JPS5879997A - ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するプラスミドｐＥＬ７および関連クロ−ニング・ベクタ− - Google Patents
ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するプラスミドｐＥＬ７および関連クロ−ニング・ベクタ−Info
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- JPS5879997A JPS5879997A JP57184415A JP18441582A JPS5879997A JP S5879997 A JPS5879997 A JP S5879997A JP 57184415 A JP57184415 A JP 57184415A JP 18441582 A JP18441582 A JP 18441582A JP S5879997 A JPS5879997 A JP S5879997A
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- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ひにプラスミドＩ）Ｉ！：ｌ−７の制限フラグメントお
よび抗生物質耐性を伝達する１つ以」−のＩ） Ｎ Ａ
断片を含むもう１つのプラスミドを含む、新規な１組の
組み替えＤ Ｎ Ａクローニング・ベクターに関する。
よび抗生物質耐性を伝達する１つ以」−のＩ） Ｎ Ａ
断片を含むもう１つのプラスミドを含む、新規な１組の
組み替えＤ Ｎ Ａクローニング・ベクターに関する。
本発明は、史に上記の１組のベクターの被形ｔ！を転換
体に関する。
体に関する。
本発明は、ストレプトマイセス属およびその類縁宿主細
胞に使用する抗生物質耐性伝達クローニング・ベクター
を提供する。これまで、−１−記の微生物における組み
替えｌ） Ｎ Ａ技術の発展および開発は、クローニン
グ・ベクターに遺伝上の選択され得るマー−ｈ−か一股
に存在しないことから、遅れ特に困難なものになってい
た。本発明のベクターはストレプトマイセス属および他
の宿主菌において機能性であり選択され得るので、当技
術分野における重大な進歩を示すものである。
胞に使用する抗生物質耐性伝達クローニング・ベクター
を提供する。これまで、−１−記の微生物における組み
替えｌ） Ｎ Ａ技術の発展および開発は、クローニン
グ・ベクターに遺伝上の選択され得るマー−ｈ−か一股
に存在しないことから、遅れ特に困難なものになってい
た。本発明のベクターはストレプトマイセス属および他
の宿主菌において機能性であり選択され得るので、当技
術分野における重大な進歩を示すものである。
本ベクターは可転性（ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ）であり
、耐性が伝達される抗生物質に感受性であるストレプト
マイセス属菌細胞に移入でき選別され得るので特に有益
である。臨床上重要な抗生物質の殆んどかストレプトマ
イセス属菌株により製造されるので、この産業上有用な
菌群に適用し得るクローニング系およびベクターを開発
することは特に望ましいことである。本発明は、このよ
うなベクターを提供し、かくして、新規抗生物質および
抗生物質誘導体を製造すると共に既知抗生物質の収率を
七けるためにストレプトマイセス属菌に遺伝子をクロ−
ニングできる。
、耐性が伝達される抗生物質に感受性であるストレプト
マイセス属菌細胞に移入でき選別され得るので特に有益
である。臨床上重要な抗生物質の殆んどかストレプトマ
イセス属菌株により製造されるので、この産業上有用な
菌群に適用し得るクローニング系およびベクターを開発
することは特に望ましいことである。本発明は、このよ
うなベクターを提供し、かくして、新規抗生物質および
抗生物質誘導体を製造すると共に既知抗生物質の収率を
七けるためにストレプトマイセス属菌に遺伝子をクロ−
ニングできる。
本発明はストレプトマイセス属宿主細胞にＩ）ＮＡをク
ローニングするための媒体を提供すると共に被形質転換
体を簡便に選別することを可能にする。
ローニングするための媒体を提供すると共に被形質転換
体を簡便に選別することを可能にする。
形質転換は非常に低い頻度でしか起こらないので、この
ような機能試験は何ば万という細胞の中でどの細胞かプ
ラスミドＤＮＡを得たかを決定するのに実質上必要であ
る。このことは、非選別性の１）ＮＡ配列がベクターに
挿入され得て、形質転換後そのベクターおよび特定の必
要な］） Ｎ Ａ配列を含む細胞を適当な抗生物質選別
法で採取し得るので重要である。
ような機能試験は何ば万という細胞の中でどの細胞かプ
ラスミドＤＮＡを得たかを決定するのに実質上必要であ
る。このことは、非選別性の１）ＮＡ配列がベクターに
挿入され得て、形質転換後そのベクターおよび特定の必
要な］） Ｎ Ａ配列を含む細胞を適当な抗生物質選別
法で採取し得るので重要である。
本明細蕾で開示し記載した本発明の目的のために、次の
用語を以上に記載する。
用語を以上に記載する。
組み替えＩ） Ｎ Ａクローニング・ベクター−・自発
的に複製するものであって、１つ以上の別の１３ＮＡ断
片を加え得るかまたは加えたＩ） Ｎ Ａ分子を含有す
るプラスミドがその範囲内に含まれるか、これに限定さ
れるわけではない。
的に複製するものであって、１つ以上の別の１３ＮＡ断
片を加え得るかまたは加えたＩ） Ｎ Ａ分子を含有す
るプラスミドがその範囲内に含まれるか、これに限定さ
れるわけではない。
形質転換−遺伝型を変化させその結果受容株細胞に安定
な遺伝し得る変化を生じさせる、受容株宿主細胞へのＩ
） Ｎ Ａの導入。
な遺伝し得る変化を生じさせる、受容株宿主細胞へのＩ
） Ｎ Ａの導入。
被形質転換体−形質転換された受容株宿主細胞。
感受性宿主細胞−ある抗生物質の存在士では、その抗生
物質に対する耐性を伝達するｌ） Ｎ Ａ断片が存在し
ないので生育できない宿主細胞。
物質に対する耐性を伝達するｌ） Ｎ Ａ断片が存在し
ないので生育できない宿主細胞。
制限フラグメントーあるプラスミドに１つ以上の制限酵
素が作用してできるプラスミドの線状部分または全部。
素が作用してできるプラスミドの線状部分または全部。
機能面での依存（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｙ Ｄｅｐ
ｅｎｄｅｎｔ）＝プラスミドの複製および１つ以上の抗
生物質に対する耐性を形質表現させるのに別の異なるプ
ラスミドが必要である状態 挿入部位の違いによる異性体−１） Ｎ Ａフラグメン
トが受容株のｌ） Ｎ Ａの２つ以上の適当な部位の１
つに挿入されでできる２つ以上の可能な組み替えＤ Ｉ
’Ｊ Ａ分子の１つ。
ｅｎｄｅｎｔ）＝プラスミドの複製および１つ以上の抗
生物質に対する耐性を形質表現させるのに別の異なるプ
ラスミドが必要である状態 挿入部位の違いによる異性体−１） Ｎ Ａフラグメン
トが受容株のｌ） Ｎ Ａの２つ以上の適当な部位の１
つに挿入されでできる２つ以上の可能な組み替えＤ Ｉ
’Ｊ Ａ分子の１つ。
プラスミドｐＬＲ２の１．５ｋｂμ叩ＨＩ制限フラグメ
ント−プラスミドｐＵ６に含有される１、５ｋｂのチオ
ストレプトン耐性伝達ＩＳａｍｌ−１１フラクメントと
同じもの プラスミドｐＬＲ１またはｐ ＬＲ４の３，４ｋｂ艷ｙ
）ＨＩ 制限フラグメント−プラスミドｐｌＪ２に含有
される３、 ４ ｋｂのネオマイシン耐性伝ａ ＋Ｓ−
ッ１１１フラグメントと同じもの プラスミドｐＬＲ］の３．５ ｋｂ ｊ’４ｔ ｌ
制限フラグメント−プラスミドｐｌＪ２に含有された３
、 ５ ｋｂのネオマイソン耐性伝達Ｐｓｔｌフラグメ
ントと同じもの。
ント−プラスミドｐＵ６に含有される１、５ｋｂのチオ
ストレプトン耐性伝達ＩＳａｍｌ−１１フラクメントと
同じもの プラスミドｐＬＲ１またはｐ ＬＲ４の３，４ｋｂ艷ｙ
）ＨＩ 制限フラグメント−プラスミドｐｌＪ２に含有
される３、 ４ ｋｂのネオマイシン耐性伝ａ ＋Ｓ−
ッ１１１フラグメントと同じもの プラスミドｐＬＲ］の３．５ ｋｂ ｊ’４ｔ ｌ
制限フラグメント−プラスミドｐｌＪ２に含有された３
、 ５ ｋｂのネオマイソン耐性伝達Ｐｓｔｌフラグメ
ントと同じもの。
ＡｍＰＲ−アンピンリン耐性！２）表現型。
Ｅ”ｅｔ” −テトラサイクリン感受性の表現型。
Ｔｈ１ｏＲ−チオストレプトン耐性の表現を。
Ｎｅ０Ｒ−ネオマイシン耐性の表現型。
本発明は、ストレプトマイセス・アムホファ／エンス／
ｐＥＩ−７（ＮＩＵＲＩ、１−２５２３）を深部通気
培養の条件士に同化できる炭素源、室索源および無機質
を含有する栄養培地でｐｌ−１５〜９の範囲内で１５〜
４５°Ｃの範囲の７Ｍ Ｋで培養して得られる細胞を採
取し、溶解して、溶解物の」−清を溶媒抽出し、抽出物
からプラスミドｌ） Ｎ Ａを沈澱させ、沈澱物からプ
ラスミドｐＥＬ７を分離することから成るプラスミドｐ
ＥＬ７の単離方法を提供する。
ｐＥＩ−７（ＮＩＵＲＩ、１−２５２３）を深部通気
培養の条件士に同化できる炭素源、室索源および無機質
を含有する栄養培地でｐｌ−１５〜９の範囲内で１５〜
４５°Ｃの範囲の７Ｍ Ｋで培養して得られる細胞を採
取し、溶解して、溶解物の」−清を溶媒抽出し、抽出物
からプラスミドｌ） Ｎ Ａを沈澱させ、沈澱物からプ
ラスミドｐＥＬ７を分離することから成るプラスミドｐ
ＥＬ７の単離方法を提供する。
本発明は更に、感受性宿主細胞に移入したとき少なくと
も１つの抗生物質に対する耐性を伝達する１つ以上の異
なるＤＮＡ断片をプラスミドｐＥＩ、７の制限フラグメ
ントと連結し得られる組み替えＤＮＡを自己連結させて
当該機能依存型プラスミドを製造することを含む、機能
面でプラスミドｐＥＩ−７に依存したプラスミドの製造
方法を提供する。
も１つの抗生物質に対する耐性を伝達する１つ以上の異
なるＤＮＡ断片をプラスミドｐＥＩ、７の制限フラグメ
ントと連結し得られる組み替えＤＮＡを自己連結させて
当該機能依存型プラスミドを製造することを含む、機能
面でプラスミドｐＥＩ−７に依存したプラスミドの製造
方法を提供する。
本発明は、また、上記の１組のベクターの被形質転換体
を包含する。
を包含する。
本発明のベクターは、１つ以上の抗生物質耐性伝達１）
Ｎ Ａ断片をプラスミドｐＥＬ７の制限フラグメント
と連結することにより構成する。制限フラグメントを与
えるプラスミドｐＥＬ７は、約１０．９ｋｂ で、分子
クローニングに特に適した幾つかの制限部位を有してい
る。本発明の耐性伝達ベクターは機能面でプラスミドｐ
ＥＩ、７に依存しているので、種々の異なるｐＥＬ ７
制限フラグメントは、非依存性の機能には影響を与える
ことなく構成に用い得る。かくして、クローニング・ベ
クターとして直接的に有用であるプラスミドルｌ礼１．
７は、本発明を構成しまた実行するのに不可欠である。
Ｎ Ａ断片をプラスミドｐＥＬ７の制限フラグメント
と連結することにより構成する。制限フラグメントを与
えるプラスミドｐＥＬ７は、約１０．９ｋｂ で、分子
クローニングに特に適した幾つかの制限部位を有してい
る。本発明の耐性伝達ベクターは機能面でプラスミドｐ
ＥＩ、７に依存しているので、種々の異なるｐＥＬ ７
制限フラグメントは、非依存性の機能には影響を与える
ことなく構成に用い得る。かくして、クローニング・ベ
クターとして直接的に有用であるプラスミドルｌ礼１．
７は、本発明を構成しまた実行するのに不可欠である。
プラスミドｐＦ、Ｉ−７の詳細な制限部位と機能地図を
添付図の第１図に示す。本明細酊の目的からして、第１
図を始めとする全ての図には目盛を記していない。
添付図の第１図に示す。本明細酊の目的からして、第１
図を始めとする全ての図には目盛を記していない。
プラスミドｐＥＩ−７は、常法によりストレプトマイセ
ス−アムボファシエ７ ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ
ａ＋ｎｂｎｆａｃｉｅｎｓ ） ／ ＰＩ！、１−７
Ｃ構成菌株は、イリノイ州ヘオリア（Ｐｅｏｒｉａ
）にあるノーザン・リーショナルーリサーチ・ラボラト
リ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）に寄託され保存菌株
となっている〕から単離できる。−１−記の寄株は、寄
託番号ＮＲＲＬ １２５２３の士に、−１−記プラスミ
ドの供給源および貯蔵庫として誰でも入手できる。
ス−アムボファシエ７ ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ
ａ＋ｎｂｎｆａｃｉｅｎｓ ） ／ ＰＩ！、１−７
Ｃ構成菌株は、イリノイ州ヘオリア（Ｐｅｏｒｉａ
）にあるノーザン・リーショナルーリサーチ・ラボラト
リ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）に寄託され保存菌株
となっている〕から単離できる。−１−記の寄株は、寄
託番号ＮＲＲＬ １２５２３の士に、−１−記プラスミ
ドの供給源および貯蔵庫として誰でも入手できる。
プラスミドｐＥＬ７の多種の制限フラグメントが構成さ
れ得るが、本明細書では例えは、１０．９ ｋｂμ１ｍ
１−１１およびｌ Ｏ，９ｋｂ Ｉ’ｓｔ Ｉ制限フラ
グメントが挙げられる。これらのフラグメントを１つ以
上の抗生物質耐性伝達ＤＮＡフラクメント（本明細書で
は例えば、プラスミドｌλ２のチオストレプトン耐性伝
達１．５ ｋｂ １３ａｍ ｉ−Ｉ Ｉ制限フラグメン
トおよびプラスミドｐＬＲ１のネオマイシン耐性伝達３
、５ ｋｂ Ｐｓｉ Ｉ制限フラグメントが挙けられる
）と連結して本発明を例示するベクターを形成する。
れ得るが、本明細書では例えは、１０．９ ｋｂμ１ｍ
１−１１およびｌ Ｏ，９ｋｂ Ｉ’ｓｔ Ｉ制限フラ
グメントが挙げられる。これらのフラグメントを１つ以
上の抗生物質耐性伝達ＤＮＡフラクメント（本明細書で
は例えば、プラスミドｌλ２のチオストレプトン耐性伝
達１．５ ｋｂ １３ａｍ ｉ−Ｉ Ｉ制限フラグメン
トおよびプラスミドｐＬＲ１のネオマイシン耐性伝達３
、５ ｋｂ Ｐｓｉ Ｉ制限フラグメントが挙けられる
）と連結して本発明を例示するベクターを形成する。
チオストレプトン耐性伝達フラグメントの供給源である
プラスミドｐＬＲ２は、約１．８．７ｋｂであり、Ｈｉ
ｎｄ Ｉｌｌ処理したプラスミドｐｌＪ６ ［Ｉ］’
ｈｏｍｐｓｏｎ ｅＬａｌ、、 １９８０ 、Ｎａｔｕ
ｒｅ ２８６ ： ５２５で開示されティる〕とμｎｄ
］ｌ［処理したプラスミドｐＢＲ３２２とを連結するこ
とにより構成する。ネオマイシン耐性伝達フラグメント
の供給源であるプラスミドｐＬＲ１は、約１４．８ｋｂ
であり、プラスミドｐｌＪ ６の代わりにプラスミドＰ
ＩＪ ２ ＣＴｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 １９
８０に開示されている〕を用いることを除いては、同様
に構成する。プラスミドｐＬＲ２およびｐＬＲｌは共に
Ｅ、コリにおいて機能性であるので、常法により、増殖
（ａｍｐｌ ｉｆｙ ）、単離でき、次の操作に用いる
ことかできる。プラスミドｐＬＲ４を生じる類似の構成
は、４四Ｉ−Ｉ Ｉ処理したプラスミドｐ’ＢＲ３２２
とＢａｍＨＩ処理したプラスミドｐＬＲ］を連結して行
なわれる。プラスミドｐｉ−Ｒ１、ｐｌ・１＜２ およ
びｐ ＬＲ４の各々の制限部位と機能地図をそれぞれ添
（＝Ｊ図の第２〜４図に示す。
プラスミドｐＬＲ２は、約１．８．７ｋｂであり、Ｈｉ
ｎｄ Ｉｌｌ処理したプラスミドｐｌＪ６ ［Ｉ］’
ｈｏｍｐｓｏｎ ｅＬａｌ、、 １９８０ 、Ｎａｔｕ
ｒｅ ２８６ ： ５２５で開示されティる〕とμｎｄ
］ｌ［処理したプラスミドｐＢＲ３２２とを連結するこ
とにより構成する。ネオマイシン耐性伝達フラグメント
の供給源であるプラスミドｐＬＲ１は、約１４．８ｋｂ
であり、プラスミドｐｌＪ ６の代わりにプラスミドＰ
ＩＪ ２ ＣＴｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 １９
８０に開示されている〕を用いることを除いては、同様
に構成する。プラスミドｐＬＲ２およびｐＬＲｌは共に
Ｅ、コリにおいて機能性であるので、常法により、増殖
（ａｍｐｌ ｉｆｙ ）、単離でき、次の操作に用いる
ことかできる。プラスミドｐＬＲ４を生じる類似の構成
は、４四Ｉ−Ｉ Ｉ処理したプラスミドｐ’ＢＲ３２２
とＢａｍＨＩ処理したプラスミドｐＬＲ］を連結して行
