JPS587256A - 体液中の免疫抑制物質ｄｅｓ−ｉ除去剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■１発明の背景 技術分野 本発明はガン患者の体液中に存在する免疫抑制物質ＤＥ
Ｓ−Ｉの除去剤に関するものである。

ガン患者の血液および腹水中には正常人に比べて多量の
ＤＥＳ−Ｉが存在し、このものは免疫抑制活性を有する
。そこで正常値を越えて存在するＤＥＳ−Ｉを体液中か
ら除去することは、ガンの治療上有効であると考えられ
る。

先行技術の問題点 肝臓、膵臓等の臓器ガンや白血病等の疾病時に血液等の
体液中に正常の値を越えて発現するフェリチン等を抗原
−抗体反応を利用して取シ除くことによりこれらの疾病
の症状を軽減乃至治癒せしめる装置は従来公知である（
特開昭５５−１４１．２４８号等）。しかし、体液中の
フェリチン等を取シ除くのみではガン疾病時にみられる
免疫力の低下を十分防止することはできない。

そこで本発明者等は、ガン患者の体液に含まれる免疫抑
制物質について鋭意研究を重ねた。即ち、フィトヘムア
グルチニン（ＰＩ（Ａ）のヒドリンＡ球幼若化抑制活性
を指標として、ガン患者血清又は腹水をＤＥＡＥ−セル
ロースイオン交換クロマトグラフィー、ケゝルクロマト
グラフィーおよびクロマトフォーカッシング法によシ分
離処理し、免疫抑制活性を有するタンパク物質ＤＥＳ−
Ｉなる物質を発見した。そして抗原−抗体反応を利用し
て、このものを体液中から除去することによシ免疫力低
下を防止し得ることを知った。

旧発明の目的 従って本発明の目的は、びン患者の体液中から正常量以
上の免疫抑制物質ＤＥＳ−Ｉを取シ除くための新規な除
去剤を提供する（−とにある。

■１発明の詳細な説明 本発明ばＤＥＳ−Ｉ抗体を担体に担持させてなる体液中
の免疫抑制物質ＤＥＳ−Ｉの除去剤からなる。

本発明のＤＥＳ−Ｉ抗体を調製するに際して、先ずＤＥ
Ｓ−Ｉは次の方法によりガン患者体液中から分離される
。

即ち、ガン患者から血液、腹水等の体液４を採取し、遠
心分離にかけ、得られた上澄液を半透膜に入れｐＨ８，
０，０，０２ＭＩＪン酸緩衝液に対して透析する。

内液をＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフ
ィーにかけ、１Ｍ食塩を添加した０、０２Ｍ’Ｊン酸緩
衝液で溶出し、溶離液を濃縮後、セファデックスＧ−２
００（ファルマシア社製）のカラムにかけ、０．０２Ｍ
！ｊン酸緩衝液で展開し、最初のＵＶ吸収ピーク部分を
集め、これをｐｔ（４〜６のクロマトフォー力ッシング
にかけ、ｐＨ４，５〜３８部分にＵＶ吸収ピークとして
溶出される。得られた溶離液をセフアゾ、クスＧ−１５
０で精製してＤＥＳ−Ｉを得る。

ＤＥＳ−Ｉを等電点電、気泳動で調べたところ、等電点
け４１〜４８であった。また、ＤＥＳ−Ｉは、ＰＨＡに
よるリン・ぐ球の幼若化を抑制する（濃度０．５Ｉψ／
ｍｌで１００％抑制）ほか、遅延型アレルギー反応の抑
制、抗体産生の抑制およびガン増殖の促進活性を有する
。ＤＥＳ−Ｉ抗体は、上記の如くして得られたＤＥＳ−
１を用いてそれ自体公知の方法で調製される。例えば、
ＤＥＳ−Ｉを供試動物例えばウサギに投与して免疫化し
、その血清からＤＥＳ−Ｉ抗体を得る方法、ＤＥＳ−Ｉ
を供試動物たとえば一７ウスに投与して免疫化し、その
膵臓細胞を同種動物の骨髄陳細胞と融合させ、その融合
細胞の培養液から得る方法、上記融合細胞を同種動物に
移植してそれが成長した腫瘍組織またはその動物の腹水
から得る方法等が挙げられる。

