JPS5877897A - ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するクロ−ニング・ベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 性開始点含有制限フラグメントならびに抗生物質耐性を
伝達する１つ以上のＤＮＡ断片から成る組み替えＤＮＡ
クローニング・ベクターお一工び当該ベクターの被形質
転換体に関する。

本抗生物質耐性伝達クローニング・ベクターはストレプ
トマイセス属および類縁宿主細胞に用いられる。これま
で、上記の微生物における組み替えＤＮＡ技術の発展お
よび開発は．クローニングベクターに遺伝上の選択され
得るマーカーが一般に存在しないことから．遅れ特に困
難なものになっていた０本ベクターはストレフブトマイ
ヤス属および他の宿主菌において機能性であり選択され
得るので．当技術分野における重大な進歩を示すもので
ある。

本ベクターは小さく可転性（ｖｅｒａａｔｉｌｅ　）で
あり、耐性が伝達される抗生物質に感受性であるストレ
プトマイセス属菌細胞に移入でき選別され得るので特に
有益である。臨床上重要な抗生物質の半数以上がストレ
プトマイヤス属菌株により製造されるので．この産業上
有用な菌群に適用し得るクローニング系およびベクター
を開発することは望ましいことである。本発明は．この
ようなベクターを提供し．かくして、新規抗生物質およ
び抗生物質誘導体を製造すると共に既知抗生物質の収率
を上げるためにストレプトマイセス属菌に遺伝子ヲクロ
ーニングできる。

本ベクターはストレプトマイセス属宿主細胞にＤＮＡを
クローニングするための媒体を提供すると共に被形質転
換体を簡便に選別することを可能にする。形質転換は非
常に低い頻度でしか起こらないので、このような機能試
験は何百万という細胞の中でどの細胞がプラスミドＤＮ
Ａを得たかを決定するのに実質上必要である。このこと
は、非選別性のＤＮＡ配列がベクターに挿入され得て。

形質転換後そのベクターおよび特定の必要なりＮＡ配列
を含む細胞を適当な抗生物質選別法で採取し得るので重
要である。

本明細書で開示し記載した本発明の目的のために０次の
用語を以下に記載する。

組ミ替えＤＮＡクローニング・ベクター＝自発的に複製
するものであって、７つ以上の別のＤＮＡ断片を加え得
ろかまたは加えたＤＮＡ分子を含有するプラスミドがそ
の範囲内に含まれるが、これ株宿主細胞へのＤＮＡの導
入。、 被形質転換体−形質転換された受容株宿主細胞。

感受性宿主細胞＝ある抗生物質の存在下では。

その抗生物質に対する耐性を伝達するＤＮＡ断片が存在
しないので生育できない宿主細胞。

制限フラグメント＝あるプラスミドに１つ以上の制限酵
素が作用してできるプラスミドの線状部分または全部。

挿入部位の違いによる異性体、、＝ＤＮＡフラグメント
が受容株のＤＮＡの２つ以上の適当な部位の７つに挿入
されてできる２つ以上の可能な組み替えＤＮＡ分子の７
つ。

プラスミドｐＬＲ２の／乙ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ制限フラ
グメント−プラスミドｐＩＪ乙１こ含有される／乙ｋｂ
のチオストレプトン耐性伝達ＢａｍＨＩフラグメントと
同じもの プラスミドｐＬＲ／またはｐＬＲＱの３　Ｑｋｂ　Ｂａ
ｍＨＩ制限フラグメント＝プラスミドＰＩＪ２に含有さ
れる３、ｇ　ｋｂのネオマイシン耐性伝達ＢａｍＨＩフ
ラグメントと同じもの Ａｍｐ　Ｒ−アンピシリン耐性の表現型。

ＴｅｔＳ−テトラサイクリン感受性の表現型。

Ｔｈ１ｏＲ＝チオストレプトン耐性の表現型。

ＮｅｏＲ−ネオマイシン耐性の表現型。

本組み替えＤＮＡクローニング・ベクターはａ）プラス
ミドｐＥＬ’　／θ３の複製の機能性開始点（ａｆｕｎ
ｃｔｉｏｎａｌ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ）含有制限フラグメント、および ｂ）形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主
細胞に移入したとき、少なくとも１つの抗生物質に対す
る耐性を伝達する７つ以上のＤＮＡ断片 を含んでいる。

三機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　）、即ち、Ｅ、
コリ、ストレプトマイセスおよびその他の属で用い得る
本組み替えＤＮＡクローニング・ベクターは。

ａ）プラスミドｐＥＬ／θ３の複製の機能性開始点含有
制限フラグメント ｂ）形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主
細胞に移入したとき、少なくとも７つの抗生物質に対す
る耐性を伝達する１つ以上のＤＮＡ断片、および ｃ）Ｅ、コリ・プラスミドの機能性レプリコンを含有し
、かつ抗生物質耐性を伝達する制限フラグノット を含んでいる。

本ベクターは、７つ以上の抗生物質に対する耐性を伝達
するＤＮＡ断片とプラスミドｐＥＬ　／　０３の複製開
始点含有制限フラグメントとを連結することにより構成
する。また、三機能性ベクターを構成するには、Ｅ、コ
リ・プラスミドの機能性レプリコンを含有し、かつ抗生
物質耐性を伝達する制限フラグメントを更に連結する。

複製開始点含有フラグメントを構成するプラスミドｐＥ
Ｌ　／θ３は。

約２θθｋｂ″′Ｃ−１分子クローニングに特に適した
幾つかの制限部位を有している。プラスミドｐＥＬ１０
３の複製開始点は、ｌ、５’ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラ
グメント内に局在する１ので、、ｌ／ｋｂのＢａｍＨＩ
領域以外を切断する制限酵素でこのプラスミドを消化す
ると９種々の異なる複製開始点含有フラグメントが生成
し得る。プラスミドｐＥＬ／θ３の詳細な制限部位およ
び機能地図を添付図の第１図に示す。本明細書の目的か
らして、第１図を始めとする全ての図には目盛を記して
いない。

プラスミドｐＥＬ　／θ３は常法によりストレプトマイ
セス・グラヌロラバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇ
ｒａｎｕｌｏ−ｒｕｂｅｒ）＆Ａ３９９／Ｑ／３／ｐＥ
Ｌ１０３［本菌株は、イリノイ州、ペオリア（Ｐｅｏｒ
ｉａ）にあるノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボ
ラトリ−（Ｎｏ　ｒ　ｔ　ｈ　ｅ　ｒ　ｎＲｅｇｉｏｎ
ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に寄
託され、永久保存菌株となっている］から単離できる。

上記の菌株は、寄託番号ＮＲＲＬ／２３１１ｔ９の下ξ
こ、上記プラスミドの好適な供給源および貯蔵庫として
誰でも入手できる。ストレプトマイセス・グラヌロラパ
ー憩Ａ３９９／ユ／　３／ｐＥＬ　ｉ　ｏ３は、それ自
体プラスミドｐＥＬ　／　０３を保持している菌株であ
るストレプトマイセス・グラヌロラバーＮａｈ３９９／
２　　［この菌株も寄託番号ＮＲＲＬ／２３．！”９の
下に上記の寄託機関に寄託されている］由来である。

プラスミドｐＥＬ　／　０３の多種の複製開始点含有フ
ラグメントが構成され得るが１本明細書では例えば、２
．ざｋｂおよび／９９ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメン
トが挙げられる。これらのフラグメントを７つ以上の抗
生物質耐性伝達ＤＮＡフラグメント（本明細書では例え
ば、プラスミドｐＬＲ，２のチオストレプトン耐性伝達
ｉ　Ａ　ｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメントおよびプラス
ミドｐＬＲ／またはプラスミドｐＬＲ４′のネオマイシ
ン耐性伝達３．　ＩＩ　ｋｂＢａｍ　ＨＩ制限フラグメ
ントが挙げられる）と連結して本発明を例示するベクタ
ーを形成する。

チオストレプトン耐性伝達フラグメントの供給源である
プラスミドＰＬＲ，２は、約／　、ｆ　７　ｋｂであり
Ｈｉｎｄ　ｍ処理したプラスミドｐＩＪ　ｌ　［Ｔｈｏ
ｍｐｓｏｎｅＬ　ａｔｏ、　／９１０．Ｎａｔｕｒｅ　
２１６：！；２！；で開示されている］とＨｉｎｄ［ｌ
処理したプラスミドｐＢＲ３，２，２とを連結すること
により構成する。ネオマイシン耐性伝達フラグメントの
供給源であるプラスミドｐＬＲ／は、約／１．Ｊ’ｋｂ
であり、プラスミドｐＩＪ乙の代わりにプラスミドｐＩ
Ｊ２［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅＬ　ａｌ、；／９１０に開
示されている］を用いることを除いては、同様に構成す
る。プラスミドｐＬＲ，２およびｐＬＲ／は共ににコリ
において機能性であるので。

常法により増殖（ａｍｐｌｉｆｙ）、単離でき１次の操
作に用いることができる。プラスミドｐＬＲ＠を生じる
類似の構成は、ＢａｍＨＩ処理したプラスミドｐＢＲ３
２２とＢａｍＨＩ処理したプラスｃドｐＬＲ／を連結し
て行なわれる。プラスミドｐＬＲ／　、　ｐＬＲ２およ
びｐＬＲ４Ｚの各々の制限部位と機能地図をそれぞれ添
付図の第２〜ｔＩ図に示す。

構成を簡便かつ容易にするために、チオストレプトン耐
性伝達ｌ乙ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩフラグメントおよびネオ
マイシン耐性伝達ＪＩＩｋｂＢａｍＨＩフラグメントを
プラスミドｐＥＬ　／　０３の、ｇ、ｊｋｂまたは／？
９ｋｂの複製開始点含有ＢａｍＨＩフラグメントと連結
する。得られる組み替えＤＮＡを自己連結（ｓｅｌｆｌ
ｉｇａｔｉｏｎ）させると本発明を例示するプラスミド
が生成する。２方向の組み替えプラスミドが個々の耐性
伝達ＤＮＡフラグメントの方向により生じる。

かくして、プラスミドｐＥＬ　／θ３の２♂ｋｂＢａｍ
ＨＩフラグメントと、プラスミドｐＬＲ，２の／乙ｋｂ
ＢａｍＨＩフラグメントを連結すると例示のプラスミド
ｐＥＬ７θ７およびｐＥＬ　／　０　！；を生じ、プラ
スミドｐＬＲ／またはプラスミドｐＬＲすの３４４　ｋ
ｂシニＨＩフラグメントを連結すると例示のプラスミド
ｐＥＬ／θ？およびｐＥＬ／／θを生じ１両フラグメン
トを共に連結すると例示のプラスミドＰＥＬ／／３゜ｐ
ＥＬ　／　／　Ｑ　、　ｐＥＬ　／　／　！；およびｐ
ＥＬ　／　／　４を生じる。同様に、プラスミドｐＥＬ
　／θ３の／　９９　ｋｂＢａｍＨＩフラグメントと、
プラス２ドｐＬＲ２の／６ｋｂＢａｍＨＩフラグメント
を連結すると例示のプラスミドｐＦＬ　／θ♂およびｐ
ＥＬ　／θグを生じ、プラスミドｐＬＲ／またはプラス
ミドｐＬＲ！の３１７ｋｂＢａｍＨＩフラグメントを連
結すると例示のプラスミドｐＥＬ／／／およびｐＥＬ　
／　／　２を生じ９両フラグメントを連結すると例示の
プラスミドｐＥＬ／／？：ｐＥＬ／／ざ、ｐＥＬ／／９
およびＰＥＬ／２θを生じる。

プラスミドｐＥＬ１０３の種々の制限フラグメントは、
、１１，５’ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントに含有
される複製開始点が存在するならば、抗生物質耐性伝達
ＤＮＡ断片を連結するのに用い得る。本発明の範囲内に
ある例示のプラスミドを構成するのに有用なプラスミド
ｐＥＬ／θ３の更に別の制限フラグメントとしては、　
Ｐａｔ　Ｉ　、　５ｐｈｌ　、　Ｂｇｊｌｎ　。

これらに限定されるわけではない。特定の抗生物質耐性
伝達ＤＮＡ断片は、プラスミドｐＥＬ／θ３フラグメン
トの１つの位置に限定されるのではなく、複製開始点ま
たはプラスミドに制御された他の重要な生理的作用が阻
害されないならば１種々の部位で連結または挿入し得る
。当業者ならば。

特定のＤＮＡ断片を連結また幌挿入するのにどの部位が
適当であるかを理解しまた容易に決定できる。

本明細書で例示するチオストレプトンおよびネオマイシ
ン抗生物質耐性伝達ＤＮＡ断片は、それぞれプラスミド
ｐＬＲ，２およびｐＬＲ／のｌ　４　ｋｂおよび！　４
Ｚ　ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントであるが。

当業者ならば、チオストレプトンおよびネオマイシンに
対する耐性を伝達する別のＤＮＡ断片をそれぞれあるい
は一緒に構成し使用できる。プラスミドｐＬＲ２の別の
チオストレプトン耐性伝達ＤＮＡ断片としては１例えば
、／３ｋｂのＰａｔ　ｌ制限フラグメント、およびｉ　
ｌｚ　ｋｂＢａｍＨｌ制限フラグメントのＢｃｌ　ｌサ
ブフラグメントが挙げられる。プラスミドｐＬＲ／の更
に別のネオマイシン耐性伝達ＤＮＡ断片としては１例え
ば、３５ｋｂのＰａｔ　ｌ制御 限フラグメント、および３，１ＩｌｋｂのＢａｍＨＩ制
限フラグメントの大きな方のＳｓｔ　ｌ　−Ｋｐｎ　ｌ
サブフラグメントが挙げられる。

クロラムフェニコール、ストレプトマイシン。

ハイグロマイシン、ビオマイシン、タイロシン。

エリスロマイシンなどの同一あるいは異なる抗生物質に
対する耐性を伝達する更に別のＤＮＡ断片も当業者なら
ば構成し使用できる。エリスロマイシン耐性伝達ＤＮＡ
断片としては１例えば、プラスミーｐＩＪ弘３の〜２．
ざｋｂシ４１．〜，１７ｋｂシ！Ｉ　　Ｂｇｌ　ｎ　、
　〜１Ｏｋｂｌ’Ｎｎｄ　ｍ　、　〜Ｑ！；　ｋｂｓｓ
ｉ　Ｉれる。プラスミドｐＩＪ　４！　３は、Ｅ、コリ
ざ０３／ｐｘＪｔａ３［本菌株はメリーランド州ロツク
ヴイル（Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ）にあるアメリカンｅタイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ
ｙｐｅ　Ｃｕ１Ｌｕｒｅ　Ｃｏｌ　１ｅｅ−Ｌｉｏｎ）
に寄託され永久保存菌株となっている］から得られる。