なわれる。プラスミドｐｉ−Ｒ１、ｐｌ・１＜２ およ
びｐ ＬＲ４の各々の制限部位と機能地図をそれぞれ添
（＝Ｊ図の第２〜４図に示す。
構成を簡便かつ容易にするために、チオストレプトン耐
性伝達１．５ ｋｂ ｌｓａｍ １１１フラグメントお
よびネオマイシン耐性伝達３．５ ｋｂ−Ｐｓｉ ｌフ
ラグメントをそれぞれプラスミドｐｌ’：ｆ−７の隣接
した即ｍ１ｌｌおよび尤５１１制限部位に挿入する。得
られる組み替えＤ Ｎ Ａを自己連結（５ｅｌｆ Ｉｉ
ｇａｒｉｏｎ ）させると本発明を例示するプラスミド
か生成する。１１１１人されたｌ） Ｎ Ａフラグメン
トの方向により２万回の組み換えプラスミドが生じる。
性伝達１．５ ｋｂ ｌｓａｍ １１１フラグメントお
よびネオマイシン耐性伝達３．５ ｋｂ−Ｐｓｉ ｌフ
ラグメントをそれぞれプラスミドｐｌ’：ｆ−７の隣接
した即ｍ１ｌｌおよび尤５１１制限部位に挿入する。得
られる組み替えＤ Ｎ Ａを自己連結（５ｅｌｆ Ｉｉ
ｇａｒｉｏｎ ）させると本発明を例示するプラスミド
か生成する。１１１１人されたｌ） Ｎ Ａフラグメン
トの方向により２万回の組み換えプラスミドが生じる。
かくして、プラスミドｐＥＬ７に、１，５ｋｂの井叩１
（Ｉフラグメントを挿入すると例示のプラスミドｐＥＩ
−７゜１およびｐＥＩ７．２を生じ、３．５ｋｂのｐｓ
ｔ Ｉ フラグメントを挿入するとプラスミドｐＥＩ、
７．３およびＰ目、７．４を生じ、両方の７ラグメント
を挿入すると例示のプラスミドｐＥＬ７，５ 、 ｐＥ
Ｌ７，５ 、 ｐＥＩ−７，７およびｐＥＩ−７，８を
生じる。
（Ｉフラグメントを挿入すると例示のプラスミドｐＥＩ
−７゜１およびｐＥＩ７．２を生じ、３．５ｋｂのｐｓ
ｔ Ｉ フラグメントを挿入するとプラスミドｐＥＩ、
７．３およびＰ目、７．４を生じ、両方の７ラグメント
を挿入すると例示のプラスミドｐＥＬ７，５ 、 ｐＥ
Ｌ７，５ 、 ｐＥＩ−７，７およびｐＥＩ−７，８を
生じる。
プラスミドｐＥＩ−７の種々の制限部位を１） Ｎ Ａ
断片を挿入するのに用い得る。従って、特定の抗生物質
耐性伝達１） Ｎ Ａ断片は１つの位置に限定されるの
ではなく、得られるプラスミドがプラスミドｐＥＬ７に
機能面で依存している限り種々の部位に挿入できる。
断片を挿入するのに用い得る。従って、特定の抗生物質
耐性伝達１） Ｎ Ａ断片は１つの位置に限定されるの
ではなく、得られるプラスミドがプラスミドｐＥＬ７に
機能面で依存している限り種々の部位に挿入できる。
本明細書で例示するチオストレプトンおよびネオマイシ
ン抗生物質耐性伝達１．） Ｎ Ａ断片は、それぞれプ
ラスミドＰＬＲ２およびｐＬＲｌの１．５ｋｌ）μ兜Ｈ
Ｉおよび３．５ ｋｂ Ｉ’ｓｔ Ｉ制限フラグメント
であるが、当業者ならば、チオストレプトンおよびネオ
マイシンに対する耐性を伝達する別のｌ） Ｎ Ａ ７
（片をそれぞれあるいは一緒に構成し使用できる。プラ
スミドＰＬｋ２の別のチオストレプトン耐性伝達ＤＮＡ
断片としては、例えば、１３ｋｂの＆銭Ｉ制限フラグメ
ント、および１．６ ｋｂ Ｒａｍ ｉ（Ｊ制限フラグ
メントのＢｃｌ Ｉサブフラグメントか挙けられる。
ン抗生物質耐性伝達１．） Ｎ Ａ断片は、それぞれプ
ラスミドＰＬＲ２およびｐＬＲｌの１．５ｋｌ）μ兜Ｈ
Ｉおよび３．５ ｋｂ Ｉ’ｓｔ Ｉ制限フラグメント
であるが、当業者ならば、チオストレプトンおよびネオ
マイシンに対する耐性を伝達する別のｌ） Ｎ Ａ ７
（片をそれぞれあるいは一緒に構成し使用できる。プラ
スミドＰＬｋ２の別のチオストレプトン耐性伝達ＤＮＡ
断片としては、例えば、１３ｋｂの＆銭Ｉ制限フラグメ
ント、および１．６ ｋｂ Ｒａｍ ｉ（Ｊ制限フラグ
メントのＢｃｌ Ｉサブフラグメントか挙けられる。
プラスミドｐＬｌ（ｌの史に別のネオマイシン耐性伝達
ＤＮＡ断片としては、例えは、３，４ｋｂのＩすｙす１
１制限フラクメント、および３，４ｋｂの１１；ｏｎ
ＩＩ Ｉ制限フラグメントの大きな方のＳａ（： ）
Ｋ１１１ＩＩザフフラクメントか挙けられる。クロラ
ノ・フェニコール、ハイグロマイシン、ヒオマイシン、
タイロシン、エリスロマイシンなとの同一あるいは異な
る抗生物質に対する耐性を伝達する更に別のｌ） Ｎ
Ａ断片も構成し使用できる。また、トー記の抗生物ｔ′
１酎性仏性伝達Ｎ Ａ断片の棟々の機能性誘導体もある
特定のヌクレオチドを付加、脱離または置換させること
により構成し得る。これらの誘導体または他の抗生物質
耐性伝達１） Ｎ Ａ断片を本明細書に例示した耐性伝
達１） Ｎ Ａ断片の代わりにブラスミｌｊ ｐｌ”王
７に連結しても、得られるプラスミドは本発明の範囲内
にある。
ＤＮＡ断片としては、例えは、３，４ｋｂのＩすｙす１
１制限フラクメント、および３，４ｋｂの１１；ｏｎ
ＩＩ Ｉ制限フラグメントの大きな方のＳａ（： ）
Ｋ１１１ＩＩザフフラクメントか挙けられる。クロラ
ノ・フェニコール、ハイグロマイシン、ヒオマイシン、
タイロシン、エリスロマイシンなとの同一あるいは異な
る抗生物質に対する耐性を伝達する更に別のｌ） Ｎ
Ａ断片も構成し使用できる。また、トー記の抗生物ｔ′
１酎性仏性伝達Ｎ Ａ断片の棟々の機能性誘導体もある
特定のヌクレオチドを付加、脱離または置換させること
により構成し得る。これらの誘導体または他の抗生物質
耐性伝達１） Ｎ Ａ断片を本明細書に例示した耐性伝
達１） Ｎ Ａ断片の代わりにブラスミｌｊ ｐｌ”王
７に連結しても、得られるプラスミドは本発明の範囲内
にある。
プラスミドｐＥＩ、７の制限フラクメンＩ・および種々
の抗生物質耐性伝達１） Ｎ Ａ断片は連結を容易にす
るように修飾し得る。例えは、分子−状の連結物質（ｌ
１ｎｋｅｒ ）を特定のプラスミドｐ ｌ’、 Ｌ７
制限フラクメントおよび特定の耐性伝達１） Ｎ Ａ断
片のとちらか一方または両方に付与する。かくして、次
の連結の際の特異的部位を都合良く構成し得る。またプ
ラスミドＰＥＩ、７およびその制限フラグメントもＤ
Ｎ Ａ連結の際の性質を変化ざぜ種々の制限部位を与え
るべくある特定のヌクレオチドを付加、脱離または置換
させることにより修飾し得る。当業者ならはヌクレオチ
ド化学と遺伝子コドンを理解し得るので、どのヌクレオ
チドが相互変換できどのＤ Ｉ’％ｌ Ａを修飾ずれは
特定の目的に望ましいものとなるかを理解し得る。
の抗生物質耐性伝達１） Ｎ Ａ断片は連結を容易にす
るように修飾し得る。例えは、分子−状の連結物質（ｌ
１ｎｋｅｒ ）を特定のプラスミドｐ ｌ’、 Ｌ７
制限フラクメントおよび特定の耐性伝達１） Ｎ Ａ断
片のとちらか一方または両方に付与する。かくして、次
の連結の際の特異的部位を都合良く構成し得る。またプ
ラスミドＰＥＩ、７およびその制限フラグメントもＤ
Ｎ Ａ連結の際の性質を変化ざぜ種々の制限部位を与え
るべくある特定のヌクレオチドを付加、脱離または置換
させることにより修飾し得る。当業者ならはヌクレオチ
ド化学と遺伝子コドンを理解し得るので、どのヌクレオ
チドが相互変換できどのＤ Ｉ’％ｌ Ａを修飾ずれは
特定の目的に望ましいものとなるかを理解し得る。
本ベクター（例えは、プラスミドｐｌ・、１．７および
例示のプラスミドｐＥＬ７．ｌ 、 ｐＥＬ７，２．
ｐｌｉＬ？、３ 、 Ｉ）Ｉ’：Ｉ−７，４、ｐＥＩ−
７，ｓ 、 ｐＥＩ−７，５、ｐｌ’ｌ−７，７および
Ｐ目、７．８）を１′、、コリ・プラスミドの機能性レ
プリコンを含有し抗生物質耐性を伝達する制限フラグメ
ント（例えは、プラスミドｐｌｓｒ（３２２，ｐｌｉＲ
３２４、ｐＢＲ３２５など）に連結して、Ｅ、コリおよ
びプラスミドＰト、１，７含有ストレプトマイセスの細
胞に使用する機能性プラスミドを生成し得る。これらの
構成（本明細書では、プラスミドｐＬＲ５およびｐＬＲ
（３が例示される）は、プラスミドの増殖および操作が
ストレプトマイセスよりもＩＬ、コリにおいてより速く
より簡便に行なえるので、特に有利である。かくして、
所望の組み替えＩ） Ｎ Ａ工程をｌ・；、コリ宿主糸
で行なったのち、特定のストレプトマイセスｌ） Ｎ
Ａを取り出し、プラスミドの形に再構成し、スＩ・レプ
トマイセス属またはその類縁宿主細胞に移入できる。
例示のプラスミドｐＥＬ７．ｌ 、 ｐＥＬ７，２．
ｐｌｉＬ？、３ 、 Ｉ）Ｉ’：Ｉ−７，４、ｐＥＩ−
７，ｓ 、 ｐＥＩ−７，５、ｐｌ’ｌ−７，７および
Ｐ目、７．８）を１′、、コリ・プラスミドの機能性レ
プリコンを含有し抗生物質耐性を伝達する制限フラグメ
ント（例えは、プラスミドｐｌｓｒ（３２２，ｐｌｉＲ
３２４、ｐＢＲ３２５など）に連結して、Ｅ、コリおよ
びプラスミドＰト、１，７含有ストレプトマイセスの細
胞に使用する機能性プラスミドを生成し得る。これらの
構成（本明細書では、プラスミドｐＬＲ５およびｐＬＲ
（３が例示される）は、プラスミドの増殖および操作が
ストレプトマイセスよりもＩＬ、コリにおいてより速く
より簡便に行なえるので、特に有利である。かくして、
所望の組み替えＩ） Ｎ Ａ工程をｌ・；、コリ宿主糸
で行なったのち、特定のストレプトマイセスｌ） Ｎ
Ａを取り出し、プラスミドの形に再構成し、スＩ・レプ
トマイセス属またはその類縁宿主細胞に移入できる。
本発明の組み替えｌ） Ｎ Ａクローニング・ベクター
はストレプトマイセス属の１種または１株に使用を制限
されない。逆に、ベクターは広範に応用でき、多数のス
トレプトマイセス属種、特にアミノグリコサイド、マク
ロライド、β−ラクタム、ポリエーテルおよびクリコベ
プタイド糸抗生物質などの抗生物質を製造する経済的に
重要な柿の特に無制限株（ｒｅｓＬｒｉｃＬｉｏｎｌｅ
ｓｓ ５ｔｒａｉｎｓ ）である宿主細胞に移入できる
。このような無制限株は当分野でよく知られている常法
（Ｌｏｒｎｏｖｓｋａｙａ ｃｔ ａｌ、。
はストレプトマイセス属の１種または１株に使用を制限
されない。逆に、ベクターは広範に応用でき、多数のス
トレプトマイセス属種、特にアミノグリコサイド、マク
ロライド、β−ラクタム、ポリエーテルおよびクリコベ
プタイド糸抗生物質などの抗生物質を製造する経済的に
重要な柿の特に無制限株（ｒｅｓＬｒｉｃＬｉｏｎｌｅ
ｓｓ ５ｔｒａｉｎｓ ）である宿主細胞に移入できる
。このような無制限株は当分野でよく知られている常法
（Ｌｏｒｎｏｖｓｋａｙａ ｃｔ ａｌ、。
１９８０ 、Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ４４ ：２０６ ）によりストレプトマイセ
ス属から容易に選別され採取される。無制限株の宿主細
胞は制限酵素を欠いているので、形質転換の際にプラス
ミドＤ Ｎ Ａを切断したり崩壊させたりすることはな
い。本明細書の目的からして、本発明のベクターの制限
部位を切断しない制限酵素を含む宿主細胞も無制限とみ
なされる。
ｉｅｗｓ ４４ ：２０６ ）によりストレプトマイセ
ス属から容易に選別され採取される。無制限株の宿主細
胞は制限酵素を欠いているので、形質転換の際にプラス
ミドＤ Ｎ Ａを切断したり崩壊させたりすることはな
い。本明細書の目的からして、本発明のベクターの制限
部位を切断しない制限酵素を含む宿主細胞も無制限とみ
なされる。
アミノクリコサイド系抗生物質を生成し、本ベクターが
特に有益であり移入できるストレプトマイセス属の無制
限株の好適な宿主細胞としては、例えば、次のような種
の無制限細胞が挙げられる。
特に有益であり移入できるストレプトマイセス属の無制
限株の好適な宿主細胞としては、例えば、次のような種
の無制限細胞が挙げられる。
（以下余白）
Ｓ 、 ｋａｎａｍｙｃｅｔｉ−ｃｕｓ （ｋａｎａ＋
ｎｙｃｉｎｓ） 、旦、仲旦〉上−四ｊ、ｃｕｓ （
ａｍｉｎｏｓｉｄｊ、ｎｅ）＋ Ｓ−／ｇｒｉｓｃｏ
口ａｖｕｓ （ａｎｔ：ｊｌ＋１ｏｔｉｃＨＡ１．２
６７）、Ｓ、ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（ａｎｔ：ｉｂ
：ｉ、ｏＬｉ、ｃＳＦゝ−７６７）’。
ｎｙｃｉｎｓ） 、旦、仲旦〉上−四ｊ、ｃｕｓ （
ａｍｉｎｏｓｉｄｊ、ｎｅ）＋ Ｓ−／ｇｒｉｓｃｏ
口ａｖｕｓ （ａｎｔ：ｊｌ＋１ｏｔｉｃＨＡ１．２
６７）、Ｓ、ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（ａｎｔ：ｉｂ
：ｉ、ｏＬｉ、ｃＳＦゝ−７６７）’。
Ｓ、 ｒｉ、ｂｏｓｉｄｉｆｊ、ｃｕｓ （ａｎｔ
ｊ、ｂｉ、ｏｌｊ−ｃ ５Ｆ７３３）＋ Ｓ−１”
、’１．ａＶＯ二ｐｅｒｓｉｃｕｓ （ｓｐｅｃｔｉ、
ｎｏ＋ｎｙｃｊｎ） 、 Ｓ、 Σ黒すｐｔｌ＋ｊ、１
−ｉｓ （ａｎｔ；ｊ、−ｎｏｓｐｅｃｔａｃｉｎ）
、互、ｒｊ−ＩｎＯ８ＩＩ８ ｆＯｒｌｌｌＦｌ １’
）泪’、”０１１１［１１１１ｙＣ’、ｌＩｌｌＩＳ（
ｐａｒｏｍｏ＋ｎｙｃｉ、ｎｓ、 ｃａｔｅｎｕｌｉｎ
）、 Ｓ、 ｆ’＋悲ｙｊａｅ ｖａｒ。
ｊ、ｂｉ、ｏｌｊ−ｃ ５Ｆ７３３）＋ Ｓ−１”
、’１．ａＶＯ二ｐｅｒｓｉｃｕｓ （ｓｐｅｃｔｉ、
ｎｏ＋ｎｙｃｊｎ） 、 Ｓ、 Σ黒すｐｔｌ＋ｊ、１
−ｉｓ （ａｎｔ；ｊ、−ｎｏｓｐｅｃｔａｃｉｎ）
、互、ｒｊ−ＩｎＯ８ＩＩ８ ｆＯｒｌｌｌＦｌ １’
）泪’、”０１１１［１１１１ｙＣ’、ｌＩｌｌＩＳ（
ｐａｒｏｍｏ＋ｎｙｃｉ、ｎｓ、 ｃａｔｅｎｕｌｉｎ
）、 Ｓ、 ｆ’＋悲ｙｊａｅ ｖａｒ。
血圧型Ａａｍｉ、ｎｏｓ、ｉｄｊ、＋］ｅ）、 Ｓ、
ｂｌ＋＋ｅｎｓ竪ｖａｒ、 ｌ山＋ｅｎｓｊｓ（＋）Ｊ
ｕｅｎｓｏｍｙｃｉｎ）、 Ｓ、 ｃａｌ、ｅｏｕ
ｌａｅ （ｃａｌ、ｒ月■目ｉｎ）、 すし。
ｂｌ＋＋ｅｎｓ竪ｖａｒ、 ｌ山＋ｅｎｓｊｓ（＋）Ｊ
ｕｅｎｓｏｍｙｃｉｎ）、 Ｓ、 ｃａｌ、ｅｏｕ
ｌａｅ （ｃａｌ、ｒ月■目ｉｎ）、 すし。
ｏｌ、ｉ、ｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ｖａｒ、 ｃｅ−１
−１ｕ１．ｏｐ１２ｉ ｌｕｓ （（ｌｅｓｌ、ｎｒｕ
ｙｃｊｒ＋ Ａ）。
−１ｕ１．ｏｐ１２ｉ ｌｕｓ （（ｌｅｓｌ、ｎｒｕ
ｙｃｊｒ＋ Ａ）。
Ｓ、 ｔｅｎｅｂｒａｒｊｕｓ （ｔｏｂｒａｍｙｃｉ
ｎ、 ａｐ＋−ａ＋１Ｉｙｃｉｎ）、 Ｓ、 Ｉａｖｅ
ｎ −ｄｕｌａｅ （ｎｅｏｍｙｃｊｎ） 、 Ｓ−ａ
−町７１ ｕｓ （ｎＣ（）ｍｙｃ ｉ ｎｓ ） 。
ｎ、 ａｐ＋−ａ＋１Ｉｙｃｉｎ）、 Ｓ、 Ｉａｖｅ
ｎ −ｄｕｌａｅ （ｎｅｏｍｙｃｊｎ） 、 Ｓ−ａ
−町７１ ｕｓ （ｎＣ（）ｍｙｃ ｉ ｎｓ ） 。
Ｓ、ａｌ、ｂｕｓ ｖａｒ、ｑｃｊ、ｎｕｓ （ｎ＋
ｅＬａ＋ｎｙｃｉｎ）、Ｓ、ｂｙ７Ｈｒｏ−磁ｐｊ−ｃ
ｕｓ ｖａｒ、 ｓａｇａ■１ｅｎｓｉｓ （ｓｐｅｃ
ｌ、１１１（ｎｕｙｃｉｎ）、Σｂｉｌ＜ｉｎｊ、ｅｎ
ｓｉｓ （ｓｌ；ｒｅｐｌ；ｏ＋ｕｙｃｉｎ）、 Ｓツ
倶左ρ賢（ｓＬ＋゛ｅｐ１．ｏ −ｍｙｃｉｎ）、 Ｓ
、 ｅｒｙＬｈｒｏｃｈｒｏｎ＋ｏ（ｚｅｎｅｓ ｖａ
＋１． ｎａ＋１＋＋１．ｏｅｎ紀ｓ（ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｊ、ｎ）、 Ｓ、 ｐｏｏｌｅｎｓｉ、ｓ
（ｓｌ、ｒｅｐＬｏｍｙｃｉｎ）。
ｅＬａ＋ｎｙｃｉｎ）、Ｓ、ｂｙ７Ｈｒｏ−磁ｐｊ−ｃ
ｕｓ ｖａｒ、 ｓａｇａ■１ｅｎｓｉｓ （ｓｐｅｃ
ｌ、１１１（ｎｕｙｃｉｎ）、Σｂｉｌ＜ｉｎｊ、ｅｎ
ｓｉｓ （ｓｌ；ｒｅｐｌ；ｏ＋ｕｙｃｉｎ）、 Ｓツ
倶左ρ賢（ｓＬ＋゛ｅｐ１．ｏ −ｍｙｃｉｎ）、 Ｓ
、 ｅｒｙＬｈｒｏｃｈｒｏｎ＋ｏ（ｚｅｎｅｓ ｖａ
＋１． ｎａ＋１＋＋１．ｏｅｎ紀ｓ（ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｊ、ｎ）、 Ｓ、 ｐｏｏｌｅｎｓｉ、ｓ
（ｓｌ、ｒｅｐＬｏｍｙｃｉｎ）。
Ｓ、 ｇａｌｂｕｓ （ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
）、Ｓ、ｒａｎ＋ｃ＋＋ｓ （ｓｌ肖ψ１．ｏ−ｍｙ
ｃｊｎ）、 Ｓ、 ｏｌ−ｊ、ｖａｃｅｕｓ （ｓｔｒ
ｅｐｌ；ｏｍｙ（：ｉｎ）、 Ｓ、 ｍａｓｔ＋ｕｅｎ
−５ｊｓ （ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｊ、ｎ）、 Ｓ、
Ｉ＋ｙｇｒｏｓｅｏｐｉｃ＋＋ｓ ｖｔ＋＋・、 １
．ｉｎ＋ｏ −ｎｅｕｓ （ｖａｌｉｄａｍｙｃｉｎｓ
） 、 Ｓ、 ｒｊ＋ｎｏｆ１ａｃｉｍ＋ｓ （由ｒ
ｓ Ｌｏ＋＋＋ｙ（ｉ ｎｓ ） 。
）、Ｓ、ｒａｎ＋ｃ＋＋ｓ （ｓｌ肖ψ１．ｏ−ｍｙ
ｃｊｎ）、 Ｓ、 ｏｌ−ｊ、ｖａｃｅｕｓ （ｓｔｒ
ｅｐｌ；ｏｍｙ（：ｉｎ）、 Ｓ、 ｍａｓｔ＋ｕｅｎ
−５ｊｓ （ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｊ、ｎ）、 Ｓ、