ＤＥＳ−Ｉ抗体の固定化は、一般のタン・ぐり固定化の
種々の方法およびそれ自体公知の抗体特有の固定化方法
をそのまま使用することができる。尚、本除去剤の目的
から、固定化形態は包括法や架橋法よりも共有結合法が
適当である。抗体を固定化する担体の材質としてはセル
ロース、セファデックス、セファロース等の多糖類、合
成繊維または合成樹脂など公知のものが使用されるが、
固定化の安定性、方法の簡便性、人体への応用性からセ
ルロースまたはナイロンが好ましい。担体の形態として
は、体液の流通性等の理由から不織布、織布、綿あるい
は糸が好ましい。ここで不織布にはｐ紙状のものも含め
る。

本発明のＤＥＳ−Ｉ除去剤を用いて、ガン患者体液中か
らＤＢＳ−Ｉを除去するに際しては、それ自体公知の方
法を使用することができる。即ち、体外循環により患者
体液を外へ導き出し、本発明のＤＥＳ−Ｉ除去剤を充填
した装置内キ通過させた後、再び体液を患者体内に戻す
ことによって体液中のＤＥＳ−Ｉを除去することができ
る。体液を除去装置に導く場合、血液を直接嗜いてもよ
いし、あらかじめｐ過装置、遠心装置により、血球と血
漿とに分離し、血漿のみを除去装置に導いてもよい。除
去装置としては、ＤＥＳ−Ｉ除去剤を層状あるいはラン
ダムにカラムに充填して連続的に処理司能としたもの、
ちるいはＤＥＳ−Ｉ除去剤を一般容器に入れたり、血流
バッグなどの密封袋に入れたシしてパッチ処理としたも
のが使用される。さらに、この除去装置には、本発明の
ＤＢＳ−Ｉ除去剤と組合せて他の公知の免疫抑制物質除
去剤例えばＺエリチン除去剤を充填し、治療効果を一層
高めることもできる。

次に添伺図面を参照しつつ、本発明のＤＥＳ−Ｉ除去剤
を使用してガン患者血液中からＤＥＳ−Ｉを除去する装
置について説明する。

第１図は該ＤＥＳ−１除去装置の溝数の一例を示す図で
ある。第１図にみられるように、該装置は、分離器（１
）、該分離器へ供給する血液の流量制御器（２）、該分
離器の血漿流出口に始端を有し、血液流路上の上記分離
器の下流位置に終端を有する血漿流路（３）、該血漿流
路上に配置されたＤＢＳ−Ｉ除去部（４）および血漿の
定量送液制御器（５）からなる。血液は流量制御器（２
）によって定量されて分離器（１）に供給され、分離器
（１）に内蔵されフンー血球血漿分離用ｐ過膜によって
血漿が一部血液から分離される。分離された血漿は分離
器（１）の血漿流出口から血漿路（３）を通ってＤＥＳ
−Ｉ除去部（４）に入り、ここで担体に担持されたＤＥ
Ｓ−Ｉ抗体の作用Ｖ（より血漿中のＤＥＳ−Ｉが除去さ
れる。血漿は定量送液制御器（５）によって血漿流路（
３）中を送液され、再び血液に合流する。

第２図は、ＤＥＳ−Ｉ除去部の構成の一例を示す断面図
である。この除去部は両端に人口（６）および出口（７
）を有する容器（８）とその内部に収容されたＤＥＳ−
■除去剤（９）と、入口（６）および出口（７）にＤＥ
Ｓ−Ｉ除去剤（９）を挾んで設けられたフィルター（１
（１）からなる。

