JPS5872520A - 継代可能なリンホカイン産生ヒトｔ細胞融合株及びその取得方法 - Google Patents

継代可能なリンホカイン産生ヒトｔ細胞融合株及びその取得方法

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JPS5872520A
JPS5872520A JP56171505A JP17150581A JPS5872520A JP S5872520 A JPS5872520 A JP S5872520A JP 56171505 A JP56171505 A JP 56171505A JP 17150581 A JP17150581 A JP 17150581A JP S5872520 A JPS5872520 A JP S5872520A
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利昭 大澤
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芳郎 小林
Makoto Asada
誠 浅田
Masahiro Higuchi
昌宏 樋口
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は継代可能なリンホカイン産生ヒ）Ｔ細胞融合株
及びその取得方法に関し、より詳しくはタンパク質合成
の阻害剤及び／又はＲＮＡ合成の阻害剤で処理したヒト
急性白血病細胞株と、マイト−ジエン又は抗原で刺激さ
れたヒトＴ細胞とを融合促進剤の存在下で融合すること
によって誘導された継代可能なリンホカイン産生ヒトＴ
細胞融合株及びその取得方法に関する。
細胞融合の現象は、１９５８年に同円によりセンダイウ
ィルス［ＨＶＪ）を用いて見出され、体細胞遺伝学の領
域において飛躍的な発展をもたらした。［：Ｙ、０ｋａ
ｄａ、　Ｂｉｋｅｎ　Ｊ、　、　１１０３　（１９５８
）　）１９７５年、ＫδｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎは
、この細胞融合技術を免疫学の分野に応用することに成
功した。
すなわち、免疫されたマウスから得た１牌臓細胞と、Ｈ
ＡＴ　（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）
感受性マウス骨髄腫（ミエローマ１）細胞との融合によ
り、モノクローナルな抗原特異的抗体を、永久に生産し
つづける細胞融合株を得ることを初めて証明した。ＣＧ
、　Ｋ６ｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ。
Ｎａｔｕｒｅ　２５６　４９５　　（１９７５））ヒト
および動物の免疫系に含まれるリンパ球は、胸腺由来の
細胞（Ｔ細胞）と、骨髄由来の細胞（Ｂ細胞）とに大別
される。
Ｂ細胞は、抗体を分泌する細胞であり、Ｋ′ｏｈｌｅｒ
らの細胞融合は、マウス由来Ｂ細胞とＨＡＴ感受性マウ
ス骨髄腫細胞との間で行なわれたものである。一方、Ｔ
細胞は、骨髄中の幹細胞（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）が胸腺
内で分化成熟し、末梢の器官（例えばリンパ節、牌臓）
および血流の中を循環する。
Ｔ細胞は、生体における免疫応答の調節制御に重要な役
割を担っている。このＴ細胞の調節制御機能が、Ｔ細胞
より遊離されるリンホカイン（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ
　）と総称される可溶性メディエータ−により推進され
ることは良く知られている。（Ｈ。
Ｇ、　Ｋｕｎｋｅｌ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｊ、　Ｄｉｘｏｎ
、　Ａｄｒａｎｏｅｓ　°ｉｎ＋＋Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ２９５６　（１９８０）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ発行〕従来、生体の免疫応答を制御することにより