上記の菌株は、寄託番号ＡＴＣＣ３９／Ｊ％の下に上記
プラスミドの好適な供給源および貯蔵庫として誰でも入
手できる。

種々の抗生物質耐性伝達ＤＮＡ断片の機能性誘導体は、
遺伝子コドンに従っである特定のヌクレオチドを付加、
脱離または置換することにより生成し得る。上記の被修
飾断片または他の抗生物質耐性伝達ＤＮＡ断片をプラス
ミドｐＥＬ／θ３の複製開始点含有フラグメントと連結
することによっても本発明の範囲内にあるベクターが生
じることは当業者ならば理解し得る。

本発明を例示する更に別の派生ベクターも構成され得６
例えば、プラスミドｐＥＬ　／　０３からＢｃＪｌ　−
ＢａｍＨＩを欠失させると例示のプラスミドｐＦＪ　／
　２４Ｚを生じ、このプラスミドから更に別の誘導体も
生成し得る。かくして、プラスミドｐＬＲ／またはｐＬ
Ｒ４ｔの〜３．’Ｉ　ｋｂＢａｍＨＩネオマイシン耐性
伝達フラグメントをプラスミドｐＦＪ　／　２４’に挿
入すると例示のプラスミドｐＦＪ　／　Ｑ　４’および
ｐＦＪ　／グｊを生じろ。プラス２ドｐＦＪ　／　ｇ　
！を欠失（Ｂｅｊｌ　ｌ　−ＢａｍＨＩ　）させると例
示のプラス２ドｐＦＪ　／　４Ｚ乙を生じる。プラスミ
ドｐＩＪ＃３の〜２．７　ｋｂｓａ７！　Ｉ　−ＢｇＪ
　ＩＩエリスロマインン耐性伝達フラグメントをプラス
ミドｐＦＪ　／　２　’Ａに挿入すると例示のプラスミ
ドｐＦＪ　／　４Ｌ７を生じる。同様に。

ブラフ、ｉドｐＩＪＩＩ３の〜、ｌ　Ｑ　ｋｂｓａ７！
Ｉエリスロマイシン耐性伝達フラグメントを挿入すると
例示のプラスミドｐＦＪ／ＱざおよびｐＦＪ　／　４り
を生じる。

上述の抗生物質耐性伝達派生プラスミドは、　ｐＥＬ／
θ３の複製開始点を含有するので６本発明の範囲内にあ
る。

プラスミドｐＥＬ　／θ３の制限フラグメントおよび種
々の抗生物質耐性伝達ＤＮＡ断片は連結を容易にするよ
うに修飾し得る。例えば０分子状の連結物質（ｌｉｎｋ
ｅｙ）を特定のプラスミドｐＥＬ　／　０３制限フラグ
メントまたは抗生物質耐性伝達ＤＮＡ断片に付与する。

かくして１次の連結の際の特異的部位を都合良く構成し
得る。また、プラスミドｐＥＬ　／θ３およびプラスミ
ドｐＥＬ　／θ３の複製開始点含有制限フラグメントも
ＤＮＡ連結の際の性質を変化させ種々の制限部位を与え
るべくある特定のヌクレオチドを付加、脱離または置換
させることにより修飾し得る。当業者ならばヌクレオチ
ド化学と遺伝子コドンを理解し得るので、どのヌクレオ
チドが相互変換できどのＤＮＡを修飾すれば特定の目的
に望ましいものとなるかを理解し得る。

本発明ベクター（例えば、プラスミドｐＥＬ　／θユｐ
ＥＬ　／　０５　、　ＰＥＬ　／θ９　、　ｐＥＬ　／
　／　３　、　ｐＥＬ　１０ＩＡｐＥＬ／　／　／　、
　ｐＥＬ／　／７　、　ｐＦＪ７２ダ、　ｐＦＪ　／グ
久ｐＦＪ　／　４４７など）を、Ｅ、コリ・プラスミド
の機能性レプリコン含有の抗生物質耐性伝達制限フラグ
メント（例えば、プラスミドｐＢＲ１１２，ｐＢＲ３２
ｔ／Ｌ、ｐＢＲ３２Ｋ　、　ｐＢＲ３２ｆなど）１７：
連結して、Ｅ、コリおよびストレプトマイセスに用い得
る新規の三機能性プラスミドを生成し得る。これらの構
成Ｃ本明細書では、特にプラスミドｐＥＬ　１２１ｐＥ
Ｔ−／２２．ｐＦＪ／！；０およびｐＦＪ　／　ｊ　／
が例示される）は、プラスミドの増殖および操作がスト
レプトマイセスよりもＥ、コリにおいてより速くより簡
便に行なえるので、特に有利である。かくして、所望の
組み替えＤＮＡ工程をＥ、コリ宿主系で行なったのち、
プラスミド全体または特定のストレプトマイセスＤＮＡ
を取り出し、必要であればプラスミドの形に再構成し、
ストレプトマイセス属またはその類縁宿主細胞に移入で
きる。

本発明の組み替えＤＮＡクローニング・ベクターはスト
レプトマイセス属の１種または７株に使用を制限されな
い。逆に、ベクターは広範に応用でき、多数のストレプ
トマイセス属種、特にアミノグリコサイド、マクロライ
ド、β−ラクタム。

ポリエーテルおよびグリコペプタイド系抗生物質などの
抗生物質を製造する経済的に重要な種の特に無制限株（
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌｅａｓ　５ｔｒａｉｎｓ）で
ある宿主細胞に移入できろ。このような無制限株は当分
野でよく知られてい乙常法（Ｌｏｍｏｖａｋａｙａ　ａ
ｔ　ａｌ、、　／　９１０　。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｔ
ｉｐ　：　、ｌθ乙）によりストレプトマイヤス属から
容易に選別され採取される・無制限株の宿主細胞は制限
酵素を欠いているので。

形質転換の際にプラスミドＤＮＡを切断したり崩壊させ
たりすることはない。本明細書の目的からして９本発明
のベクターの制限部位を切断しない制限酵素を含む宿主
細胞も無制限とみなされる。

アミノグリコサイド系抗生物質を生成し１本ベクターが
特に有益であり移入できるストレプトマイセス属の無制
限株の好適な宿主細胞としては。

例えば９次のような種の無制限細胞が挙げられろ。

（以下余白） Ｓ、　ｋａｎａｍ　ｃｅｔｉｃｕｓ　（ｋａｎａｍｙｃ
ｉｎｓ）、　Ｓ、　ｃｈｒｅ互７（ａｍｉｎｏｓｉｄｉ
ｎｅ）　、旦、　　ｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ　（ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃ　ＨＡ１２６７）、　Ｓ、　ｍ１ｃｒｏ
ｓ　ｏｒｅｕｓ　（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　５Ｆ−７６
７）。

Ｓ、　ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ　（ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃ　ＳＦ　７３３）、　Ｓ、　ｆｌａｖｏ−７（ｓ
ｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、７　（ａｃｔｉｎ
ｏ−ｓｐｅｃｔａｃｉｎ）、　Ｓ、　ｒｉｍｏｓｕｓ　
ｆｏｒｍａ　　ａｒｏｍｏｍ　ｃｉｎｕｓ（ｐａｒｏｍ
ｏｍｙｃｉｎｓ、　ｃａｔｅｎｕｌｉｎ）、　Ｓ、　ｆ
ｒａｄｉａｅ　ｖａｒ。

１ｔａｌｉｃｕｓ　（ａｍｉｎｏｓｉｄｉｎｅ）、　Ｓ
、　ｂｌｕｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｂｌｕｅｎｓｉｓ（
ｂｌｕｅｎｓｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｃａｔｅｎｕｌ
ａｅ　（ｃａｔｅｎｕｌｉｎ）、　Ｓ。

ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ　ｖａｒ、　ｃｅｌｌｕ山
止独ユｕｓ　（ｄｅｓｔｏｍｙｃｉｎＡ）、　ｐ、　ｔ
ｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ　（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ、　ａ
ｐｒａｍｙｃｉｎ）、　Ｓ。

１ａｖｅｎｄｕｌａｅ　（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、
　ａｌｂｏ　ｒｉｓｅｏｌｕｓ　（ｎｅｏ−ｍｙｃｉｎ
ｓ）、　Ｓ、　ａｌｂｕｓ　ｖａｒ、　７　（ｍｅｔａ
ｍｙｃｉｎ）。

ｓ、　ｈ　　ｒｏｓｃｏ　１ｃｕｓ　ｖａｒ、　７　（
ｓｐｅｃｔｉｎｏ−ｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｂｉｋｉｎ
ｉｅｎｓｉｓ　（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、
　肛」！凪（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｅ
ｒ　ｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏ　ｅｎｅｓ　ｖａｒ。

ｎａｒｕｔｏｅｎｓｉｓ　（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
）、　Ｓ、　匹弧息巨巨（ｓｔｒｅｐｔｏ　−ｍｙｃｉ
ｎ）、　’４．　ｐ　（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、
　’Ｓ−，ｒａｍｅｕｓ（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）
、　Ｓ、　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ　（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｉｎ）。

Ｓ、　ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ　（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｉｎ）、　Ｓ、　ｈ　　ｒｏｓｃｏ　１ｃｕｓｖａｒ、
　ｌｉｍｏｎｅｕｓ　（ｖａｌ司ａｍｙｃｉｎｓ）、　
Ｓ、　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ（ｄｅｓｔｏｍｙｃｉｎ
ｓ）、　Ｓ、　ｈ　　ｒｏｓｃｏ　１ｃｕｓ　ｆｏｒｍ
ａ　７（ｇｌｅｂｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｆｒａｄｉ
ａｅ　（ｈｙｂｒｉｍｙｃｉｎｓ、ｎｅｏｍｙｃｉｎｓ
）。

Ｓ、　ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　（ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃ　Ａ１６３１６−Ｃ）、　Ｓ、　ａｑｕａｃａｎｕｓ
（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ）、　
Ｓ、　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｓ　（ｈｙｇｒｏ　−ｍ
ｙｃｉｎ　Ａ）、　Ｓ、　ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉ、
ｓ　（ｈｙ（Ｈｒｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ。

ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
ｓ）＋　Ｓ、　ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ　（ｈｙにｒｏ
　−ｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕｓ　
（ｋａｓｕｇａｍｙｃｉｎｓ）、　Ｓ、　ｋａｓｕｇａ
−ｅｎｓｉｓ　（ｋａｓｕｇａｍｙｃｉｎｓ）、　Ｓ、
　ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ　（卸ｔｉｂｉｏｔｉｃＬＬ−Ａ
Ｍ３ｋ）、旦、　１ｉｖｉｄｕｓ　（Ｌｉｖｉｄｏｍｙ
ｃｉｎｓ）、　Ｓ、　ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ（ｓｅｌｄｏ
ｍｙｃｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ）および且０．臼旦ｕｓ　
（ｒｉｂｏｓｙｌｐａｒｏｍａｍｉｎｅ　）　。

マクロライド系抗生物質を生成し１本ベクターが特に有
益であり移入できるストレプトマイヤス属の無制限株の
好適な宿主細胞としては１例えば。

次のような種の無制限細胞が挙げられる。

Ｓ、　ｃａｅｌｅｓｔｉｓ　（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　
Ｍ２Ｂ５）、　Ｓ、　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（ｐｌａｔｅ
ｎｏｍｙｃｉｎ）、　ｓ、　ｒｏｃｈｅｉ　ｖａｒ、　
ｖｏｌｕｂｉＬｉｓ　（ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃ　Ｔ２
６：３６）、　Ｓ、ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ　（ｍｅｔｈ
ｙｍｙｃｉｎｓ）、　Ｓ。

ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　（ｂｕｎｄｌｉｎ）、　Ｓ
、　ｎａｒｂｏｎｅｓｉｓ　（ｊｏｓａ−ｍｙｃｉｎ、
　ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）、且、ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃ
ｕｓ　（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃＮＡ−１８１）、　Ｓ、
　ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ　（ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃ　ＰＡ１３３Ａ＋　Ｂ）ｓＳ、　ｒｏｓｅｏｃｉｔｒ
ｅｕｓ　（ａｌｂｏｃｙｃｌｉｎｅ）、　Ｓ、　ｂｒｕ
ｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ（ａｌｂｏｃｙｃｌｉｎｅ）、　
Ｓ、　ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　（ａｌｂｏ
ｃｙｃｌｉｎｅ）。

Ｓ、　ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　（ｃｉｎ
ｅｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ）、　Ｓ、　ａｌｂｕｓ（ａｌｂ
ｏｍｙｃｅｔｉｎ）　、且、　ｆｅｌｌｅｕｓ　（ａｒ
ｇｏｍｙｃｉｎ、　ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）。

Ｓ、　ｒｏｃｈｅｉ　（ｌａｎｋａｃｉｄｉｎ、　ｂｏ
ｒｒｅｉｉｄｉｎ）、　Ｓ、　ｖｉｏｌａｃｅｏ−ｎｉ
ｇｅｒ　（ｌａｎｋａｃｉｄｉｎ）、互、　ｇｒｉｓｅ
ｕｓ　（ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）。

（ｔｕｒｉｍｙｃｉｎ、　ｒｅｌｏｍｙｃｉｎ、　ｍａ
ｒｉｄｏｍｙｃｉｎ、　ｔｙｌｏｓｉｎ。

ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｇｒｉｓｅｏｓｐｉ
ｒａｌｉｓ　（ｒｅｌｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ。

１ａｖｅｎｄｕｌａｅ　（ａｌｄｇａｍｙｃｉｎ）、、
’Ｓ、　ｒｉｍｏｓｕｓ　（ｎｅｕｔｒａｍｙｃｉｎ）
。

互、　ｄｅｌｔａｅ　（ｄｅｌｔａｍｙｃｉｎｓ）、　
Ｓ、　ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ。

ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　（ｅｓｐｉｎｏｍｙ
ｃｉｎｓ）、　Ｓ、’ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ（ｍｙ
ｄｅｃａａ＋ｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ　（ｆｏｒｏｍａｃｉｄｉｎ　Ｄ）。

Ｓ、　ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉ
ｎ）、互０ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ（ｇｒｉｓｅｏｍｙｃｉ
ｎ）、　Ｓ、　ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　（
ａｍａｒｏｍｙｃｉｎ。

ｓｈｉｎｃｏｍｙｃｉｎｓ）、　Ｓ、　ｆｉｍｂｒｉａ
ｔｕｓ　（ａｍａｒｏｍｙｃｉｎ）、互。

ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ　（ａｍａｒｏｍｙｃｉｎ）、　
Ｓ、　ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ　（ｅｒｙｔｈｒｏ−ｍｙｃ
ｉｎｓ）、　Ｓ、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ　（ｏｌ
ｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ）、　！３゜ｏｌｉｖｏｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓ　（ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ
、　ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏ−ｇｅｎｅｓ　ｖａｒ、　
ｓｕｒａｇａｏｅｎｓｉｓ　（ｋｕｊｉｍｙｃｉｎｓ）
、　Ｓ、　ｋｉｔａｓａｔｏ−ｅｎｓｉｓ　（１ｅｕｃ
ｏｍｙｃｉｎ）、　３．　ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ　ｖ
ａｒ、　ｊｏｓａ−ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　（ｌｅｕｃｏ
ｍｙｃｉｎ　Ａ３．　ｊｏｓａｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　
ａｌｂｏ　−ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　（ｍｉｋｏｎｏｍｙ
ｃｉｎ）、　Ｓ、　ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ　（ｃｈａ
ｌｃｏ−ｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｃｉｒｒａｔｕｓ　（
ｃｉｒｒａｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｄｊａｋａｒｔｅｎ
ｓｉｓ（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｅｕｒｙｔ
ｈｅｒｍｕｓ　（ａｎｇｏｌａｍｙｃｉｎ）。

