JPS58759A - 非煮沸変性によるアツセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は変性（内因性物質の検定可能な形態への転化）
を用いる臨床用アッセイ方法、更に具体的には、変性の
ための煮沸を要しない放射アッセイによる、ひと血清及
び細胞中のビタミンＢ１□及び／又は葉酸の含有量レベ
ルを決定するための方法に関する。血清又は細胞中の他
の目的成分（即ち、被分析物）−換言すれば、（他の内
因性成分）−や他の方式によるアッセイ方法にも本発明
は応用可能である。

血清中の葉酸及びビタミンＢ１□濃度並びに赤血球中の
葉酸濃度を測定することは臨床診断法の補助的手段とか
さまざまな種類の栄養複貧血の原因究明のための手段と
して有用である。これらのビタミン欠乏は主として不適
当な食事、吸収不良及びアルコール中毒のいずれかによ
り起る。

ビタミンＢ１□が欠乏した場合、神経障害につながるこ
とがある。さらに、ビタミンＢ１□はＮ−メチルテトラ
ヒドロフオレートをひとの細胞壁を通して運ぶのに必要
とされるので、ビタミンＢ１□が欠乏すると、葉酸エス
テルの代謝を乱して巨赤芽球性貧血をひき起すおそれが
ある。

巨赤芽球異常は他の原因による葉酸エステルの欠乏によ
っても起り得るので、それが両ビタミンのうちどちらの
ビタミンが欠乏して起きたのか、それとも両方のビタミ
ンとも欠乏して起きたのか、あるいは全く別の原因によ
り発生したのかを調べる必要がある。

放射アッセイ手法で出現するまでは、微生物学的アッセ
イ方法が血清中の葉酸エステル及びビタミンＢ１□の濃
度レベルを調べる主たる手段であった。かかる微生物学
的アッセイ方法は時間がかかり、しかも試料中にａ様物
質や代謝拮抗物質が存在している場合のように、成長度
に影響を及ぼす可能性のある他の因子に基因する測定誤
差を伴うものである。

飽和分析法即ち拮抗的蛋白質結合法（ＣＰＢ）による放
射アッセイ方法、特に葉酸エステル及びビタミンＢ１□
に対する放射アッセイ方法の概要が確立してから、従来
の微生物学的アッセイ方法はあらましそれによって置き
換えられてしまっている。放射アッセイ技術は微生物学
的手法によって得られた数値と良く相関した数値をもた
らしただけでなく、測定に対して妨害となる種々の原因
から影響の少い、より正確な結果をより少ない時間と経
費で提供した。これらの放射アッセイ方法に於いて用い
られる拮抗的結合法の原理は被分析物質及びその放射標
識物質をそれらに特有の結合位置を有する一定量の物質
（通常は蛋白質）に結合させることにある。ビタミンＢ
Ｉ２に対しては、精製内因子〔例えば、ぶたの内因子（
ＩＦ）、ひとの内因子（ＩＦ）、又はにわとりの若しく
はふぐの薄情〕が結合蛋白質として用いられ、葉酸エス
テルをアッセイする場合は、β−ラクトグロブリン中の
葉酸エステル結合能を有する蛋白質が用いられる。個々
の蛋白質の有する限られた数の結合位置に対する拮抗が
試料又は標準液中に存在する被分析物質と一定少量のト
レーサー（放射性同位元素により標識された、前記被分
析物質の対応物質）との間に起る。内因性の被分析物質
が存在しな（・場合、トレーサーは無競争で結合蛋白質
のありとあらゆる結合可能位置に結合する。結合したト
レーサーと結合しない（遊離状態）のトレーサーとを夫
々分離してそれらの量を測定することによって、放射能
の量を被分析物質の濃度の函数として標準線を引くこと
が出来る。任意の試料中に含まれる被分析物質の量は、
この試料の放射線強度の読み値を用いて、その標準線か
ら読み取ることが出来る。

前述のような種類の改良されたアッセイ方法を提供する
のが本発明の最も重要な目的である。

本発明はさまざまな被分析物質に対ずろいろいろな種類
のアッセイ方法に遍く適用可能であるが、説明のために
、まずビタミンＢ１□及び／又は葉酸エステルの放射ア
ッセイ方法に関してその要旨を説明する。

水溶液と混合する。ビタミンＢ１□及びその複製に対し
て有用なシアン基結合を与える、例えば青酸カリのよう
な転化剤の存在下、得られた溶液をメルカプタン系−変
性剤に接触する。この過程に於いて、面清中の結合蛋白
質は不可逆的に変性処理されて、ビタミンＢ１２と葉酸
エステルの両方が遊離される。この変性及び遊離手順は
ｐＨ１２−１４、好ましくは１２−１３　で行なわれる
。好適かつきわだって有益なメルカプタン系変性剤とし
てジチオチドリトールが挙げられる。