Ｉ＋ｙｇｒｏｓｅｏｐｉｃ＋＋ｓ ｖｔ＋＋・、 １
．ｉｎ＋ｏ −ｎｅｕｓ （ｖａｌｉｄａｍｙｃｉｎｓ
） 、 Ｓ、 ｒｊ＋ｎｏｆ１ａｃｉｍ＋ｓ （由ｒ
ｓ Ｌｏ＋＋＋ｙ（ｉ ｎｓ ） 。
互、 Ｉｔ ｇｒｏｓｃｏｐ、１−ｃｕｓ ｆｏｒｍａ
（ｒｌｅｌ＋ｏｓｕｓ （ｔ＜１ｅｌ）（＋ｍｙｃｉ
ｕ） 。
（ｒｌｅｌ＋ｏｓｕｓ （ｔ＜１ｅｌ）（＋ｍｙｃｉ
ｕ） 。
Ｓ、ｆｒａｄｉ、ａｅ（ｈｙｌ）ｒｉｍｙｃｉｎｓ、ｎ
ｅｏｍｙｃｉｎｓ）、Ｓ、ｃ＋＋１ｏ−−ｃｉｄｉｃｕ
ｓ （ａｎｔｊ、ｂｉｏ１月、ｃ Ａ１６３１６−Ｃ）
、 Ｓ、 ａｑｕａｃａｎｕｓ （Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ
ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ）、 Ｓ、ｃｒｙｓｔａｌ、
１ｊ、ｎｕｓ （ｈｙｇｒｏ −ｍｙｃｉ、ｎ Ａ）
、 Ｓ、 ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｊ、ｓ （ｂｙｇｒ
ｏｍｙｃｉｎ） 、 Ｓ。
ｅｏｍｙｃｉｎｓ）、Ｓ、ｃ＋＋１ｏ−−ｃｉｄｉｃｕ
ｓ （ａｎｔｊ、ｂｉｏ１月、ｃ Ａ１６３１６−Ｃ）
、 Ｓ、 ａｑｕａｃａｎｕｓ （Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ
ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ）、 Ｓ、ｃｒｙｓｔａｌ、
１ｊ、ｎｕｓ （ｈｙｇｒｏ −ｍｙｃｉ、ｎ Ａ）
、 Ｓ、 ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｊ、ｓ （ｂｙｇｒ
ｏｍｙｃｉｎ） 、 Ｓ。
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ｈｙｇｒｏｍｙｃｉ、
ｎｓ）、 Ｓ、 ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ （ｂｙｇｒ
ｏｍｙｃｊ、ｎ）、 Ｓ、 １ｃａｓｕｇａｓｐｊ、ｎ
ｕｓ （ｌｃａｓｕｇａｍｙｃｊ、ｎｓ）、 Ｓ。
ｎｓ）、 Ｓ、 ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ （ｂｙｇｒ
ｏｍｙｃｊ、ｎ）、 Ｓ、 １ｃａｓｕｇａｓｐｊ、ｎ
ｕｓ （ｌｃａｓｕｇａｍｙｃｊ、ｎｓ）、 Ｓ。
ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ （ｌｃａｓｕｇａｍｙｃｉ、
ｎｓ） 、 Ｓ、 μ叫ヨｐｓｉｓ （ａｎｔ；１−ｂ
ｌｏｔｉｃ ＬＬ−ＡＭ３１．）、互、 ｌ］−ｖｉ、
ｄｕｓ （１，−１ｖｊ、ｄｏｍｙｃｊｎｓ） 、 Ｓ
。
ｎｓ） 、 Ｓ、 μ叫ヨｐｓｉｓ （ａｎｔ；１−ｂ
ｌｏｔｉｃ ＬＬ−ＡＭ３１．）、互、 ｌ］−ｖｉ、
ｄｕｓ （１，−１ｖｊ、ｄｏｍｙｃｊｎｓ） 、 Ｓ
。
ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ （ｓｅｌ、ｄｏｍｙｃｊｎ ｃ
ｏｍｐｌ、ｅｘ）および互、 Ｃａｎ１ｌＳ（ｒｉｂ
ｏｓｙｌ、 ｐａｒｏｍａｍｊ、ｎｅ） 。
ｏｍｐｌ、ｅｘ）および互、 Ｃａｎ１ｌＳ（ｒｉｂ
ｏｓｙｌ、 ｐａｒｏｍａｍｊ、ｎｅ） 。
マクロライド系抗生物質を生成し１本ベクターが特に有
益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限株の
好適な宿主細胞としては１例えば。
益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限株の
好適な宿主細胞としては１例えば。
次のような種の無制限細胞が挙げられる。
Ｓ、 ｃａｅｌｅｓｔｉｓ （ａｎｔｊ、ｂｉｏｔｉｃ
Ｍ１８８）＋ Ｓ−ｐｌａｔｅｎｓｊ、ｓ （ｐｌａ
ｔｅｎｏｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、 ｒｏｃｈｅｉ、 ｖａ
ｒ、 ｖｏｌｕｂｉｌｉ、ｓ （ａｎｔｉ’−ｂｉｏｔ
ｉｃ Ｔ２６３６）＋ Ｓ−ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ （
ｍｅｔｈｙｍｙｃｊｎｓ）、 ｓ。
Ｍ１８８）＋ Ｓ−ｐｌａｔｅｎｓｊ、ｓ （ｐｌａ
ｔｅｎｏｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、 ｒｏｃｈｅｉ、 ｖａ
ｒ、 ｖｏｌｕｂｉｌｉ、ｓ （ａｎｔｉ’−ｂｉｏｔ
ｉｃ Ｔ２６３６）＋ Ｓ−ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ （
ｍｅｔｈｙｍｙｃｊｎｓ）、 ｓ。
ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ （ｂｕｎｄ］−１ｎ）、
Ｓ、 ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ （ｊｏｓａ＋ｎｙ−ｃ
ｉｎ、 ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、 ｆｕｎｇｉ
ｃｉｄｉｃｕｓ （ａｎｔ：ｉ、ｂｊｏｔｊｃＮＡ−１
８１）、 Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ （ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃ ＰＡ１３３Ａ。
Ｓ、 ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ （ｊｏｓａ＋ｎｙ−ｃ
ｉｎ、 ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、 ｆｕｎｇｉ
ｃｉｄｉｃｕｓ （ａｎｔ：ｉ、ｂｊｏｔｊｃＮＡ−１
８１）、 Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ （ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃ ＰＡ１３３Ａ。
Ｂ）＋ Ｓ−ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ （ａｌｂｏｃ
ｙｃｌｉｎｅ）、 Ｓ暑〕ｒｕｎｅｏ−ｇｒｉｓｅｕｓ
（ａｌ、ｂｏｃｙｃｌｉｎｅ）＋ Ｓ、 ｒｏｓｅｏ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （ａｌｂｏｃｙｃｌ、１ｎｅ
）、 Ｓ ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （ｃ
ｉｎｅｒｏｍｙｃｉ、ｎＢ）ｌ互−ａｌ、ｂｕｓ （ａ
ｌ、ｂｏｍｙｃｅｔｊｎ）、 Ｓ、 ｆｅｌ］、ｅｕｓ
（ａｒｅａ −ｍｙｃｉｎ＋ ｐ］−ｃｒｏｍｙｃ
：ｉｎ）＋ Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ （１，ａｎｌｃａｃｊ
、ｄｉｎ＋ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）、 Ｓ、 ｖｉｏｌ
ａｃｅｏｎｉ ｅｒ （］、ａｎｋａｃｊｄｉ、ｎ）＋
互ｔｇｒｔ Ｂ Ｃ１１８（ｂ Ｏｒｒｅ １１ｄ １
ｎ ） ｇ Ｓ −ｍａｌ−ｚｅＬＪ ８ （Ｕｎ（＞
１’ａＩＩｌ’ＹＣ’Ｉ ｎ） ＋Ｓ、ａｌｌ）ｕｓｖ
ａｒ−ｃｏｊ−］−ｍｙｃｅｔ、ｉ、ｃｕｓ（ｃｏｌｅ
ｉ＋＋＋ｙｃｉｎ）＋Ｓ−ｍｙＣａｒＯｆａＣ１ｅｎＳ
（ａｃｅｔｙｌ−］−ｅｕｋｏｍｙｃｉ、ｎ、 ｅｓｐ
ｉｎｏｍｙｃｉ＋１）。
ｙｃｌｉｎｅ）、 Ｓ暑〕ｒｕｎｅｏ−ｇｒｉｓｅｕｓ
（ａｌ、ｂｏｃｙｃｌｉｎｅ）＋ Ｓ、 ｒｏｓｅｏ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （ａｌｂｏｃｙｃｌ、１ｎｅ
）、 Ｓ ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （ｃ
ｉｎｅｒｏｍｙｃｉ、ｎＢ）ｌ互−ａｌ、ｂｕｓ （ａ
ｌ、ｂｏｍｙｃｅｔｊｎ）、 Ｓ、 ｆｅｌ］、ｅｕｓ
（ａｒｅａ −ｍｙｃｉｎ＋ ｐ］−ｃｒｏｍｙｃ
：ｉｎ）＋ Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ （１，ａｎｌｃａｃｊ
、ｄｉｎ＋ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）、 Ｓ、 ｖｉｏｌ
ａｃｅｏｎｉ ｅｒ （］、ａｎｋａｃｊｄｉ、ｎ）＋
互ｔｇｒｔ Ｂ Ｃ１１８（ｂ Ｏｒｒｅ １１ｄ １
ｎ ） ｇ Ｓ −ｍａｌ−ｚｅＬＪ ８ （Ｕｎ（＞
１’ａＩＩｌ’ＹＣ’Ｉ ｎ） ＋Ｓ、ａｌｌ）ｕｓｖ
ａｒ−ｃｏｊ−］−ｍｙｃｅｔ、ｉ、ｃｕｓ（ｃｏｌｅ
ｉ＋＋＋ｙｃｉｎ）＋Ｓ−ｍｙＣａｒＯｆａＣ１ｅｎＳ
（ａｃｅｔｙｌ−］−ｅｕｋｏｍｙｃｉ、ｎ、 ｅｓｐ
ｉｎｏｍｙｃｉ＋１）。
Ｓ−ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ｔｕｒ〕、ｍｙｃ
ｉ、ｎ、 ｒｅｌ、ｏ＋ｎｙｃｉｎ、 ｍａｒｉｄｏ
−ｍｙｃｉｎ、 ｔｙｌ、ｏｓｉ、ｎ＋ ｃａｒｂｏ
ｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、 ｇｒＩｓＯｏｓｐｉｒａｌ−ｉ
ｓ（ｒｅｌｏｍｙｃｉｎ） ＋ Ｓ−−リｙｅｎｄすａ
ｅ （ａｌ、ｄｇａｍｙｃ」ｎ） ＋ Ｓ。
ｉ、ｎ、 ｒｅｌ、ｏ＋ｎｙｃｉｎ、 ｍａｒｉｄｏ
−ｍｙｃｉｎ、 ｔｙｌ、ｏｓｉ、ｎ＋ ｃａｒｂｏ
ｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、 ｇｒＩｓＯｏｓｐｉｒａｌ−ｉ
ｓ（ｒｅｌｏｍｙｃｉｎ） ＋ Ｓ−−リｙｅｎｄすａ
ｅ （ａｌ、ｄｇａｍｙｃ」ｎ） ＋ Ｓ。
ｒｉｍｏｓｕｓ （ｎｅｕｔｒａｍｙｃｉｎ） 、
Ｓ、 但！。年し５片−（ｄｅｌｔａｍｙｃｉｏｓ
）＋Ｓ、 ｆｕｎ ｉｃｉ、ｄｉ、ｃｕｓ ｖａｒ、
ｅＳｐＩＩｌＯｎｌｙＣｅｔＩＣｕＳ（ｅｓｐｊ、ｎｏ
−ｍｙｃｉｎｓ）、 Ｓ−ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ
（ｍｙｄｅｃａｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、ＥＩＩＩＩＩＩ
Ｏ−１〕巴ｃｉ、ｅｎｓ （ｆｏｒｏｍａｃｉ、ｄｉ
ｎ Ｄ）、 Ｓ−ｅｕｒｏｃジｄ：ｉ、ｃ＋＋ｓ
（ｍｅしｈｙ−ｍｙｃｉ、ｎ）＋ Ｓ−ｇｒＩＳｅＯ
切見（ｇｒｉ、ｓｅｏｍｙｃｉ、ｎ）、 Ｓ、 ｒ’す
ｖｏ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （ａｍａｒｏｍｙｃ
ｉｎ＋ ｓｌ］ｉｎｃｏｍｙｃｉ、ｎｓ）＋ Ｓ。
Ｓ、 但！。年し５片−（ｄｅｌｔａｍｙｃｉｏｓ
）＋Ｓ、 ｆｕｎ ｉｃｉ、ｄｉ、ｃｕｓ ｖａｒ、
ｅＳｐＩＩｌＯｎｌｙＣｅｔＩＣｕＳ（ｅｓｐｊ、ｎｏ
−ｍｙｃｉｎｓ）、 Ｓ−ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ
（ｍｙｄｅｃａｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、ＥＩＩＩＩＩＩ
Ｏ−１〕巴ｃｉ、ｅｎｓ （ｆｏｒｏｍａｃｉ、ｄｉ
ｎ Ｄ）、 Ｓ−ｅｕｒｏｃジｄ：ｉ、ｃ＋＋ｓ
（ｍｅしｈｙ−ｍｙｃｉ、ｎ）＋ Ｓ−ｇｒＩＳｅＯ
切見（ｇｒｉ、ｓｅｏｍｙｃｉ、ｎ）、 Ｓ、 ｒ’す
ｖｏ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （ａｍａｒｏｍｙｃ
ｉｎ＋ ｓｌ］ｉｎｃｏｍｙｃｉ、ｎｓ）＋ Ｓ。
ｆ’ｉｍｂｒｉ、ａｔｕｓ （ａｍａｒｏｍｙｃｉｎ）
＋ Ｓ−ｆａｓｃｉ、ｃｕｌ、ｕｓ （ａｍ＋１ｒｏ−
ｎ＋ｙｃｉｎ ） ＋ Ｓ −ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ （
ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉ、ｎｓ ） ＋ Ｓり四賜１）
ｉ０ｊｉＣＬＧ９ （ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉ、ｎ）
＋ Ｆ３− ０］、ｊ、ＶＯＣ］１ｒ０１１１０７％
ｎＯ８（ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、 ｓｐｉ
ｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａ＋゛−ｓ＋＋＋思（
ｒａｏ−ｅｎｓｉｓ （ｌｃｕｊｊ、ｍｙｃｉ、ｎｓ
）、 Ｓ、 １ｃｉｔａｓａｌ；ｏｅｎｓｉｓ
（１，ａｕｃｏｍｙＣｉｎ）＋Ｓ、ｎａｒｂｏｎｅｎｓ
ｉｓ ｖａｒ、 、’ｏｓａｍ ｃｅｔｉｃｕｓ
（：Ｉａｕｃｏ＋ｎｙｃｉｎＡ３＋ ｊｏｓａｍ
ｙｃｉｎ）、Ｓ−ａｌ、ｌｉｏ ｒｉ−ｓｅｏｌ、ｕｓ
（ｍ−ｉ＋ｃｏｎｏ＋ｎｙｃｉｎ）ｎｓ、 コｐ
ｉ、ｋｉｎｉ、ｅｎｓｉｓ （ｃｈａｌｃｏｍｙｃｉ
ｎ）＋ Ｓ−ｃｉｒｒａｌ；ｕｓ （２５− （ｃｉｒｒａｍｙｃｉｎ）、！ジ、ｄｊａｋａｒｔｅｎ
ｓｉｓ （ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）＋ ｓ。
＋ Ｓ−ｆａｓｃｉ、ｃｕｌ、ｕｓ （ａｍ＋１ｒｏ−
ｎ＋ｙｃｉｎ ） ＋ Ｓ −ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ （
ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉ、ｎｓ ） ＋ Ｓり四賜１）
ｉ０ｊｉＣＬＧ９ （ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉ、ｎ）
＋ Ｆ３− ０］、ｊ、ＶＯＣ］１ｒ０１１１０７％
ｎＯ８（ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、 ｓｐｉ
ｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａ＋゛−ｓ＋＋＋思（
ｒａｏ−ｅｎｓｉｓ （ｌｃｕｊｊ、ｍｙｃｉ、ｎｓ
）、 Ｓ、 １ｃｉｔａｓａｌ；ｏｅｎｓｉｓ
（１，ａｕｃｏｍｙＣｉｎ）＋Ｓ、ｎａｒｂｏｎｅｎｓ
ｉｓ ｖａｒ、 、’ｏｓａｍ ｃｅｔｉｃｕｓ
（：Ｉａｕｃｏ＋ｎｙｃｉｎＡ３＋ ｊｏｓａｍ
ｙｃｉｎ）、Ｓ−ａｌ、ｌｉｏ ｒｉ−ｓｅｏｌ、ｕｓ
（ｍ−ｉ＋ｃｏｎｏ＋ｎｙｃｉｎ）ｎｓ、 コｐ
ｉ、ｋｉｎｉ、ｅｎｓｉｓ （ｃｈａｌｃｏｍｙｃｉ
ｎ）＋ Ｓ−ｃｉｒｒａｌ；ｕｓ （２５− （ｃｉｒｒａｍｙｃｉｎ）、！ジ、ｄｊａｋａｒｔｅｎ
ｓｉｓ （ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）＋ ｓ。
ｅｕｒｙｔｌｌｅｒｍｕｓ （ａｎｇｏｌａｍｙｃｉｎ
）、 Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ （ｔｙｌ、ｏｓｊ、ｎ。
）、 Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ （ｔｙｌ、ｏｓｊ、ｎ。
１ａｃｔｅｎｏｃｉｎ、 ｍａ、ｃｒｏｃｉｎ）、 ３
−７ｚｏｓｈｉｌｃｊ、ｅｎｓｉｓ （ｂａｎｄａ−ｍ
ｙｃｉｎ）、 Ｓ−、ｇｒｉｓｅｏｆゝ］ ａｖｕｓ
（ａｃｕｍｙｃｊ、ｎ ） 、 Ｓ、 ］＋ａ １−ｓ
Ｌａｄ月（ｃａｒｌ〕ｏｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、
ｌ：ｅｎｄａｅ （ｃａｒｌ〕ｏｍｙｃｉ、ｎ）＋
Ｓ−ｍａｃｒｏ−ｓｐｏｒｅｕｓ （ｃａｒｂｏ
ｍｙｃ］、ｎ）、 Ｓ−ｔｈｅｒｍｏｔｏｌ、ｅｒａ
ｎｓ （ｃａｒｂｏ−ｍｙｃｉｎ）およびＳ、 ａｌ
、Ｉ〕１ｒｅｔｉｃｕｌｉ （ｃａｒｂｏｍｙｃｉ、ｎ
）−β−ラクタム系抗生物質を生成し１本ベクターが特
に有益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限
株の好適な宿主細胞としては９例λば。
−７ｚｏｓｈｉｌｃｊ、ｅｎｓｉｓ （ｂａｎｄａ−ｍ