Ｓ、　ｆｒａｄｉａｅ　（ｔｙｌｏｓｉｎ、　１ａｃｔ
ｅｎｏｃｉｎ、　ｍａｃｒｏｃｉｎ）、　Ｓ。

ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ　（ｂａｎｄａｍｙｃｉｎ）
、　Ｓ、　ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ（ａｃｕｍｙｃｉ
ｎ）、　Ｓ、　ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　（ｃａｒｂｏｍｙ
ｃｉｎ）、　Ｓ、　ｔｅｎｄａｅ（ｃａｒｂｏｍｙｃｉ
ｎ）、　Ｓ、　ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ　（ｃａｒｂ
ｏｍｙｃｉｎ）、　Ｓ。

ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ　（ｃａｒｂｏｍｙｃｉ
ｎ）およびＳ、ａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ（ｃａｒｂｏ
ｍｙｃｉｎ）　。

β−ラクタム系抗生物質を生成し９本ベクターが特に有
益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限株の
好適な宿主細胞としては９例えば。

次のような種の無制限細胞力ｒ挙げられる。

Ｓ、　ｌｉｐｍａｎｉｉ　（Ａ１６８８Ｊ　ＭＭ４５５
０．　ＭＭ１３９０２）、　Ｓ、　ｃｌａｖｕ−１ｉｇ
ｅｒｕｓ　（Ａ１６８８６Ｂ、　ｃｌａｖｕｌａｎｉｃ
　ａｃｉｄ）、　Ｓ、　ｌａｃｔａｍ−ｄｕｒａｎｓ　
（ｃｅｐｈａｍｙｃｉｎ　Ｃ）、　Ｓ、　ｇｒｉｓｅｕ
ｓ　（ｃｅｐｈａｍｙｃｉｎＡ、　Ｂ）、　Ｓ、　ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　（ｄｅａｃｅｔｏｘｙｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｎＣ）、　Ｓ、　ｗａｄａｙａｍｅ
ｎｓｉｓ　（１／Ｓ−３４１＋２−Ｄ）、　Ｓ、　ｃｈ
ａｒｔｒｅｗｉｓ（ＳＦ　１６２３）、　Ｓ、　ｈｅｔ
ｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓお！び　Ｓ、　ｐａｎａｙｅｎｓ
ｉｓ（Ｃ２０８１Ｘ）；　Ｓ、　ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎ
ｓｉｓ、　Ｓ、　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ、　Ｓ。

ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　、互、＝辿躬およびＳ、　ｖｉｒ
ｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（ｃｅｐｈａｍｙｃｉｎ
ｓ　Ａ、　Ｂ）；　Ｓ、ｃａｔｔｌｅｙａ　（ｔｈｉｅ
ｎａｍｙｃｉｎ）ＨおよびＳ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、　
Ｓ、　ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ、　Ｓ、　ｆｌａｖｕｓ
。

Ｓ、　ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ、　Ｓ、　ａｒｇｅｎ
ｔｅｏｌｕｓおよびＳ、５ｉｏｙａ−ｅｎｓｉｓ　（Ｍ
Ｍ　４５５０およびＭＭ　１３９０２）　。

ポリエーテル系抗生物質を生成し１本ベクターが特に有
益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限株の
好適な宿主細胞とｑでは１例えば。

次のような種の無制限細胞が挙げられる。

Ｓ、　ａｌｂｕｓ　（Ａ２０４．　Ａ２８６９５Ａおよ
びＢ、　ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）。

Ｓ、　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　（Ａ２１８．　ｅ
ｍｅｒｉｃｉｄ、　ＤＥ３９３６）、　Ａ１２ＯＣＡ２
８６９５Ａ　およびＢ、　ｅｔｈｅｒｏｍｙｃｉｎ、　
ｄｉａｎｅｍｙｃｉｎ）、　Ｓ。

ｇｒｉｓｅｕｓ　　（ｇｒｉｓｏｒｉｘｉｎ）、　　Ｓ
、　　ｃｏｎｇＪｏｂａｔｕｓ　　（ｉｏｎｏｍｙｃｉ
ｎ）。

Ｓ、　ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ、　ａｓｔｅｒ
ｏｃｉｄｉｃｕｓ　（ｌａｉｄｌｏｍｙｃｉｎ）。

Ｓ、　１ａｓａｌｉｅｎｓｉｓ　（ｌａｓａｌｏｃｉｄ
）、　Ｓ、　ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ（ｌｏｎｏｍ
ｙｃｉｎ）、　Ｓ、　ｃａｃａｏｉ　ｖａｒ、ａｓｏｅ
ｎｓｉｓ　（ｌｙｓｏｃｅｌｌｉｎ）。

Ｓ、　ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ　（ｍｏｎｅｎｓｉ
ｎ）、　Ｓ、　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ（ｎａｒａｓ
ｉｎ）、　Ｓ、　ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ　（ＲＰ　：
３０５０４）、　Ｓ、と）ｎｇ−ｗｏｏｄｅｎｓｉｓ　
（ｌｙｓｏｃｅｌｌｉｎ）、　Ｓ、　ｆｌａｖｅｏｌｕ
ｓ　（（：Ｐ３８９３６）＋Ｓ、　ｍｕｔａｂｉｌｉｓ
　（Ｓ−１１％３ａ）およびＳ、　ｖｉｏｌａｃｅｏｎ
ｉｇｅｒ（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）　。

グリコペプタイド系抗生物質を生成し９本ベクターが特
に有益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限
株の好適な宿主細胞としては９例えば９次のような種の
無制限細胞が挙げられる。

Ｓ、　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　およびＳ、　ｈａｒａｎ
ｏｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ　（ｖａｎｃｏ−ｍｙｃｉｎ）
；　Ｓ、　ｃａｎｄｉｄｕｓ　（Ａ−３５５１２，ａｖ
ｏｐａｒｃｉｎ）およびＳ、　ｅｂｕｒｏｓｐｏｒｅｕ
ｓ　（ＬＬ−ＡＭ　３７４）。

本ベクターが特に有益で移入できるストレプトマイセス
属の無制限株の他の好適な宿主細胞としては。

例えば９次のような種の無制限細胞が挙げられる。

Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、　Ｓ、　ｇｒａｎｕｌｏｒ
ｕｂｅｒ、　Ｓ、　ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ。

Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ、　Ｓ、　ｔｅｎｅｂｒａｒｉ
ｕｓ、　Ｓ、　ａｃｒｉｍｙｃｉｎｓ、　Ｓ。

ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、　Ｓ、　ｐａｒｖｉｌｉｎ、
　Ｓ、　ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ。

Ｓ、　ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ、　Ｓ、　ｖｉｎａ
ｃｅｕｓ、　Ｓ、　ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ。

およびＳ、　ａｚｕｒｅｕｓ。

上述の代表的ストレプトマイセス属の無制限宿主細胞に
加えて９本ベクターは１例えばバチルス。

スタフィロコッカスならびにストレプトスポランジウム
、アクチノプランズ、ノカルディアおよびマイクロモノ
スポラを包含するアクチノマイセテス類縁属などのよう
な他の属の無制限株の細胞においても有益であり移入で
きる。かくして９本発明のベクターは種々の微生物の宿
主細胞に広く応用でき、有益であり、また移入できる。

本発明の具体的内容は全て有益であるが１本組み替えＤ
ＮＡクローニング・ベクターおよび被形質転換体のある
ものは、他のものより好ましい。

即ち、好ましいベクターは、プラスミドｐＥＬ１０３゜
ｐＥＬ　／θｊ　、　ｐＥＬ７０９　、　ｐＥＬ／　／
３　、　ｐＥＬｌＯＩＡ、乙／／／、ＰＥＬ／／７．ｐ
ＥＬ／２／、ｐＦＪ／２１ＡｐＦＪ　／　ｇ　！　、　
ｐＦＪ　／　４Ｚ乙、　ｐＦＪ　／　４’　７　、　ｐ
ＦＪ＃／。

ｐＦＪ　／　！；　３　、　ｐＦ’、Ｔ　／　３；　３
およびｐＦＪ　／　Ａ　Ｏであり好ましい被形質転換体
は、ストレプトマイセス・アムボファシエンス／ｐＥＬ
１０３．ｓ、アムボファシェンス／ｐＥＬ１０５．Ｓ、
アムボファシエンス／ｐＥＬ１０９．Ｓ、アムポファシ
エノス／ｐＥＬ／／３゜Ｓ、アムボファシエンス／ＰＥ
Ｌ／　ｏａ　、　ｓ、アムボファシエンス／　ＰＥＬ　
／　ｔ　ｔ　、　ｓ、アムボファシエノス／ＰＥＬ／／
７．Ｅ、コリＫ　／２　ＨＢ１０／　／ｐＥＬ／２／：
Ｓ、アムボファシエンス／ｐＦＪＶｘ＋、ｓ、アムボフ
ァシエンス／ｐＦＪ／≠＋　、　Ｓ、アムボファシエン
スｐＦＪ／４’＆−８，アムボファシエンス／ｐＦＪ７
ダＺＥ、コリに／２　ＨＢ１０／　／ｐＦＪ　／　３０
　、　Ｅ、コリに／２ＨＢ／θ／　／　ｐＦＪ　／　３
３　、　Ｅ、コリに／２　ＨＢ１０／／ｐＦＪ　／　！
；　３およびＥ、コリＫｔｘ　ＨＢｔｏｔ／ｐＦＪ／ｌ
θである。更に、上記の好ましい群の内で、プラスミド
ｐＥＬ　７θ３　、　ｐＥＬ／　０！；　、　ｐＥＬ／
　／　３　、　ｐＥＬ１０９、ｐＦＪ／２グ、　ｐＦＪ
　／　ＱグおよびｐＦＪ／ダ７ならびに被形質転換体Ｓ
、アムボファシエンス／ｐＥＬ　／θ３．Ｓ、アムボフ
ァシエンス／　ｐＥＬ　／　０改Ｓ、アムボファンエン
ス／ｐＥＬｔ／３．ｓ、アムボファシエンス／ｐＥＬ１
０９．ｓ、アムボファシエンスｐＦＪ　／　２１１　、
Ｓ、アムボファシエンスｐＦＪ　／ψダおよびＳ、アム
ボファシエンス／　ｐＦＪ　ｉ　ｔｔ　７が最モ好まし
い。

本発明の組み替えＤＮＡクローニング・ベクターおよび
被形質転換体は、広範な有用性を有し。

ストレプトマイセス属および類縁微生物に用いるに適し
たクローニング媒体の必要性を満たすよう助成する。更
にまた０本ベクターの、形質転換されていない宿主細胞
には有毒である抗生物質に対する耐性を伝達する能力は
、被形質転換体を選別するための機能的手段ともなる。

このことは、ベクターＤＮＡを得た特別の細胞を決定し
選別するために実質上必要であるので重要である。存在
を確かめる機能試験が無いＤＮＡ断片の場合も１本ベク
ターに挿入して、非選別性ＤＮＡを含有する被形質転換
体を適当な抗生物質選別法により単離することができる
。このような非選別性ＤＮＡ断片は、プラスミドの機能
および複製に必要な領域内を除いてどこにでも挿入でき
、全てのタイプの抗生物質修飾酵素および調節遺伝子を
特定する遺伝子を包含するがこれに限定されない。

更に詳しくは、遺伝子を包含する非選別性ＤＮＡ断片は
０例えば例示のプラスミドｐＥＬ　／　／　３のような
プラスミドの／乙ｋｂ耐性伝達ＢａｍＨＩフラグメント
の中心部のＳａＪ　Ｉ制限部位に挿入する。このような
挿入によりチオストレプトン耐性遺伝子は不活化され、
かくして１組み替えプラスミドを含有する被形質転換体
を容易に同定できる。これには、まずネオマイシン耐性
かどうかで選別し。

次にチオストレプトンには耐性でなくネオマイシンには
耐性である被形質転換体を同定する。同様に、必要なり
ＮＡ断片を例えば！ｇｋｂの耐性伝達ＢａｍＨＩフラグ
メントの内部のＢａｍＨＩ制限部位に挿入するとネオマ
イシン耐性遺伝子が不活化される。かくして、この組み
替えプラスミドを保有する被形質転換体もまた。まずチ
オストレプトン耐性かどうかで選別し１次いでネオマイ
シンには耐性でなくチオストレプトンに耐性である被形
質転換体を同定することにより、容易に同定できる。

従って、ストレプトマイセス属および類縁細胞において
抗生物質耐性かどうかで選別できることにより、必要な
特定の非選別性ＤＮＡを含有する極稀な細胞を効率的に
採取できる。

本明細書で上述したように、抗生物質耐性による機能試
験はまた。制御因子として働き１個々の抗生物質耐性遺
伝子の形質表現を調製するＤＮＡ断片の位置を決定する
ためにも用いられる。このような断片には、プロモータ
ー、アテニュエイタ−（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ　）　、
リグレッサー、インデューサー。

リボゾーム結合部位などが挙げられるがこれらに限定さ
れるわけではない。このような断片は、ス、心１ トレブトマイセス属および類縁微生物の細胞の他の遺伝
子の形質表現を制御するのに用いられる。

本発明のチオストレプトンおよびネオマイシン耐性伝達
ベクターはまた。連結したＤＮＡ断片が何代にも亘って
宿主細胞内にしっかり保持されるようにするのに有用で
ある。チオストレプトンまたはネオマイシン耐性伝達フ
ラグメントに共有結合で連結しており、ストレプトマイ
セス属または類縁微生物の細胞のどちらか一方において
増殖させた遺伝子またはＤＮＡフラグメントは、形質転
換されていない細胞には有毒である程度のチオストレプ
トンまたはネオマイシンに被形質転換体をさらしても維
持されろ。それ故に、ベクター、即ち共有結合で連結し
たＤＮＡ　、を失った被形質転換体は生育できず、培養
から除かれる。かくして本発明のベクターは必要なりＮ
Ａ配列を安定化し維持することができる。

本発明のクローニング・ベクターおよび被形質転換体は
、ストレプトマイセス属および類縁細胞において現在製
造されている種々の生成物の収率を改良するための遺伝
子のクローニングを提供する。このような生成物の例と
しては、ストレプトマイシン、タイロシン、セファロス
ポリン、アクタプラニン、ナランン、モネンシン、アプ
ラマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシンなどが
挙げられるがこれらに限定されない。本発明は。