、癌、アレルギー、感染症など種々の疾病を治療する試
みがなされているが、免疫系細胞を含む種々の細胞にそ
れぞれ特異性のあるリンホカインは、更に有効な免疫治
療剤として応用可能である他、臨床診断薬として広く医
療分野への応用が期待されている等、医学的にきわめて
重要な物璽である。
しかしながら通常の方法では、リンホカインは充分量得
られず、またその純度の低さなどの点が医療分野への応
用の大きな妨げとなっている。リンホカインは、抗原特
異的な刺激やマイト７ジエン刺激などにより、リンパ球
によって産生される非抗体性の蛋白因子群であり、リン
パ球の中でも主にＴ細胞によって生産される。主なリン
ホカインとその作用を以下に示す。
ｌ）々クロファージに作用するリンホカイン■　Ｍｉｇ
ｒａｔｉｏｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　
（以下ＭＩＦと略、マクロファージ遊走阻止因子） 作用：　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでマクロファージの遊走を阻
止する。
■　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆ
ａｃｔｏｒ　（以下ＭＡＦと略、マクロファージ活性化
因子） 作用：マクロファージの食作用、殺菌作用などを促進さ
せる。
■　Ｍｏｎｏｃｙｔｅ　−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　（：
ｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＭＣＦ、単球−
マクロファージ走化性因子）作用：　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
で単球、マクロファージの走化性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉ
ｓ　）　ｆ惹起する。
２）多形核白血球（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａ
ｒ　１ｅｕｃｏｃｙｔｅ　）に作用するリンホカイン ■　白血球（遊走）阻止因子（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　−
ＭｉｇｒａｔｉｆｆＩｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔ
ｏｒ、　Ｌ　Ｉ　Ｆ　）作用：　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで多
形核白血球の遊走を阻止する。
■　走化性因子（Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ　ｆａｃｔｏ
ｒ　）作用：　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで好中球、好酸球、好
塩基球の走化性を誘起する。
３）リンパ球に作用するリンホカイン ■　インターロイキｙ　ｌ　（１ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ
　ｌｌ　、　ＩＬ−Ｉｆ　）作用：抗原又はマイト−ジ
エン刺激をうけたＴ細胞の分裂、増殖を促進する。
４）その他の細胞に作用するリンホカイン■　リンホト
キシン（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ　、　ＬＴ　）作用：
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＬ細胞、Ｈｅ１ａ細胞を傷害、剥
離させる。
■　γ−インターフェロン（γ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