フィルターαＯはＤＥＳ−Ｉ除去剤（９）の担体破片等
が血液に入り体内に流れ込むのを防ぐために設けられて
いる。

次に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。

Ａ、ＤＥＳ−Ｉの調製 （１）　　胃ガン患者腹水からの調製 前ガ゛ン患者から採取した腹水を遠心分離にかけ、固形
分を除き、−Ｆ−澄液をＰ■（８，０１００２Ｍリン酸
緩衝液に対して透析し、その内液を得る。かクシ７て得
られた内液を上記緩衝液であらかじめ平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セルＩコース（ワットマン社製ＤＥ−５２）カラム
にかけ、同緩衝液で十分洗浄する。

次に０．０２Ｍリン酸緩衝１（ｐ１１８．０）に１Ｍ食
塩を加えた溶媒をカラムに流し、タンパクを溶離する。

得られた溶離液をその１まあるいは適当にセントリフロ
ー（アミコン・ファースト・リミテ。

ド社製）で濃縮した後、あらかじめ０．０２　Ｍ　！Ｊ
ン酸緩衝液（ｐ）（８，０）で平衡化（−だセフアゾ、
クスＧ−２００（ファルマシア社製）のカラムにかけ、
同緩衝液で展開し、最初のＵＶ吸収ピーク部分を集める
。これをｐｔ（４〜６のクロマトフオーカシングにかけ
、ｐＨ４，Ｑ付近のピーク部分を集める。得られた試料
中に含まれるポリバッファーをセフアゾ。

クスＧ−１５０にかけ、最初に溶出されるＵＶ吸収のピ
ーク部゛分を集め、これをＤＢＳ−Ｉとする。これらの
ステッノで得られる両分は、次に記すＰＨＡによるリン
・３球幼若化を抑制する活性を測定して抑制活性を持つ
両分として分離された。腹水１００　ｍｌ（総タンハク
量４３００ｍ９）からＤＥＳ−Ｉ　５０３　ｍ９が得ら
れた。

（２）　　胃ガン患者血漿からの調製 胃ガン患者から採取した血漿に０．０１Ｍ塩化カルシウ
ム液を適当量加え、生じた沈澱を遠心除去する。得られ
た上澄液を０．０２Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐ’　８．０　
）に対して透析し、透析内液を上記（１）と全く同様に
処理してＤＥＳ−Ｉを得た。血漿１００　ｍ／！（総タ
ンパク量７４００ｍｙ）からＤＥＳ−Ｉ　８７５　”ｉ
７が得られた。

Ｂ、　　ＰＨＡによるリン・ぐ球幼若化抑制活性の測定
方法および活性 ヒト末梢血リンパ球を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で１．０Ｘ１０６個細胞／ｍ７！に調
整する。これにＰＨＡを１５μｔ／ｍｌとなるように加
゛え・同時に試料を加え、５４時間培養する。その後３
Ｈ−ＴｄＲを加え１８時間培養し、’Ｈ−ＴｄＲのリン
パ球へのとりこみ抑制を対照と比較して測定する。

ＤＥＳ−Ｉの抑制活性を表１に示す。表１に示すように
、抑制活性は０．５　ｍ９／−濃度でいずれの試料でも
ほぼｉｏｏ％と高い。

表　　１ ＤＥＳ−Ｉ標品のＰＨＡによる９７４球幼若化抑制Ｃ１
等電点 ＤＥＳ−Ｉを３５から７０のＰＨグラディエンドを持つ
平板等電点電気泳動にかけたところ、ｐＨ４，１〜４８
のところに数本のバンドを形成した。従って・ＤＢＳ−
Ｉは等電点が４．１〜４８の範囲内にあるものである。

