すものである
。 以下この抗酸化性を大豆より調製した分離蛋白を使用し
た場合について実験に基いて説明する。 実験に供した試料は、フェニールアラニン、メチオニン
及びチロシンの各アミノ酸をエチルエステルとし、前記
方法に準拠し種々反応時間を変えて調製したもので、得
られたアミノ酸エステル導入ペプチドの抗酸化性の測定
はロダン鉄性により行い、その結果は５００ｒ′Ｉ［Ｔ
１の吸光度を測定した。得られた実験結果を第１図及び
第２図に示すが、第１図はフェニールアラニンで第２図
はメチオニンの実験結果である。第１図より判明するよ
うに、もとの蛋白質（イ）にくらべ対照のペプチド（ロ
）は何れの反応時間で得られたものでも吸光歴は低下し
、抗酸化性は向上することが判明するが、更にフェニー
ルアラニンのエステルを導入したペプチド（ハ）は更に
抗酸化性を向上さすものである。又フェニールアラニン
導入量に）は反応時間が長くなるにつれ増加し、４時間
反応時において導入量が最も多い。この導入量は反応時
間の延長と共に更に増加するが、実用的には１〜４時間
の反応で停止させるとよい。次にメチオニンの例を示す
第２図ではメチオニンエステル導入ペプチド（ホ）が対
照ペプチド（へ）より常に強い抗酸化性を示し、メチオ
ニンエステルの導入量（ト）はフェニールアラニンのそ
れと態様を異にし、１時間反応が最高で爾後低下する。 又第１図ではフェニールアラニンエステルのとりこみが
最高の４時間反応で最も強い抗酸化性を示し、第２図で
はメチオニンエステルのとりこミカ最も多い１時間反応
で最も強い抗酸化性を示すところから抗酸化性の増強は
アミノ酸エステルのとりこみにより増強したものと判断
されるが、更に第３図のようにメチオニンを単に混合し
たペプチド（イ）やフェニールアラニンを単に混合した
ペプチド（Ｉ乃では、それぞれの対象のペプチドに）、
（ロ）にくらべ何ら抗酸化性を増加させずメチオニンエ
ステルを導入したペプチド（（ホ）と７エニールアラニ
ンエステルを導入したペプチド０うは常に増加を示す所
より抗酸化性能の強化はアミノ酸エステル導入ペプチド
とすることにより行なわれるのである。 次に第４図に示すようにメチオニンエステル導入ペプチ
ドの添加量を増加させると当然のこととして抗酸化力は
増大するもので、図中ａ　Ｉｄ　Ｏｍ？、ｂは２ｍｇ、
Ｃは１０ｍ２、ｄは２０ｍｒ、ｅは３０ｍ？、ｆは５０
ｍＷの添加量を示している。 次に動物蛋白の例として卵白より製造したオボアルプミ
ンを使用した実験例について説明すると。 試料の調製は、アルカリ変性オボアルプミン２０係を含
むＰ　１−１９の１Ｍ炭酸緩衝液４．　□　ｍｌにフェ
ニールアラニンのテチルエステル１００　ｍＭ及Ｕノぐ
パインを全蛋白質量の１０００分の１重量とメルカプト
エタノール１０ｍＭを混合し、３０分及び１時間反応さ
せ直にＩＮ苛性ソーダを加えるか或は液体窒素で凍結し
、反応を停止した。精製は、透過膜により２日間流水中
で透析して精製した。 上記試料の抗酸化性について行った実験結果を第５図に
示す。尚、実験ではコントロール（へ）として、リノー
ル酸を使用し、これに対する酵素反応１時間で、苛性ソ
ーダで酵素止めをした試料（ト）、酵素反応１時間で凍
結して酵素止めをした試料（イ）及び酵素反応３０分で
凍結して酵素止めをした試料（す）を加えて実験を行っ
たが、倒れの場合でも吸光度の低下がみられ、抗酸化性
が増加していることが判明する。更に動物蛋白の他の例
としてゼラチンを使用し、これに前述の方法に準じてチ
ロシン及びメチオニンを導入させ得られた試料をリノー
ル酸０．１４に各試料０〜３０ｍ？添加して抗酸化性を
測定した結果を第６図（チロシン）、第７図（メチオニ
ン）について示す。第６．７図より判明するように、倒
れの場合においても添加量の増加と共に抗酸化性は増加
するものである。 本発明は上記の如くアミノ酸エステルをペプチドに導入
させて抗酸化性を増加するものであるが、前記反応にお
いて使用したパパインは他の蛋白質分解酵素に代えても
可能である１、反応の進行により蛋白質は次第に低分化
するが、前記の如く母体とするペプチドの分解度の差が
抗酸化性に影響を与えない所から抗酸化性の強弱は導入
したアミノ酸エステルの量によってのみ支配されること
になる。従って、その製造方法はアミノ酸エステルの導
入量のみに配慮して製造すれば良いので製造管理も容易