。
ＩＦＮ−γ） 作用：ウィルス病原性に干渉する。
■　Ｃｏ１ｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔ
ｏｒ　（Ｃ８Ｆ）作用：骨髄白血球前駆細胞（ＣＦＵ−
Ｃ）に作用して、この細胞の顆粒球又はマクロファージ
）の分化増殖を促進する。
上記リンホカインの活性は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　（生体
外）で測定されるが、ｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）との
対応が認められるリンホカインも報告されている。
例えば、ツベルクリン反応の場においてｃｈｅｍｉｃａ
ｌｍｅｄｉａｔｏｒによる血管拡張浮腫に加えて多数の
マクロファージの集積がみられる。これは感作Ｔ細胞由
来の走化因子（ＭＣＦ）により遊走集合したマクロファ
ージが更にＭＩＦによって固定されたものであり、ＭＣ
Ｆ、ＭＩＦがマクロファージを効率良く集積、活性化し
て異物処理を有効に進める生体防御に関連していること
が示されている。
ＭＣＦ、ＭＩＦ以外に将来医薬として期待されるリンホ
カインとして、ＭＡＦ、　　リンホトキシン、インター
ロイキン■、ＩＦＮ−γ、Ｃ８Ｆがあげられる。
これらリンホカインを生産する方法として１）抗原感作
された末梢血リシンく球を、その抗原と共に培養する方
法。
２）末梢血リンパ球又は牌臓細胞全マイトージエンと共
に培養する方法。
３）　　Ｔ細胞増殖因子（ＩＬ−Ｉｔ）を用いて抗原特
異的Ｔ細胞クローンを確立し、培養する方法。
等が知られているが、１）、　　２）の方法では大量の
血液を必要とするうえに、生産されるリンホカインの量
が極めて僅かであり、高純度の製品を大量に入手、する
ことが困難であることコ３）の方法では、ＩＬ−Ｉｆの
存在下で特定のリンホカインを生産することはできるが
、Ｔ細胞からの生産性が悪く、又ヒ）ＩＬ−Ｈの入手が
困難（高価）であることなどの問題点を有する。
これらは、リンホカイン産生Ｔ細胞が継代できないこと
、増殖性が小さいこと、Ｉ′Ｌ−■等増殖因子の存在下
で培養してもなお増殖性が小さいことに起因している。
以上の理由で、現状では臨床応用に必要な量のリンホカ
インを確保することは極めて困難である。
これらの問題を解決する一つの方策として細胞融合の技
術が用いられ、マウスでは既にＴ細胞融合株が樹立され
、その細胞の生産するリンホカインに関する解析が可能
となっている。しかし、マウスＴ細胞融合株により生産
されたリンホカインをヒトに対して臨床応用することは
できない。ヒト免疫学、臨床応用の必要性から継代可能
なリンホカイン産生ヒ、トＴ細胞融合株の確立が期待さ
れている。
ヒトＴ細胞の融合においても、マウスＴ細胞融合と同様
の方法で行うことは十分考えられるところである。
すなわち、リンホカイン産生Ｔ細胞（継代できない）と
、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン
）感受性Ｔ系腫瘍細胞（継代できる）とを融合促進剤の
存在下で融合した後、ＨＡＴ培地にても増殖できる細胞
のみを選別し、クローン化して目的のリンホカインを産
生ずるＴ細胞融合株を選び出す方法である。［Ｑ、Ｃａ
ｔｈｅｒｉｎｅ他ｒ　Ｎａｔｕｒｅ　Ｊ第２９２巻、８
４２頁、１９８１年〕しかし、ヒトＴ系腫瘍細胞にＨＡ
Ｔ感受性をもたせることは極めて煩雑な操作を必要とし
、かつ樹立が困難である。
本発明者らは継代可能なリンホカイン産生ヒトＴ細胞融
合株の取得方法を種々検討した結果、タンパク質合成の
阻害剤及び／又はＲＮＡ合成の阻害剤で処理したヒト急
性白血病細胞株と、マイト−ジエン又は抗原で刺激され
たヒトＴ細胞とを融合促進剤の存在下に融合することに
より、継代可能なリンホカイン産生ヒ）Ｔ細胞融合株の
取得に成功し、本発明を完成するに至った。
本発明は一般に次の工程からなる。
Ａ、ヒト末梢血及び手術によシ無菌的に摘出した牌臓又
は胸腺よシ分離したリンパ球をマイト−ジエン又は抗原
