JPH01265972A - 体液中の有害成分の除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は体液中の有害成分の除去方法に関する。さらに
詳しくは、免疫疾患、腎炎、肝炎などの炎症、ウィルス
性疾患などにおいて、血液、血漿などの体液中に出現す
る有害物質、ウィルス、有害細胞などを吸着除去する方
法に関する。

［従来の技術・発明が解決しようとする課題］人工透析
に端を発した体外循環治療は近年大いに発展し、治療対
象となる疾患も増加の一途をたどっている。これに伴い
、体液中に出現し、疾患の原因または進行と密接な関係
にあると考えられる有害成分をより選択的に除去する手
段が求められている。この目的のために膜による分離力
法が検討されてきたが、かかる方法は選択性が充分でな
く、除去対象物質以外の体液成分の損失が大きいという
欠点を有している。

また吸着により有害成分を除去しようとする試みがなさ
れ、活性炭、アンバーライトＸＡＤに代表される、いわ
ゆる合成吸着剤が主として肝臓病用に用いられてきてい
る。しかしながら、前記合成吸着剤は選択性に乏しく、
また高分子量物質は除去できないなど多くの欠点を有し
ている。

さらに選択性を高める目的で、水不溶性担体に除去対象
物質と親和性を有する物質を保持させた、いわゆるアフ
ィニティー吸着体を用いる試みが始められている。しか
しながら、これらの試みは通常アフィニティーク口マト
グラフィ−用に用いられる担体を転用したものが多く、
体外循環治療に用いるには好ましくない種々の欠点を有
していることが明らかとなっている。

すなわち、通常アフィニティークロマトグラフィーに用
いられる担体は、アガロース、デキストラン、ポリアク
リルアミド、多孔質ガラス、多孔質シリカなどであるが
、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミドなど
の軟質ゲルは、 （１）機械的強度が弱いため、撹拌などの操作により破
壊されやすい、 （２）耐圧強度が小さいため、カラムに充填して体外循
環に用いる際に高流速で体液を流すと圧密化をひきおこ
し、流速が安定せず、詰りを生じることもある などの欠点を有している。

一方、多孔質ガラスなどの無機多孔体は耐圧強度は高い
ものの、 （１）撹拌などの操作により破壊されて微粉を生じやす
い、 （２）担体表面への除去対象物質以外の成分の吸着、い
わゆる非特異吸着が無視できないなどの欠点を有してい
る。

さらには、斜上の欠点を克服すべく合成高分子によるポ
リマーゲルが提案されているが、該欠点を充分克服して
いるとはいえず、未反応モノマーなどによる毒性も懸念
され、また吸着容量も軟質ゲルに劣っている。

［課ｍを解決するための手段］ 本発明者らは斜上のごとき欠点を克服すべく鋭意研究を
重ねた結果、多孔質セルロースゲルに除去対象物質に親
和性を有する物質（以下、リガンドという）を保持させ
てなる吸着体と体液とを接触させることによって、高流
速で選択的に体液中の有害成分を吸着除去しうることを
見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に用いる多孔質セルロースゲルは、 （１）機械的強度が比較的高く、強じんであるため撹拌
などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすること
が少ない、またカラムに充填して体液を高流速で流して
も圧密化したり目詰りしたりしないので、高流速で流す
ことが可能である、さらに細孔構造が高圧蒸気滅菌など
によって変化を受けにくい、 （２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性で
あり、リガンドの結合に利用しうる水酸基が多数存在し
、非特異吸着も少ない、（３）空孔容積を大きくしても
比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量かえ
られる、（４）安全性が合成高分子ゲルなどに比べて高
いなどの優れた点を有しており、該多孔質セルロースゲ
ルにリガンドを保持させることによって、はぼ理想的な
吸着体かえられ、この吸着体と体液とを接触させること
によって高流速で選択的に体液中の有害成分を吸着除去
しつる。

［実施例］ 本発明に用いる多孔質セルロースゲルとしてはセルロー
ス自体のゲルが好ましいが、エステル化またはエーテル
化されたセルロース誘導体、あるいはセルロースと該誘
導体との混合物のゲルであってもよい。かかるセルロー
ス誘導体としてはアセチルセルロース、メチルセルロー
ス、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースな
どがあげられる。またゲル粒子の形態は球状が望ましい
。

該多孔質セルロースゲルは、たとえばセルロースおよび
（または）セルロース誘導体を溶剤を用いて溶解あるい
は膨潤させたのち、用いた溶剤とは混和しない別の溶媒
中に分散させて球状とし、ゲル化再生する方法で製造す
ることができる。