例エバヒトインシュリン、ヒトグロインシュリン。

グルカゴン、インターフェロンなどの商業的に重要な蛋
白質、商業的に重要な工程および化合物に至る代謝経路
中の酵素的機能、ま１こは遺伝子の形質表現を改善する
制御因子をフード化するＤＮＡ配列をクローニングし、
特徴づけ、再構成するのに有用な選択性ベクターをも提
供する。上記の所望のＤＮＡ配列としては０例えばスト
レプトマイシン、セファロスポリン、タイロシン、アク
タグラニジ。ナラジン、モネンシン、アブラマイシン。

トブラマイシンおよびエリスロマイシンの誘導体の如き
抗生物質誘導体の合成を触媒する酵素またく は抗生物質もへは他の生成物の副生を中介し増加　。

させる酵素をコード化するＤＮＡが挙げられるがこれら
に限定されない。かくして、このような化 ＤＮＡ断片を挿入し安定疋きることにより、ストレプト
マイセス属および類縁微生物により製造される抗生物質
の収率と利用率を増加させることができる。

ストレプトマイセス・グラヌロラバーｍＡ３９９／Ｑ／
３／ＰＥＬ／θ３は幾つかの異なる媒地のいずれかを用
いて多数の方法で培養できる。培養培地中の好ましも）
炭化水素源としては１例えば、糖蜜、グルコース、デキ
ストリノおよびグリセロールが挙げられ、窒素源として
は０例えば、ソイ。

フラワー（ｓｏｙ−４１ｏｕｒ）　　、アミノ酸混合物
およびヘフトンカ挙げられる。栄養無機塩もまた含まれ
。

ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム。

フォスフエイト、クロライド、サルフエイトおよびイオ
ン様物質を生じ得る汎用される塩が挙げられる。他の微
生物の成長と発育に必要であるように、必須微量成分も
また加えられる。このような微量成分は、普通他の媒体
成分の添加に伴なって不純物として供給される。

ストレプトマイセス・グラヌロラバーＮａＡ３９９／Ｑ
／３／ＰＥＬ１０３は、好気性培養条件下にｐＨが約５
〜９の比較的広い範囲内で、約／ｊ−弘θ°Ｃの範囲の
温度で生育させる。しかし、プラスミドｐＥＬ　／　０
３を最高の複製数で生成するには、ｐＨが約７２の培地
で培養し始め、培養温度を約３０°Ｃに保持するのが望
ましい。上述の条件下でストレプトマイセス・グラヌロ
ラバーＮａｈ３９９／Ｑ／３／ｐＥＬ１０３を培養する
と、プラスミドｐＥＬ１０３を当分野でよく知られた技
法を用いた常法で単離できる細胞の貯蔵物質を生じる。

以下の実施例により０本明細書に記載した発明をさらに
詳細に例示する。本発明を構成する説明および実処方手
続を必要に応じて記載する。

（以下余白） プラスミドｐＥＬ　／　０３の単離 Ａ、ストレプトマイセス・グラヌロラバー（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｇ　ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ　）　Ａ　
Ａ　３９９　／　、２．　／　３　／Ｉ）ＥＬ１０３の
培養 ストレプトマイヤス・ｊグラメロラバー１’ａ　Ａ　３
９９／２．　／３／ｐＥＬ　／　０３　（ＮＲＲＬ　／
２！；ゲ９）の成長段階にある接種物を、殺菌したトリ
ブチカーゼ・ソイ・ブロス”　（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ
　ａｏｙ　ｂｒｏｔｈ）を脱イオン水に３３９／ｌで溶
かした液Ｃ３０ｔｔｔｌ）中で該菌株を深部通気培養の
条件下に生育させるという常法により、調製した。

トリブチカーゼ・ソイ・ブロス中の接種物を。

３０°Ｃで４１４時間培養したのち、接種物のうち約／
θｇ／を殺菌したトリブチカーゼ・ソイ・ブロス（！θ
θｍｌ　）中に移し、ｐＨを調整することなく。

３θ°Ｃで約２θ時間培養すると、プラスミドＤＮＡを
回収し続いて単離するのに用いるストレプトマイナス・
グラヌロラバーＡ　Ａ　３９９　／　２．　／　３／　
ｐＥ　Ｌ／θ３の細胞を得た。

壷トリブチカーゼ・ソイ・ブロスはミシガン州デトロイ
トにあるティフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）から得られる。

Ｂ、プラスミドの単離 ストレプトマイセス・グラヌロラバー＆Ａ３９９／、２
．　／３／ｐＥＬ　／　０３の細胞（湿重量約７２ｆ）
を遠心分離（７０分間、ｔｌ″Ｃ，１０，０θθｒｐｍ
）Ｉｎより回収し、そこへ、ＴＥＳ緩衝液〔００７Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノエタン〔上リス〕。

ＯθＯ／ＭＥＤＴＡ、３ｔ１％スクロース、　ｐＨざ〕
（約Ｓθｍｌ　）を加え、続いて、θユ、ｔＭＥＤＴＡ
（／θｍｌ　）に懸濁したリゾチーム（約θ、２５ｇ）
を加えた。この混合液を３７°Ｃで約７５分間インキュ
ベートしたのち、ＴＥ緩衝液〔００７Ｍトリス。

θＯθ／Ｍ　ＥＤＴＡ、Ｉ）Ｈ♂〕に溶かした７０％ト
ライトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ　−／　０θ（約Ｏｊ
ｇ／）を加え。

６５°Ｃで約７５分間インキュベートした。溶解物を遠
心分離（ｇｔ分間、ｔ″Ｃ、１５θ０θｒｐｍ　）　シ
たのち、上清液をイソアミルアルコールで１回。

クロロホルムとイソアミルアルコールの２１：／溶液で
７回抽出した。次１こ、水層（こ３Ｍ酢酸ナトリウム（
約θｊｇ／）を加え、３容量の冷９３％エタノール（−
，２０”Ｃ）を加えた。エタノールで沈澱した物を急激
にドライアイス−エタノール浴中に入れ、ＤＮＡの沈澱
を遠心分離（／ｊ分間、ｑ”Ｃ、１０，００Ｏｒｐｍ　
）で採取した。得られた沈澱を真空乾燥し、ＳＴＥ緩衝
液〔０θ／Ｍトリス。

００θ／Ｍ　ＥＤＴＡ、００／Ｍ塩化ナトリウム〕（１
／　Ｗ／　）に再懸濁した。臭化エチジウムによる塩化
セシウムグラデイエントを用いて遠心分離（ＩＡＯ時間
、／ｊ″Ｃ、３３，０００ｒｐｍ　）　してブラフ、Ｅ
ドＤＮＡを精製し、続いて、所望のプラスミドｐＥＬ／
θ、、？ＤＮＡバンドを取出し、常法により臭化エチジ
ウムを抽出した。３容量のエタノール中でＤＮＡを沈澱
させて単離するプラスミドｐＥＬ　／　０３ＤＮＡを１
０倍希釈のＴＥ緩衝液（／ｌ／）ｌこ溶解し、−，２０
”Ｃで凍結して保存した。

実施例２ プラスミドｐＬＲ２の構成 Ａ、プラスミドｐｌＪ４の川國■消化 プラスミドｐＩＪ　６Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｔｈａｎｐｓｏｎ
　ｅｔ　ａｔ、。

／９１θ、　Ｎａｔｕｒｅ　２１乙：Ｌ訂　で開示〕（
約２θ４゜、２０ｐｇ）、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、
／１１９／冨１）（Ｊ−Ｉｌｌ）、水（／９Ｔｈ）、腹
烈ｍ（３ニユーイングランド・バイオ・ラブダ・ユニッ
ト含有）制限酵素’Ｃｔｐｌ）および反応液”＜５ｔｉ
）を３７°Ｃで２時間インキュベートした。反応はｕＭ
酢酸アンモニウム（約ｊθメ）および９５％エタノール
（、ＺＯＯｐｌ’）を加えて停止させた。得られたＤＮ
Ａの沈澱を７θ％エタノールで２回洗浄し、真空乾燥し
て、ＴＥ緩衝液（２θ／１ｌ）Ｉこ懸濁し、　−，２６
°Ｃで凍結して保存した。

秦制限酵素は以下の所から入手できる。

ニューイングランド・バイオ・ラブダ・インコーホレイ
テッド Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ、、　Ｉｎ
ｃ。

３２　Ｔｏｚｓｒ　Ｒａ１ｄ Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓａｔｔａθ／９
／ｊベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズＢ＊
ｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ　−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ７９１７／　　Ｃａｓｔｌｅｗａｙ　Ｄ
ｒｉｖｅＩｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ
　’ｌ乙２３０ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・
インコーホレイテッド Ｂｅｔｈｓｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅａ　ＩｎｃＰ、　０．　Ｂｏｘ　、ｊ；７７ Ｇａｉｔｈｅｒａｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎ＋ｄ　　
、２０７乙θｍＨｉｎｄｌ［制限酵素用の反応液は以下
の組成で調製した。

６０θｍＭ　　ＮａＣｊ＋ ７００ｍＭ　トリス−塩酸、　ｐ）（７９７θｒｎＭＭ
ｇＣ１゜ ７０ｍＭ　　ジチオスレイトール Ｂ、プラスミドＰＢＲ３ユ２の世射■消化プラスミドＰ
ＢＲ，？２２ＤＮＡ（約♂４．ゲ〃）。

反応液（ｊμ）、ＢＳＡ（／■／舅ｌ、５メ）、水（３
／ｌｄ）　、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（／ｍ）を３７°
Ｃテ２時間インキュベートした。６０″Ｃで７０分間イ
ンキュベートすることｆこより反応を停止したあと。

酢酸アンモニウム（ＦＪ！　０ｔｔｌ　）　、　９．！
；　％エタノール（２θθ／ｌｌ）を加えた。得られた
ＤＮＡの沈澱を７θ％エタノールで２度洗浄し、真空乾
燥し。

水（ｌｌ−ｊＴｈ）に懸濁した。

Ｃ０■■消化したプラスミドｐＩＪ　、４とｐＢＲ３ユ
ニの連結 ・　Ｈｉｎｄ■処理したプラスミドｐＩＪ乙〔実施例２
人で得られる〕（約、２０　ｐ！　）　、　Ｈｉｎｄｌ
Ｊ処理したプラスミドＰＢＲ３２２Ｃ実施例２Ｂで得ら
れる〕（２０ｐｄ　）　、　Ｂ　ＳＡ　（／ｗ４／ｙｇ
ｌＡ；ｔｉ　）　　、　’ｒ＜Ｉ）ＮＡリガーゼ”（／
ｐｌ）および連結液”（！；ｐ！’）を１６°Ｃで４時
間インキュベートした。４ＬＭ酢酸アンモニウム（約ｊ
　Ｏｐｌ　）および９ｊ％エタノール（２θθｌ）を加
えて反応を停止し、得られたＤＮＡの沈澱を７０％エタ
ノールで２回洗浄し、真空乾燥してＴＥ緩衝液ζこ懸濁
した。懸濁したＤＮＡは所望のプラスミドＰＬＲ２であ
った。

＊　Ｔ　ＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ　’）ガーゼは以下のところ
から入手できる。

ニューイングランド・バイオ・ラブダ・インコーホレイ
テッド Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　ＬａｂＢ、、　　Ｉ
ｎｃ。

３２　　Ｔｏｚｅｒ　Ｒｄ。

Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　　θ／
９／ｊ壷壷　凍結液は以下の組成から調製した。

！；００ｍＭ　　）、リス−塩酸、ｐＨ７１２θＯｍＭ
　　ジチオスレイトール ／　００　ｍＭ　　ＭｇＣＡ’。

／ＱｍＭ　　ＡＴＰ 実施例３ Ｅ、コリ　（Ｅ、Ｃｏ１１　）Ｋ　／　２ＨＢ　／θ／
／ｐＬＲ，２の構成 凍結した適当なＥ、コ’Ｊ　Ｋ　／２　ＨＢ　１０／の
細胞口Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　／９７７　、
　Ｇｅｎｅ　２ニア３；　　９３　〕（約１０ｍ１　）
を遠心分離により沈澱させ、００７Ｍ塩化ナトリウム（
約１０ｗ１”）ｊこ懸濁した。次に、再び細胞を沈澱さ
せ、０θ３Ｍ塩化カルシウム（約１０ｍ１　）に再懸濁
し、２０分間氷上でインキュベートし三度沈澱させて、
最後に００３Ｍ塩化カルシウム（／′２５１１１）に再
懸濁した。得られた細胞懸濁液は次の形質転換に適して
いた。

ＴＥ緩衝液に懸へしたプラスミドＰＬＦｔ２　Ｃ実施例
２Ｃで調製〕をエタノールで沈澱させ、３０ｍＭ塩化カ
ルシウム溶液ＣＩ！；Ｏｄ’）に懸濁し、試験管内で適
当なＥ、コ＋）Ｋ／２ＨＢ／θ／細胞（約２０θメ）と
穏やかに混和した。得られた混合液を氷上で約ｔ３分間
、その後、ケ２°Ｃで約７分間インキュベートした。次
にアンピシリンｌθｐｇ／ｍｌ）を含むＬ−ブロスＣＢ
ｅｒｔａｎｉ、　／９！；　／　、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ６２　：　２９３　）　（約３ｙｉｌ）を
加え、振盪下に３７°Ｃで／時間インキュベートして、
アンピシリンを含むＬ−寒天〔Ｍｉ　１ｌｅｒ　、　／
　９７２　、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１
ｅｃ　−ｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ、　ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　〕に
移植した。生き残ったコロニーを選別し、予想表現型（
ＡｍｐＲ，Ｔｅｔｓｌかどうかを試験した。これは所望
の被形質転換体Ｅ、コリに／ユＨＢ　１０／／ｐＬＲ−
２であった。

実施例Ｖ プラスミドｐＬＲ／の構成 プラスミドｐＬＲ／は、プラスミドｐＩＪ６の代わりに
プラスミドｐＩＪ２　ＣＴｈａｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ
、、　／９１ｒＯ。

Ｎａｔｕｒｅ　、ｌざｇ：！；２３で開示〕を用いるこ
とを除いては、実施例、２Ａ−Ｃと実質的に同じ操作で
調製した。所望のプラスミドｐＬＲ／はＴＥ緩衝液に懸
濁した。

実施例！ Ｅ、コリに／２ＨＢ１θ／／ｐＬＲ／の構成所望の構成
は、プラスミドｐＬＲ２の代りにプラスミドｐＬＲ／を
用いて形質転換することを除いては、実施例３と実質的
に同じ操作で行なった。生き残ったコロニーを選別し、
予想表現型（ＡｍｐＲ。

ＴｅｔＳ）かどうかを試験したところ、これは所望の被
形質転換体Ｅ、コリに／２ＨＢ／θ／／ＰＬＲ／であっ
た。

実施例６ プラスミドｐＬＲ４＋！の構成 Ａ、プラスミドｐＬＲ／のＢａｍＨ１部分的消化プラス
ミドｐＬＲ／（約１０μ、／θ〜）、ＢＳＡ（／　Ｍ９
／ＩＩｌ、　！；　ｔｉ　）　、水（２９ｕ／　）　、
　ＢａｍＨＩ　〔水でｌニゲに希釈〕制限酵素（／メ）
および反応液１（ｊ４）を３７℃で７５分間インキュベ
ートした。