で刺激した後、細胞に結合したマイト−ジエン又は抗原
を可及的に除去する。
使用する抗原又はマイト−ジエンとしては、ヒトＴ細胞
に対して形質転換を誘導する物質であれば良く、目的と
するリンホカインに応じて適宜選択して使用する。マイ
ト−ジエンとしては、フィトヘムアグルチニンーＰ（以
下ＰＨＡ−Ｐと略）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）な
どが挙げられる。
Ｂ、　ヒト急性白血病細胞をタンパク質合成の阻害剤及
び／又はＲＮＡ合成の阻害剤で処理した後、培養液中の
阻害剤を遠心除去する。
ヒト急性白血病細胞株としては、Ｔ細胞系の腫瘍細胞例
えばＣＥＭ、ＴＡＬＬ、ＭＯＬＴ−４株などが使用でき
る。
タンパク質合成の阻害剤としてはエメチン塩酸塩の他、
公知の不可逆的なタンパク質合成阻害剤が使用できる。
例えばクロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナ
マイシン、カナマイシン、リシン、ストレプトマイシン
、テトラサイクリン等が挙げられる。これらタンパク質
合成阻害剤のみを用いる他、ＲＮＡ合成の阻害剤を併用
することが望ましい。ＲＮＡ合成阻害剤としてはアクチ
ノマイシンＤが好ましいが、この他α−アマンテン、エ
チジウムブロマイド、マイトマイシンＣ１リフアンピシ
ン、アドリアマイシンなどが挙げられる。場合によって
はＲＮＡ合成阻害剤のみを用いることもできる。これら
阻害剤による処理条件はヒト急性白血病細胞株の分裂増
殖を完全に防止できる条件から選択される。例えばＣＥ
Ｍ（２Ｘ１０　’　／ｍｔ）をエメテン塩酸塩単独で処
理する場合、その濃度は１Ｏ−４〜１０’Ｍ１　アクチ
ノマイシンＤを併用する場合、エメテン塩酸塩１０−５
Ｍ、アクチノマイシンＤ　Ｏ，０５；ｙ：Ｏ，−ノ４１
ｇ／ｍｅ−，（処理温度３７°Ｃ１処理時間２時間）の
範囲が望ましい。
Ｃ６以上のように調製したリンホカインズ産出ヒトＴ細
胞と、タンパク質合成の阻害剤及び／又はＲＮＡ合成の
阻害剤によって増殖を停止したヒト急性白血病細胞株を
適当な融合促進剤の存在下に融合する。
ヒトＴ細胞と、ヒト急性白血病細胞株の混合比は１：１
〜２０：ｌの範囲好ましくは２：１〜１５：１である。
融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（以下Ｐ
ＥＧと略）、ポリビニルアルコール、細胞融合能を有す
るウィルス、中でもセンダイウィルス（ＨＶＪ）の属す
るｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ　ＥＩびその不活化物な
どが用いられるが、一般的には、ＰＥＧ（分子量１，０
００〜４，０００）を使用する。
Ｄ、融合細胞株の生細胞濃度を１０５〜２×１ｏ６／ｍ
ｌとし、ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒを添加した栄養培地
を含む９６つｘ　Ａ／　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅで
培養した。
ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒとしては、抗生物質又はＸ線
照射等により増殖を止めたヒト細胞が用いられる。
栄養培地としては、ヒト急性白血病細胞株が増殖できる
培地であればいずれも使用できる。例えばＲＰＭＩ　１
６４０に牛胎児血清（Ｆｅ２）１０％、２−メルカプト
エタノール５Ｘ１０−５Ｍ、グルタミン２、ｍＭを添加
した培地が好適に用いられる。
培養後１週間で、これら阻害剤で処理したヒト急性白血
病細胞株及びｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒは完全に死滅し
融合細胞のみ増殖した。
尚、融合株が取得できたことの確認は■細胞表面抗原の
解析■核型の解析により行った。
Ｅ、融合細胞の増殖したウェルの培養上清を、分析し、
目的のりンホカイン産生性を確認する。