Ｄ、遅延型アレルギー反応抑制活性の測定方法および活
性 Ｂａ１ｂ／ｃ雄５週令マウスの腹腔に生理食塩水０５−
に溶かしたＤＥＳ−Ｉ　２　ｍｑを投与する。対照は生
理食塩水０．５−を腹腔内に投与したものとする。翌日
生理食塩水に懸濁したヒツノ赤面球（ＳＲＢＣ）　５　
Ｘ１０６個を腹腔内に投与する。ＤＥＳ−Ｉ投与後４日
目に５×１０８個５ＲＢＣをマウス足部に注射し、その
翌日足前の肥大をシックネスケ゛−ジで測定する。その
結果を表２に平均値で示す。なお平均値は６匹マウスに
よるものである。

表　　２ ＤＥＳ−Ｉ標品の遅延型足踵反応抑制 表２から２ｍ９／マウス投与により、ＤＢＳ−Ｉは顕著
に遅延型アレルギー反応を抑制することがわかる。

Ｄと同様にして、マウス１匹ちたりＤＥＳ−Ｉ　２　ｍ
９を腹腔内設すし、翌日、５ＲＢＣを５×１０６個同様
に投与する。この［］より５日後口径を摘出し、膵臓内
細胞をと９出し、抗体産生細胞をカニンガム（Ｃｕｎｉ
ｎｇｈａｍ）法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４　、５９
９〜６００　＋　１９６８　）によってＰＦＣを数える
。結果を表３に・示す。

ＤＥＳ−Ｉはこの活性も抑制することがわかる。

表　　３ ＤＥＳ−Ｉの液性抗体産生（ＰＦＣ）抑制御試料（２７
Ｖ、ｚ’？ウス）１ＰＦＣ／１０６牌臓細胞１′抑制率
％）　１□ Ｆ、腫瘍増殖促進活性測定法および活性ＩＣＲマウス（
雄、５週令）の腹腔内にＤＥＳ−Ｉを前記同様に１匹あ
たり２ｍ９投与し、同時にザルコーマ１８０細胞を背部
皮下に１０６個移植する。３週間後に成長した腫瘍組織
を切りと９、その重量を測定する。結果を表４に示す。

表４から、ＤＢＳ−Ｉが腫瘍増殖を促進することが明ら
かである。

表　　４ ＤＢＳ４の腫瘍増殖促進活性 Ｇ、抗体の製法 （１）　　ウサギへの免疫による抗体取得常法によって
ＤＥＳ−Ｉをウサギに投与して免疫し、最終免疫１週間
後に全採血する。全血から血清を分離し、硫安分画によ
るγ−グロブリン分画を分離する。かくして得られた分
画を０．　ＯＩ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で
平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけ、素通シ
画分を集める。これを濃縮したのち、セファデックスＧ
−１０００ケゝルクロマトグラフイーにかけ、最初のピ
ークを集め、抗体標品とする。

（２）融合細胞による抗体取得 Ｂａ１ｂ／ｃマウス１匹あたり５００γのＤＥＳ−Ｉを
計３回投与し、最終免疫１週間後膵臓を摘出する。膵臓
細胞５Ｘ１０７個と８−アザグアニン耐性ｘ６３−Ａｇ
８６５３マウス骨髄腫細胞をポリエチレングリコール１
０００を用いて常法に従って融合させ、常法によｐ　Ｈ
ＡＴ培地を用いて融合細胞のみを選択的に培養する。次
いでＲＰＭＩ　１６４０培地（１０チウシ胎児血清入り
）で培養する。この融合細胞のうち、抗体産生細胞を同
種マウス胸腺繊維芽細胞を用いたフィーダーレイヤー法
によりクローニングする。

クローン細胞は浮遊培養によって培養し、培養液を集め
、培養液より上記（１）と同様にして抗体標品を調製す
る。

Ｈ６抗体の担体への固定化法 （１）　　ナイロン不織布への固定化 ナイロン不織布（富士紡社製）　２　Ｖ−をツメチル硫
酸２００　ｍｌに浸漬し、１００℃で４分間加熱する。