４Ｚ　Ｍ酢酸アンモニウム（約ｊθＩｄ）オよ（１９３
％エタノール（２θθＩｉりを加えて反応を停止し。

得られたＤＮＡの沈澱を７０％エタノールで２回洗浄し
、真空乾燥して、水（２θ１１１）に懸濁した。

秦ＢａｍＨＩ制限酵素用の反応液は以下の組成で調製し
た。

７３　Ｍ　　　ＮａＣ１ ６θｍＭ　　　トリｙ、−ＨＣ１，ｐＨ７９６θｒｎ　
Ｍ　　ＭｇＣｌ　２ Ｂ、プラスミドＰＢＲ３，２ユの垣ＨＩ消化所望の消化
は、ＨｉｎｄｌＩ［制限酵素の代りにＢａｍＨＩ制限酵
素を用いることを除いては、実施例ユＢと本質的に同じ
操作で行なった。消化したプラスミドｐＢＲ３２２は水
（，２９ｉ）に懸濁した。

＼ ・・・　　　　　　Ｃ，ＢａｍＨＩ部分的消化されたプ
ラスミドｐＬＲ／オヨびＢａｍＨＩ消化されたプラスミ
ドｐＢＲ３２２の連結 所望の連結は実施例２Ｃと本質的に同じ操作で行なった
。得られた連結したＤＮＡをＴＥ緩衝液に懸濁した。こ
れは所望のプラスミドｐ」ダであつた。

実施例７ Ｅ、コ！Ｊ　Ｋ／２　ＨＢ１０／／ｐＬＲ１ｉ（Ｄ構成
所望の構成は、プラスミドＰＬＲ，２の代りにｐＬＲｑ
を用いて形質転換することを除いては、実施例３と本質
的に同じ操作で行なった。生き残ったコロニーを選別し
、予想表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅ　ｔ”）がどうかを試験
した。これは所望の被形質転換体Ｅ、コリに／２　ＨＢ
１０／／ｐＬＲ１ｔであっｔ二。

実施例！ Ａ、プラスミドＰＬＲ，２のシュＨＩ消化および／６ｋ
ｂのチオストレプトン耐性伝達フラグメントの単離 ブラフ、　２　ｔ’　ＰＬＲ，２ＤＮＡ　（約３０ｐｇ
）、反応液Ｃｌ０ｐｌ）、ＢＳＡＣ／Ｉｌｆ／Ａｔ、１
０ｉｄ’）、水（コ９ＩＪｌ）およびＢａｍＨＩ制限酵
素（グユニット／Ｉｌｌ。

／ｌｉ）を３７°Ｃで２時間インキュベートした。等量
の＆Ｍ酢酸アンモニウムおよびｘ、ｓ容量の９！％エタ
ノールを加えて、−２０″Ｃで約／ざ時間冷却してＤＮ
Ａを沈澱させた。ＤＮＡの沈澱を遠心分離で採取し、Ｔ
Ｅ緩衝液（約ｊθｌｄ）に懸濁した。所望の／乙ｋｌ）
のＢａｍＨＩ制限フラグメントをＤＮＡの懸濁液からゲ
ル電気泳動による常法で単離した。単離に続いて、フラ
グメントをＴＥ緩衝液（約２θＩｄ）に再懸濁し、以後
の連結に用いた。

Ｂ５プラスミドｐＥＬ　／θ３のＢａｍＨ１部分的消化
プラスミドｐＥＬ　／θ３ＤＮＡ（約２０ｐｙ”）、反
応液（１０Ｉｉｌ’）　、　ＢＳＡ（／ＷＩＡ１．１０
メ）、水（３９μ）およびＢａｍＨＩ制限酵素〔酵素２
Ｉを水ざＩで希釈して調製〕（／Ｊｉ）を室温で約７５
分間インキュベートした。等量の＆Ｍ酢酸アンモニウム
およびｊ容量の９ｊ％エタノールを加えて。

−２θ℃で約／！時間冷却してＤＮＡを沈澱させた。こ
のＤＮＡの沈澱を遠心分離で採取し、７０％エタノール
で洗浄し、真空乾燥して、ＴＥ緩衝液（約ｊθｐりに懸
濁した。

Ｃ６連結 部分的に消化されたプラスミドｐＥＬ　／θ３ＤＮＡ（
約２０ｐｇ）、プラスミドｐＬＲ，２の／乙ｋｌ、のＢ
ａｍＨＩ制限フラグメノト（／θ〜）、連結液（！；ｔ
ｉ）　、　ＢＳＡ（／”９Ｚｗ１．３；メ）、水（／θ
μ）およびＴ４ｔＤＮＡ！Ｊガーゼ（／メ）から成る混
合液を約／６°Ｃで約９時間インキュベートした。ゲＭ
酢酸アンモニウム（１７Ｉｉｌ）および冷エタノール（
２００ＩＪｌ）を加えｆ：（Ｄち、−２０”ＣＴ−約／
ざ時間冷却してＤＮＡを沈澱させた。このＤＮＡの沈澱
を遠心分離で採取し、７０％エタノールで洗浄し、再び
採取して、培地Ｐ　（Ｈｏｐｗｏｏｄ　ａｎｄＷｒｉｇ
ｈｔ／９７ざ、　ＪｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇ
ｅｎｅｒａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　／乙、２：３０
７〕（ｊＯｄ　）に懸濁し２次の形質転換に用いた。

可能なｐＥＬ　／　０３制限フラグメントのいずれが１
１に’ｂのＢ　ａ　ｍ　ＨＩチオストレプトン耐性伝達
フラグメントに連結するかによって少なくとも２タイプ
の組み替えプラスミドが得られる。かくして。

プラスミドｐＦ：、Ｌ１０３のユ♂ｋｂのＢａｍＨＩ制
限フラグメントに連結すると、４１１ｋｂのプラスミド
であるｐ比１０７およびｐＥＬ　／　０　！；が得られ
。

／９９ｋｂのハユＩＩフラグメント（直鎖状ｐＥＬｐＥ
Ｌ　／　０３はチオストレプトン耐性フラグメントを挿
入し得るＢａｍＨＩ制限部位を３箇所有するので、プラ
スミドｐＥＬ　／　０　／およびｐＥＬ１０ゲの挿入部
位の違いによる異性体もできる。１ｌｋｂのＢｍｍＨＩ
耐性伝達フラグメントは２方向のどちらの方向にも配位
できるので、２方向の組み替えプラスミドが生じる。プ
ラスミドｐＥＬ　／θ７およびｐＥＬ　／θＳならびに
プラスミドｐＥＬ／θざおよびｐＥＬ　／　０４Ｚの各
々の制限部位と機能地図をそれぞれ添付図の第５図およ
び第６図に示す。

当業者ならば、プラスミドＤＥＬ１０Ｊ（７）ＢａユＨ
Ｉ部分的消化により、互いｌζ連結できまた７つ以上の
耐性伝達ＤＮＡフラグメントとも連結できる種々の制限
フラグメントが混成して幾つかの更に別の組み替えプラ
スミドが生成することは当然理解し得るところである。

２．、♂　ｋｂの複製開始点食［ＢａｍＨＩフラグメン
トを含む更に別のプラスミドはいずれも機能性であり、
かくして２本発明を例示する。前述した更に別のプラス
ミドは常法により適当な宿主細胞に移入したのち制限酵
素およびゲル電気泳動分析により同定できる。

実施例ワ ／θグの構成 実施例ｆＣで得たＤＮＡ（約２θＩｉｇ）およびストレ
プトマイセス・アムボファシェノスの／×１０’個のプ
ロトプラスト〔該菌株は、イリノイ州ペオリアにあるノ
ーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌｎｂｏ　−１ａ４ｏｒｙ　）に寄託され永久保存菌株
となっており。

寄託番号ＮＲＲＬ２１Ａ２θの下にそこがら誰でも入手
できる〕を用いて、所望の構成をインターナショナル・
バプリケーション（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ７９
／′０θθ９ｊ内）黒ｗｏ７９１０　／　／　Ａ　９　
、実施例ユと実質的に同じ操作で行なった。所望の被形
質転換体は、再生プロトプラストを、プレート上の最終
濃度がｊθＩＪ４ｙｌｌとなるに充分な量のチオストレ
プトンを含むＲ２培地上部寒天（Ｒ，２ｍｅｄｉｕｍｔ
ｏｐ　ａｇａｒ　）　（Ｒ２培地はＴ（ｏｐｗｏｏｄ　
ａｎｄ　Ｗｒ　ｉｇｈｔ　。

／９７Ｊ’　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　／６．２　：３Ｑに記載さ
れている〕で覆うことにより、チ　／オストレプトン耐
性かどうかで選別した。得られおヨヒＳ、アムボファシ
エンス／　ＰＥＬ　／　ＯＩＩのチオストレプトン耐性
のコロニーを既知方法に従って採取し、培養して、構成
するプラスミドの制限酵素および電気泳動分析による常
法で同定した。

実施例／θ Ａ、プラスミドｐＬＲ／のＢａｍ　ＨＩ消化および３１
ｋｂのネオマイシン耐性伝達フラグメントの単離所望の
消化および単離は実施例どＡと実質的に同じ操作で行な
う。３＆ｋｂのＢａｒｎＨｒ制限フラグメントをＴＥ緩
衝液（約２０４）に懸濁して次の連結に用いる。

、Ｂ、連結 Ｊｌｋｂのネオマイシン耐性伝達ＢａｍＨＩ制限フラグ
メントをＢａｍ　ＨＩ部分的消化したプラスミドｐＥＬ
１０３〔実施例ざＢで調製〕と、実施例ざＣと実質的に
同じ操作で連結する。

ｐＥＬ　／θ３の存在し得る制限フラグメントのいずれ
が３ｕｋｂのネオマイシン耐性伝達ルヮＨｌフラグメン
トを連結するか１こよって少なくとも２タイプの組み替
えプラスミドが生じる。かくして。

プラスミドｐＥＬ　／　０３の２ざｋｂのＢａｍＨＩ制
限フラグメントと連結すると、　４．、）　ｋｂのプラ
スミドであるｐＥＬ　／　０９およびｐＥＬ／１０を生
じ。

／９５’ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント（直鎖状ｐＥＬ
１０３）と連結す□名と２３３ｋｂのプラスミドである
ＰＥＬ／／／およびｐＥＬ／／、２を生じる。また。

プラスミドｐＥＴ、　／　０３は、ネオマイシン耐性伝
達フラグメントを挿入し得るＢａｍＨＩ制限部位を３箇
所有するので、プラスミドＰＥＬ／／／おヨヒｐＥＬ／
／２の挿入部位の違いによる異性体もできる。３．１ｌ
ｋｂの耐性伝達Ｂａｍ　ＨＩフラグメノトは二方向のど
ちらの方向にも配位し得るので、２方向の組み替えプラ
スミドが生じる。プラスミドＰＥＬ／　ｏｑオヨｏ：ｐ
Ｅｒ、／／　ｏすらヒｔＣプラスｚドｐＥＬ　／　／　
／およびｐＥＬ／／、２の各々の制限部位と機能地図を
それぞれ添付図の第７図および第ｇ図に示す。

当業者には、実施例ざＣに記載したようＥこ、２ざｋｂ
の複製開始点含有シュＨＩフラグメントを含む更に別の
組み替えプラスミドが上記の方法で再生できることは当
然理解し得るところである。これらのプラスミドは機能
性でかくして本発明を更に例示する。上述の更に別のプ
ラスミドは常法で移入して、制限酵素およびゲル電気泳
動分析により同定できる。

実施例／／ ｐＥＬ／　０９　、Ｓ、７Ａボフ７’ｉｘノス／ｐＥＬ
／　／　０　。

実施例１０で得たＤＮＡ（約２０〜）およびストレプト
マイセス・アムボファシェノス（ＮＲＲＬＡ　２４’　
２０　）の／×１０　個のプロトプラストを用いて、所
望の構成を、インターナショナル・パブリケーション（
国際特許出願番号ＰＣＴ／Ｇ　Ｂ　７９１０００９３内
）ＡＷＯ７９１０／＃９．実施例２と実質的（こ同じ操
作で行なう。所望の被形質転換体は、再生したプロトプ
ラストを、プレート上の最終濃度が／ｐｙ１１となるの
に充分な量のネオマイジノを含むＲ２培地上部寒天で覆
うこと１こより、ネオマイシン耐性かどうかで選別する
。

得られるストレプトマイセス・アムボファシェンス／ｐ
ＥＬ１０９．ｓ、アムホファシェンス／ｐＥＬ／／θ、
Ｓ、アムボファシエンス／Ｉ）ＥＬ／／／およびＳ、ア
ムボファシエンス／ｐＥＬ／／２のネオマイシン耐性コ
ロニーを既知方法で採取し、構成するプラスミドの制限
酵素および電気泳動分析による常法で同定する。

秦抗生物質ネオマイシンはミズーリ州、セントルイスｌ
こあるシグマ社（Ｓｉｇｍａ）から入手できる。

実施例／２ プラスミドｐＥＬ／／３およびｐＥＬ／／４’の構成プ
ラスミドｐＥＬ／θ７をストレプトマイセス・アムボフ
ァシェンス／ｐＥＬ１０７Ｃ実施例９で調製〕から実施
例／の方法に従って単離し、実施例ざＢと実質的に同じ
操作でＢａｍＨＩ制限酵素で部分的消化する。このＢａ
ｍ　Ｈ１部分的消化物を実施例ざＣと実質的に同じ操作
で、プラスミドｐＬＲ／の３．Ｉ／−ｋｂのネオマイシ
ン耐性伝達Ｂａｍ　ＨＩフラグメント〔実施例１０Ａで
調製〕と連結すると、−所望のプラスミドを生じる。プ
ラスミドｐＥＬ／θ７はネオマイシン耐性伝達フラグメ
ントを挿入し得るＢａｍＨＩ制限部位を２箇所有するの
で、プラスミドｐＢＬ／／３およびｐＥＬ　／　／　ｇ
の挿入部位の違いによる異性体もできる。３．’Ｉｋｂ
のネオマイシン耐性伝達シェＨＩフラグメントは２方向
のどちらの方向にも配位し得るので２方向の組み替えプ
ラスミドが生じる。プラスミドｐＥＬ　／　／　３およ
びＰＥＬ／／ｇの各々の制限部位と機能地図を添付図の
第９図に示す。

実施例／３ ／／’ｌの構成 実施例／２で得たＤＮＡ（２０ＩＪ９）およびストレプ
トマイセス・アムボファシェンス（ＮＲＲＬＡ２グ２θ
）の／×／θ　個のプロトプラストを用いて。