以上の方法によって得た融合細胞株は、リンホカイン活
性を保持したまま長期継代が可能であり更に、クローニ
ングにより、リンホカインを効率良く産生ずるサプライ
ンを得ることができる。
そのサプラインを生体外あるいは生体内で培養すること
によりリンホカインを製造することができる。これらｊ
培養方法は公知の方法を使用すれば良い、例えば、生体
外培養法としては、攪拌培養法や、シャーレ、ルーびん
内での静置培養法が含まれる。
生体内培養法としては、ヌードラット、ヌードラット又
はヒト以外でヒトの腫瘍細胞を移植可能な動物に融合細
胞を接種し、固体状腫瘍又は腹水腫瘍を形成させ、適当
な増殖期間後、当該分野の常套法によって腹水および／
又は血液を採取する方法、又特開昭５４−９８３０７に
示される免疫反応を弱めたハムスターに融合細胞を接種
、増殖する方法などが含まれる。
継代可能なリンホカイン産生ヒトＴ細胞融合株は、りン
ホカインの大量生産に有用なばかりでなく、目的のリン
ホカイン産生細胞を大量に入手できる４とから、細胞中
のリンホカイン産生関連遺伝子（メツセンジャーＲＮＡ
など）の抽出源としても利用できる。抽出したメツセン
ジャーＲＮＡより逆転写酵素により相補的ＤＮＡ　（Ｃ
ＤＮＡ）を作製した後、遺伝子組換えの常法に従ってリ
ンホカインを微生物（細菌、酵母、放線菌、カビ）に作
らせることも可能である。
次に実施例を挙げ本発明を具体的に説明する。
実施例１ （１）リンホカイン産生ヒトＴ細胞融合　の調製ヒト末
梢血リンパ球（以下ＰＢＬと略）（ａＡ−Ａ２．−Ａｗ
２４．−Ｂ７．−Ｂｗ３５．−Ｃｗ３゜−ＣＷ７）１０
’個／ｍｌを、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０チ牛脂児
血清、５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカブトエタノール、２ｍ
Ｍグルタミン含有）（以下ＲＰＭＩ培地と略）中、Ｐ　
ＨＡ　−Ｐ　５　μｇ／ｍｌにより２日間刺激後、Ｎ−
アセチルガラクトサミン０、１　Ｍによって細胞に結合
したＰＨＡ−Ｐを可及的に除去した。
他方、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０チ新生牛血清含有
）中で増殖したヒト急性白血病細胞株ＣＥＭ（ＨＬＡ−
Ａｔ、−Ａｗ３０．−Ｂ８゜−Ｂ２Ｏ）２Ｘ１０６個／
ｍｌにエメチン塩酸塩１０−５Ｍを添加し、３７°Ｃ，
２時間処理した後、培養液中のエメテン塩酸塩を遠心除
去した。
以上のように調製したＰＢＬとＣＥＭを１０：ｌの比で
混合後、遠心分離して得た細胞ペレットに、０．５ｍｔ
の４６チポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１５４０）
、７５％ジ、メチルスルホキサイド、５μｇ／ｍｔポリ
Ｌ−アルギニンを加え、３７０Ｃ，４５秒間融合させ、
ｌＯｍｔの２５ｚｎＭＨＥＰＥＳ添加ＭＥＭ培地をゆっ
くシ加え遠心した。
融合後、融合細胞中の生細胞数１２Ｘ１０５個／ｍｔと
し、ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒとしてマイトマイシンＣ
処理（マイトマイシンＣ濃度２５　μｇ／ｍｔ、　３７
°Ｃ１３０分）したＣＥＭ８Ｘ１０４個／　ｍｌを含む
ＲＰＭＩ培地を、ｌウェル中０．２　ａｌ含む９６ウエ
ルカルチヤープレートで培養した。培養後１週間は、死
んでい＜ＣＥＭより放出される薬剤の影響を緩和するた
めに、毎日培養液ヲ１／２づつ交換した。
融合細胞の増殖が認められたウェル中の細胞を用い（２
）に示す方法でリンホカイン活性を測定した。
この間に対照として培養したエメチン処理ＣＥＭ及びマ
イトマイ７ンＣ処理ＯＥＭは完全に死滅した。
（２）融合細胞の培養とリンホトキシン活性（りにより
得た融合細胞ｔ、ＰＨＡ−Ｐ２０μｇ／ｍｔの存在下、
ＲＰ’ＭＩ培地中で培地量培養し、培養上清のリンホト
キシン活性をＬ−Ｐ３（Ｌ細胞の亜株）を標的細胞とし
て測定した結果、２つの融合株（Ｅ−１０，Ｆ−８）に