これを氷水浴中で急冷し、冷メタノール５０〇−で５回
洗浄する。メタノールをよく切った犬イ１、ロン不織布
にリン酸緩衝＊　（Ｐ）１７．４　）　４０−に溶かし
た１チ抗体標品を加え、４℃で１日培養する。

その後リン酸緩衝液で洗浄し、リン酸緩衝液中１Ｍグリ
シンで処理する。ナイ「２ン不織布１ｇ−あたり約３０
７ｎ９の抗体標品が結合する。織物（ナイロン製濾過膜
）、ナイロン糸でもほぼ同様の結果が得られた。

（２）Ｐ紙およびレイヨン不織布への固定化東洋ｐ紙Ａ
５１あるいはレイヨン不織布（工材化学社製）２Ｉを常
法によｐ　ｐｉ（１１〜１２で臭化シアンを用いて活性
化する。これを０．１Ｍ重炭酸ソーダ水溶液でよく洗浄
する。これに０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，４
）に溶かした１チ抗体標品２０ｍ１を加え、５℃で１日
培養する。その後１Ｍエタノールアミン（ｐｌ（９，０
）で処理し、蒸留水、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
０）および蒸留水で順次十分に洗浄する。この方法によ
り、ｐ紙１１あたり２５ｍ？、レイヨン不織布ＩＩあた
ｐ３３ｍ９の抗体標品が固定化された。脱脂綿を用いた
ところ、脱脂綿１１あた。９４１ｍゾが固定された。涙
紙やレイヨン不織布は細かい繊維が出やすいため、使用
゛に際しては、それを除去するフィルターが必要とされ
る。

■、発明の作用効果 本発明のＤＢＳ−Ｉ除去剤をガン患者の体液と接、触せ
しめることにより、該体液中の免疫抑制物質ＤＥＳ−Ｉ
を容易に除去することができる。

次に試験例を掲げて本発明の効果を具体的に示す。

試験例 本発明のＤＥＳ−Ｉ除去剤を充填したカラムにガン患者
から採取した体液試料を通した。カラムの入口と出口に
おける試料中のＤＥＳ−Ｉ濃度を一元放射免疫拡散法で
定量した。結果を表５に示す。

表　　５ 体液中ＤＥＳ−Ｉの吸着除去結果

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＤＥＳ−Ｉ除去剤を使用してガン患
者血液中からＤＥＳ−Ｉを除去する装置の構成の一例を
示し、第２図は上記装置を構成するＤＥＳ−Ｉ除去部の
一例を示す断面図である。 １・・・分離器、２・・・流量制御器、３・・・血漿流
路、４・・・ＤＥＳ−Ｉ除去部、５・・・血漿定量送液
制御器、６・・・入口、７・・・出口、８・・・容器、
９・・・ＤＥＳ−Ｉ除去剤、１０・・・フィルター。 第１図 第２図 手続補正書（自発） 昭和５６年１１月２４日 特許庁長官　島田春樹　殿 １　事件の表示 昭和５６升　特許　願第１０４３７９号２　発明の名称
　体液中の免疫抑制物質ＤＥＳ−１除去剤３　補正をす
る者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 （１）明細書第４頁第１行目の 「・・・溶出される。得られた溶離液・・」を 「・・・溶出される溶離液・・・」 と訂正する。 （２）　　同第８頁下から第４行目〜第３行目の「・・
・ポリバッファーをセファ−ｆ、り・」を 「・・・ポリバッファーを除去するためセファクス」 と訂正する。 （３）　　同第１４頁第１０行〜第１１行の「面Ｊ性ｘ
　６３−Ａｇ　８．６５３マウス」を 「耐性Ｘ６３−Ａｇ３・６５３マウス」と訂正する。 以

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ＤＥＳ−Ｉ抗体を担体に担持させてなること
   を特徴とする体液中の免疫抑制物質ＤＥＳ−Ｉ除去剤。
2. （２）担体が不織布、織布、綿あるいは糸である特許請
   求の範囲第１項記載の免疫抑制物質ＤＥＳ−Ｉ除去剤。