このような試薬をかかるｐＨレベルで用いると、煮沸し
なくとも変性を起して、これらの（及び他のものを含め
て）被分析物質を内因性結合体から解離することが可能
で、被分析物質の放射標識対応物即ち複製をアッセイ作
業に有用な形に転化できるという実用的な利点があたら
される。

ビタミンＢ１□及び／又は葉酸エステルの他に、本発明
は例えば他の安定なビタミン類や変性の際に用いられる
高アルカリ条件に耐えることの出来る他の被分析物質の
放射アッセイ方法においても利用可能である。ＣＰＢ以
外に、本発明は抗体分化アッセイにも有用である。その
場合、トレーサー法は放射能よりもむしろ、例えば、螢
光に依存することが出来る。さらに別の応用や変型は当
業者にとって当然思考しうるところである。

本発明の非煮沸法の利点を最も有効的に利用しうるよう
に、試薬、患者からの試料、標準液及び変性剤の量を適
宜法めなければならなし・。

メルカプタン系変性（還元）剤としては、ジチオチドリ
オール型のものが好ましく、特にジチオトレイトール（
トリオ−１，４−ジメルカプト−２、３−ブタンジオー
ル）を用いると顕著な効果が得られる。

結合蛋白質を添加すると、被分析物質とその対応する結
合蛋白質とから錯化合物が形成される。この結合手順は
ｐＨ８−１０，好ましくはｐＨ９，３にて実施される。

それ以降の手順は通常のＣＰＢ放射アッセイと同じ条件
により実施される。

低温放置したのち、前記蛋白質と結合した被分析物及び
トレーサーを結合しないものから吸収により分離し、標
準線が引ける。結合したビタミンＢ１゜及び／又は葉酸
エステル及び／又は結合していないビタミンＢ１□及び
／又は葉酸エステルの放射線強度を計数し、標準線上に
プロットする。

本発明の他の目的、特徴及び利点は添付の図面を参照し
、次の好ましい実施の態様に関する記載から明らかにな
る。

本発明の放射アッセイ方法の実施に際して用いられる代
表的試薬は次の通りである。

ゼロ標準液：緩衝液及びす）　ＩＪウムアジドを含有す
るポリマーペース。

標準ビタミン液：緩衝液及びナトリウムアジドを含有す
るポリマーベース中 にビタミンＢＩ２　（シアノコバラ ミ／）及び葉酸エステル（Ｎ− メチルテトラヒドロフオレート） を下記濃度で含有する再調製用 標準液。

５０　　　　　　　　　　　１．５ １５０　　　　　　　　　　　３．０ ４００　　　　　　　　　　　　６．０１０００　　　
　　　　　　　　１０．０２０００　　　　　　　　　
　２０．０還元剤ニジチオトレイトール水溶液（０，２
６ウム水溶液。

トレーサー：塩化ナトリウム、指示染料及びナトリウム
アジドを含むホウ酸塩 緩衝液中に１．５μＣｉ未満のＣＯ５７標識ジアノコバ
ラミン及び３０μＣｉ 未満の■１２５標識葉酸エステルを含 ムモの。コバラミンの比放射能は ２　Ｃｉ　／　μｍｏｌｅ　　である。

〔各アッセイ毎に、アッセイ開始 直前に前記抽出剤及びトレーサー を少量ずつ、具体的には例えば １００μｌ　ずつ混合して、トレーサ ーのマスター試薬をつくる。」 無添加試薬：蛋白質及びナトリウムアジドを含有するホ
ウ酸塩及びリン酸塩の 緩衝液。

結合剤：蛋白質及びす）　ＩＪウムアジドを含有するホ
ウ酸塩及びリン酸塩緩衝液の 精製内因子及びβ−ラクトグロブリ ン液。

吸着剤：カーボン、ポリマー、結合剤及び崩壊剤との錠
剤、又はポリマー被覆カ ーボン及びナトリウムアジドとの水 性スラリー。

試料の作成は移動及び保存（凍結状態で）可能なモノグ
ルタミン酸塩（維持　必須栄養素）類を単離するために
従来から用いられている放射アッセイ法に従って行う。

保存状態から使用状態に試薬を調整するには、蒸留水を
添加することを要する（試薬自体が１０〜１００　ｔｎ
ｌ容量の試薬ピンに入っている場合、各試薬毎に蒸留水
２　ｍｌを加える）。血清、トレーサー及び抽出剤の最
適容量比率は次の通りである。