所望の構成は、インターナショナル・パブリケーション
（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ７９／θ００９ｊ内）
＆ＷＯ７９１０／／Ａ９．実施例ユと実質的に同じ操作
で行なう。所望の被形質転換体は、前述の実施例りおよ
び／／に記載した方法で、まずｒオストレプトン耐性か
どうかで選別し９次にネオマイシン耐性かどうかで選別
する。得られるストレプトマイセス・アムボフ歩シエン
ス／ｐＥＬ／／３おヨヒＳ、　　アムボファシエンス／
ＰＥＬ／／ｑノチオストレプトンおよびネオマイシン耐
性コロニーを既知方法で採取し、構成するプラスミドの
制限酵素および電気泳動分析による常法で同定する。

実施例／ｌ プラスミドｐＥＬ／／ｊおよびｐＥＬ／／乙の構成所望
のプラスミドは、プラスミドｐＥＬ１０７の代りにプラ
スミドｐＥＬ／θｊを用いてＢａｍ　ＨＩ　部分的消化
を行なうことを除いては、実施例／２と実質的に同じ操
作で構成する。プラスミドｐＥＬ／θｊはネオマイシン
耐性伝達フラグメントを挿入し得るＢａｍ　ＨＩ制限部
位を２箇所有するので。

プラスミドｐＥＬ　／　／　ｊおよびｐＥＬ／＃の挿入
部位の違いによる異性体もできる。３３ｋｂのネオマイ
シン耐性伝達ＢａｍＨＩフラグメントは２方向のどちら
の方向にも配位し得るので、２方向の組み替えプラスミ
ドが生じる。プラスミドＰＥＬ／／３；およびｐＥＬ　
／　／　Ａの各々の制限部位と機能地図を添付図の第１
θ図に示す。

実施例／ｊ ／／６の構成 実施例／ｑで得たＤＮＡ（ユ０ｐｙ）を用いて。

所望の構成を実施例／３と本質的に同じ操作で行なう。

得られるストレプトマイセス・アムボファシエンス／　
ＰＥＬ／　／　ｓおよヒＳ、アムボファノエンスｐＥＬ
　／　／　ｇのチオストレプトンおよびネオマイシン耐
性コロニーを既知方法で採取し、構成するプラスミドの
制限酵素および電気泳動分析による常法で同定する。

実施例／６ 所望のプラスミドは、プラスミドｐＥＬ　／　０７およ
びｐＥＬ　／θｊの代わりにプラスミドｐＥＬ　／θざ
およびｐＥＬ　／θグをそれぞれ用いてＢａｍＨＩ部分
的消化することを除いては、実施例／２および／ゲと実
質的に同じ操作でそれぞれ構成する。まｔこ、プラスミ
ドｐＥＬ１０ざおよびｐＥＬ／θゲはネオマイシン耐性
伝達フラグメントを挿入し得るＢａｎ　ＨＩ制限部位を
３箇所含有するので、プラスミドｐＥＬ７　／　７　、
　ｐＥＬ　１ハｒ、ｐＥＬ／／９およびｐＥＬ　７２０
の挿入部位の違いによる異性体もできる。、Ｒ＃ｋｂの
ネオマイシン耐性伝達ＢａｍＨＩフラグメントは２方向
のどちらの方向にも配位し得るので、２方向の組み替え
プラスミドが生じる。

プラスミドＰＥＬ　／　／　７およびｐＥＬ／／ｊｒｊ
！らヒ＋ＣプラスミドｐＥＬ／／りおよびｐＥＬ　／　
２０の各々の制限部位と機能地図をそれぞれ第１／図お
よび第１２図に示す。

実施例／７ 実施例／ｌで得られるプラスミドｐＦ、Ｌ／／７゜ｐＥ
Ｌ／／Ｊ’、　ｐＥＬ／／９およびｐＥＬ　／　２０　
（７）ＤＮＡ混合物（約２０ｔｑｔ＞を、実施例／３お
よび／Ｓと本質的に同じ操作で、それぞれストレプトマ
イセス・アムボファシェンスに移入スル。得うレルスト
レプトマイセス・アムボファシェンス／ｐＥＬ／／７．
ｓ、アムホファシエンス／ｐＥＬ／／すＩｓ・アムボフ
ァシェンス／ｐＡ／ｙｑおよヒｓ、アムボファシェンス
／　ｐＥＬ　／　２θのチオストレプトンおよびネオマ
イシン耐性コロニーを既知方法で採取し、構成するプラ
スミドの制限酵素および電気泳動分析による常法で同定
する。

実施例／（５′ プラスミド・キメラｐＥＬ　／２　／およびＰＥＬ／、
２．２の構成 所望のプラスミド・キメラは、プラスミドｐＥＬ／θ７
のシ、ｍＨ１部分的消化物を、実施例ざＣと実質的に同
じ連結方法で、　Ｂａｍ　ＨＩ消化したプラスミドｐＢ
Ｒ３２２に連結して得られる。プラスミドＰＥＩ、１０
７を実施例／と実質的に同じ操作でストレプトマイセス
・アムボファシエンス／　ｐＥＬ／θ７〔実施例９で調
製〕がら単離し、実施例ざｈの方法でＢａｍＨＩ部分的
消化する。ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＲ３２２
は、制限酵素としてＨｉｎｄｌｌ［０代わりにＢａｍＨ
Ｉを用いることを除いては、実施例２Ｂと実質的に同じ
方法で調製する。

所望のプラスミド・キメラＤＮＡを遠心分離により採取
し７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥したのちＴＥ緩
衝液（ｊθｌｔりに懸濁する。また。

プラスミドｐＥＬ　／　０７は被制限プラス２ドｐＢＲ
３２２を挿入し得るシッＨＩ制限部位を２箇所有するの
で、プラスミドｐＥＬ　／ユ／およびＰＥＬ／、２２の
挿入部位の違い番こよる異性体もできる。制限プラスミ
ドＰＢＲ３，２２は二方向のどちらの方向にも配位し得
るので、２方向の組み替えプラスミドが生じる。ｐＥＬ
　／　、２　／およびｐＥＬ　／　ｕ　２の各々の制限
部位および機能地図を添付図の第７３図に示す。

実施例／９ 所望の構成は、プラスミドＰＬＲ，２の代わりにプラス
ミドｐＥＬ　／　、２　／およびｐＥＬ　／　２２を用
いて形質転換することを除いては、実施例３と実質的に
同じ操作で行なう。生き残ったコロニーをまず選別し、
予想表現型（ＡｍｐＲ，ＴａＬ８）かどうかを試験し、
構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析
による常法で、所望の被形質転換体Ｅ。

コリに／、２　　ＨＢ／θ／／ｐＥＬ／２／およびＥ、
コリに／、２ＨＢ　１０／／　ＰＥＬ／　２２トＬ／　
”？−同定ｔ　ル。

実施例２０ ／２２の構成 所望の構成は、プラヌベドｐＥＬ／θ７　、　ｐＥＬ／
　Ｏｊ　、　ｐＰ２Ｌ／　ＯＩオヨヒｐＥＬ／　０４ｔ
（Ｄ代わり１こプラスミドＰＥＬ　／　２　／およびｐ
ＥＬ７２２を用いて形質転換することを除いては実施例
９と実質的に同じ操作で行なう。得られる被形質転換体
を上述の実施例？で記載した方法によりチオストレプト
ン耐性かどうかで選別する。かくして構成したチオスト
レプトン耐性のストレプトマイセス・アムボファシエン
ス／　ＰＥＬ　／　２　／およびＳ、アムボファシエン
ス／ｐＥＬ／２２のコロニーを既知方法で採取し、構成
するプラスミドの制限酵素および電気泳動分析による常
法で同定する。

実施例２／ プラスミドｐＦＪ　／　２　’ｌの構成Ａ、プラスミド
ｐＥＬ　／　０．５”のル■ＨＩ（部分的）および貼±
Ｉ消化 プラスミドｐＥＬ　／θ５ＤＮＡ（約ユ０ｔｎｉ）、反
応液（／θＩＪり、ＢＳＡ（／■／ｍ１．／θＨ）、水
Ｃ３９ｔｄ）および沖１（Ｉ制限酵素（／メ）〔酵素２
４を水ｇｔ、ｔで希釈したもの〕を室温で約７５分間イ
ンキュベートした。等量の４ＺＭ酢酸アンモニウムおよ
びユ容量の９ｑ％エタノールを加えたのち、−ユθ°Ｃ
で約７ｇ時間冷却してＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡの沈
澱を遠心分離により採取し。

７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥してＴＥ緩衝液（
約２θμ）に懸濁した。Ｂｅ１１反応液１（約５ｐｌ）
、ＢＳＡ（／ｗｇ／ｍ／、１０ｍ）、水（３９Ｉ）およ
びト↓１制限酵！（／ｍ）にューイングランド・バイオ
・ラブ・ユニットで過剰量含有〕を加えたのち、混合液
をｓｏ”ｃで約６０分間インキュベートした。等量のＱ
Ｍ酢酸アンモニウムおよびｊ容量の９３％エタノールを
加えて一２０℃で約７１時間冷却してＤＮＡを沈澱させ
た。ＤＮＡの沈澱を遠心分離により採取し、７０％エタ
ノールで洗浄し、真空乾燥したのち、ＴＥ緩衝液（約！
θ１．１）に懸濁した。

１１ＢｅｌＩ制限酵素用の反応液は以下の組成で調製し
ｔこ。

７３θｍＭ　　　　ＫＣｌ ６θｍＭ　　）リス−塩酸、ｐＴ（７ｇｌθＯｍＭ　　
ＭｇＣｌａ ７０ｍＭ　　ジチオスレイトール ＢＪ結 部分的消化されたＤＮＡプラスミドｐＥＬ　／θｊ（約
２０ｐ９）、連結液（！；ｐｌ）、ＢＳＡ　（／■／ｍ
ｌ、！；メ）、水Ｃｌ０ｔｔ！’）およびＴｌＤＮＡリ
ガーゼ（／メ）を約／６℃で約１時間インキュベートし
た。４Ｍ酢酸アンモニウム（１１，Ｏｄ）および冷エタ
ノール＜２００ｔｄ’）を加えたのち、混合液を一コθ
°Ｃで約７ｇ時間冷却してＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡ
の沈澱を遠心分離により採取し。

７０Ｑｆｉエタノールで洗浄し、再び採取して、Ｐ培地
（！；Ｏｔ！りに懸濁して次の形質転換に用いた。

当業者ならば、プラスミドｐＥＬ　／　０　、！；の部
分的ＢａｍＨＩおよびＢｃｌＩ消化によって、それ自身
と連結し得るまたは互いに連結し得る種々のフラグメン
トが混成して、幾つかの更に別のプラスミドが生成する
ことは、理解し得るところである。所望のプラスミドｐ
ＦＪ　／　ｕ　＆は、前述の更に別のプラスミドと共に
、適当な宿主細胞に移入して、制限酵素およびゲル電気
泳動分析による常法で同定できる。

所望の構成は、実施例♂Ｃの代わりに実施例ツ／で得た
ＤＮＡを用いることを除いては、実施１例９と本質的に
同じ操作で行なった。得られたチオストレプトン耐性被
形質転換体コロニーを既知方法で採取し、培養して、構
成するプラスミドの制限酵素および電気泳動分析による
常法で同定した。所望の被形質転換体ストレプトマイセ
ス・アムボファシエンス／　ＰＦＪ　／　２ｑを培養し
て、その後のプラスミドｐＦＪ　７２１１の既知方法に
よる製造と単離に用いた。〜ｌｌ０ｋｂのプラスミドｐ
ＦＪ／２１１の制限部位地図を添付図の第１ｑ図に示す
。

実施例２３ プラスミドｐＦＪ／＆ゲおよびｐＦＪ　／　＆　ｊの構
成Ａ、プラスミドｐＦＪ　／　２μのＢａｍ　ＨＩ消化
消化は、プラスミドｐＬＲ２の代りにブラフ、ミドｐＦ
Ｊ　／　２ゲを用いることを除いては、実施例ＪＡと本
質的に同じ操作で行なう。得られるＤＮＡの沈澱をＴＥ
緩衝液（約５ｏｔｉ）に懸濁して、所望の触Ｈ１消化物
を得た。

Ｂ、連結 ３、！ｋｂのネオマイシン耐性伝達シュＨＩ制限フラグ
メント〔実施例ＩＯＡで調製〕を、実施例／Ｃと本質的
に同じ操作で、　Ｂａｍ　ＨＩ消化したプラスＥ　）’
　ｐＦＪ／　２’ｌと連結した。、９．４Ｚｋｂの耐性
伝達Ｂａｎ　ＩＩフラグメントは２方向のどちらの方適
当な宿主細胞に移入して制限酵素およびゲル１気泳動分
析により同定できる。

実施例２４ｔ ／＆５の構成 所望の構成は、実施例／θで得たＤＮＡの化オリに実施
例ユ３で得たＤＮＡを用いることを除しては、実施例／
／と実質的に同じ操作で行なう。

得うれるストレプトマイセス・アムボファシェース／ｐ
ＦＪ／１ｉｌｌおよびＳ、アムボファシェンス／ｐＦＪ
　／　ｇ　ｊのネオマイシン耐性コロニーを既知フ法で
採取し、チオストレプトン耐性かどうがでゐ験し、構成
するプラスミドの制限酵素およびゲル１気泳動分析によ
る常法で同定する。得られる著形質転換体を常法で培養
して、その後のプラスミ々の制限部位地図を添付図の第
１ゲ図に示す。

Ｒ実施例２ｊ プラスミドｐＦＪ　／　ｕ　、４の構成所望の構成は、
消化が部分的であることおよびプラスミドｐＥＬ　／　
０３；の代わりにプラスミドｐＦＪ／４ｔｘｔを用いる
ことを除いては、実施例２／と実質的に同じ操作で行な
う。得られるＤＮＡの沈澱）　　　を遠心分離により採
取し、７０％エタノールで洗浄し、再び採取して、培地
Ｐ（５０ｍ）に懸濁してその後の形質転換に用いる。プ
ラスＥドｐＦＪ／グ６の制限部位地図を添付図の第１ｊ
図に示す。

実施例、２６ む 所望の構成は、実施例１０で得たＤＮＡの代ゎε　　　
りにプラスミドｐＦＪ　／　４Ｚ　、４を用いることを
除いては、実施例／／と本質的に同じ操作で行なう。

実施例コ２ ？　　プラスミドｐＦＪ　／　４１ニアの構成Ａ、Ｅ、
：ｌ！Ｊ　、！ｒ０３／ｐＩＪｑ３（Ｄ培養およびプラ
スミドｐｒ、ｒｇ３の単離 所望（７）　Ｅ、ｌ　＋Ｊ　、ｆ　／７３／　ｐＩＪ　
１１３　（ＡＴＣＣ３９／３６）の培養およびそれに続
くプラスミドｐＩＪｌｔ３の単離は共に、　Ａ、Ｍａｎ
ｕａｌ　Ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ　。

Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　〕と実質的に同じ操作
で行なう。得られるｐＩＪゲ３ＤＮＡを常法でＴＥ緩衝
液に懸濁して一２０″Ｃで冷却して保存する。

Ｂ、フラ’ニア、　Ｅ　）’　ｐｒＪ　’７３　（Ｄ〜
２７　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ−Ｂｇｌ■フラグメントの消化
および単離 所望の消化は、プラスミドｐＥＬ　／　０３　、　Ｂａ
ｍ　ＨＩ制限酵素および反応液の代わりにプラスミドｐ
ＩＪ１１３、ジ１ユＩ制限酵素および反応液０を用い、
■工制限酵素および反応液の代わりに痴↓■制限酵素お
よび反応液０を用いることを除いては、実施例ユ／と実
質的に同じ操作で行なう。また、５ａｌｌ消化は部分的
であった。得られる５ａｌＪ　−ＢＢｑ■フラグメント
を分取し、アガローズ（ａｇａｒｏｓｅ　）ゲル電気泳
動（Ｄａｖｉ　ｓ　、　ＲｏＷ、ｅｔ　ａｌ、、　／　
９Ｊ’θ）によるＣ、プラスミドｐＦＪ　２ＩＩのＢａ
ｍ　ＨＩおよび部分的む」■消化 プラスＦ、　）’　ｐＦＪ／ｕ４ｔＤＮＡ　（約２０ｐ
ｇ）　、　ＢＳ　Ａ　（／　１１１１１／ｘ１．　／θ
ｌ）、水（３９ｔｉ　）　、　ＢａｒｎＨＩ　制ｍＷＩ
ｇ（／／−／）Ｃニューイノグランド°バイオ・ラフ・
ユニットで過剰量含有〕および反応液（／θ４）を３７
°Ｃで６θ分間イノキュベートしたのち、ｔｊ″Ｃで７
０分間培養して、９°Ｃまで冷却した。ここに、死リュ
Ｉ反応液”Ｃｌ０ｐｌ’）およびＳｉｌ■制限酵素（／
ｌｄ）ロニュ〜イングラノド・バイオ・ラブ・ユニット
で過剰量含有〕を補添して、再び３７°Ｃで約１０分間
インキュベートした。等量のｌＡＭ酢酸アンモニウムお
よび２容！（７）９５％１り）−ルを加えたのち、−，
２０″Ｃで約＃時Ｍ冷却してＤＮＡを沈澱させた。この
ＤＮＡの沈澱を遠心分離により採取し、７０％エタノー
ルで洗浄し、真空乾燥して、ＴＥ緩衝液（約ｊ。

ｐりに懸濁した。

壷ハ土工制限酵素用の反応液は以下の組成で調製１３　
　Ｍ　　　　ＮａＣ１ ６０ｍＭ　　）リス−塩酸、　ｐＨ７９６θｍＭ　　Ｍ
ｇＣら ＡＯｍＭ　　β−メルカプトエタ・ノール／　１８９／
ｌｅｌ　　Ｂ　Ｓ　Ａ 軸回１ユ■制限酵素用の反応液は以下の組成で調製した
。

Ｑ　、ｌ、　Ｍ　　　ＮａＣ１ ７００ｍＭ　トリス−塩酸、ｐＨ７，ｇ／　００　ｍ　
ＭＭｇＣｌ　ｘ ／θθｍＭ　　β−メルカプトエタノール／■７’ｍｌ
　　Ｂ　Ｓ　Ａ Ｄ、連結 プラスミドｐＩＪｌ１３の〜２７ｋｂジリュＩ−１■フ
ラグメントを、実施例１ｒＣと実質的に同じ操作でブラ
フ、６ドｐＦＪ／２’ｌのＢａｍＨＩ一部分的ハユニ消
化物に連結した。得られたＤＮＡの沈澱を遠心分離によ
り採取し、７０％エタノールで洗浄し、再び採取して、
培地Ｐ（ｔＯｍ／）に懸濁してその後の形質転換に用い
ｔコ。プラスミドｐＦＪ実施例２ｇ 所望の構成は、実施例ざＣで得たＤＮＡの代わりにプラ
スミドｐＦＪ／１１７ｃ実施例２７で調製〕を用いるこ
とを除いては、実施例９と実質的に同じ操作で行なった
。所望の被形質転換体は、プレート上の濃度が３；　０
　／ＪＪｙ４１となるに充分な量のエリスロマイシンを
含有するＲ２培地上部寒天で、再生したプロトプラスト
を覆うことにより、エリスロマイシン耐性かどうかで選
別した。得られたエトレプトマイセス・アムボファシェ
ンス／　ｐＦＪ／ゲ７であった＼。このことは、構成す
るプラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動分析による
常法で確認した。

実施例２９ Ａ、プラスミドｐＩＪ＆Ｊの恒す１部分的消化所望の消
化は、プラスミドｐＬＲ／およびＢａｍＨＩ制限酵素お
よび反応液の代わりにプラスミドｐＩＪゲ３および５ａ
ｌＩ制限酵素および反応液を用いることを除いては、実
施例ｔと実質的に同じ操作で行なった。得られた）１■
部分的消化したフラグメントを分取し、アガローズ・ゲ
ル電気泳動による常法で単離した。所望のジリエフラグ
メントは〜２ざｋｂであった。

Ｂ、プラスミドｐＦＪ　／　２　ｌｔのシリ２１部分的
消化所望の消化は、プラスミドＰＬＲ／　、　１３ａｒ
ｌ　ＨＩ　制限酵素および反応液の代わりにプラスミド
ｐＦＪ／　２ｕ　、　Ｓａｌ　Ｉ制限酵素および反応液
を用いることを除いては、実施例６と実質的に同じ操作
で行なった。得られたＩ）ＮＡの沈澱を遠心分離により
採取し、７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥して、Ｔ
Ｅ緩衝液（約ｊθ４）に懸濁した。

Ｃ１連結 プラスミドｐＩＪｌ／−３の〜Ｑｆ　ｋｂのＳａ　ｌ　
エフラグメントを、実施例♂Ｃと実質的に同じ操作で。

プラスミドｐＦＪ　／　２　”の５ａｌｉ部分的消化物
に連結した。得られたＤＮＡの沈澱を遠心分離により採
取し、７０％エタノールで洗浄し、再び採取して、培地
ＰＧ３；０ｔｄ）に懸濁して次の形質転換に用いた。

〜２．ざｋｂの５ａｌＪフラグメントは二方向のどちら
の方向にも配位し得るので、２方向の組み替えプラスミ
ドが生しる。プラス２ドｐＦＪ　／　４ｔ、？およびｐ
ＦＪ　／　ｌ＠　９は常法て適当な宿主細胞に移入して
制限酵素およびゲル電気泳動分析により同定できる。

実施例３θ ／ｇ９の構成 所望の構成は、実施例ＩｒＣで得たＤＮＡの代りに実施
例、２９Ｃで得ｆ：　Ｄ　Ｎ　Ａを用いることを除いて
は、実施例９と本質的に同じ操作で行なった。

所望の被形質転換体は、再生したプロトプラストを、プ
レート上の濃度が！；　Ｏｐｙ／ｍｌとなるのに充分な
量のエリスロマイシンを含むＲ２培地上部寒天で覆うこ
とにより、エリスロマイシン耐性かどうかで選別した。

得られたストレプトマイセス・アムボファシエンス／　
ｐＦＪ　／　１１ＦおよびＳ、アムボファシエンス／ｐ
Ｆ：Ｉ／ｌ１９のエリスロマイシン耐性コロニーを既知
方法で採取し、培養し、チオストレプトン耐性かどうか
を試験して、構成するプラスミドの制限酵素およびゲル
電気泳動分析による常法で同定した。所望の被形質転換
体を常法で培養シてそノ後のプラスミドｐＦＪ／１ｔＪ
ｆおよびｐＦＪ付図の第１乙図に示す。

実施例３１ へプラスミドＰＢＴｔ？２２およびｐＦＪ　／　４’　
７のシ見ＨＩ消化 所望の消化は、ＨｉｎｄＩ［Ｉ制限酵素および反応液の
代わりにＢａｍ）［制限酵素および反応液を用いること
を除いては、実施例ＪＢと実質的に同じ操作で行なう。

町連結 ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＲＪＪＪおよびｐＦ
Ｊ　／　ｇ　７を連結するには実施例♂Ｃと実質的に同
じ操作で行なう。所望のプラスミド・キメラＤＮＡを遠
心分離で採取し、７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥
してＴＥ緩衝液（ｓｏｔｔｔ）に懸濁する。制限された
プラスミドＰＢＲ３２，２，はコ方向のどちらの方向に
も配位し得るので、２方向の組み替えプラスミドが生じ
る。プラスミドｐＦＪ／！；０および、ｐＦＪ　／　ｊ
　／は、常法で適当な宿主細胞に移入して制限酵素およ
びゲル電気泳動分析により同定できる。

実施例３２ 所望の構成は、プラスミドｐＥＬ／２／およびｐＥＬ／
２２の代わりにプラスミドＰＦＪ　／　ｊθおよびｐＦ
Ｊ　／　ｊ　／を用いることを除いては、実施例１９と
実質的に同じ操作で行なう。生き残ったコロニーを、ま
ず選別し予想表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅｔ８）かどうかを
試験して、構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電
気泳動分析による常法で所望の被形質転換体Ｅ、コリに
／２　ＨＢ／θ／／ｐＦＪ／３θおよびＥ、コリに／２
　ＨＢ／θ／／ＰＦＪ／　ｊ　／として同定する。