ｙｃｉｎ）、 Ｓ−、ｇｒｉｓｅｏｆゝ］ ａｖｕｓ
（ａｃｕｍｙｃｊ、ｎ ） 、 Ｓ、 ］＋ａ １−ｓ
Ｌａｄ月（ｃａｒｌ〕ｏｍｙｃｉｎ）＋ Ｓ、
ｌ：ｅｎｄａｅ （ｃａｒｌ〕ｏｍｙｃｉ、ｎ）＋
Ｓ−ｍａｃｒｏ−ｓｐｏｒｅｕｓ （ｃａｒｂｏ
ｍｙｃ］、ｎ）、 Ｓ−ｔｈｅｒｍｏｔｏｌ、ｅｒａ
ｎｓ （ｃａｒｂｏ−ｍｙｃｉｎ）およびＳ、 ａｌ
、Ｉ〕１ｒｅｔｉｃｕｌｉ （ｃａｒｂｏｍｙｃｉ、ｎ
）−β−ラクタム系抗生物質を生成し１本ベクターが特
に有益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限
株の好適な宿主細胞としては９例λば。
次のような種の無制限細胞が挙げられる。
−」〒３． ｌｉｐｍａｎｉｉ、 （Ａ１６８８４
＋ ＭＭ４５５０． ＭＭ１３９０２）＋ Ｓ、
ｃｉ、ａｖｕ−１ｊｇｅｒｕｓ （Ａ１６８８６
Ｂ、 ｃｌａｖｕｌ、ａｎｉｃ ａｃｉｄ）＋
ニジ、１ａｃｔａ＋ｎ−ｄｕｒａｎｓ （ｃｅｐｈａ
ｍｙｃｉｎ Ｃ）＋ Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （ｃｅｐ
ｈａｍｙｃｊｎＡ、Ｂ）、Ｓ、ｌ〕ｙｇｒｏｓｃｏｐｉ
ｃｕｓ （ｄｅａｃｅｔｏｘｙｃｅｐｈａｌｏｓｐｏ
ｒｉ＋−＋Ｃ）、 Ｓ−、ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ
（ＷＳ−３４４２−Ｄ）、 Ｓ−ｃｈａｒｔｒａｌｌｓ
ｌｓ（ＳＦ １６２３）＋ Ｓ−ｈｅｔｅｒｏｍｏｒ＋
］ｉｕｓ ａｎｄ Ｓ−ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ（Ｃ２０
８］、Ｘ）＋ Ｓ、 ｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ＋
Ｓ、 ｆ’ｉｍｂｒｉａｔｕｓ＋ ｓ。
＋ ＭＭ４５５０． ＭＭ１３９０２）＋ Ｓ、
ｃｉ、ａｖｕ−１ｊｇｅｒｕｓ （Ａ１６８８６
Ｂ、 ｃｌａｖｕｌ、ａｎｉｃ ａｃｉｄ）＋
ニジ、１ａｃｔａ＋ｎ−ｄｕｒａｎｓ （ｃｅｐｈａ
ｍｙｃｉｎ Ｃ）＋ Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （ｃｅｐ
ｈａｍｙｃｊｎＡ、Ｂ）、Ｓ、ｌ〕ｙｇｒｏｓｃｏｐｉ
ｃｕｓ （ｄｅａｃｅｔｏｘｙｃｅｐｈａｌｏｓｐｏ
ｒｉ＋−＋Ｃ）、 Ｓ−、ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ
（ＷＳ−３４４２−Ｄ）、 Ｓ−ｃｈａｒｔｒａｌｌｓ
ｌｓ（ＳＦ １６２３）＋ Ｓ−ｈｅｔｅｒｏｍｏｒ＋
］ｉｕｓ ａｎｄ Ｓ−ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ（Ｃ２０
８］、Ｘ）＋ Ｓ、 ｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ＋
Ｓ、 ｆ’ｉｍｂｒｉａｔｕｓ＋ ｓ。
ｓ−□−および−９−５ｉｏｙａｅｎＳｉＳ （ＭＭ
’１５５０９６ ａｎｄ ＭＭ １３９０２）。
’１５５０９６ ａｎｄ ＭＭ １３９０２）。
ポリエーテル系抗生物質を生成し１本ベクターが特に有
益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限株の
好適な宿主細胞としては．例えば。
益であり移入できるストレプトマイセス属の無制限株の
好適な宿主細胞としては．例えば。
次のような種の無制限細胞が挙げられる。
互． ａｌｂｕｓ （Ａ２０４， Ａ２８６９５Ａ ａ
ｎｄ Ｂ， ｓａｌ．：ｉｎｏｍｙｃｊ．ｎ）＋旦−ｈ
ｒｏｓｃｏｐｉ．ｃｕｓ （Ａ２１８， ｅｍｅｒ
］．ｃｊｄ， ］）ｌε３９３６）、△１．２０Ａ 。
ｎｄ Ｂ， ｓａｌ．：ｉｎｏｍｙｃｊ．ｎ）＋旦−ｈ
ｒｏｓｃｏｐｉ．ｃｕｓ （Ａ２１８， ｅｍｅｒ
］．ｃｊｄ， ］）ｌε３９３６）、△１．２０Ａ 。
Ａ２８６９５Ａ ａｎｄ Ｂ， ｅｔｌｌｅｒｏｍｙｃ
ｉｎ， ｄｉ．ａｎｅｍｙｃｊｎ）、 ｓ。
ｉｎ， ｄｉ．ａｎｅｍｙｃｊｎ）、 ｓ。
ｇｒｉ．ｓｅｕｓ （ｇｒｉｓｏｒｉｘｉｎ）、Ｓ．
ｃｏｎ（ｇｌｏｂａｌ；ｕｓ （ｉｏｎｏ＋＋＋ｙｃ
ｊ．ｎ）。
ｃｏｎ（ｇｌｏｂａｌ；ｕｓ （ｉｏｎｏ＋＋＋ｙｃ
ｊ．ｎ）。
王． ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ． ａｓｔｅｒ
ｏｃｉｄｉｃｕｓ （１．ａ］．ｄ３．ｏｍｙｃｌｎ）
＋Ｓ． ｌａｓａｌｉｅｎｓｉｓ （ｌａｓａｌｏ
ｃｉｄ）、 Ｓ． ｒｉ．ｂｏｓ凰．ｄｉｒｉｃｕ
ｓ’（１ｏｎｏｍｙｃｉｎ）、 Ｓ． ｃａｃａｏｉ
ｖａｒ− ａｓｏｅｎｓｌｓ （］、ｙｓｏｃａ．ｉ．
］．ｉｎ）。
ｏｃｉｄｉｃｕｓ （１．ａ］．ｄ３．ｏｍｙｃｌｎ）
＋Ｓ． ｌａｓａｌｉｅｎｓｉｓ （ｌａｓａｌｏ
ｃｉｄ）、 Ｓ． ｒｉ．ｂｏｓ凰．ｄｉｒｉｃｕ
ｓ’（１ｏｎｏｍｙｃｉｎ）、 Ｓ． ｃａｃａｏｉ
ｖａｒ− ａｓｏｅｎｓｌｓ （］、ｙｓｏｃａ．ｉ．
］．ｉｎ）。
Ｓ− ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ （ｍｏｎ．ｅｎｓ
ｉｎ）、、 Ｓ． 夛用四躬埋互（ｎａｒａｓｉｎ）＋
Ｓ．ｇａｌ］−ｉｎａｒｉｕｓ．（ＲＰ３ｏ５ｏ１＋）
、ｓ．、１．ｏｎに−ｗｏｏｄｅｎｓｉｓ （１ｙｓｏ
ｃｅ１．１ｉｎ）＋ Ｓ− ｆ］．ａｖｅｏｌ．ｕｓ
（ＣＴ’３８９３（’ｉ）。
ｉｎ）、、 Ｓ． 夛用四躬埋互（ｎａｒａｓｉｎ）＋
Ｓ．ｇａｌ］−ｉｎａｒｉｕｓ．（ＲＰ３ｏ５ｏ１＋）
、ｓ．、１．ｏｎに−ｗｏｏｄｅｎｓｉｓ （１ｙｓｏ
ｃｅ１．１ｉｎ）＋ Ｓ− ｆ］．ａｖｅｏｌ．ｕｓ
（ＣＴ’３８９３（’ｉ）。
Ｓ． ｍｕｔａｂｉｌｉｓ （Ｓ−１１７４３ａ）およ
び互． ｖｉｏｌ。ａｃｅｏｎｉ （Ｈｅｒ（ｎｉｇｅ
ｒｉｃｉｎ ） 。
び互． ｖｉｏｌ。ａｃｅｏｎｉ （Ｈｅｒ（ｎｉｇｅ
ｒｉｃｉｎ ） 。
グリコペプタイド系抗生物質を生成し．本ベクターが特
に有益であり移入できるストレプトマイセス えば、次のような種の無制限細胞が挙げられ゛る。
に有益であり移入できるストレプトマイセス えば、次のような種の無制限細胞が挙げられ゛る。
Ｓ． ｏｒｉｅｎｔａｌ．ｉｓおよびＳ．ｈａｒａｎｏ
ｍａｃｂ１ｅｎｓ］．ｓ （ｖａｎｃｏ −ｍｙｃｉｎ
）； Ｓ− ｃａｎｄｊ山ＪＳ （Ａ−３５５１２
， ａｖｏｐａｒｃｊｎ）ならびに互．ユ凹を叩圧車止
（ＬＬ−ＡＭ ３７４） 一本ベクターが特に有益で移
入できるストレプトマイセス ては，例えば、次のような種の無制限細胞が挙げられる
。
ｍａｃｂ１ｅｎｓ］．ｓ （ｖａｎｃｏ −ｍｙｃｉｎ
）； Ｓ− ｃａｎｄｊ山ＪＳ （Ａ−３５５１２
， ａｖｏｐａｒｃｊｎ）ならびに互．ユ凹を叩圧車止
（ＬＬ−ＡＭ ３７４） 一本ベクターが特に有益で移
入できるストレプトマイセス ては，例えば、次のような種の無制限細胞が挙げられる
。
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ， Ｓ． ｒａｎｕｌｏｒ
ｕｂｅｒ，互− ｒ０８ｅＯｓｐＯｒｕｓｌＳ− １ｉ
ｖｉｄａｎｓ， Ｓ− ｅｓｐｉｎｏｓｕｓおよびＳ．
ａｚｕｒｅｕｓ ・ｃ以下余白） 上述の代表的ストレプトマイセス属の無制限宿主細胞に
加えて、本ベクターは、例えばバチルス、スタフィロコ
ッカスならびにストレプトスポランジウム、アクチノプ
ランズ、ノカルディアおよびマイクロモノスポラを包含
するアクチノマイセテス類縁属などのような他の属の無
制限株の細胞においても有益であり移入できる。かくし
て、本発明のベクターは種々の微生物の宿主細胞に広く
応用でき、有益であり、また移入できる。
ｕｂｅｒ，互− ｒ０８ｅＯｓｐＯｒｕｓｌＳ− １ｉ
ｖｉｄａｎｓ， Ｓ− ｅｓｐｉｎｏｓｕｓおよびＳ．
ａｚｕｒｅｕｓ ・ｃ以下余白） 上述の代表的ストレプトマイセス属の無制限宿主細胞に
加えて、本ベクターは、例えばバチルス、スタフィロコ
ッカスならびにストレプトスポランジウム、アクチノプ
ランズ、ノカルディアおよびマイクロモノスポラを包含
するアクチノマイセテス類縁属などのような他の属の無
制限株の細胞においても有益であり移入できる。かくし
て、本発明のベクターは種々の微生物の宿主細胞に広く
応用でき、有益であり、また移入できる。
本発明の具体的内容は全て有益であるが、本組み替えｌ
） Ｎ Ａクローニング・ベクターおよび被形質転換体
のあるものは、他のものより好ましい。
） Ｎ Ａクローニング・ベクターおよび被形質転換体
のあるものは、他のものより好ましい。
即ち、好ましいベクターは、プラスミドｐｌ・：Ｌ７。
ｐＥＬ７，１， ｐＥＬ７，３ 、 ｐＥＬ７．５ 、
ｐＬｌ＜１ およびＰ目（２、好ましい１組のベク
ターは、プラスミドｐｉ：Ｌ７とｐＥＬ７，１， ｐＥ
Ｉ−７とｐＥＬ７．３およびｐ Ｉ！： ｌ− ７とＰ
口、７、５ならびに好ましい被形質転換体は、ストレプ
トマイセス・アムボファシエンス／ ｐｌｉ：Ｌ７、Ｓ
，アムボファシエンス／ ｐＥＬ７ 、 ｐＦ．ｔ７，
１ 、Ｓ．アムホファンエンス／ ｐＥＬ７ 、 ｐＥ
Ｌ７．３、Ｓ．アムボファシエンス／ ｐＥＩ−７ 、
ｐＥＬ７，５、Ｅ．コリに１２ ）（１１０１／ｐＬ
Ｒ１および］う、フリに１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲ２で
ある。
ｐＬｌ＜１ およびＰ目（２、好ましい１組のベク
ターは、プラスミドｐｉ：Ｌ７とｐＥＬ７，１， ｐＥ
Ｉ−７とｐＥＬ７．３およびｐ Ｉ！： ｌ− ７とＰ
口、７、５ならびに好ましい被形質転換体は、ストレプ
トマイセス・アムボファシエンス／ ｐｌｉ：Ｌ７、Ｓ
，アムボファシエンス／ ｐＥＬ７ 、 ｐＦ．ｔ７，
１ 、Ｓ．アムホファンエンス／ ｐＥＬ７ 、 ｐＥ
Ｌ７．３、Ｓ．アムボファシエンス／ ｐＥＩ−７ 、
ｐＥＬ７，５、Ｅ．コリに１２ ）（１１０１／ｐＬ
Ｒ１および］う、フリに１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲ２で
ある。
更に上記の好ましい群の中で、プラスミドＰ１″．■−
７、−組のプラスミドｐＥｆ−７とｐ１′）Ｉ、７．１
およびｐ ｌ！： Ｉ− ７とｐｌ乙Ｌ７．５ならびに
被形性転換体Ｓ，アムボファンエンス／ｐＥＬ７、Ｓ、
アムポファシエンス／ｐＦ．Ｉ、７。
７、−組のプラスミドｐＥｆ−７とｐ１′）Ｉ、７．１
およびｐ ｌ！： Ｉ− ７とｐｌ乙Ｌ７．５ならびに
被形性転換体Ｓ，アムボファンエンス／ｐＥＬ７、Ｓ、
アムポファシエンス／ｐＦ．Ｉ、７。
ｐＥＬ７．１およびＳ、アムポファシエンス／ｐ）：Ｌ
７。
７。
ｐＥＬ７．５が最も好ましい。
本発明の組み替えＤＮＡクローニング・ベクターおよび
被形質転換体は、広範な有用性を有し、ストレプトマイ
セス属および類縁微生物に用いるに適したクローニング
媒体の必要性を満たすよう助成する。更にまた、本ベク
ターの、形質転換されていない宿主細胞には有毒である
抗生物質に対する耐性を伝達する能力は、被形質転換体
を選別するための機能的手段ともなる。このことは、ベ
クターＤＮＡを得た特別の細胞を決定し選別するために
実質上必要であるので重要である。存在を確かめる機能
試験が無いＤＮＡ断片の場合も、本ベクターに挿入して
、非選別性ＤＮＡを含有する被形質転換体を適当な抗生
物質選別法により単離することができる。このような非
選別性Ｄ Ｎ’ Ａ断片は、全てのタイプの抗生物質修
飾酵素および調節遺伝子を特定する遺伝子を包含するが
これに限定されない。
被形質転換体は、広範な有用性を有し、ストレプトマイ
セス属および類縁微生物に用いるに適したクローニング
媒体の必要性を満たすよう助成する。更にまた、本ベク
ターの、形質転換されていない宿主細胞には有毒である
抗生物質に対する耐性を伝達する能力は、被形質転換体
を選別するための機能的手段ともなる。このことは、ベ
クターＤＮＡを得た特別の細胞を決定し選別するために
実質上必要であるので重要である。存在を確かめる機能
試験が無いＤＮＡ断片の場合も、本ベクターに挿入して
、非選別性ＤＮＡを含有する被形質転換体を適当な抗生
物質選別法により単離することができる。このような非
選別性Ｄ Ｎ’ Ａ断片は、全てのタイプの抗生物質修
飾酵素および調節遺伝子を特定する遺伝子を包含するが
これに限定されない。
更に詳しくは、遺伝子を包含する非選別性１） ＮＡ断
片は、例えは例示のプラスミドｐ１５１．７５のような
プラスミドの１．５ｋｂ耐性伝達遍！県ＩＩ■フラグメ
ントのＰｖｕ ＩＴ制限部位に挿入する。このような挿
入によりチオストレプトン耐性遺伝ｒは不活化され、か
くして、組み替えプラスミドを含有する被形質転換体を
容易に同定できる。これには、まずネオマイシン耐性か
どうかで選別し、次にチオストレプトンには耐性でなく
ネオマイシンには耐性である被形質転換体を同定する。
片は、例えは例示のプラスミドｐ１５１．７５のような
プラスミドの１．５ｋｂ耐性伝達遍！県ＩＩ■フラグメ
ントのＰｖｕ ＩＴ制限部位に挿入する。このような挿
入によりチオストレプトン耐性遺伝ｒは不活化され、か
くして、組み替えプラスミドを含有する被形質転換体を
容易に同定できる。これには、まずネオマイシン耐性か
どうかで選別し、次にチオストレプトンには耐性でなく
ネオマイシンには耐性である被形質転換体を同定する。
同様に、必要なｌ） Ｎ Ａ断片を例えば３．５ｋｂの
耐性伝達！−社■フラクメントのＫｐｎ Ｉ制限部位に
挿入するとネオマイシン耐性遺伝子か不活化される。か
くして、この組み替えプラスミドを保有する被形質転換
体もまた、まずチオストレプトン耐性かどうかで選別し
、次いでネオマイシンには耐性でなくチオストレプトン
に耐性である被形質転換体を同定することにより、容易
に同定できる。従って、ストレプトマイセス属および類
縁細胞において抗生物質耐性かどうかで選別できること
により、必要な特定の非選別性ＤＮ’Ａを含有する極稀
な細胞を効率的に採取できる。
耐性伝達！−社■フラクメントのＫｐｎ Ｉ制限部位に
挿入するとネオマイシン耐性遺伝子か不活化される。か
くして、この組み替えプラスミドを保有する被形質転換
体もまた、まずチオストレプトン耐性かどうかで選別し
、次いでネオマイシンには耐性でなくチオストレプトン
に耐性である被形質転換体を同定することにより、容易
に同定できる。従って、ストレプトマイセス属および類
縁細胞において抗生物質耐性かどうかで選別できること
により、必要な特定の非選別性ＤＮ’Ａを含有する極稀
な細胞を効率的に採取できる。
本明細書で上述したように、抗生物質耐性による機能試
験はまた、制御因子として働き、個々の抗生物質耐性遺
伝子の形質表現を調製するＤＮＡ断片をおびただしい数
のＤＮＡから探し出すのにも用いられる。このような断
片には、プロモーター、アテニュエイター（ａｔｔｅｎ
ｕａｔｏｒ）、リプレッサー、インテユーサ−、リポゾ
ーム結合部位などが挙けられるがこれらに限定されるわ
けではない。
験はまた、制御因子として働き、個々の抗生物質耐性遺
伝子の形質表現を調製するＤＮＡ断片をおびただしい数
のＤＮＡから探し出すのにも用いられる。このような断
片には、プロモーター、アテニュエイター（ａｔｔｅｎ
ｕａｔｏｒ）、リプレッサー、インテユーサ−、リポゾ
ーム結合部位などが挙けられるがこれらに限定されるわ
けではない。
このような断片は、ストレプトマイセス属および類縁微
生物の細胞の他の遺伝子の形質表現を制御するのに用い
られる。
生物の細胞の他の遺伝子の形質表現を制御するのに用い
られる。
本発明のチオストレプトンおよびネオマイシン耐性伝達
ベクターはまた、連結した］）’ＮＡ断片が何代にも亘
って宿主細胞内にしつかり保持されるようにするのに有
用である。チオストレプトンまたはネオマイシン耐性伝
達フラグメントに共有結合で連結しており、ストレプト
マイセス属または類縁微生物の細胞のどぢらか一方にお
いて増殖させた遺伝子またはＤ Ｎ Ａフラグメントは
、形質転換されていない細胞には有毒である程度のチオ
ストレプトンまたはネオマイシンに被形質転換体をさら
しても維持される。それ故に、ベクター、即ち共有結合
で連結したＤ Ｎ Ａを失った被形質転換体は生育でき
ず、培養から除かれる。かくして、本発明のベクターは
必要なＩ）ＮＡ配列を安定化し維持ず４ことができる。
ベクターはまた、連結した］）’ＮＡ断片が何代にも亘
って宿主細胞内にしつかり保持されるようにするのに有
用である。チオストレプトンまたはネオマイシン耐性伝
達フラグメントに共有結合で連結しており、ストレプト