ｓ：ｔ：ｅ＝２：２：１ 但し、Ｓ：血清の容積 ｔニドレーサーの容積 ｅ：抽出剤の容積 アッセイを実施するに際し、表−■に示す通り、まず試
、Ｉ管を１８本（２本ずつ１組で合計９組）１人目の患
者に用意し、さらに２人目の患者に２本（試験管４１９
及び扁２０）、３人目の患者に２本（試験管／％２］及
び腐２２、・・・と云った具合に用意し、試験管扁３及
び應４を特に結合剤を用いない対照として用いる。

表−■は試験管の各組に対して行なわれる試験手順をも
示す。即ち、試験管／Ｉ６３〜／１６１８・・・に標準
液２００μｌをピペットで取り、試験管扁１〜Ａ］８・
・・にトレーサーマスター試薬を２００μｌピペツトで
加え、（１〜２秒間）攪拌混合したのち低温放置する。

次いで全部の詳験管に抽出剤を１００μｌずつピペット
で加え、同様に攪拌混合及び低温放置を行い、試験管扁
１〜屑４にのみ無添加試薬１　ｍｌを加え、また試験管
／１６３〜／１６．Ｉ　８−に結合剤１　ｍｌを添加し
たのち、やはり攪拌混合及び低温放置し、次いで、試験
管層３〜ＡＩ８・・−・に錠剤又はスラリーを加え、攪
拌混合及び低温放置を繰り返し、全部の試験管を遠心分
離に付したのち上澄（即ち、液体）のみ試験管Ａ３〜Ａ
］８・・・から傾斜法により分離し、試験管中に固形物
（錠剤又は粉末）が残る。得られた上澄液を新しい試験
管、即ち、試験管屑３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、・・・・
・・に移す。これらの上澄液はガンマ−線計数試験に用
いることが出来る。ＣＯ５７及び１１２５の読値の間の
クロスオーバーが必ず３％未満であるようにガンマ計数
器を調節する。

第１図は上記方法を用いて得られた代表的結果を示し、
下側の標準線は葉酸エステルに対するもの（左側の縦座
標及び下側の横座標に対応スル）で、上側の標準線はビ
タミン８１□Ｋ　対するもの（右側の縦座標及び上側の
横座標に対応する）である。標準液の横座標値とそれに
対応する葉酸エステル及びビタミンＢ２のＣＰＭ　（１
分間当りの計数）読み値の縦座標変化を用（・て点をプ
ロットする。これらの点から標準線を得る。しかる後、
患者のＣＰＭ値に対応する縦座標値から線をのばし、対
応する横座標」二の単位容積当りの重量（ｍｌ当りのｒ
Ｊ又はｐ！　）として読み取ることが出来る。以上の例
は血清に適用できる。第２図は上記と同様の葉酸エステ
ル濃度測定試験用標準線を示すが、トレーサー及びマス
ター試薬は第１図の条件と違っている。

赤血球読み値を次の葉酸エステル補正式により補正する
。

１００％　ＸＤＸＣ Ｈ 〔但し、ＲＣＦは赤血球中の葉酸エステル濃度（ｎｇ／
ｒｎｌ）、Ｃは分析したｈｏｍｏｌｇｓａｔｅ　ａｌｉ
ｑｕｏｔ　（溶血反応生成物数）　（ｎｇ／ｍｔ　）、
Ｈはへマドクリット率（４）、及びＤは適用可能な希釈
係数（通常の実施において４１）を示す。〕 第３図及び第４図は本発明に係る上記方法（非煮沸変性
）を用いて得たビタミンＢ１２及び葉酸エステルの濃度
を従来技術による煮沸変性法により求めた結果に相関づ
けて示すものである。