プラスミドｐＦＪ　／　ｊθおよびｐＦＪ　／　！；　
／の各々の制限部位地図を添付図の第７６図に示す。

実施例３３ 所望の構成は、実施例１Ｃで得たＤＮＡの代わりにプラ
スミドｐＦＪ　／　３θ〔実施例３２で得たＥ。

コリに／２　ＨＢ１０／／ｐＦＪ／！；０から常法で単
離〕を用いることを除いては、実施例９と実質的に同じ
操作で行なう。

実施例３ゲ 所望の構成は、実施例ＩＣで得たＤＮＡの代わりにプラ
スミドＰＦＪ　／　３　／　Ｃ実施例３２で得たＥ。

：ｌ　ＩＪ　Ｋ／２　ＨＢ１０／／ｐＦＪ／！；／カラ
常法”１ｌｆｉ　〕ヲ用いることを除いては、実施例ワ
と実質的に同じ操作で行なう。

前述の操作に従って構成する代表的プラスミドおよび被
形質転換体は、以下の表／および表２に示すとおりであ
る。

（以下余白） 表　　　２ ＣＪＪ下余白）

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＥＬ１０３の制限部位と機能地図
を示す。第２図はプラスミドｐＬＲ／の制ｆｆｉ部位と
機能地図を示す。第３図はプラスミドｐＬＲ，２の制限
部位と機能地図を示す。第９図はプラスミドｐＬＲ＆の
制限部位と機能地図を示す。第５図はプラスミドｐＥＬ
１０７およびｐＥＬｌｏｊの制限部位と機能地図を示す
。第６図はプラスミドｐＥＬ１０１およびｐＥＬｌｏｇ
の制限部位と機能地図を示す。 第７図はプラスミドｐＥＬ＃７９およびＰＥＬｌｌＯの
制限部位と機能地図を示す。第１図はｐＥＬ／／／およ
びｐＥＬ／／２の制限部位と機能地図を示す。 第９図はプラスミドｐＥＬ／／３およびｐＥＬ／／４Ｌ
の制限部位と機能地図を示す。第１θ図はプラスミドｐ
Ｅ　Ｌ／　／　！；およびｐＥＬ／／乙の制限部位と機
能地図を示す。第１１図はプラスミドｐＥＬ／／７およ
びｐＥＬ／／ざの制限部位と機能地図を示す。 第７２図はプラスミドｐＥＬ／／９およびｐＥＬ／ｒの
制限部位と機能地図を示す。第７３図はプラスミドｐＥ
Ｌ／、２／　およびｐＥＬ／λ２の制限部位と機能地図
を示す。第１ｇ図はプラスミドｐＦＪ／２’ｌ。 ｐＦＪ／ＩｎおよびｐＦＪｌｌｌ！；の制限部位地図を
示す。第１５図はプラスミドｐＦＪ／１１６およびｐＦ
Ｊ／ｌｔ７の制限部位地図を示す。第１６図はプラスミ
ドＰＦＪ／４！Ｊ、ｐＦＪ／４ｉ、ｐＦＪ／ｊ；θおよ
びｐＦＪＩ！；／の制限部位地図を示す。 第１図 第２図 第３図 第ｑ図 は冷ＲＩ ａｍＨＩ 第　　５　　図 ＥＬ１０７ ＥＬ１０５ 第６図 ｐａｔｔｏｅ 第７図 一工１０・ 第ｇ図 ａｔ１１１ ｐ区Ｌ１１２ 第９ｔＡ ＥＬ１１３ ＥＬ１１４ 第１０図 ｐｔｔ１１５ 第１／図 ｐｌＥＬ１１？ 第　　７２　図 ＥＬ１２０ 第　　／３　　図 ｐ！Ｌ１２１ ｐ！Ｌ１２２ 第　　ｕ　図 農１ ｐＦＪＩ調 第　　７５　　区 ＦＪ１４７ 第　　１６　　図 ７１））Ｊｌり１ 第１頁の続き ■Ｉｎ’ｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番”／
ＣＩ２　Ｒ１／２９ １／３６５ １／４４ １、／４６５ 優先権主張　♀１９８２年８月２日３米国（ＵＳ）３工
・４０４０８２ ＠発　明　者　ウオルター・エム・ナカツカサアメリカ
合衆国インティアナ州 インディアナポリス・クロスマ ン・ドライブ２１１８番地 ■発　明　者　、マーク・エイ・リチャードソンアメリ
カ合衆国インディアナ州 インディアナポリス・ニゲレッ ト・レーン・アフトＡ３０２１番地 ０発　明　者　ジエイムズ・エイ・メイプアメリカ合衆
国インディアナ州 インディアナポリス・リトル・ オーク・レーン７４１０番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａ）プラスミドｐＥＬ　／θ３の複製の機能性開
   始点含有制限フラグメント、および ｂ）形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主
   細胞に移入したとき、少なくとも１つの抗生物質に対す
   る耐性を伝達する１つ以上のＤＮＡ断片 を含む組み替えＤＮＡクローニング・ベクター。 （２）　ｐＥＬ　／　０３の制限フラグメントが、ｌ、
   ｆｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントである特許請求の
   範囲（１）記載のクローニング・ベクター。 （３）　ｐＥＬ　／　０３の制限フラグメントが１５！
   ９ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントである特許請求の
   範囲（１）記載のクローニング・ベクター。 （４）１つ以上のＤＮＡ断片がチオストレプトン。 ネオマイシンおよびエリスロマイシンの１つ以上の抗生
   物質に対する耐性を伝達する特許請求の範囲（１）　、
   　（２）または（３）記載のクローニング・ベクター。 （５）チオストレプトンに対する耐性を伝達するＤＮＡ
   断片がプラスミドｐＬＲ、ｌの１６ｋｂのＢａｍＨＩ制
   限フラグメントである特許請求の範囲（４）記載のクロ
   ーニング−ベクター。 （６）ネオマイシンに対する耐性を伝達するＤＮＡ断片
   がプラスミドｐＬＲ／の、１ＱｋｂのＢａｍＨＩ制限フ
   ラグメントである特許請求の範囲（４）記載のクロ−ニ
   ング・ベクター。 （７）プラスミドｐＥＬ　／　０　！；またはｐＥＬ　
   ／　０７である特許請求の範囲（２）および（５）記載
   のクローニング・ベクター。 （８）プラスミドｐＥＬ　／　０，９またはｐＥＬ　／
   　／　０である特許請求の範囲（２）および（６）記載
   のクローニング・ベクター。 （９）プラスミドｐＥＬ／　／　３　、　ｐＥＬ、／　
   ／　ｔｌ、　、　ＰＥＬｉ１ｓまたはｐＥＬ　／　／　
   Ａである特許請求の範囲（２）。 （５）および（６）記載のクローニング・ベクター。 顛プラスミドｐＥＬ　／θｌまたはｐＥＬ　／θ！であ
   る特許請求の範囲（３）および（５）記載のベクター。 ０１）プラスミドｐＥＬ　／　／　／またはｐＥＬ　／
   　／　２である特許請求の範囲（３）および（６）記載
   のクローニング、ベクター。 αのプラスミドｐＥＬ　／　／　７　、　ｐＥＬ　／　
   ／　Ｉｒ、　ｐＥＬ／／９またはＰＥＬ／、２θである
   特許請求の範囲（３）。 （５）および（６）記載のクローニング・ベクター。 α３ＤＮＡ断片がチオストレプトンに対する耐性を伝達
   する。プラスミドｐＦＪ／２’ｌまたはｐＦＪ／９／で
   ある特許請求の範囲（４）記載のクローニング・ベクタ
   ー。 Ｑ４１ＤＮＡ断片がチオストレプトンおよびネオマイシ
   ンに対する耐性を伝達する。プラスミドｐＦＪ／ダ＃　
   、　ｐＦＪ／　ｑ５　、　ｐＦＪ／ダ乙またはｐＦＪ　
   ／３２である特許請求の範囲（４）記載のクローニング
   ・ベクター。 α５ＤＮＡ断片がチオストレプトンおよびエリスロマイ
   シンに対する耐性を伝達する。プラスミドｐＦＪ／す７
   　、　ｐＦＪ　／　４’ざ、ｐＦＪ／≠？またはｐＦＪ
   ＩＳ９である特許請求の範囲（４）記載のクローニング
   ・ベクター。 ００）プラスミドｐＥＬ　／　０３の複製の機能性開始
   点含有制限フラグメント ｂ）形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主
   細胞に移入したとき、少なくとも７つの抗生物質に対す
   る耐性を伝達する７つ以上のＤＮＡ断片、および ｃ’）Ｅ、コリ・プラスミドの０機能性レプリコンを含
   有し、かつ抗生物質耐性を伝達する制限フラグメント を含む二機能性組み替えＤＮＡクローニング・ベクター
   。 ＱηＥ、コリ・プラスミドがプラスミドｐＢＲ３，２２
   である特許請求の範囲αＱ記載のクローニング・ベフタ
   −。 （至）プラスミドｐＥＬ　／　２　／またはｐＥＬ　／
   　２２である特許請求の範囲αη記載のクローニング・
   ベクタＯ ０呻プラスミドｐＦＪ　／　７９またはｐＦＪ　／ざＯ
   である特許請求の範囲αカ記載のクローニング・ベクタ
   １１ＤＮＡ断片がチオストレプトンに対する耐性を伝達
   する。プラスミドｐＦＪ　／　！；　３またはｐＦＪ／
   Ｓ６である特許請求の範囲ＯＱまたはａカ記載のクロー
   ニング・ベクター。 ■ｐＤＮＡ断片がチオストレプトンおよびネオマイシン
   に対する耐性を伝達する。プラスミドｐＦＪ／ｊグ、　
   ｐＦＪ／！；３　、　ｐＦＪ／３７またはｐＦＪ／ｊ；
   ♂である特許請求の範囲ＯＱまたはＱ７）記載のクロー
   ニング・ベクター。 （イ）ＤＮＡ断片がチオストレプトンおよびエリスロマ
   イシンに対する耐性を伝達する。プラスミドｐＦＪ　／
   　、ｉｏ、　ｐＦＪ／　！；Ｉ　、　ｐＦＪ／　１，０
   　、　ｐＦＪ／ｇ／ｐＦＪ　／　１．２　、　ｐＦＪ　
   ／　６３　、　ｐＦＪ　／　７７またはｐＦＪ／７１ｒ
   である特許請求の範囲ＯＱまたはαη記載のクローニン
   グ・ベクター。 ＠＆）プラスミドｐＥＬ　／θ３の複製の機能性開始点
   含有制限フラグメント、および ｂ）形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主
   細胞に移入したとき、少なくとも１つの抗生物質に対す
   る耐性を伝達する７つり上のＤＮＡ断片 を含む組み替えＤＮＡクローニング・ベクターを有する
   被形質転換宿主細胞。 （ハ）ａ）プラスミドｐＥＬ　／θ３の複製の機能性開
   始点含有制限フラグメント。 ｂ）形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主
   細胞に移入したとき、少なくとも７つの抗生物質に対す
   る耐性を伝達する７つ以上のＤＮＡ断片、および ｅ）Ｅ、コリ・プラスミドの６機能性レプリコンを含有
   し、かつ抗生物質耐性を伝達する制限フラグメント を含む二機能性組み替えＤＮＡクローニング・ベクター
   を含む被形質転換宿主細胞。 （ハ）ストレプトマイセス、ストレプトスポランジウム
   、アクチノプランズ、ノカルディア、マイクロモノスポ
   ラ、バチルスまたはスタフィロコッカス属の無制限細胞
   である特許請求の範囲（ハ）または（ハ）記載の被形質
   転換宿主細胞。 （ホ）ストレプトマイセス属の種、フラジアエ、コエリ
   コロール、アムボファシエンスまたはグラヌロラバーで
   ある特許請求の範囲（ハ）記載の被形質転換宿主細胞。 （イ）無制限ストレプトマイセス属の好ましくはアムボ
   ファシエンス種である特許請求の範囲（ハ）記載の被形
   質転換宿主細胞。 （ハ）Ｋコリである特許請求の範囲（ハ）記載の被形質
   転換宿主細胞。 翰感受性宿主細胞に移入されたとき少なくとも７つの抗
   生物質に対する耐性を伝達する１つ以上のＤＮＡ断片と
   プラスミドｐＥＬ　／θ３の複製の機能性開始点含有制
   限フラグメントとを連結し、得られる組み替えＤＮＡを
   自己連結させてクローニング・ベクターを製造すること
   から成る組み替えＤＮＡクローニング・ベクターの製造
   法。 （１）ｐＥＬ／θ３の制限フラグメントがＱＪ’ｋｂの
   ＢａｍＨＩ制限フラグメントである特許請求の範囲四記
   載の方法。 （８１）ｐＥＬ　／　０３の制限フラグメントが／９９
   ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメントである特許請求の範
   囲四記載の方法。 （：！２．）抗生物質耐性を伝達する１つ以上のＤＮＡ
   断片がチオストレプトン、ネオマイシンおよびエリスロ
   マイシンのうちの１つ以上に対する耐性を伝達する断片
   である特許請求の範囲Ｈ、（３０）または（３１）記載
   の方法。 （３３）チオストレプトンに対する耐性を伝達するＤＮ
   Ａ断片がプラスミドｐＬＲ２の７４ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈ１
   制限フラグメントである特許請求の範囲（３２）記載の
   方法。 （３４）ネオマイシンに対する耐性を伝達するＤＮＡ断
   片がプラス、ミドｐＬＲ／の３グｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ制
   限フラグメントである特許請求の範囲（３２）記載の方
   法。 （８５）プラスミドｐＬＲ，２のｌ　４ｋｂ　ＢａｍＨ
   Ｉ制限フラグメントとプラスミドｐＥＬ　ｆ　０３のＱ
   ＩｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメントとを連結することか
   ら成るプラスミドｐＥＬ　／　ＯｊまたはｐＥＬ１０７
   を製造する特許請求の範囲（３０）および（３３）記載
   の方法。 （８６）プラスミドｐＬＲ／またはｐＬＲｌｌｔの３！
   ｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメントとプラスミドｐＥＬ　
   ／θ３の、ｌＪ’　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメント
   とを連結することから成るプラスミドｐＥＬ　／θ９ま
   たはｐＥＬ／１０を製造する特許請求の範囲（３０）お
   よび（３４）記載の方法。 （３７）プラスミドｐＬＲ，２のｌ　６ｋｂＢａｍＨＩ
   制限フラグメントおよびプラスミドｐＬＲ／のｌ　４ｎ
   ｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントとプラスミドｐＥＬ　
   ／　０３のＱ　Ｉ　ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ制限フラグメン
   トとを連結することから成るプラスミドｐＥＬ／／３　
   、／／Ｉ１．／／！；または／／乙を製造する特許請求
   の範囲（３０）、（３３）および（３４）記載の方法。 （３８）プラスミドＰＬＲ２のｉ　４ｋｂ　ＢａｍＨＩ
   制限フラグメントとプラスミドｐＥＬ　／　０３の／９
   ９ｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメントとを連結することか
   ら成るプラスミドｐＥＬ　／　ＯｇまたはｐＥＬ　／　
   Ｏｒを製造する特許請求の範囲（３１）および（３３）
   記載の方法。 （３９）プラスミドｐＬＲ／のｌ　ＩＡ　ｋｂ　Ｂａｍ
   ＨＩ制限フラグメントとｐＥＬ　／　０３の／９９ｋｂ
   のＢａｍＨＩ制限フラグメントとを連結することから成
   るプラスミドｐＥＬ　／　／　／またはｐＥＬ　／　／
   　２を製造する特許請求の範囲（３１）および（ａ４）
   記載の方法。 （４０）プラスミドＰＬＲ２のｉ　４ｋｂＢａｍＨＩ制
   限フラグメントおよびプラスミドｐＬＲ／の３．　りｋ
   ｂ　Ｂａｒｎ）（Ｉ／／７　、　ｐＥＬ／　／１．　ｐ
   ＥＬ／／９またはｐＥＬ　／　２０を製造する特許請求
   の範囲（３１）、　（３３）および（８４）記載の方法
   。 （４１）プラスミドｐＥＬ　／　０　！のＢａｍＨＩ部
   分的消化物とプラスミドｐＥＬ１０！；のＢｃＪ、ｌ完
   全消化物とを連結することから成るプラスミドＰＦＪ　
   ／　、２　’＋を製造する特許請求の範囲一乃至（３２
   ）記載の方法。 （４２）プラスミドｐＦＪ　／　２　’ｉのＢａｍＨＩ
   消化物とプラスミドｐＬＲ／の３＃ｋｂＢａｍＨＩフラ
   グメントとを連結することから成るプラスミドｐＦＪ　
   ／　４＜　’４およびＰＦＪ　／　４＜　３を製造する
   特許請求の範囲（２９）乃至（３２）記載の方法。 （４８）プラスミドｐＦＪ　／　４（４’のＢａｍＨＩ
   およびＢａｔ　１部分的消化物を自己連結させることか
   ら成るプラスミドｐＦＪ　／　４Ｚ　、！りを製造する
   特許請求の範囲（２９）乃至（３２）記載の方法。 （４４）プラスεドｐＩＪグ３の２７ｋｂＳａｊ！Ｉ　
   　Ｂｇｌ■フラグメノトとグラスミドｐＦＪ　／　２　
   ’ＩのＢａｍＨＩ一部分′的Ｓａ７！Ｉ消化物とを連結
   することから成るプラスミドｐＦＪ／’Ｉ−７を製造す
   る特許請求の範囲（２９）乃至（３２）記載の方法。 （４５）プラスミドｐＩＪ≠３の５ａ７１１部分的消化
   物とプラスミドＰＦＪ　／　２４１の５ａｉ１部分的消
   化物とを連結することから成るプラスミドｐＦＪ　／　
   ｔｌＪおよびｐＦＪ　／　Ｖ　９を製造する特許請求の
   範囲（２９）乃至（３２）記載の方法。 （４６）　＆）グラスミドｐＥＬ　／　０３の複製の機
   能性開始点含有制限フラグメント。 ｂ）形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主
   細胞に移入したとき、少なくとも７つの抗生物質に対す
   る耐性を伝達する１つ以上のＤＮＡ断片、および ｃ）Ｆ４コリ・プラスミドの１機能性レプリコンを含有
   し、かつ抗生物質耐性を伝達する制限フラグメント を連結し、得られた組み替えＤＮＡを自己連結させてク
   ローニング・ベクターを形成することから成る二機能性
   組み替えＤＮＡクローニング・ベクターの製造法。 （４７）Ｅ、コリ・プラスミドがプラスミドｐＢＲ３２
   ２である特許請求の範囲（４６）記載の方法。 （４８）プラスミドｐＥＬ　／　０７のＢａｍＨＩ部分
   的消化物とＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＲ３２２
   とを連結することから成る三機能性プラス２ドｐＥＬ／
   ２／またはｐＥＬ　／ユ２を製造する特許請求の範囲（
   ４７）記載の方法。 （４９）プラスミドＰＢＲ３２２のＢａｍＨＩ消化物と
   プラスミドｐＦＪ　／　ｇ　７のＢａｍＨＩ消化物とを
   連結することから成るプラスミドｐＦＪ　／　３；０ま
   たはｐＦＪ　／　３　／を製造する特許請求の範囲（４
   ６）または（４７）記載の方法。 （５ｏ）プラスミドｐＥＬ　／θ３゜ （５１）プラスＥ□ドｐＥＬ　／θ３の２ｇｋｂＢａｍ
   ＨＩ制限フラグメント。 （５２）プラスミドｐＥＬ　／θ３の／　９．９ｋｂ　
   ＢａｍＨＩ制限フラグメント。 （５３）ストレプトマイセス・グラヌロラバーｍＡ３９
   ９／２．／３ＮＲＲＬ／２３１１９を深部通気培養の条
   件下に同化できる炭素源、窒素源および無機質を含有す
   る栄蓋培地でｐＨ３−９，／ｊ″ｃ−ｔｉｏ°Ｃの温度
   で培養して得られる細胞を採取し、溶解して。 溶解物の上清を溶媒抽出し、抽出物からプラスミドＤＮ
   Ａを沈澱させ、沈澱からプラスミドｐＥＬ／θ３を分離
   することから成るグラ４εドｐＥＬ１０３の単離方法。