マイセス属または類縁微生物の細胞のどぢらか一方にお
いて増殖させた遺伝子またはＤ Ｎ Ａフラグメントは
、形質転換されていない細胞には有毒である程度のチオ
ストレプトンまたはネオマイシンに被形質転換体をさら
しても維持される。それ故に、ベクター、即ち共有結合
で連結したＤ Ｎ Ａを失った被形質転換体は生育でき
ず、培養から除かれる。かくして、本発明のベクターは
必要なＩ）ＮＡ配列を安定化し維持ず４ことができる。
本発明のクローニング・ベクターおよび被形質転換体は
、ストレプトマイセス属および類縁細胞において現在製
造されている種々の生成物の収率を改良するための遺伝
子のクローニングを提供する。このような生成物の例と
しては、ストレプトマイシン、タイロシン、セファロス
ポリン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、アブ
ラマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシンなどが
挙げられるかこれらζこ限定されない。本発明は、例え
はヒトインシュリン、ヒトプロインシュリン、クルカゴ
ン、インターフェロンなどの商業的に重要な蛋白質、商
業的に重要な工程および化合物に至る代謝経路中の酵素
的機能、または遺伝子の形質表現を改善する制御因子を
コード化する１）ＮＡ配列をクローニングし、特徴つけ
、再構成するのに有用な選択性ベクターをも提供する。
、ストレプトマイセス属および類縁細胞において現在製
造されている種々の生成物の収率を改良するための遺伝
子のクローニングを提供する。このような生成物の例と
しては、ストレプトマイシン、タイロシン、セファロス
ポリン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、アブ
ラマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシンなどが
挙げられるかこれらζこ限定されない。本発明は、例え
はヒトインシュリン、ヒトプロインシュリン、クルカゴ
ン、インターフェロンなどの商業的に重要な蛋白質、商
業的に重要な工程および化合物に至る代謝経路中の酵素
的機能、または遺伝子の形質表現を改善する制御因子を
コード化する１）ＮＡ配列をクローニングし、特徴つけ
、再構成するのに有用な選択性ベクターをも提供する。
」−記の所望のｌ） Ｎ Ａ配列としては、例えばスト
レプトマイシン、セファロスポリン、タイロシン、アク
タプラニン、ナラジン、モネンシン、アブラマイシン、
は他の生成物の副生を中介し増加させる酵素をコード化
する１）へＡか挙けられるがこれらに限定されない。か
くして、このようなＩ） Ｎ Ａ断片を挿入し安定化で
きることにより、ストレプトマイセス属および類縁微生
物により製造される抗生物質の収率と利用率を増加させ
ることかできる。
レプトマイシン、セファロスポリン、タイロシン、アク
タプラニン、ナラジン、モネンシン、アブラマイシン、
は他の生成物の副生を中介し増加させる酵素をコード化
する１）へＡか挙けられるがこれらに限定されない。か
くして、このようなＩ） Ｎ Ａ断片を挿入し安定化で
きることにより、ストレプトマイセス属および類縁微生
物により製造される抗生物質の収率と利用率を増加させ
ることかできる。
プラスミドｐ ｌ’： Ｉ−７の供給源として、ストレ
ブＩ・マイセス・アムボファシエンス／Ｐｌ“；１，７
は幾つかの異なる媒地のいずれかを用いて多数の方法で
培養できる。培養培地中の好ましい炭化水素源としては
、例えは、糖蜜、グルコース、テキストリンおよびクリ
セロ−ルが挙けられ、窒素諒としては、例えば、ソイ・
フラワー（ｓｏｙ ｆｌｏｕｒ）、７ミｙ ｓ混合物お
よびペプトンが挙けられる。栄養無機塩もまた含まれ、
ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム、フォ
スフエイト、クロライド゛、ザルフエイトおよびイオン
様物質を生し得る汎用される塩が挙けられる。他の微生
物の成長と発育に必要であるように、必須微量成分もま
た加えられる。このような微量成分は、晋通他の媒地成
分の添加に伴なって不純物として供給される。
ブＩ・マイセス・アムボファシエンス／Ｐｌ“；１，７
は幾つかの異なる媒地のいずれかを用いて多数の方法で
培養できる。培養培地中の好ましい炭化水素源としては
、例えは、糖蜜、グルコース、テキストリンおよびクリ
セロ−ルが挙けられ、窒素諒としては、例えば、ソイ・
フラワー（ｓｏｙ ｆｌｏｕｒ）、７ミｙ ｓ混合物お
よびペプトンが挙けられる。栄養無機塩もまた含まれ、
ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム、フォ
スフエイト、クロライド゛、ザルフエイトおよびイオン
様物質を生し得る汎用される塩が挙けられる。他の微生
物の成長と発育に必要であるように、必須微量成分もま
た加えられる。このような微量成分は、晋通他の媒地成
分の添加に伴なって不純物として供給される。
ストレプトマイセス・アムボファシエンス／ＰＥＩ、７
は、好気性培養条件下にｐｔｌが約５〜９の比較的広い
範囲内で、約１５〜４０”Ｃの範囲の温度で生育させる
。しかし、プラスミドｐｔ、Ｉ４７を最高の複製数で生
成するには、ｐＨ７５（約６．５の培地で培養し始め、
培養温度を約３０“Ｃに保持するのか望ましい。上述の
条件下でストレプトマイセス・アムポファシエンス／ｐ
ＥＬ７を培養すると、プラスミドｐＥＬ７を常法て単離
できる細胞の貯蔵物質を生じる。
は、好気性培養条件下にｐｔｌが約５〜９の比較的広い
範囲内で、約１５〜４０”Ｃの範囲の温度で生育させる
。しかし、プラスミドｐｔ、Ｉ４７を最高の複製数で生
成するには、ｐＨ７５（約６．５の培地で培養し始め、
培養温度を約３０“Ｃに保持するのか望ましい。上述の
条件下でストレプトマイセス・アムポファシエンス／ｐ
ＥＬ７を培養すると、プラスミドｐＥＬ７を常法て単離
できる細胞の貯蔵物質を生じる。
以下の実施例により、本明細書に記載した発明をさらに
詳細に例示する。本発明を構成する説明および実処方手
続を必要に応じて記載する。
詳細に例示する。本発明を構成する説明および実処方手
続を必要に応じて記載する。
実施例１
ストレプトマイセス・アムホファシエンス／ｐ Ｅｌ。
７ （ｉＮ’Ｅ＜ ｋＬ １２５３５ ）の成長段階に
ある接種物を、以上の好ましい組成から成る殺菌した栄
養培地（５０＊ｅ）中で該菌株を深部通気培養の条件下
に生育させるという常法により、調製した。
ある接種物を、以上の好ましい組成から成る殺菌した栄
養培地（５０＊ｅ）中で該菌株を深部通気培養の条件下
に生育させるという常法により、調製した。
グルコース ２０１／／１コー
ン・スチープーリ力−１０ｇ、／（ＩＣａ ＣＯａ
２ ｇ／４水道水
１，１ｅ米ニユートリソイ・フラ
ワーはアルケール・タニエルスーミドランド・カンパ＝
−（Ａ ｒ＜：ｈｅｒ Ｉ’）；ｕ＋ｉ −ｅｌｓ
Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ） （４５５５
１’ａｒｉｃｓ ｌ’ａｒｋｗａｙＤｅｃａｉｕｒ
ｌ１ｌｉｎｏｉｓ ６２５２６）から入手できる。
ン・スチープーリ力−１０ｇ、／（ＩＣａ ＣＯａ
２ ｇ／４水道水
１，１ｅ米ニユートリソイ・フラ
ワーはアルケール・タニエルスーミドランド・カンパ＝
−（Ａ ｒ＜：ｈｅｒ Ｉ’）；ｕ＋ｉ −ｅｌｓ
Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ） （４５５５
１’ａｒｉｃｓ ｌ’ａｒｋｗａｙＤｅｃａｉｕｒ
ｌ１ｌｉｎｏｉｓ ６２５２６）から入手できる。
蒜 コーン・スチープ・リカーはＣＩ） Ｃインターナ
ショナル・コーン・プロタクツ（Ｃ’ＰＣＩｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏ−ｎａｌ Ｃｏｒｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ）
、〔Ｐ、 ０．Ｂｏｘ ３ Ｑ Ｑ Ｏ、ｌ’：ｎｇｌ
ｅ−ｗｏｏｄ、Ｎ、 Ｊ、０７６３２’）から入手でき
る。
ショナル・コーン・プロタクツ（Ｃ’ＰＣＩｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏ−ｎａｌ Ｃｏｒｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ）
、〔Ｐ、 ０．Ｂｏｘ ３ Ｑ Ｑ Ｏ、ｌ’：ｎｇｌ
ｅ−ｗｏｏｄ、Ｎ、 Ｊ、０７６３２’）から入手でき
る。
得られた成長段階にある接種物を３０“（六ｐｉ−１５
，５で４８時間培養した。培養後、接種物（約１．０ｍ
１）を以下の好ましい組成から成る殺菌した細胞生成培
地（５０＊ｅ）に移植した。
，５で４８時間培養した。培養後、接種物（約１．０ｍ
１）を以下の好ましい組成から成る殺菌した細胞生成培
地（５０＊ｅ）に移植した。
トリブチカーゼ・ソイ−フロス＊ ３ｏ（／／ｌ！
クルコース ５ｇ／ｌグリン
ン ５ｆ）／（４脱イオン水
１．９７ｅ米トリブチカーセ・
ソイ・フロスはティフコ・ラボラトリーズ（１）ｉｆｃ
ｏ Ｌａｔ〕ｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） （１）ｅｔｒｏ
ｉｔＭｉｃｈｉｇａｎ ’）から入手できる。
クルコース ５ｇ／ｌグリン
ン ５ｆ）／（４脱イオン水
１．９７ｅ米トリブチカーセ・
ソイ・フロスはティフコ・ラボラトリーズ（１）ｉｆｃ
ｏ Ｌａｔ〕ｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） （１）ｅｔｒｏ
ｉｔＭｉｃｈｉｇａｎ ’）から入手できる。
菌を接種した細胞生成培地を３０゛Ｃで約２０時間、ｐ
Ｈを調整することなく培養すると、プラスミドＤＮＡを
回収し続いて単離するのに用いるストレプトマイセス・
アムホファシエンス／ｐＥＩ−７の細胞を得た。
Ｈを調整することなく培養すると、プラスミドＤＮＡを
回収し続いて単離するのに用いるストレプトマイセス・
アムホファシエンス／ｐＥＩ−７の細胞を得た。
ストレプトマイセス・アムボファソエンス／ｐＥＬ７の
細胞（湿重量約１０ｇ）を遠心分離して（１０分、５”
Ｃ，１０，０００ｒＰｍ ）採取した。この細胞を組織
破砕器でポモケナイスし、＝１’ ｌ！： Ｓ Ｍ衝欣
（０，０５Ｍトリス（ヒドロキンメチル）アミノメタン
〔トリス〕、０．００５Ｍ Ｉｉ Ｄ−ｉ’Ａ オヨｉ
Ｊ０．０５Ｉｖｌ ＮａＣ１、ｐＨ８，Ｑ ）で洗浄し
て、２５％スクロースを含有する１’Ｅｓ緩衝液に＠濁
した。リソチーム（約１２０〜）をＴ Ｅ Ｓ −２５
％スクロース緩衝液（２０＋＋＋／）に懸濁して加え、
得られる懸濁液を３５〜３７゛Ｃで約２０分間インキュ
ベートし、Ｑ、 ２５ Ｍ ｌ’：Ｉ）ｌ’Ａ （ｐＨ
８，Ｑ、４ Ｑ ｍｅ ）を加えて、出ひ３５゛Ｃで１
０分間培養した。ここに、５％別）Ｓ（ドデンル硫酸ナ
トリウム） （７） ｌ’ ｌ“〕緩衝液（００１Ｍト
リス、０．００１Ｍ ｉ：Ｉ）ＴＡ 、 Ｉ’ｌｌ ８
．０ ） 溶液（約４０ｍ１ ）を加え、舊ひ３５〜３
７ ”＜Ｅで２０分間インキュベートしたのち、５ＭＮ
ａＣ／／の脱イオン水溶液（約５０ ｌｌｅ ）を加え
た。この混合液を攪拌し、水浴上に約４時間放置して、
遠心分離した（３０分、４°Ｃ１１０，０００μｅｍ
） 。４２％ポリエチレンクリコールの脱イオン水溶液
（約０３１３答１１：）をＩＮａＣ／／の」−清に加え
、４°Ｃで約１８時間冷却した。得られたｌ） Ｎ Ａ
の沈澱を遠心分離により（５分、４°Ｃ１Ｃ１３０００
ｒｐ採取しｐ）１８． Ｑ テｌ’ Ｉ忙Ｓ緩衝液に溶
解した。塩化セノウムおよび塩化エチジウムクラテイエ
ントを用いて遠心分離する（４０時間、１５゛Ｃ１３５
，００Ｏｒｐｍ ）と、Ｉ） Ｎ Ａは明ｆＩｒｌ−に
分聞１した２つのハンドに分かれ、そのうち低い方のハ
ンドは所望のプラスミドｐｌ“、１，７であった。稀゛
法に従って、プラスミド・バンドを取出し、イソアミル
アルコールで２度洗浄して、ｐＨ８，Ｑのｌ’ ｌ”：
緩衡液にて透析し、エタノールで沈澱させた。かくして
単離したプラスミドｐＦ、Ｉ−７１） Ｎ ＡをｐＨ８
，Ｑの′１′Ｅ緩衝液（０，４ｍ１）に溶解して、−２
０″Ｃで凍結して保存した。
細胞（湿重量約１０ｇ）を遠心分離して（１０分、５”
Ｃ，１０，０００ｒＰｍ ）採取した。この細胞を組織
破砕器でポモケナイスし、＝１’ ｌ！： Ｓ Ｍ衝欣
（０，０５Ｍトリス（ヒドロキンメチル）アミノメタン
〔トリス〕、０．００５Ｍ Ｉｉ Ｄ−ｉ’Ａ オヨｉ
Ｊ０．０５Ｉｖｌ ＮａＣ１、ｐＨ８，Ｑ ）で洗浄し
て、２５％スクロースを含有する１’Ｅｓ緩衝液に＠濁
した。リソチーム（約１２０〜）をＴ Ｅ Ｓ −２５
％スクロース緩衝液（２０＋＋＋／）に懸濁して加え、
得られる懸濁液を３５〜３７゛Ｃで約２０分間インキュ
ベートし、Ｑ、 ２５ Ｍ ｌ’：Ｉ）ｌ’Ａ （ｐＨ
８，Ｑ、４ Ｑ ｍｅ ）を加えて、出ひ３５゛Ｃで１
０分間培養した。ここに、５％別）Ｓ（ドデンル硫酸ナ
トリウム） （７） ｌ’ ｌ“〕緩衝液（００１Ｍト
リス、０．００１Ｍ ｉ：Ｉ）ＴＡ 、 Ｉ’ｌｌ ８
．０ ） 溶液（約４０ｍ１ ）を加え、舊ひ３５〜３
７ ”＜Ｅで２０分間インキュベートしたのち、５ＭＮ
ａＣ／／の脱イオン水溶液（約５０ ｌｌｅ ）を加え
た。この混合液を攪拌し、水浴上に約４時間放置して、
遠心分離した（３０分、４°Ｃ１１０，０００μｅｍ
） 。４２％ポリエチレンクリコールの脱イオン水溶液
（約０３１３答１１：）をＩＮａＣ／／の」−清に加え
、４°Ｃで約１８時間冷却した。得られたｌ） Ｎ Ａ
の沈澱を遠心分離により（５分、４°Ｃ１Ｃ１３０００
ｒｐ採取しｐ）１８． Ｑ テｌ’ Ｉ忙Ｓ緩衝液に溶
解した。塩化セノウムおよび塩化エチジウムクラテイエ
ントを用いて遠心分離する（４０時間、１５゛Ｃ１３５
，００Ｏｒｐｍ ）と、Ｉ） Ｎ Ａは明ｆＩｒｌ−に
分聞１した２つのハンドに分かれ、そのうち低い方のハ
ンドは所望のプラスミドｐｌ“、１，７であった。稀゛
法に従って、プラスミド・バンドを取出し、イソアミル
アルコールで２度洗浄して、ｐＨ８，Ｑのｌ’ ｌ”：
緩衡液にて透析し、エタノールで沈澱させた。かくして
単離したプラスミドｐＦ、Ｉ−７１） Ｎ ＡをｐＨ８
，Ｑの′１′Ｅ緩衝液（０，４ｍ１）に溶解して、−２
０″Ｃで凍結して保存した。
実施例２
プラスミドｐＩＪ６ＤＮＡ（約２０７ｊ／（，２０μｇ
）（−１’ｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 １９８
０ 、Ｎａｔｕｒｅ ２８６ ： ５２５に開示され
ている〕、Ｂ Ｓ Ａ （牛血清アルブミン、１ ”９
／ｍｅ 、 ５ ｐｅ）、水（１９ｔｉｐ） Ｊｌｉｎ
ｄｌｌ （３ニューイングランド・バイオ・ラフ・ユニ
ッｌ−含有〕制限酵素”（１μｅ）および反応液”Ｃ３
ｐＧを３７゛Ｃで２時間インキュベートした。反応は４
Ｍ酢酸アンモニウム（約５０μｐ）および９５％エタノ
ール（２００μｅ）を加えて停止させた。得られたＩ）
へＡの沈澱を７０％エタノールで２度洗浄し、真空乾燥
し、゛１腓緩衝液（２０μｌ）に懸濁して、−２０”Ｃ
で凍結して保存した。
）（−１’ｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 １９８
０ 、Ｎａｔｕｒｅ ２８６ ： ５２５に開示され
ている〕、Ｂ Ｓ Ａ （牛血清アルブミン、１ ”９
／ｍｅ 、 ５ ｐｅ）、水（１９ｔｉｐ） Ｊｌｉｎ
ｄｌｌ （３ニューイングランド・バイオ・ラフ・ユニ
ッｌ−含有〕制限酵素”（１μｅ）および反応液”Ｃ３
ｐＧを３７゛Ｃで２時間インキュベートした。反応は４
Ｍ酢酸アンモニウム（約５０μｐ）および９５％エタノ
ール（２００μｅ）を加えて停止させた。得られたＩ）
へＡの沈澱を７０％エタノールで２度洗浄し、真空乾燥
し、゛１腓緩衝液（２０μｌ）に懸濁して、−２０”Ｃ
で凍結して保存した。
米制限酵素は以下の所から入手できる。
ニューイングランド・バイオ・ラブダ・インコーホレイ
テッド Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａ１）ｓ、、 Ｉ
ｎｃ。
テッド Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａ１）ｓ、、 Ｉ
ｎｃ。
３２ ］’ｏｚｅｒ Ｒｄ 。