ゲルを構成するセルロースおよび（または）セルロース
誘導体は架橋されていてもよい。架橋剤の代表例として
は、エピクロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジェポキ
シ化合物、ジアルデヒド化合物、ジイソシアナート化合
物、塩化シアヌル、ジアルコキシアルキルシラン化合物
、トリアルコキシアルキルシラン化合物などがあげられ
るが、該架橋剤に限定されるわけではない。

本発明に用いる多孔質セルロースゲルの細孔径について
は、除去対象物質の分子量およびサイズにより最適のも
のを選ぶことができる。細孔径の測定法には種々のもの
があり、直接測定する方法としては水銀圧入法、電子顕
微鏡観察による方法などがあるが、含水粒子については
これらの方法を適用できないばあいがある。このような
場合には排除限界分子量を細孔径の目安とすることがで
きる。排除限界分子量とは底置（たとえば波多野博行、
花卉俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ、化学同人）
などに述べられているように、ゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子
のうち最少の分子量を有するものの分子量のことである
。現象的には、排除限界分子量以上の分子量のものは移
動相体積近傍に溶出されることから、種々の分子量の化
合物を用いて溶出体積との関係を調べれば排除限界分子
量を求めることができる。

排除限界分子量は対象とする化合物の種類により異なっ
ており、本発明に用いる多孔質セルロースゲルは、球状
蛋白質およびウィルスを除去対象物質としたばあいの排
除限界分子量（以下、排除限界分子量という）は５Ｘ１
０３〜１×１０８の範囲であることが好ましい。排除限
界分子量がＩＸＬＯ８を超えるとリガンドの保持二が減
少して除去対象物質の吸着量が減り、またゲルの強度が
低下するため好ましくない。

多孔質セルロースゲルの空孔容積はセルロース含量を目
安にすることができる。セルロース含量はつぎに示す式
で表わされる。

セルロース含量（％）−Ｘ１００ Ｖｔ−Ｖ。

（式中、Ｗはゲル重ｆｆｉ（ｇ）　、Ｖｔはゲルを充填
したカラムの体積（ｍｌ）、Ｖｏはゲルの細孔に侵入し
えない高分子量物質をゲルが充填されたカラムに通した
ばあい、該高分子量物質がカラムから溶出するまでの溶
出容積（ｍｌ）である。）本発明に用いる多孔質セルロ
ースゲルはセルロース含量が２％以上６０％以下である
ことが好ましく、２％より少ないとゲルの強度が低下し
、６０％を超えると細孔容積が小さくなり好ましくない
。

多孔質セルロースゲルの粒子径は一般的には小さい方が
吸着能力の点で好ましいが、粒子径があまり小さくなる
とカラムなどに充填したばあいの圧力損失が大きくなる
ため好ましくなく、粒子径は１〜５，０００μの範囲で
あることが好ましい。

本発明に用いる除去対象物質に親和性を宵する物質（リ
ガンド）としてはつぎに示す物質が代表例としてあげら
れる。

免疫複合体を除去するには、Ｃ１，などの補体成分、プ
ロティンＡなどの特異蛋白質、免疫複合体に対する抗体
などを用いることができる。

自己免疫疾患などで出現する自己抗体などを除去するに
は、たとえば全身性エリテマトーデスにおいて血中に出
現する抗核抗体や抗ＤＮＡ抗体を除去するには、核酸塩
基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、
さらにはＤＮＡ　、　ＲＮＡなどを用いることができ、
重症筋無力症において出現する抗アセチルコリンリセプ
ター抗体を除去するには、アセチルコリンリセブター分
画成分を用いることができる。

そのほかにも自己抗体の除去には各自己抗体に対する抗
原を用いることができる。

さらには、血中に出現する種々の有害成分を除去するた
めには、除去対象物質に対する抗体を用いることができ
る。たとえば、肝炎ウィルスの除去にはウィルス表面の
抗原に対する抗体、全身性エリテマトーデスにおいて血
中に出現するＤＮＡなどの除去には抗ＤＮＡ抗体などを
用いることができる。またリンパ球異常に対しては抗Ｂ
細胞抗体、抗すプレッサーＴ細胞体などを用いてリンパ
球を除去することもできる。