活性が認められた。この活性は３ケ月以上保持されてい
る。尚リンホトキシン活性は次の小林らの方法によシ測
定した。すなわち、あらかじめマイクロプレートに形成
させたＬ　−Ｐ３：　ｓ　ｏμｔ（細胞数２’Ｘ１０’
個）に被検体２５μを及びアイテノマイシンＤ（４μｇ
／ｍｔ）２５μｔを加え、３７°Ｃ１２０−２４時間培
養後、細胞をグルタルアルデヒドで固定、染色し、形態
上正常な細胞数を計測する方法により行った。
ＣＹ、　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１２２７９１（１９７９）］ （３）融合株、Ｅ−１０及びＦ−８の特性ｌ）細胞表面
抗原の解析 ■　ＣＥＭは、螢光活性化セルソーター（Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒ
ｔｅｒ　）による分析から、モノクローナル抗体０ＫＴ
３と反応しないことが知られており、一方ヒ）Ｔ細胞が
ＯＫ’Ｔ３と反応することを利用して、ヒトＴ細胞融合
株（Ｅ−１０及びＦ−８）の０ＫＴ３反応性を１２Ｊ−
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを用いたｔｗｏ　−５ｔｅｐ　ｂｉ
ｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ及びｉｍｍｕｎｏｆ　１ｕｏｙ
ａｃｅｎｃｅで調べた。その結果、ＣＥＭの反応性がな
いのに対して、Ｅ−１０はＰＢＬ−Ｔ細胞と比較して同
程度、Ｆ−８は５０チ程度の反応性が認められた。
■　１２５Ｉ　−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを用いたー−ｓｔ
ｅｐｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙによって、Ｅ−１０，
Ｆ７−８のＨＬＡ抗原を調べた。ＰＢＬはＨＬＡ−Ａ２
．−Ｂｗ３５ｐｏｓｉｔｉｖｅ　、　ＣＥ　ＭはＨＬＡ
−Ａ　Ｉ　、　−Ｂ　８　ｐｏｓｉｔｉｖｅであるのに
対し、Ｅ−１０，Ｆ−８共にＨＬＡ−ＡＩ　。
−Ａ　２　、−　Ｂ　８　ｐｏｓｉｔｉｖｅであった。
２）核型の解析 ＣＥＭ及びＥ−１０，Ｆ−８の染色体数を各々５０〜８
０のｍｅｔａｐｈａｓｅ核について調べた。その結果Ｃ
ＥＭは８４．３±０．９（平均値上Ｓ、Ｅ、）（８５）
（ｍｅｄｉａｎ　）であるのに対し、Ｅ−１Ｏは９５．
５±１．７　［９４）、Ｆ−８は９１．５±１．６［９
３：］であり、約ｌＯの染色体増加を観察した。
実施例２ 実施例１で得られたリンホカイン産生細胞融合株Ｅ−１
０ｉ１０’個／ｍｌ含むＲＰＭＩ培地で１日間培養して
得た培養上清の４倍希釈液のＭＩＦ活性ヲハリ７トンの
方法（Ｊ、　’ｌ’ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ’　７ｒ１ｅ
ｔａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１１０　７５
２．１９７３）に従って測定した結果、マクロファージ
遊走阻止率は２９．９４であり、同条件下で培養したＯ
ＥＭの培養上清に活性は認められなかった。同、ＰＢＬ
１０７個／ｍｌをＣ０ｎＡ（ｌＯμｇ／ｒｒＬｔ）を含
むＨ’ＥＰＥＳ含有ＭＥＭ培地で１日間培養して得た培
養上清は２５．２チのマクロファージ遊走阻止率を示し
た。Ｅ　−１０のＭＩＦ活性は６チ月以上保持されてい
る。
実施例３ ＣＥＭにエメチン塩酸塩５Ｘ、１０−５Ｍ、アクチノマ
イシンＤ　０．１ｇｇ／ｍｔを添加し、３７°Ｃ２時間
処理したものＬ実施例１と同様に作成したＰＢＬと融合
させ、実施例１の方法で培養した結果、対照として培養
したエメテン塩酸塩及びアクチノマイシンＤ処理ＣＥＭ
は完全に死滅し、融合細胞のみ増殖が認められた。
この融合株を実施例２の方法と同様に培養して得た培養
上清についてＭＩＦ活性を測定した結果、マクロファー
ジ遊走阻止率は４０チであった。