１（ｅｖｅｒｌｙ 、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
Ｏ］ ９１５ヘ−リンカーマンハイム・バイオケミカ
ルスＢｏｅｌｌｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｌｔｅｉｍ
ｌ′Ｓｉｏｃｈｃｍｉｃａｌｓ７９４１ Ｃａｓ
ｉｌｅｗａｙ ｌ）ｒ。
Ｏ］ ９１５ヘ−リンカーマンハイム・バイオケミカ
ルスＢｏｅｌｌｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｌｔｅｉｍ
ｌ′Ｓｉｏｃｈｃｍｉｃａｌｓ７９４１ Ｃａｓ
ｉｌｅｗａｙ ｌ）ｒ。
Ｉ ｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉｓ 、 ｌ ｎ山ａｎａ
４６２５０米米μｎｄｌｌ 制限酵素用の反応液は
以上の組成で調製した。
４６２５０米米μｎｄｌｌ 制限酵素用の反応液は
以上の組成で調製した。
５ＱＱｍＭ ＮａＮａ
Ｃ１１Ｏ０１１１リス−塩酸、ｐＨ７，９７３ｍＭ Ｍ
ｇ Ｃ１２ １ＱｍＭジチオスレイトール プラスミドｐＢＲ３２２１） Ｎ Ａ （約Ｂ ｌｔｐ
、４１ｉｆ／ ）、反応液＜５ｐｅ）、Ｉｓ Ｓ Ａ
（１１Ｎｙ／ｍｅ 、 ５ ｔｔｐ）、水（３１ｔｉｎ
オヨヒ１ｌｉｎｄｌｌｌ制限８８ （１ｔｔｅ） ヲ
３７“Ｃで２時間インキュベートシた。６０゛Ｃて１０
分間インキュベートして反応を停止したのち、酢酸アン
モニウム（約５０μｌ）および９５％エタノール（２０
０μｌ）を加えた。得られたｒ） Ｎ Ａの沈澱を７０
％エタノールで２度洗浄し、真空乾燥して、水（４５μ
ｅ）に懸濁した。
ｇ Ｃ１２ １ＱｍＭジチオスレイトール プラスミドｐＢＲ３２２１） Ｎ Ａ （約Ｂ ｌｔｐ
、４１ｉｆ／ ）、反応液＜５ｐｅ）、Ｉｓ Ｓ Ａ
（１１Ｎｙ／ｍｅ 、 ５ ｔｔｐ）、水（３１ｔｉｎ
オヨヒ１ｌｉｎｄｌｌｌ制限８８ （１ｔｔｅ） ヲ
３７“Ｃで２時間インキュベートシた。６０゛Ｃて１０
分間インキュベートして反応を停止したのち、酢酸アン
モニウム（約５０μｌ）および９５％エタノール（２０
０μｌ）を加えた。得られたｒ） Ｎ Ａの沈澱を７０
％エタノールで２度洗浄し、真空乾燥して、水（４５μ
ｅ）に懸濁した。
（用郵ＩＩＩ Ｔ白化したプラスミドｐｌＪ６とｐｌ
ｓＲ３２２の連結 一見ＭすＩｌｌ処理したプラスミドｐｌＪ６（約２０μ
ｅ）〔実施例２人で調製）、すｉｎｄ ■処理したブラ
スミＦｐＢＲ３２２（２０ｐｅ）Ｃ実施例２ Ｉｓ テ
調製−ｊ、ＢＳＡ（１ｎｌ／ｌｕｇ、５μｇ）、”ｌ’
４ Ｉ） Ｎ Ａリカーゼオ（１μ６）およＵ’ ｉ
ｌｌ液液（５μｍ ヲ１６”Ｃテ４時間イン牛ユベー）
Ｌ、４Ｍｆｆ１”酸アンモニウム（約５０産）および９
５％エタノール（２００μｅ）を加えて反応を停止した
。得られたＩ） Ｎ Ａの沈澱を７０％エタノールで２
度洗浄し、真空乾燥して、’ｌ’ Ｅ緩衝故に懸濁した
ところ、懸濁１） Ｎ Ａは所望のプラスミドＰＫ−に
２てあった。
ｓＲ３２２の連結 一見ＭすＩｌｌ処理したプラスミドｐｌＪ６（約２０μ
ｅ）〔実施例２人で調製）、すｉｎｄ ■処理したブラ
スミＦｐＢＲ３２２（２０ｐｅ）Ｃ実施例２ Ｉｓ テ
調製−ｊ、ＢＳＡ（１ｎｌ／ｌｕｇ、５μｇ）、”ｌ’
４ Ｉ） Ｎ Ａリカーゼオ（１μ６）およＵ’ ｉ
ｌｌ液液（５μｍ ヲ１６”Ｃテ４時間イン牛ユベー）
Ｌ、４Ｍｆｆ１”酸アンモニウム（約５０産）および９
５％エタノール（２００μｅ）を加えて反応を停止した
。得られたＩ） Ｎ Ａの沈澱を７０％エタノールで２
度洗浄し、真空乾燥して、’ｌ’ Ｅ緩衝故に懸濁した
ところ、懸濁１） Ｎ Ａは所望のプラスミドＰＫ−に
２てあった。
米Ｔ４１）ＮＡリガーゼは以−ドの所から得られる。
ニューイングランド・バイオ・ラブダ・インコーホレイ
テッド Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａ１）ｓ、、
Ｉｎｃ。
テッド Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａ１）ｓ、、
Ｉｎｃ。
３２ ’ｌ−’ｏｚｅｒ Ｒｄ。
Ｂｅｖｅｒｌｙ 、 Ｍａ ５ｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
、 ０１．９１５米米連結液は以下の組成で調製した。
、 ０１．９１５米米連結液は以下の組成で調製した。
５００ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７，３
２００ｍＭジチオスレイトール
Ｉ Ｑ Ｑ ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ１２
１Ｑ ｍＭ ＡＴＰ
実施例３
凍結した適当なト５．コリに１２１１１へ１０１細胞（
約１０ｍ／） （ｌｓｏｌｉｖａｒｅｔａｌ、、 １９
７７、Ｇｃｎｃ２ニア５−−９３〕を遠心分離により沈
澱させて、０．０１Ｍ塩化すｌ−ＩＪウム（約ＩＱｍＪ
）に懸濁した。次に、細胞を再び沈澱させ、（１，０３
Ｍの塩化カルシウム溶成（約１０ｍ／）に再懸濁し、水
中で２０分間培養し、三度沈澱させて、最後に０． （
１３Ｍ塩化力ルノウム溶液（１，２５ｍＪ）に再懸濁す
ると、次の形質転換に適する細胞懸濁液が得られた。
約１０ｍ／） （ｌｓｏｌｉｖａｒｅｔａｌ、、 １９
７７、Ｇｃｎｃ２ニア５−−９３〕を遠心分離により沈
澱させて、０．０１Ｍ塩化すｌ−ＩＪウム（約ＩＱｍＪ
）に懸濁した。次に、細胞を再び沈澱させ、（１，０３
Ｍの塩化カルシウム溶成（約１０ｍ／）に再懸濁し、水
中で２０分間培養し、三度沈澱させて、最後に０． （
１３Ｍ塩化力ルノウム溶液（１，２５ｍＪ）に再懸濁す
ると、次の形質転換に適する細胞懸濁液が得られた。
１゛Ｅ緩衝液に懸濁したプラスミドｐ１．Ｒ２（実施例
２Ｃで調製〕をエタノールで沈澱させ、３ＱｍＭ塩化カ
ルシウム溶液（１５０μｅ）に懸濁し、試験管の中で適
当なＥ、コリに１２Ｈ１息１０１細胞（約２００μｇ）
と穏やかに混和し、水中で約４５分間、４２゛Ｃで約１
分間培養した。次に、アンピシリン（５０μｌ７ｍ１）
を含有するＩ、−ブロス（約３＃ｌｌ）〔Ｂｅｒｉａｎ
ｉ 、 １９５１ 、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
６２ ： ２９３ ）を加えた。得られた混合液を３
７゛Ｃで１時間振盪培養し、アンピシリンを含有するし
一寒天〔Ｍｉｌｌｅｒ 。
２Ｃで調製〕をエタノールで沈澱させ、３ＱｍＭ塩化カ
ルシウム溶液（１５０μｅ）に懸濁し、試験管の中で適
当なＥ、コリに１２Ｈ１息１０１細胞（約２００μｇ）
と穏やかに混和し、水中で約４５分間、４２゛Ｃで約１
分間培養した。次に、アンピシリン（５０μｌ７ｍ１）
を含有するＩ、−ブロス（約３＃ｌｌ）〔Ｂｅｒｉａｎ
ｉ 、 １９５１ 、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
６２ ： ２９３ ）を加えた。得られた混合液を３
７゛Ｃで１時間振盪培養し、アンピシリンを含有するし
一寒天〔Ｍｉｌｌｅｒ 。
１９７２ 、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ｌ−１ａｒｂｏｒ ＮｅｗＹｏｒｋ）に移植
した。生き残ったコロニーを選別し、ＲＳ 予想表現型（Ａｍｐ 、Ｔｅ ｌ ）かどうかを試験す
ると、所望の被形質転換体Ｅ、コリｉｃ１２Ｉ−ＩＢ
Ｉ Ｑ ｌ ／ｐＬＲ２であった。
ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ｌ−１ａｒｂｏｒ ＮｅｗＹｏｒｋ）に移植
した。生き残ったコロニーを選別し、ＲＳ 予想表現型（Ａｍｐ 、Ｔｅ ｌ ）かどうかを試験す
ると、所望の被形質転換体Ｅ、コリｉｃ１２Ｉ−ＩＢ
Ｉ Ｑ ｌ ／ｐＬＲ２であった。
実施例４
プラスミドｐＬＲ１は、プラスミドｐｆＪ’６の代わり
にプラスミドｐｌ Ｊ ２ （−１’ｈｏｍｐｓｏｎ
ｃｔ 、 ａｌ 、、 ］ ９８Ｑ 。
にプラスミドｐｌ Ｊ ２ （−１’ｈｏｍｐｓｏｎ
ｃｔ 、 ａｌ 、、 ］ ９８Ｑ 。
ＮａＬｕｒｅ ２８６ ： ５２５で開示〕を用いる
ことを除いては、実施例２Ａ、Ｃと実質的に同じ操作で
調製した。所望のプラスミド１）ＬＲｌはＴ ｌｉ緩衝
液に懸濁した。
ことを除いては、実施例２Ａ、Ｃと実質的に同じ操作で
調製した。所望のプラスミド１）ＬＲｌはＴ ｌｉ緩衝
液に懸濁した。
実施例５
所望の構成は、プラスミドｐ Ｌ Ｒ２の代わりにプラ
スミドｐＬＲ１を用いて形質転換を行なうことを除いて
は、実施例３と実質的に同じ操作で行なった。生き残っ
たコロニーを選別して予想表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅ ｔ
５）かどうかを試験すると、所望の被杉質転換体Ｅ、
コリＫ １２ ＨＢ １０ ｉ／ｐｌ、１（１であった
。
スミドｐＬＲ１を用いて形質転換を行なうことを除いて
は、実施例３と実質的に同じ操作で行なった。生き残っ
たコロニーを選別して予想表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅ ｔ
５）かどうかを試験すると、所望の被杉質転換体Ｅ、
コリＫ １２ ＨＢ １０ ｉ／ｐｌ、１（１であった
。
実施例６
ブー）スミＦｐＬＲ１（約１０ ｔｉＬ １０ ｐＦ）
、 Ｉ％ｓＡ（１’９／ｍｅ 、 ５ ｐｌ） 、水（
２ｇ ｐ（１） 、１．Ｓｐｍｌｉ Ｊ制限酵素〔水で
１＝４に重訳したもの一］ （］ ｐ、（１）およ米 び反応液（５μｅ）を３７゛Ｃで１５分間インキュベー
トし、４Ｍ酢酸アンモニウム（約５０μｅ）および９５
％エタノール（２００μｌ）を加えて反応を停止した。
、 Ｉ％ｓＡ（１’９／ｍｅ 、 ５ ｐｌ） 、水（
２ｇ ｐ（１） 、１．Ｓｐｍｌｉ Ｊ制限酵素〔水で
１＝４に重訳したもの一］ （］ ｐ、（１）およ米 び反応液（５μｅ）を３７゛Ｃで１５分間インキュベー
トし、４Ｍ酢酸アンモニウム（約５０μｅ）および９５
％エタノール（２００μｌ）を加えて反応を停止した。
得られたＤＮＡの沈澱を７０％エタノールで２度洗浄し
、真空乾燥して、水（２・０μｌ）に懸濁した。
、真空乾燥して、水（２・０μｌ）に懸濁した。
米ル凹Ｈ■制限酵素用の反応液は以−ドの組成で調製し
た。
た。
１．５ＭＮａＣ１
６０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ７，９
５Ｑ ｍＭ ＭｇＣ５２
Ｂ、プラスミドｐＢＲ３２２の榊ＨＩ消化所望の消化は
、Ｈｉｎｄｌｌｌ 制限酵素の代わりに埠兜Ｈ■制限酵
素を用いることを除いては、実施例２Ｂと実質的に同じ
操作で行なった。消化されたプラスミドｐＢＲ３２２は
水（２９μｌ）に懸濁した。
、Ｈｉｎｄｌｌｌ 制限酵素の代わりに埠兜Ｈ■制限酵
素を用いることを除いては、実施例２Ｂと実質的に同じ
操作で行なった。消化されたプラスミドｐＢＲ３２２は
水（２９μｌ）に懸濁した。
所望の連結は、実施例２Ｃと本質的に同じ操作で行なっ
た。得られた連結１） Ｎ Ａを′１゛Ｅ緩衝液に懸濁
すると所望のプラスミドｐＬＲ４であると分った。
た。得られた連結１） Ｎ Ａを′１゛Ｅ緩衝液に懸濁
すると所望のプラスミドｐＬＲ４であると分った。
実施例７
Ｅ、コリに１２ Ｈ１息１０１ ／ｐＬＲ４の構成所望
の構成は、プラスミドｐ１．Ｒ２の代わりにプラス］’
ＰＩ、Ｒ４を用いて形質転換することを除いては、実施
例３と本質曲番こ同じ操作で行なった。
の構成は、プラスミドｐ１．Ｒ２の代わりにプラス］’
ＰＩ、Ｒ４を用いて形質転換することを除いては、実施
例３と本質曲番こ同じ操作で行なった。
行き残ったコロニーを選別し、予想表現型（Ａ ｍｐ”
。
。
Ｔｅｔ ５）かどうかを試験すると、所望の被形性転換
体ト４．コリＫ １２ ＨＢ １． Ｑ １ ／ｐＬ
Ｒ４てあった。
体ト４．コリＫ １２ ＨＢ １． Ｑ １ ／ｐＬ
Ｒ４てあった。
実施例８
見
プラスミドＰＬＲ２１） ＩＮ Ａ （約５０１１ｇ）
、反応液（２０ａｅ）、０．１Ｍジチオスレイト−ル（
１０μｅ）、ＩＳＳ Ａ （ｌ Ｉｄｙ、／ｍｅ 、
２０ μａ）、水（１００１１ｅ）オヨびμ狸Ｈ■制限
酵素（４ユニット／μβ、５μｅ）ヲ３７°Ｃで２時間
インキュベートし、等量の４Ｍ＃酸アンモニウムおよび
２容量の９５％エタノールを加えたのち、得られた混合
液を一２０゛Ｃで約１８時間冷却してＤＮＡを沈澱させ
た。このｌ） Ｎ Ａの沈澱を遠心分離で採取し、１゛
Ｅ緩衝液（約５０μｌ）に懸濁した。所望の１．６ ｋ
ｂのＩ四Ｈ（制限フラグメントは、ケル電気泳動により
ＤＮＡの懸濁液から常法で単離した。単離に続いて、上
記のフラグメントを１゛Ｅ緩衝液（約２０μｅ）に再＠
濁して次の連結に用いた。
、反応液（２０ａｅ）、０．１Ｍジチオスレイト−ル（
１０μｅ）、ＩＳＳ Ａ （ｌ Ｉｄｙ、／ｍｅ 、
２０ μａ）、水（１００１１ｅ）オヨびμ狸Ｈ■制限
酵素（４ユニット／μβ、５μｅ）ヲ３７°Ｃで２時間
インキュベートし、等量の４Ｍ＃酸アンモニウムおよび
２容量の９５％エタノールを加えたのち、得られた混合
液を一２０゛Ｃで約１８時間冷却してＤＮＡを沈澱させ
た。このｌ） Ｎ Ａの沈澱を遠心分離で採取し、１゛
Ｅ緩衝液（約５０μｌ）に懸濁した。所望の１．６ ｋ
ｂのＩ四Ｈ（制限フラグメントは、ケル電気泳動により
ＤＮＡの懸濁液から常法で単離した。単離に続いて、上
記のフラグメントを１゛Ｅ緩衝液（約２０μｅ）に再＠
濁して次の連結に用いた。
所望の消化は、プラスミドＰＬＲ２の代わりにプラスミ
ドｐ ｌ！： Ｌ ７を用いることを除いては、実施例
８Ａと実質的に同じ操作で行なった。また、」−記のｌ
） Ｎ Ａ消化は、電気泳動にかけずに直接Ｔ Ｉら緩
衝液（２０μ召）に懸濁し次の連結に用いた。
ドｐ ｌ！： Ｌ ７を用いることを除いては、実施例
８Ａと実質的に同じ操作で行なった。また、」−記のｌ
） Ｎ Ａ消化は、電気泳動にかけずに直接Ｔ Ｉら緩
衝液（２０μ召）に懸濁し次の連結に用いた。
Ｃ６連結
共耶Ｈ■制限プラスミドｐＥＩ−７１） Ｎ Ａ （約
２０μｇ）、プラスミドｐＬＲ２の１，６ｋｂ抛凹Ｈ■
制限フラグメント（１０μｇ）、ｌＳＳ Ａ （］ ｌ
１ｌｆ／ ／ ｄ 、 ５／１ｅ）、連結液（１０μｅ
）、水（４５μｐ）および′１゛４Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガ
ーゼ（３，５μｅ）から成る混合液を約１６゛Ｃで約１
８時間インキュベートし、０．１容ｂｔの３Ｍ酢酸アン
モニウムおよび２容量の冷エタノールを加えたのち、−
２０”Ｃで約１８時間冷却して１）ＮＡを沈澱させた。
２０μｇ）、プラスミドｐＬＲ２の１，６ｋｂ抛凹Ｈ■
制限フラグメント（１０μｇ）、ｌＳＳ Ａ （］ ｌ
１ｌｆ／ ／ ｄ 、 ５／１ｅ）、連結液（１０μｅ
）、水（４５μｐ）および′１゛４Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガ
ーゼ（３，５μｅ）から成る混合液を約１６゛Ｃで約１
８時間インキュベートし、０．１容ｂｔの３Ｍ酢酸アン
モニウムおよび２容量の冷エタノールを加えたのち、−
２０”Ｃで約１８時間冷却して１）ＮＡを沈澱させた。
得られたｌ） Ｎ Ａの沈澱を遠心分離により採取し、
７０％エタノールで洗浄し、再ひ採取して、Ｐ培地（５
０μｇ） （Ｉ ｌ１ｌ）ＰＷ（１＋１ｄａｎｄ Ｗｒ
ｉｇｈ【、 ｌ ９７１３ 、 Ｊ、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｔｉ ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｕｓ
１６２：３０７〕に懸濁して次の形質転換に用いた。
７０％エタノールで洗浄し、再ひ採取して、Ｐ培地（５
０μｇ） （Ｉ ｌ１ｌ）ＰＷ（１＋１ｄａｎｄ Ｗｒ
ｉｇｈ【、 ｌ ９７１３ 、 Ｊ、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｔｉ ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｕｓ
１６２：３０７〕に懸濁して次の形質転換に用いた。
挿入されたｌ、 ５ ｋｂのチオスｌ−レプトン耐性伝
達ｆ５ａｍＨｉフラグメントの方向番こよって２方向の
組み賛えプラスミドか生じる。また、プラスミドｐＥＩ
、７は自己連結によって修復する。プラスミドｐＥＬ７