斜上のごとく抗原−抗体反応を利用する方法のほかに、
被吸着物質に特異的な親和性（アフィニティー）を有す
る物質を用いることができる。代表例としては、関節リ
ウマチ症において出現するリウマチ因子を除去するため
の変性あるいは凝集されたイムノグロブリン、γ　−グ
ロブリンまたはそれらの分画成分、トリプトファンなど
のアミノ酸、リポ蛋白除去のためのヘパリンなどの硫酸
化多糖類、イムノグロブリン除去のためのプロティンＡ
１ハプトグロビン除去のためのヘモグロビン、プラスミ
ノゲン除去のためのリジン、Ｃ１９除去のためのイムノ
グロブリンＧ１プレカリクレイン除去のためのアルギニ
ン、トランスコーチン除去のためのコーチゾル、ヘモベ
キシン除去のためのヘミン、エンドトキシン除去のため
のポリミキシンなどがあげられる。さらには、コンカナ
バリンＡ１コングルチニン、フィトヘマグルチニンなど
のレクチン、核酸、酵素、基質、補酵素なども用いるこ
とができる。

以上に述べた除去対象物質およびリガンドはあくまで代
表例にすぎず、これらに限定されるわけではない。除去
対象物質としては、たとえば尿酸ビリルビンのように分
子ｆｆｉ　１０００以下のものから、たとえばウィルス
のように分子量数千万態上のものまで種々のものがあげ
られる。また担体の多孔質セルロースゲルは、通常除去
対象物質の分子量および分子サイズに応じて決定される
が、リガンドの種類、除去対象物質の分子の形状などに
よっても影響をうけ、たとえば除去対象物質の分子量が
数百、数百刃、数千刃のものに対してはそれぞれ排除限
界分子−が数千〜数十刃、数千刃、数千刃〜１億のもの
を用いるのが適当である。またリガンドは単独で用いて
もよいし、２種以上を混合して用いてもよい。

リガンドを担体の多孔質セルロースゲルに保持させる方
法には公知の種々の方法を用いることができる。すなわ
ち、物理的方法、イオン結合法、共有結合法などがあげ
られる。本発明の除去方法を体外循環治療に用いる際に
は、リガンドが脱離しないことが重要であるため結合の
強固な共有結合法が好ましく、その他の方法を用いるに
しても脱離を防ぐ工夫が必要である。

また必要に応じてスペーサーを担体とリガンドの間に導
入してもよい。

前記吸着体と体液を接触させる手段としては種々のもの
があげられる。たとえば入口と出口に体液成分は通過す
るが吸着体は通過しないフィルター、メツシュなどを装
着したカラムに吸着体を充填し、該カラムを体外循環回
路に組み込み、血液、血漿などをカラムに通して行なう
体外循環治療に用いるのが代表的であるが、必ずしもか
かる手段に限定されるものではない。

前記吸着体はリガンドが大幅に変性されない限り、高圧
蒸気滅菌が可能であり、該滅菌操作による細孔、粒子の
形状、体積の変化はわずかである。

つぎに実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない
。

実施例１ セルロファインＡ−３（チッソ■製の多孔質セルロース
ゲル、排除限界分子量５Ｘ１０７、粒子径４５〜１０５
場）　ｌｏｍｌに２０％ＮａＯＨ４ｇ　、ヘプタン１２
ｇ１ノニオン系界面活性剤トウィーン２０（Ｔｗｅｅｎ
２０）を１滴加え、４０℃で２時間攪拌後、エピクロル
ヒドリン５ｇを加えて２時間攪拌した。静置後上澄みを
捨て、ゲルを水洗濾過してエポキシ化セルロースゲルを
えた。えられたゲルに濃アンモニア水１５ｍ１加え、４
０°Ｃで１．５時間攪拌し、内容物を吸引濾過し、水洗
してアミノ基の導入されたセルロースゲルをえた。

つぎにヘパリン２００　ｍｇを水１０ｍ１に溶解し、こ
れに前記アミノ基含有ゲル３　ｍｌを加え、ｐｌ＋４．
５に調整したのち、１−エチル−３−（ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミド２００　ｍｇをｐＨ４，５
に保ちながら添加し、４°Ｃで２４時間振とうした。

反応終了後、２Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食塩水溶液およ
び水で洗浄してヘパリンの保持されたセルロースゲルを
えた。保持されたヘパリン量は１　、８ｍｇ　／　ｍｌ
であった。またここまでの操作によりゲルが破壊された
り、微粉の発生は認められなかった。

ついでえられた吸着体を内径９１ＩＩＩＩ１１長さ４７
止、内容積約３　ｍｌのカラムに充填し、高脂血症患者
の血漿１８ｍ１を０．３ｍｌ／分でカラムに通した。カ
ラムでの圧力損失は終始１５ｍ＋ｓ）１ｇ以下で、目詰
りなどは観察されなかった。