特許出願人　電気化学工業株式会社 代理人　弁理士　　　鈴　木　定　子 手続補正書 昭和５６年１２月７日 特許庁長官　島　田春樹殿 １、事件の表示 昭和５６年　特　許　願第１７１５０５号３、補正をす
る者 事件との関係　特許出願人 住　所　　東京都千代田区有楽町１丁目４番１号Ｍｌｌ
　ｙ４　、、、）（３２ｇ　）電気化学工業株式会社代
表者　　篠　原　　　晃 ４、代理人〒１５０ ６゜　補正により増加する発明の数　なし７、補正の対
象　明細書の特許請求の範囲の欄及び廃明の詳細、な説
明の欄 （１）　　特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。
（２）明細書、３債、下から４行ｒＡｄｒａｎｃｅｓ　
ｉｎＪ　ｆｒ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｊに訂正する
。
（３）　同、１０頁、１５行ないし末行の「タンパク質
合成の・・・・・・等が挙げられる。」ヲ「タンパク質
合成の阻害剤としては、公知の真核細胞のタンパク質合
成阻害剤が用いられるが、エメチン塩酸塩、バタタマイ
シンなど不可逆的なタンパク質合成阻害剤が好ましい。
」に訂正する。
（４）同、１１頁、４行の「マイトマイシンＣｊ」ｑ削
除する。
（５）同、ｌ１頁、６行ないし７行の「場合によっては
ＲＮＡ合成阻害剤のみ？用いることもできる。」を削除
する。
（６）同、１１頁、１２行の［エメテン塩酸塩１０−”
Ｍ、　Ｊを「エメテン塩酸塩１０−４〜１０　’Ｍ％　
Ｊに訂正する。
（７２゛　　同、１４頁、１０行のｒ（ＣＤＮＡ）Ｊを
［（ｃＤＮＡ）Ｊに訂正する。
に訂正する。
（９）　　同、１５頁、１７行のｒ２５ｍＭＨＥＰＥＳ
Ｊをｒ２５ｍＭ　　ＨＥＰＥＳＪに訂正する。
■）　同、１８貞、１８行ないし１９行の［〔Ｊ。
Ｔｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ’　Ｊｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１１０７５２゜１９７３］Ｊ
をｒ　ＣＪ、　Ｔｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　Ｊｒ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１ｔ０７５２．　（１９７３）
　）　Ｊに訂正する。
但）同、１９頁、１５ないし１７行を「この融合株を実
施例１−（２）の方法と同様に培養上清についてリンホ
トキシン活性を測定した結果、２つの融合株（Ｃ−５，
Ｄ−９）について活性が認められた。」ＫＩＴ′Ｅ“６
・　　　　　　　　　　　　　（以上）訂正特許請求の
範囲 （リ　ヒト急性白血病細胞株とマイト−ジエン又は抗原
で刺激されたヒトＴ細胞とを融合させ、融合側１゜ 胞だけを分離して得られた継代可能なリンホカイン産生
ヒトＴ細胞融合株。
（２）タンパク質合成阻害剤又はタンパク質合成阻害３
゜ 剤とＲＮＡ合成阻害剤との併用により処理したヒト急性
白血病細胞株を用いる特許請求の範囲第１項の継代可能
なリンホカイン産生ヒトＴ細胞融合株。
（３）　　ヒト急性白血病細胞株をタンパク質合成阻害
剤又はタンパク質合成阻害剤とＲＮＡ合成阻害剤と　　
　４゜の併用によ多処理する一方、ヒ）Ｔ細胞をマイト
−ジエン又は抗原で刺激し、両者を融合促進剤の存在下
で融合させた後、融合細胞だけを分離する継代可能４１
Ｊンホ力イン産生ヒトＴ細胞融合株の　　　７５゜取得
方法。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６・
７゜ 昭和５６年１２月２８日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 事件の表示　昭和５６年特許願第１７１５０５号発明の
名称　継代可能なリンホカイン産生ヒトＴ細胞融合株及
びその取得方法 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　東京都千代田区有楽町１丁目４番１号名称　　