．１は、耐性伝達フラグメントのト想■制限部位をプラ
スミドｐＥ１．．７の５ｌ）１１ Ｊ部位（ｆ ｌａｎ
ｋｉｎｇ ）に最も近いように挿入して得られる組み替
えプラスミドを表わす。プラスミドＰ目７７２は、その
逆方向の組み替えプラスミドを表わす。
達ｆ５ａｍＨｉフラグメントの方向番こよって２方向の
組み賛えプラスミドか生じる。また、プラスミドｐＥＩ
、７は自己連結によって修復する。プラスミドｐＥＬ７
．１は、耐性伝達フラグメントのト想■制限部位をプラ
スミドｐＥ１．．７の５ｌ）１１ Ｊ部位（ｆ ｌａｎ
ｋｉｎｇ ）に最も近いように挿入して得られる組み替
えプラスミドを表わす。プラスミドＰ目７７２は、その
逆方向の組み替えプラスミドを表わす。
かくして、最後に得られたＤＮＡの懸濁液は、プラスミ
ドｐ ｌ！： Ｌ ７、ｐＥＬ７．ｌおよびＰＥＬ７，
２などのプラスミドを含有している。また、プラスミド
ｐＥＬ７はチオストレプトン耐性伝達フラグメントを挿
入し得るμｕｎＨ■制限部位を２両所有するので、プラ
スミドｐＥｌ−７，１およびｐ Ｅ ｌ−７，２の挿入
部位の違いによる異性体も生成する。プラスミドｐＥ
Ｌ ７．１およびＰＩ！：Ｌ７，２の各々の制限部位と
機能地図をそれぞれ添付図の第５図および第６図に示す
。
ドｐ ｌ！： Ｌ ７、ｐＥＬ７．ｌおよびＰＥＬ７，
２などのプラスミドを含有している。また、プラスミド
ｐＥＬ７はチオストレプトン耐性伝達フラグメントを挿
入し得るμｕｎＨ■制限部位を２両所有するので、プラ
スミドｐＥｌ−７，１およびｐ Ｅ ｌ−７，２の挿入
部位の違いによる異性体も生成する。プラスミドｐＥ
Ｌ ７．１およびＰＩ！：Ｌ７，２の各々の制限部位と
機能地図をそれぞれ添付図の第５図および第６図に示す
。
実施例９
実施例８Ｃで得たｌ）へＡ（約２０μρ）およびストレ
プトマイセス・アムホファンエンスの１×１０８個のプ
ロトプラスト〔該菌株は、イリノイ州ペオリア（Ｐｅｏ
ｒｉａ ）にあるノーサン・リージョナル・リサーチ、
ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｋｅｇｉｏｎａｌＲ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）に寄託され
、保存菌株となつており、寄託番号Ｎ ＲＲＬ２４２０
の下に、ｉ（１でもそこから入手できる〕を用いて、所
望の構成を、インターナショナル・パブリケーション（
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＲ７９１０００９５内）
Ａ ＷＯ７９１０１１６９、実施例２と実質的に同じ操
作で行ｔ、「つた。所望の被形質転換体を選別し、抗生
物質チオストレプトン（約５０μｆｌ ／ｍｅ ）を含
むベネット（Ｉｓ ｅｎｎｅＬ Ｌ ）の培地を改変し
た培地７に移植することにより、チオストレプトン耐性
かとうがて選別した。得られたストレプトマイセス・ア
ムポファンエンス／ｐ１″、Ｌ７ 、 ｐＥＬ７１およ
びＳ、アムポファシエンス／ｐＥＩ−７、ｐＥｒ、ｒ、
ｚノチオストレプトンｍｉＪ＋（コロニーを採取し、培
養して、構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電気
泳動分析による常法て同定した。
プトマイセス・アムホファンエンスの１×１０８個のプ
ロトプラスト〔該菌株は、イリノイ州ペオリア（Ｐｅｏ
ｒｉａ ）にあるノーサン・リージョナル・リサーチ、
ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｋｅｇｉｏｎａｌＲ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）に寄託され
、保存菌株となつており、寄託番号Ｎ ＲＲＬ２４２０
の下に、ｉ（１でもそこから入手できる〕を用いて、所
望の構成を、インターナショナル・パブリケーション（
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＲ７９１０００９５内）
Ａ ＷＯ７９１０１１６９、実施例２と実質的に同じ操
作で行ｔ、「つた。所望の被形質転換体を選別し、抗生
物質チオストレプトン（約５０μｆｌ ／ｍｅ ）を含
むベネット（Ｉｓ ｅｎｎｅＬ Ｌ ）の培地を改変し
た培地７に移植することにより、チオストレプトン耐性
かとうがて選別した。得られたストレプトマイセス・ア
ムポファンエンス／ｐ１″、Ｌ７ 、 ｐＥＬ７１およ
びＳ、アムポファシエンス／ｐＥＩ−７、ｐＥｒ、ｒ、
ｚノチオストレプトンｍｉＪ＋（コロニーを採取し、培
養して、構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電気
泳動分析による常法て同定した。
米へネットの培地（寒天）は、Ｗａ ｋ ｓｍａｎ 、
］ ９６１ ＋’ｌ”ｈｅ Ａｃｒｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ 、Ｖｏｌｕｎｌｅｌｌ 、１ｈｃ Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ ａｎｒｌＷｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、 Ｉ
％ａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｍａｒｙｌ卸ｄで開示されてい
るが、これにＣ：ｏ（１ｇ２・１１２０ （０，０１１
７０）を加え、クルコースの代わりにテキスＩ・リンを
用いる点で改変しである。
］ ９６１ ＋’ｌ”ｈｅ Ａｃｒｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ 、Ｖｏｌｕｎｌｅｌｌ 、１ｈｃ Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ ａｎｒｌＷｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、 Ｉ
％ａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｍａｒｙｌ卸ｄで開示されてい
るが、これにＣ：ｏ（１ｇ２・１１２０ （０，０１１
７０）を加え、クルコースの代わりにテキスＩ・リンを
用いる点で改変しである。
実施例１０
プラスミドｐＬＲＩ Ｉ） Ｎ Ａ （約５０μｇ）、
反応面７（２０μｌ）、０゜１Ｍジチオスレイトール（
１０μｅ）、Ｂ Ｓ Ａ （１”＆／ｍｇ 、 ２０ｔ
ｉｌ） 、水（１００μｅ）オよびｌ’ｓＬ（制限酵素
７（４ユニット／μｍ、５μ召）を３７゛Ｃで２時間イ
ンキュベートした。等計の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび
２容量の９５％エタノールを加えたのち、得られた混合
液を−２０“Ｃで約１８時間冷却してｌ） Ｎ Ａを沈
澱させた。このＩ）ｌ’ＪＡの沈澱を遠心分離により採
取して゛（’Ｅ緩衝液（約５０μｅ）に懸濁した。所望
の３．５ｋｂのち壮■制限フラグメントをゲル電気泳動
による常法でＩ）ＮＡ懸濁液から単離した。単離（こ続
いて、ト記フラグメントを′１′Ｅ緩衝液（約２０μａ
）に再！ｒ！、濁して次の連結に用いた。
反応面７（２０μｌ）、０゜１Ｍジチオスレイトール（
１０μｅ）、Ｂ Ｓ Ａ （１”＆／ｍｇ 、 ２０ｔ
ｉｌ） 、水（１００μｅ）オよびｌ’ｓＬ（制限酵素
７（４ユニット／μｍ、５μ召）を３７゛Ｃで２時間イ
ンキュベートした。等計の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび
２容量の９５％エタノールを加えたのち、得られた混合
液を−２０“Ｃで約１８時間冷却してｌ） Ｎ Ａを沈
澱させた。このＩ）ｌ’ＪＡの沈澱を遠心分離により採
取して゛（’Ｅ緩衝液（約５０μｅ）に懸濁した。所望
の３．５ｋｂのち壮■制限フラグメントをゲル電気泳動
による常法でＩ）ＮＡ懸濁液から単離した。単離（こ続
いて、ト記フラグメントを′１′Ｅ緩衝液（約２０μａ
）に再！ｒ！、濁して次の連結に用いた。
米ＰｓｔＪ 制限酵素用の反応Ｈりは以下の組成で調製
した。
した。
５０ ｍＭ Ｎａ Ｃ１
５ｍＭ トリス−塩酸、１旧７．４
５ｍＭ ＭｇＣ／２
５ｍＭ ２−メルカプトエタノール
１、００ ｐｇ／ｍｅ Ｉｓ Ｓ Ａ
料制限酵素は実施例２に列記した所から人ｆできる。
所望の消化は、プラスミドｐＬＲ１の代わりにプラスミ
ドｐＥｒ・７を用いることを除いては、実施例１０Ａと
実質的に同じ操作で行なった。更に、このｌ） Ｎ Ａ
消化物を電気泳動にかけすに１′１う緩衝液（２０ｐｌ
）に直接懸んして次の連結に用いた。
ドｐＥｒ・７を用いることを除いては、実施例１０Ａと
実質的に同じ操作で行なった。更に、このｌ） Ｎ Ａ
消化物を電気泳動にかけすに１′１う緩衝液（２０ｐｌ
）に直接懸んして次の連結に用いた。
Ｃ１連結
所望の連結は、片些■制限プラスミドｐｌ’：Ｉ、７
＋）ＮＡ（約２０μｇ）とプラスミド１）ｌＲ１（７）
３．５ ｋｌｌ（ｉＤ−ＰｓｔＪ制限フラクメント（
約１９μｇ）を実施例８（シと実質的に同じ操作で反応
させた。
＋）ＮＡ（約２０μｇ）とプラスミド１）ｌＲ１（７）
３．５ ｋｌｌ（ｉＤ−ＰｓｔＪ制限フラクメント（
約１９μｇ）を実施例８（シと実質的に同じ操作で反応
させた。
挿入した３、 ５ ｋｂのネオマイシン耐性伝達ｖ些■
フラグメントの方向によって、２方向の組み替えプラス
ミドか生じる。また、プラスミドｐ Ｅ Ｌ ７は自己
連結により修復する。プラスミドｐＦ、Ｉ−７，３は耐
性伝達フラグメントのＳａｃ■制限部位がプラスミドｐ
ＥＩ−７）Ｋｐｎ ■部位（ｆ Ｉａｎｋｉｎｇ ）に
最も近くなるように挿入した組み替えプラスミドを表わ
す。
フラグメントの方向によって、２方向の組み替えプラス
ミドか生じる。また、プラスミドｐ Ｅ Ｌ ７は自己
連結により修復する。プラスミドｐＦ、Ｉ−７，３は耐
性伝達フラグメントのＳａｃ■制限部位がプラスミドｐ
ＥＩ−７）Ｋｐｎ ■部位（ｆ Ｉａｎｋｉｎｇ ）に
最も近くなるように挿入した組み替えプラスミドを表わ
す。
プラスミドｐＦ、Ｌ７．４はその逆方向の組み替えプラ
スミドを表わす。かくして、最後に得られたｒＪＮＡの
懸濁液は、プラスミドｐＥＩ、７．ｐＥＩ・７３および
ｐ Ｅ Ｌ ７．４なとのプラスミドを含有している。
スミドを表わす。かくして、最後に得られたｒＪＮＡの
懸濁液は、プラスミドｐＥＩ、７．ｐＥＩ・７３および
ｐ Ｅ Ｌ ７．４なとのプラスミドを含有している。
また、プラスミドｐ Ｉ！、 Ｌ ７はネオマイシン耐
性伝達フラグメントを挿入し得るＰｓｔｆｉ制限部位を
２箇所有するので、プラスミドｐＥＬ７．３およびｐＥ
Ｌ７．４の挿入部位の違いによる異性体も生成する。プ
ラスミドｐＥｆ−７，３およびｐＥＬ７．４の各々の制
限部位と機能地図をそれぞれ添付図の第７図および第８
図に示す。
性伝達フラグメントを挿入し得るＰｓｔｆｉ制限部位を
２箇所有するので、プラスミドｐＥＬ７．３およびｐＥ
Ｌ７．４の挿入部位の違いによる異性体も生成する。プ
ラスミドｐＥｆ−７，３およびｐＥＬ７．４の各々の制
限部位と機能地図をそれぞれ添付図の第７図および第８
図に示す。
実施例１１
７ 、 ｐＥｌ７．３ オヨひストレプトマイセス・ア
ムポフ実施例１０Ｃで得た１−） Ｎ Ａ （約２０μ
ｇ）およびストレプトマイセス・アムポファソエンス（
ＮＲｋｌ−局２４２０）の１×１０個のプロトプラスト
用いて、所望の構成をインターナショナル・パブリケー
ンヨン（国際特許出願番号１’ （：’Ｉ’／Ｇ Ｉｓ
７ ９ １０００９５内）届Ｗ０７９１０１１６９、
実ｈ１μ例２と実質的に同じ操作で行なう。所望の被形
ｒ■転換体を、抗生物質ネオマイシンへ約１μ９７ｍｅ
）を含有するベネット培地の改変培地に移植すること
により、ネオマイノン耐性かとうがて選別する。得られ
るストレプトマイセス・アムポファシエンス／ｐｌ’：
１７ 、 ＰＥＬ７．３およびＳ．アムポファソエンス
／ Ｐｔ、■，７。
ムポフ実施例１０Ｃで得た１−） Ｎ Ａ （約２０μ
ｇ）およびストレプトマイセス・アムポファソエンス（
ＮＲｋｌ−局２４２０）の１×１０個のプロトプラスト
用いて、所望の構成をインターナショナル・パブリケー
ンヨン（国際特許出願番号１’ （：’Ｉ’／Ｇ Ｉｓ
７ ９ １０００９５内）届Ｗ０７９１０１１６９、
実ｈ１μ例２と実質的に同じ操作で行なう。所望の被形
ｒ■転換体を、抗生物質ネオマイシンへ約１μ９７ｍｅ
）を含有するベネット培地の改変培地に移植すること
により、ネオマイノン耐性かとうがて選別する。得られ
るストレプトマイセス・アムポファシエンス／ｐｌ’：
１７ 、 ＰＥＬ７．３およびＳ．アムポファソエンス
／ Ｐｔ、■，７。
ｐＥＩ、７．４のネオマイシン耐性コロニーを採取し、
培養して、構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電
気泳動分析による常法で同定する。
培養して、構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電
気泳動分析による常法で同定する。
米抗生物質ネオマインンはミズリー州セントルイス（
ＳＬ 、 Ｌｏｕｉ ｓ ）にあるシクマ社（ Ｓ ｉ
ｇｍａ ）から入手できる。
ＳＬ 、 Ｌｏｕｉ ｓ ）にあるシクマ社（ Ｓ ｉ
ｇｍａ ）から入手できる。
実施例１２
所望のプラスミドは、ストレプトマイセス・アムポファ
シエンス／ ＰＥＩ−７ 、 ｐＥｌ７，１ Ｃ実施例
９で調製し、実施例１Ａの操作に従って培養したもの）
から、実施例１１３の単離方法と実質的に同じ操作で単
離する。かくして単離されたプラスミドｐＥＬ７おヨｉ
Ｊ ｐＥｌ７．１ ノＤ Ｎ Ａ ヲＰＨｓ．ｏ ノ”
ｉ’ Ｅ緩衝液に懸重して次の制限酵素による消化に用
いる。
シエンス／ ＰＥＩ−７ 、 ｐＥｌ７，１ Ｃ実施例
９で調製し、実施例１Ａの操作に従って培養したもの）
から、実施例１１３の単離方法と実質的に同じ操作で単
離する。かくして単離されたプラスミドｐＥＬ７おヨｉ
Ｊ ｐＥｌ７．１ ノＤ Ｎ Ａ ヲＰＨｓ．ｏ ノ”
ｉ’ Ｅ緩衝液に懸重して次の制限酵素による消化に用
いる。
化
所望の消化は、プラスミドｐＬＲ１ ｌ） Ｎ Ａの代
わりにプラスミドｐＥＬ７およびｐＥＩ、７，ｉ ｌ）
ＩＮ Ａの混合物を用いることを除いては、実施例１
０Ａと実質的に同じ操作で行なう。かくして」−記の消
イヒさレタＤ Ｎ Ａ ヲＴ Ｅ緩衝液Ｃ２０ｐｌ）
に＠濁して、次のプラスミドｐＬＲ］の３． ５ ｋ
ｂ Ｐｓｔ ■制限フラグメントとの連結に用いる。
わりにプラスミドｐＥＬ７およびｐＥＩ、７，ｉ ｌ）
ＩＮ Ａの混合物を用いることを除いては、実施例１
０Ａと実質的に同じ操作で行なう。かくして」−記の消
イヒさレタＤ Ｎ Ａ ヲＴ Ｅ緩衝液Ｃ２０ｐｌ）
に＠濁して、次のプラスミドｐＬＲ］の３． ５ ｋ
ｂ Ｐｓｔ ■制限フラグメントとの連結に用いる。
Ｃ．連結
所望の連結は、プラスミドｐＥＩ−７およびｐ ｔ：Ｌ
７，１１） Ｎ Ａの担■制限混合物（約２（ｂｚ／）
と３．５ ｋｌ）のＰｓｃ Ｉ制限フラグメント（約１
０μｇ）〔実施例１、 Ｏ Ａで調製〕を、実施例１０
Ｃと実質的に同じ操作で、反応させることにより行なう
。
７，１１） Ｎ Ａの担■制限混合物（約２（ｂｚ／）
と３．５ ｋｌ）のＰｓｃ Ｉ制限フラグメント（約１
０μｇ）〔実施例１、 Ｏ Ａで調製〕を、実施例１０
Ｃと実質的に同じ操作で、反応させることにより行なう
。
３、 ５ ｋｌ）のＰｓｔ Ｉフラグメントはプラスミ
ド１）１゛土７およびｐＥｌ７，ｌのとららか一方また
は両方と連結するので、組み替えプラスミドの混合物か
生成する。前述したように、これらの組み替えプラスミ
ドも、３． ５ ｋｂのＰｓｔ ■ネオマイシン耐性伝
達フラグメントの方向によって２方向存在する。かくし
て、プラスミドｐＥＬ７と連結すると、プラスミドＰ目
、７．３およびｐ ｌ’： Ｉ− ７．４を生じ、プラ
スミドｐＥＬ７．１ と連結すると所望のプラスミドｐ
ｉ’． Ｌ７．５およびｐＥｔ７．６を生じる。また
、プラスミドｌ）ｌ・１。
ド１）１゛土７およびｐＥｌ７，ｌのとららか一方また
は両方と連結するので、組み替えプラスミドの混合物か
生成する。前述したように、これらの組み替えプラスミ
ドも、３． ５ ｋｂのＰｓｔ ■ネオマイシン耐性伝
達フラグメントの方向によって２方向存在する。かくし