カラムを通過させることにより血漿中の総コレステロー
ルの６５％が吸着され、総蛋白などの減少はわずかであ
った。

実施例２ 実施例１で用いたセルロファインＡ−３の粒子径を１５
０〜２００μにかえたほかは実施例１と同様にしてヘパ
リンの保持されたセルロースゲルをえた。保持されたヘ
パリン量は１　、５ｍｇ　／　ｍｌであった。

斜上のゲルを実施例１と同じカラムに充填し、高脂血症
患者の血漿１８ｍ１（ヘパリン２００Ｕ添加）を０．２
ｍｌ／分でカラムに通した。カラムでの圧力損失は３０
ｍｍＨｇ以下であり、変化もわずかであった。

カラムを通過させることにより血漿中の総コレステロー
ルの５５％が吸着され、総蛋白、血球の減少はわずかで
あった。また吸着体表面での血栓形成もわずかであった
。

実施例３ 実施例１でえられたヘパリンの保持されたゲルをオート
クレーブを用いて１２０℃で１５分間滅菌し、実施例１
と同じカラムに充填し、高脂血症患者の血漿１８ｍ１を
０．３ｍｌ／分でカラムに通した。カラムでの圧力損失
、総コレステロールの吸着はともに実施例１と同様であ
った。

実施例４ 実施例１と同様にしてエポキシ化セルロースゲルを作製
した。えられたゲル１０ｍ１にプロティンＡ５０ｆｆ１
ｇを加え、ｐＨ９，５に調整し、室温で２４時間反応さ
せたのち、２Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食塩水溶液および
水で洗浄した。ついでモノエタノールアミンを加え、１
６時間反応させて未反応エポキシ基を封止し、ついで水
洗してプロティンＡの保持されたセルロースゲルをえた
。

えられた吸着体を実施例１と同じカラムに充填し、ヒト
血漿１８ｍ１を０．３ｍｌ／分でカラムに通したところ
、約３５％のグロブリンが吸着された。

なお、アルブミンの減少はわずかであった。

実施例５ 実施例１で用いたセルロファインＡ−３の２０　ｍｌを
水に分散させ、これにｐｌを１１〜１２に保ちながら臭
化シアン６ｇを徐々に添加し、１０分間攪拌した。ゲル
を決別し、冷水およびＯ，１ＭＮａＨｃＯ３水溶液で洗
浄して活性化ゲルをえた。ついでポリミキシン硫酸塩１
．５ｇを０．ＩＭＮａｌｌＣＯ３水溶液２０ｍ１に溶解
し、これに斜上のゲルを加えて４℃で２４時間振とうし
たのち、モノエタノールアミン溶液を用いて過剰の活性
基を封止してポリミキシンの保持されたセルロースゲル
をえた。

えられたゲル１　ｍｌを内径７　ｍｍのオーブンカラム
に充填し、エンドトキシン添加（約１００μｇ／　ｍｌ
　）牛血類５　ｍｌを０．３ｍｌ／分でカラムに通した
ところ、６０％のエンドトキシンが吸着された。

実施例６ セルロフアインＡ−３をセルロファインＡ−２（チッソ
沖製の多孔質セルロースゲル、排除限界分子＝７ｘｔｏ
ｓ、粒子径４５〜１１０５ＡＩ〉にかえたほかは実施例
１と同様にしてエポキシ化セルロースゲルを作製した。

えられたゲル１０ｍ１にヒトイムノグロブリン０１０ｍ
ｇを加え、ｐＨ９，０に調整し、室温で２４時間反応さ
せたのち、ゲルを決別し、２Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食
塩水溶液および水で洗浄した。ついでモノエタノールア
ミン溶液を用いて未反応エポキシ基を封止してイムノグ
ロブリンＧの保持されたセルロースゲルをえｌこ　。

つぎにえられたゲルを実施例１と同じカラムに充填し、
ヒト血漿１８ｍ１を０．２ｍｌ／分でカラムに通したと
ころ、約３０％の０１９が吸着された。

［発明の効果］ 本発明の方法によれば、体液中の宵害成分を選択的に除
去することができる。また、本発明の方法を、吸着体を
カラムに充填し、体液を高流速で流す体外循環治療に適
用すると、吸着剤の圧密化、目詰りおよび破壊がおこり
にくいので、安全に効率よく有害成分を除去することが
できる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　多孔質セルロースゲルに除去対象物質に親和性を有
   する物質が保持されてなる吸着体と体液とを接触させる
   ことを特徴とする体液中の有害成分の除去方法。