（３，２９）　　電気化学工業株式会社代表者　　篠　
原　　晃 代理人　〒１５０ 補正命令の日付　　自発 補正の対象　　明細書の発明の詳細な説明の欄補正の内
容　。
明細書、３頁、下から４行のｒａｄンー艶−５ｔｎＪを
「Ａｌｙａｎｃｅｓ　ｉ　ｎ　Ｊに訂正する。
手続補正書 昭和５７年１０月２６日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、　事件の表示 昭和５６年特許願第１７１５０５号 ２、　発明の名称　縫代可能なリンホカイン産生ヒトＴ
細胞融合株及びその取得方法 ３、　補正をする者 事件との関係　　　本人　１１１七り八人住所　　東京
都千代田区有楽町１丁目４番１号名称　　（３２９）電
気化学工業株式会社代表者　　篠　原　　晃 ４、代理人　■１５０ 住所　　東京都区渋谷区渋谷三丁目６番４号電話　０３
　（４０７）　０７５３番 ５、　補正命令の日付　　自発 ６、　補正の対象 （１１明細書１１頁１６行及び１７行の「タンパク質合
成の阻害剤及び／又はＲＮＡ合成の阻害剤」を「タンパ
ク質合成阻害剤又はタンパク質合成阻害剤とＲＮＡ合成
阻害剤との併用」に訂正する。
（２）明細書１９頁の「特許出願人　電気化学工業株式
会社」の上に法文を挿入する。
［実施例４ 実施例１で得られたリンホカイン産生ヒトＴｌ［ｌ胞融
合株Ｅ−１０をｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒとしてマイト
マイシンＣ処理（処理条件は実施例１と同じ）したＣＥ
Ｍ　　２Ｘ　　１０’／ｍｌ及び２０％のＣｏｎ　Ａ−
活性化ＰＢＬ上清を含むＲＰＭＩ培地中で限界希釈法（
細胞０．５個／ウェル）によりクローン化してサプライ
ンＥ　１０−２０を得た。
次いでＥ　１０−２０を１０”個／ｍｌ含むＲＰＭＩ培
地で１日間培養して得た培養上清を硫安分画（５０〜１
００％飽和）、ＰＢＳに対し透析して得た試料につき、
ＭＩＦ活性を測定した結果、マクロファージ遊走阻止率
は３２％であった。
更にＭＡＦ活性をＨｏＷ、　Ｍｕｒｒａｙらの方法（Ｊ
、Ｂｘｐ、Ｍｅｄ、、１５３１６９０　　（１９８１）
　）の変法により測定した。すなわちヒトマクロファー
ジ様細胞株Ｕ９３７とＭＡＦとの反応により生ずる細胞
内スーパーオキサイドアニオン（Ｏｉ）を、ニトロブル
ーテトラゾリウムの変色（国の存在により細胞が青変す
る。）により検知した。その結果、全細胞数の３０％が
変色し、ＭＡＦ活性が認められた。
同様にしてＣＥＭ株を培養して得た培養上清を硫安分画
（５０〜１００％飽和）、ＰＢＳに対し透析して得た試
料につき、ＭＩＦ活性を測定した結果、マクロファージ
遊走阻止率は９．９％、ニトロブルーテトラゾリウムに
より変色した細胞は全細胞数の２１％であった。」 以上

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　　ヒト急性白血症細胞株とマイト−ジエン又は
    抗原で刺激されたヒトＴ細胞とを融合させ、融合細胞だ
    けを分離して得られた継代可能なリンホカイン産生ヒト
    Ｔ細胞融合株。
  2. （２）　　タンパク質合成阻害剤及び／又はＲＮＡ合成
    阻害剤により処理したヒト急性白血病細胞株を用いる特
    許請求の範囲第１項の継代可能なリンホカイン産生ヒ）
    Ｔ細胞融合株。
  3. （３）　　ヒト急性白血病細胞株をタンノζり質合成阻
    害剤及び／又はＲＮＡ合成阻害剤により処理する一方、
    ヒトＴ細胞をマイト−ジエン又は抗原で刺激し、両者を
    融合促進剤の存在下で融合させた後、融合細胞だけを分
    離する継代可能な１ノンホカイン産生ヒ）Ｔ細胞融合株
    の取得方法。
JP56171505A 1981-10-28 1981-10-28 継代可能なリンホカイン産生ヒトｔ細胞融合株及びその取得方法 Expired JPS6011889B2 (ja)

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