プロットした点の間に中心線を引くと、両者間に本発明
の方法の信頼性−を十分に示す相関性があるのがよくわ
かる。

ひとたび上記の開示内容を知れば、当業者にとって、本
発明の概念から離間することなく本明細書中に記載した
特定の実施態様から無数の他の応用、変更及び改良が可
能なこ°とは明らかである。従って、本発明は本明細書
に記載した技術のあらゆる新規な特徴および特徴の組み
合わせのすべてを包括するものとして解釈され、前記特
許請求の範囲及びその精神によってのツメ限定されると
理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の方法を実施して得られた「
標準」線の例を示すグラフ、第３図及び第４図は本発明
により求めたビタミンＢ１゜及び葉酸エステル濃度と従
来の放射アッセイ法により得た結果とのそれぞれの相関
性を示すグラフである。 特許出願人 アールアイエイ　プロダクン　インコーポレイテソト代
理人 煮ノ；へ°°“ＦＩｏ、　４ 手　続　補　正　書　　（自発） 昭和５７年５　月２６日 特許庁長官　殿 １、事件の表示　昭和５７年　特許願　　第５０２４２
号２、発明の名称 非煮沸変性によるアッセイ方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　出願人 アールアイエイ　プロダクツ　インコーホレイテッド４
、代理人 住所　　東京都港区赤坂１丁目９番２０号５、補正の対
象 代理権を証明する書面、願書の出願人の欄及び図面。 ゛６．補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）拮抗蛋白質結合法を用いる血清中の目的成分を分析
   するための放射アッセイ方法であって、 （ａ）　　一種もしくはそれ以上の内因性目的成分を有
   する一定量の血清試料を還元剤及び前記目的成分の放射
   標識複製とを含有する溶液に接触せしめたのち、はぼ室
   温にて低温放置して前記目的成分の変性、即ち、前記血
   清中における前記目的成分の内因性結合蛋白質からの不
   可逆的分離を開始し； （ｂ）　　得られた混合物のｐＨを実質的に１２〜１４
   にする物質を含有する別の溶液を添加し、次いで室温に
   て充分低温放置して前記目的成分の変性、即ち、前記血
   清中における前記目的成分の内因性蛋白質からの不可逆
   的解離を完了し； （Ｃ）　　生成した溶液のｐＨを前記目的成分を結合す
   るのに適当な範囲に下げ； （ｄ）　　前記目的成分の解離を同時にまたはその後で
   、前記目的成分に対する新しい結合蛋白質を添加し； （ｅ）　　得られた混合物を低温放置して前記目的成分
   及びその放射標識複製と前記新しい結合蛋白質とを完全
   に結合せしめ； （ｆ）　　蛋白質に結合しなかった標識複製と蛋白質に
   結合した認識複製とをそれぞれ別個のグループとして分
   離したのち、前記グループの一方又は両方からの放射線
   強度を測定して、拮抗的な前記蛋白質と前記目的成分及
   びその標識複製との結合結果並びに前記血清中の前記目
   的成分の含有量とに相関性を有する計数値を得ることを
   特徴とする放射アッセイ方法。 ２）前記還元剤がジチオチドリトール（ＤＴＴ）である
   特許請求の範囲第１項記載の放射アッセイ方法。 ３）前記目的成分が葉酸である特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の放射アッセイ方法。 ４）前記標識複製が■１２５で標識した葉酸エステル誘
   導体で、前記新しい結合蛋白質が精製β−ラクトグロブ
   リンである特許請求の範囲第３項記載の放射アッセイ方
   法。 ５）前記目的成分がビタミンＢ１□である特許請求の範
   囲第１項または第２項記載の放射アッセイ方法。 ６）前記標識複製がＣｏ５７で標識したジアノコバラミ
   ンで、前記新しい結合蛋白質が精製内因子及びｐＨ８−
   １０とするのに添加された緩衝液と−から成る特許請求
   の範囲第５項記載の放射アッセイ方法。 ７）前記ｐＨ１２−１４における目的成分の変性がＤＴ
   Ｔ、シアン酸類及び／又はそれらの塩の水溶液、並びに
   強アルカリ成分を前記溶液中に用いることにより一部実
   施される特許請求の範囲第２項記載の放射アッセイ方法
   。 ８）前記目的成分が同時アッセイに付される葉酸及びビ
   タミンＢ１□とから成り、前記標識複製が■１２５で標
   識した葉酸エステル誘導体及びＣ０５７で標識したジア
   ノコバラミンとから成り、新しい結合蛋白質がβ−ラク
   トグロブリン、精製内因子及びｐＨ５−１ｏｅするのに
   添加された緩衝液とから成り、前記両標識複製からの放
   射線をそれらのエネルギーレベルの違（・に基づいて分
   離する特許請求の範囲第２項または第７項記載の放射ア
   ッセイ方法。 ９）初期変性手順を含む臨床用アッセイ方法であって、
   前記変性手順がｐＨ１２−１４にてプルカプタン系還元
   剤を用いて被分析物質及びその結合体とを含む内因性試
   料を処理することを一特徴とする臨床用アッセイ方法。 １０）変性後ｐＨを８−１０の範囲に下げ、アッセイを
   拮抗的蛋白質結合法を用いて実施する特許請求の範囲第
   ９項記載の臨床用アッセイ方法。 １１）蛋白質との拮抗的結合の程度を測定し−Ｃ内因性
   被分析物質の含有量を決定する特許請求の範囲第１０項
   記載の臨床用アッセイ方法。