であり、且つ安価な材料を使用するので安価な抗酸化剤
となる。 本発明の方法により得られた抗酸化剤は大豆油、バター
、牛脂、魚油等の動物性油脂、マーガリン、ショートニ
ング、硬化油等の如き加工油脂、或はあげせんべい、チ
ョコレート等の菓子類に直接又は間接添加して商品の酸
化による劣化を防止する効果を奏するものである。 以下実施例により説明する。 実験例１ 大豆分離蛋白質１００ｆ（不二製油製）を稀アルカＩＪ
　ｌ　ｌに溶解し変性させ、攪拌しながら塩酸を加えＰ
　Ｈ４，５となし生成した沈澱を分離した。 この蛋白質を凍結乾燥し、その１２をＰ　ｌ−Ｉ　９．
　Ｑの１Ｍ、ＮａＨＣＯａ−ＮａｚＣＯａ緩衝液６ｍ緩
衝液６宮ｌた。次いで前記緩衝液に２５ｍＭのフェニー
ルアラニンエチルエステルを溶解した液２ｍｌと、１ｍ
２のパパイ〜ンのメルカプトエタノールｌＯμＭの溶液
２ｍｌを加え、３７℃で４時間反応させフェニールアラ
ニンエチルエステルをペプチドの中にとりこませた。こ
のときのとり込み量はフェニールアラニンとして約１５
ｍ？であった。反応後はＩＮｌＮ−ＮａＯＨ１Ｏを加え
て酵素反応を止め、３７℃で１時間保持した。次いで大
量の脱塩水中で１昼夜透析を行い精製した。このときの
収量は０．６Ｆであった。精製後の分析結果を第１表に
示す。 第　　　１　　　表 蛋　　　　　白　　　　　質　　　　　　　１０　　係
ア　　　　ミ　　　　ノ　　　　酸　　　　　　　　２
５ｍＭパ　　　パ　　　イ　　　ン　　　　　　　ｌ／
１０００メルカプトエタノール　　　　　１０ｍＭ上記
フェニールアラニンエステル導入ペプチドは強力な抗酸
化性を有し、パター１００ｆに対し２０ｍ？添加し試験
を行った結果極めて良好な成績を示した。４ 実施例２ 鶏卵より製造したオポアルプミン１００ｒを稲荷性ソー
ダ溶液に浴解し、２０％磯度のアルカリ変性オボアルプ
ミンを調製した。これに塩酸で中和し、沈澱させて精製
し、凍結乾燥後その１２をとりＰＨ９，０（７）Ｉ　Ｍ
　ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯａ緩衝液４　ｍｌに分散さ
せ、チロシン・エチルエステル、１００ｍＭ溶液２ｍｌ
と、１ｍ２のパパインのメルカプトエタノール１０ｍ１
Ｍの溶液２ｍｌを加え３７℃で１時間反応させチロシン
・エチルエステルの導入されたベフリイトが生成された
。反応後ＩＮ塩酸又は苛性ソーダを加えて酵素反応をと
め、大量の水中で２４時間透析して精製した。このとき
の収量は乾物として０．６５　Ｆであった。上記チロン
ンエステルを得大したペプチド２は、大豆油１００Ｖに
対し２０ｍ？絵加して抗酸化性の試験を行った所極めて
強い抗酸化性を示した。 ４、図面の簡単な説明 第１図はフェニールアラニンを使用した場合の抗酸化性
を示し、左側数値は５００ｎｍにおける吸光度、右側数
値は導入量を示す。第２図はメチオニンを使用した場合
の抗酸化性で、数値の表示は第１図と同じであ地。第３
図は本発明の方法により反応させた製剤と反応させず混
合した場合の抗酸化性を示す。数値は５００ｎｍにおけ
る吸光度を示す。第４図はメチオニンエステル導入ペプ
チドの添加量と抗酸化性の関係を示し、数値は、５００
１ｍにおける吸光度である。第５図はオボアルフミンに
フェニールアラニンエチルエステルを導入した場合の抗
酸化性を示す。第６図はゼラチンにチロシンのエチルエ
ステルを導入した場合の製品のリノール酸に対する抗酸
化性を示し、　−図中ｇは□ｍ９、ｈは５ｍｙ％ｉはｌ
Ｏ〜、」は２０ｍｙ、ｋは３０Ｍの添加である。父、第
７図はメチオニンの場合を示し、添加量はｌ：□ｍｙ、
ｍ：５ｍＶ＋　ｎ　：　ｌ　Ｏｍｙ、０：２０ｍｆ、ｐ
：３ｏｍ９である。 簿６　夙 ｕ　　　　　　　　　　　　　　２０　ｈｒ多７７！Ｉ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）大豆蛋白質を部分加水分解し、得られたペプチド
   にメチオニ／、フェニールアラニン又はチロシンより選
   ばれたアミノ酸のエステルを導入シ、抗酸化力を増強袋
   ずことを特徴とする抗酸化剤の製法。
2. （２）大豆蛋白の部分加水分解が酵素による加水分解で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項の抗酸化剤
   の製法。