て、プラスミドｐＥＬ７と連結すると、プラスミドＰ目
、７．３およびｐ ｌ’： Ｉ− ７．４を生じ、プラ
スミドｐＥＬ７．１ と連結すると所望のプラスミドｐ
ｉ’． Ｌ７．５およびｐＥｔ７．６を生じる。また
、プラスミドｌ）ｌ・１。
７およびｐＥｌ７．１は自己連結により修復する。
プラスミドＰＩ！：Ｌ７，５は、３． ５ ｋｂのネオ
マインン耐性伝達央■フラグメントのＳａｃＪ制限部位
か１、、 ６ ｋｂのチオストレプトン耐性伝達−堕１
１ｉフラクメントのＰｖｕ １１制限部位に最も近くな
るように挿入した組み替えプラスミドを表わす。プラス
ミドｐＥＬ７．６は、３， ５ ｋｂのネオマイシン耐
性伝達Ｐｓｔ■ フラグメントがその逆方向である組み
替えプラスミドを表わす。かくして、最後に得られるＤ
ＮＡの＠濁液はプラスミドｐＥＩ−７ 、ｐＥｌ７．１
。
マインン耐性伝達央■フラグメントのＳａｃＪ制限部位
か１、、 ６ ｋｂのチオストレプトン耐性伝達−堕１
１ｉフラクメントのＰｖｕ １１制限部位に最も近くな
るように挿入した組み替えプラスミドを表わす。プラス
ミドｐＥＬ７．６は、３， ５ ｋｂのネオマイシン耐
性伝達Ｐｓｔ■ フラグメントがその逆方向である組み
替えプラスミドを表わす。かくして、最後に得られるＤ
ＮＡの＠濁液はプラスミドｐＥＩ−７ 、ｐＥｌ７．１
。
ｐＥｌ．、７，３ 、 ｐＥＩ・７，４ 、 ｐＥｌ７
，５ 、 ｐＥｌ７．５などのプラスミドを含有し、実
施例８および１０で記載した理由から、プラスミドｐＥ
Ｌ７，３ 、 ｐＥｌ７．４ 、 ｐＦ：ｆ．７．５お
よびｐ’Ｅ Ｌ ７，５の押入部位の違いによる異性体
も含有する。所望のプラスミドｐＥｆ−７．５およびｐ
ＥＩ、７、６の各々の制限部位と機能地図をそれぞれ怒
付図の第９図および第１０図に示す。
，５ 、 ｐＥｌ７．５などのプラスミドを含有し、実
施例８および１０で記載した理由から、プラスミドｐＥ
Ｌ７，３ 、 ｐＥｌ７．４ 、 ｐＦ：ｆ．７．５お
よびｐ’Ｅ Ｌ ７，５の押入部位の違いによる異性体
も含有する。所望のプラスミドｐＥｆ−７．５およびｐ
ＥＩ、７、６の各々の制限部位と機能地図をそれぞれ怒
付図の第９図および第１０図に示す。
実施例１３
７、ＰＥＬ７．５およびＳ．アムポファ／エンス／ ｐ
Ｉ！．１．、 ７ 。
Ｉ！．１．、 ７ 。
ｐＥｌ７．５の構成
実施例１２Ｃで得たＩ）ＮＡ（２０μ９）およびストレ
プトマイセス・アムポファソエンス（ Ｎ Ｒ Ｒ Ｌ
／１０． ２ ４ ２ ０ ）の１×１０個のプロトプ
ラストいて、所望の構成を、インターナショナル・パフ
リケーション（国際特許出願番号１″Ｃ’Ｆ／Ｇ Ｉｓ
７９１０００９５内）魚ＷＯ７９１０１１６９、実施
例２と実質的に同じ操作で行なう。所望の被形質転換体
を、抗生物質チオストレプトン（約５０μｇ／′Ｉ＋Ｉ
ｌ）オよび抗生物質ネオマイシン（１μｆ／ ／ｄ ）
を含むベネット培地の改変培地に移植することにより、
チオストレプトンおよびネオマイシン耐性かとうがて選
別する。得られるストレプトマイセス・アムポファンエ
ンス／ ＰＥｌ−７、ＰＩＩ：Ｉ、７．５およびＳ、ア
ムポファンエンス／ ｐＥｆ７ 、 ｐＦ、Ｌ７．６の
チオストレプトンおよびネオマイシン耐性コロニーを常
法で、採取し培養して構成するプラスミドの制限ｒｆｆ
素およびケル電気泳動分析により同定する。
プトマイセス・アムポファソエンス（ Ｎ Ｒ Ｒ Ｌ
／１０． ２ ４ ２ ０ ）の１×１０個のプロトプ
ラストいて、所望の構成を、インターナショナル・パフ
リケーション（国際特許出願番号１″Ｃ’Ｆ／Ｇ Ｉｓ
７９１０００９５内）魚ＷＯ７９１０１１６９、実施
例２と実質的に同じ操作で行なう。所望の被形質転換体
を、抗生物質チオストレプトン（約５０μｇ／′Ｉ＋Ｉ
ｌ）オよび抗生物質ネオマイシン（１μｆ／ ／ｄ ）
を含むベネット培地の改変培地に移植することにより、
チオストレプトンおよびネオマイシン耐性かとうがて選
別する。得られるストレプトマイセス・アムポファンエ
ンス／ ＰＥｌ−７、ＰＩＩ：Ｉ、７．５およびＳ、ア
ムポファンエンス／ ｐＥｆ７ 、 ｐＦ、Ｌ７．６の
チオストレプトンおよびネオマイシン耐性コロニーを常
法で、採取し培養して構成するプラスミドの制限ｒｆｆ
素およびケル電気泳動分析により同定する。
実施例１４
所望のプラスミドは、ブラスミｌ−’ Ｉ）ｉ土７およ
びｐＥｆ７．ｌ ｌ） Ｎ Ａの混合物の代わりにプラ
スミドｐＥＬ７およびｐＥｆ−７，２Ｄ Ｎ Ａの混合
物〔実施例９で調製したストレプトマイセス・アムポフ
ァシエンス／ ｐＥｆ７ 、 ｐＥｆ７．２から単離〕
を用いることを除いては、実施例１２Ａ、Ｃと実質的に
同じ操作で構成した。
びｐＥｆ７．ｌ ｌ） Ｎ Ａの混合物の代わりにプラ
スミドｐＥＬ７およびｐＥｆ−７，２Ｄ Ｎ Ａの混合
物〔実施例９で調製したストレプトマイセス・アムポフ
ァシエンス／ ｐＥｆ７ 、 ｐＥｆ７．２から単離〕
を用いることを除いては、実施例１２Ａ、Ｃと実質的に
同じ操作で構成した。
３．５ ｋｂのＰｓＬ ■フラグメントはプラスミドｐ
ＥＩ、７およびｐＥｆ７２のどちらか一方または両方と
連結するので種々の組み替えプラスミドが混成する。
ＥＩ、７およびｐＥｆ７２のどちらか一方または両方と
連結するので種々の組み替えプラスミドが混成する。
前述したように、これらの組み替えプラスミドも、３、
５ ｋＭ） 、ｔ ｔマイシン耐性伝達Ｐｓｔ Ｊフラ
グメントの方向によって２方向存在する。かくして、プ
ラスミドｐ Ｅ Ｌ ７と連結すると、プラスミドｐＥ
Ｉ、７．３およびｐＥｆ７．４が生じ、プラスミドｐＥ
Ｌ７．２と連結すると、所望のプラスミドＰＩ！：Ｌ７
．７およびｐＥｆ７８が生じる。また、プラスミドｐＥ
Ｌ７およびｐＥｆ７２は自己連結によっても修復する。
５ ｋＭ） 、ｔ ｔマイシン耐性伝達Ｐｓｔ Ｊフラ
グメントの方向によって２方向存在する。かくして、プ
ラスミドｐ Ｅ Ｌ ７と連結すると、プラスミドｐＥ
Ｉ、７．３およびｐＥｆ７．４が生じ、プラスミドｐＥ
Ｌ７．２と連結すると、所望のプラスミドＰＩ！：Ｌ７
．７およびｐＥｆ７８が生じる。また、プラスミドｐＥ
Ｌ７およびｐＥｆ７２は自己連結によっても修復する。
プラスミドｐＥＩ、７．７は、３．５ ｋｌ）のネオマ
インン耐性伝達、４ユ■フラクメントのＳａｌ Ｊ制限
部位（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｌｉａｍ ＩＩＩ ）を１．
５ ｋｂのチオストレプトン耐性伝達ＢａｍＨ）フラグ
メントのＰｖｕ ＩＴ制限部位に最も遠くなるように挿
入した組み替えプラスミドを表わす。プラスミドＰＩ！
：Ｉ、７．８は、３．５ ｋｂのネオマイシン耐性伝達
１’ｓＬ Ｉフラグメントかその逆方向である組み替え
プラスミドを表わす。かくして、最後に得られたＩ）
Ｎ Ａの＠濁液は、プラスミドｐＥＬ７ 、 ＰＥｌ７
，２ 、 ＰＥｌ７，３ 、 ＰＥｌ７，４ 、 ｐＥ
Ｌ７．７ 。
インン耐性伝達、４ユ■フラクメントのＳａｌ Ｊ制限
部位（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｌｉａｍ ＩＩＩ ）を１．
５ ｋｂのチオストレプトン耐性伝達ＢａｍＨ）フラグ
メントのＰｖｕ ＩＴ制限部位に最も遠くなるように挿
入した組み替えプラスミドを表わす。プラスミドＰＩ！
：Ｉ、７．８は、３．５ ｋｂのネオマイシン耐性伝達
１’ｓＬ Ｉフラグメントかその逆方向である組み替え
プラスミドを表わす。かくして、最後に得られたＩ）
Ｎ Ａの＠濁液は、プラスミドｐＥＬ７ 、 ＰＥｌ７
，２ 、 ＰＥｌ７，３ 、 ＰＥｌ７，４ 、 ｐＥ
Ｌ７．７ 。
ｐＥｆ７．８などのプラスミドを含有し、実施例８およ
び１０で記載した理由から、プラスミドｐＥＩ−７，３
，ｐＥＩ、７．４ 、ｐＥｆ７．７およびｐ Ｉｉ Ｉ
−７，１３の押入部位の違いによる異性体も含有する。
び１０で記載した理由から、プラスミドｐＥＩ−７，３
，ｐＥＩ、７．４ 、ｐＥｆ７．７およびｐ Ｉｉ Ｉ
−７，１３の押入部位の違いによる異性体も含有する。
所望のプラスミドｐＥＬ７．７およびｐ Ｅｆ−７，８
の各々の制限部位と機能地図をそれぞれ添付図の第１１
図および第１２図に示す。
の各々の制限部位と機能地図をそれぞれ添付図の第１１
図および第１２図に示す。
実施例１５
実施例１４で調製したＩ） Ｎ Ａを用いて、所望の被
形質転換体を実施例１３と実質的に同じ方法で行なう。
形質転換体を実施例１３と実質的に同じ方法で行なう。
得られるストレプトマイセスーアムホファシエンス／
ＰＥ ｒ−７、ＰＩ’：Ｌ７．７および５．アムボファ
シエンス／ ｐＥｆ７ 、 ｐＥｆ７８のチオストレプ
トンおよびネオマイシン耐性コロニーを常法で、採取し
培養して構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電気
泳動分析により同定した。
ＰＥ ｒ−７、ＰＩ’：Ｌ７．７および５．アムボファ
シエンス／ ｐＥｆ７ 、 ｐＥｆ７８のチオストレプ
トンおよびネオマイシン耐性コロニーを常法で、採取し
培養して構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電気
泳動分析により同定した。
実施例１６
単
プラスミドｐＬＲ５およびｐＬＲ５は、プラスミドｐＬ
Ｒ１の代わりにプラスミドｐＥＩ、７を用いることを除
いては、実施例５Ａ、Ｃと実質的に同じ操作で調製する
。挿入するプラスミドｐＥＬ７１） Ｎ Ａの方向によ
って２方向の組み替えプラスミドが生じる。また、実施
例８で記載した理由から、プラスミドｐＬＲ５およびＰ
ＬＲ６の挿入部位の違いによる異性体も生成する。プラ
スミドｐＬＲ５およびＰｌ」（６のそれぞれの制限部位
と機能地図を添付図の第１３図および第１４図に示す。
Ｒ１の代わりにプラスミドｐＥＩ、７を用いることを除
いては、実施例５Ａ、Ｃと実質的に同じ操作で調製する
。挿入するプラスミドｐＥＬ７１） Ｎ Ａの方向によ
って２方向の組み替えプラスミドが生じる。また、実施
例８で記載した理由から、プラスミドｐＬＲ５およびＰ
ＬＲ６の挿入部位の違いによる異性体も生成する。プラ
スミドｐＬＲ５およびＰｌ」（６のそれぞれの制限部位
と機能地図を添付図の第１３図および第１４図に示す。
実施例１７
Ｅ、コリに１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＬＲ５およびＥ、コリ
に１２ＨＢＩＱ１．／ｐＬＲ５の構成 所望の構成は、プラスミドＰＬＲ２の代わりにブラスミ
ドｐＬＲ５およびｐ Ｉ−ｋ ６１一実施例１６で調製
〕を用いて形質転換することを除いて（４、実施例３と
実質的に同じ操作で行なう。生き残るコロニーを選別し
、予想表現型（ＡｍｐＲ，−１’ｅｔＳ）かどうかを試
験すると、これは所望の被形質転換体ｌ・２．コＩＪ
Ｋ１２ Ｉ（ＢＩＯＩ／ＰＬＲ５オヨｉＪ”］！：、
：］ ＩＪ Ｋ１２ ｆｌｌｓ１０１／ｐＬ Ｒ５であ
る。得られる被形質転換体コロニーを既知方法で採取し
培養して、構成するプラスミドの制限酵素およびケル電
気泳動分析による常法で同定する。
に１２ＨＢＩＱ１．／ｐＬＲ５の構成 所望の構成は、プラスミドＰＬＲ２の代わりにブラスミ
ドｐＬＲ５およびｐ Ｉ−ｋ ６１一実施例１６で調製
〕を用いて形質転換することを除いて（４、実施例３と
実質的に同じ操作で行なう。生き残るコロニーを選別し
、予想表現型（ＡｍｐＲ，−１’ｅｔＳ）かどうかを試
験すると、これは所望の被形質転換体ｌ・２．コＩＪ
Ｋ１２ Ｉ（ＢＩＯＩ／ＰＬＲ５オヨｉＪ”］！：、
：］ ＩＪ Ｋ１２ ｆｌｌｓ１０１／ｐＬ Ｒ５であ
る。得られる被形質転換体コロニーを既知方法で採取し
培養して、構成するプラスミドの制限酵素およびケル電
気泳動分析による常法で同定する。
実施例１８
プラスミドｐ Ｌ Ｒ５は、Ｅ、コリＫ１２１１鳳５Ｉ
ＯＩ／ｐＬ’Ｒ５（’一実施例１７で調製〕から常法に
より単１１１１Ｆし、実施例１３と実質的に同じ操作で
ストレプトマイセス・アムホファシエンス／ｐＥｌ−７
に移入スる。コロニーを選別して、所望の被形質転換体
ストレプトマイセス・アムポファシエンス／ ｐＬＩ（
５を構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動
分析により同定する。
ＯＩ／ｐＬ’Ｒ５（’一実施例１７で調製〕から常法に
より単１１１１Ｆし、実施例１３と実質的に同じ操作で
ストレプトマイセス・アムホファシエンス／ｐＥｌ−７
に移入スる。コロニーを選別して、所望の被形質転換体
ストレプトマイセス・アムポファシエンス／ ｐＬＩ（
５を構成するプラスミドの制限酵素およびゲル電気泳動
分析により同定する。
上記の操作により構成し得る代表的プラスミドは以下に
列記するとおりである。
列記するとおりである。
個々のプラスミド塩は、その構成がら得られる挿入部位
の違いによる異性体と方向の違いによる異性体の全てを
表わし包含する。
の違いによる異性体と方向の違いによる異性体の全てを
表わし包含する。
ｐ Ｌ Ｒ７ｐ Ｂ Ｒ３２２とｐＥＬ７，１ｐＬＲ８
ｐＢＲ３２２とＰＩ！、Ｋ７．２ｐＬＲ９ｐＢＲ３２２
とｐＥＩ、７．３ｐＬＲ１０ｐＢＲ３２２とｐ Ｅ Ｌ
７．４ＰＬＲＩＩ ＰＢＲ３２２と
ｐＥＩ−７，５ｐＬＲ］ ２ ｐＢＲ
３２２とｐ Ｅ Ｌ ７．５ｐＬＲ１３ｐ１３Ｒ３２２
とｐ Ｅ Ｉ−７，７ｐ Ｌ Ｒ１４ｐ Ｂ Ｒ３２２
とｐＥＬ７．８プラスミドｐ Ｌ Ｋ７からｐＬＲ１４
の代表的被形質転換体は以下に列記するとおりである。
ｐＢＲ３２２とＰＩ！、Ｋ７．２ｐＬＲ９ｐＢＲ３２２
とｐＥＩ、７．３ｐＬＲ１０ｐＢＲ３２２とｐ Ｅ Ｌ
７．４ＰＬＲＩＩ ＰＢＲ３２２と
ｐＥＩ−７，５ｐＬＲ］ ２ ｐＢＲ
３２２とｐ Ｅ Ｌ ７．５ｐＬＲ１３ｐ１３Ｒ３２２
とｐ Ｅ Ｉ−７，７ｐ Ｌ Ｒ１４ｐ Ｂ Ｒ３２２
とｐＥＬ７．８プラスミドｐ Ｌ Ｋ７からｐＬＲ１４
の代表的被形質転換体は以下に列記するとおりである。
Ｅ、コ リ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬｋ７Ｅ、コリ
に１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲ８Ｅ、コリに１２ １（
ＢＩＯＩ／ＰＬＲ９■・；、コリに１２ １月３１０１
． ／Ｐ Ｉ、１（１０Ｅ、コリｘ１２ ｏｎ１ｏ１
／ｐＬＲ１１１と、コ リ Ｋ１２ １−ｉＢｌ、ｌ
）１／ｐＬＲ１２ト２．コリに１２ ＨＢＩＱ１／ｐ
ＬＲ１３ｐ、コリに１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＬＲ１４ス
トレプトマイセス・アムホファシエンス／ ｐ Ｆ、
ｌ・７．ｐｆ、Ｒ７ストレプトマイセス・アムポファシ
エンス／ ｐ ｌ礼ｌ、７．ｐｌ−１ζ９ストレプトマ
イセス・アムボファシエンス／ｐＥ＋−７、ｐｌＴ（］
１
に１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲ８Ｅ、コリに１２ １（
ＢＩＯＩ／ＰＬＲ９■・；、コリに１２ １月３１０１
． ／Ｐ Ｉ、１（１０Ｅ、コリｘ１２ ｏｎ１ｏ１
／ｐＬＲ１１１と、コ リ Ｋ１２ １−ｉＢｌ、ｌ
）１／ｐＬＲ１２ト２．コリに１２ ＨＢＩＱ１／ｐ
ＬＲ１３ｐ、コリに１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＬＲ１４ス
トレプトマイセス・アムホファシエンス／ ｐ Ｆ、
ｌ・７．ｐｆ、Ｒ７ストレプトマイセス・アムポファシ
エンス／ ｐ ｌ礼ｌ、７．ｐｌ−１ζ９ストレプトマ
イセス・アムボファシエンス／ｐＥ＋−７、ｐｌＴ（］
１
第１図はプラスミドｐＥＬ７の制限部位と機能地図を示
す。第２図はプラスミドｐｆ、１（］の制限部位と機能
地図を示す。第３図はプラスミドｐｌＲ２の制限部位と
機能地図を示す。第４図はプラスミドｐＬＲ４の制限部
位と機能地図を示す。第５図はプラスミドｐＥＬ７．ｌ
の制限部位と機能地図を示１〜。 第６図はプラスミドＰＥＬ７，２の制限部位と機能地図
を示す。第７図はプラスミドＰＥ■、７．３の制限部位
と機能地図を示１゜第８図はプラスミドＰ１“；【−７
４の制限部位と機能地図を示す。第９図はプラスミドｐ
１″：Ｌ７．５の制限部位と機能地図を示す。第１０図
はプラスミドｐＥＬ７．５の制限部位と機能地図を示す
。第１１図はプラスミドＰＥＬ７．７の制限部位と機能
地１火１を示す。第１２図はプラスミドｐＥＬ７８の制
限部位と機能地図を示す。第１３図はプラスミドｐｆ−
Ｒ５の制限部位と機能地図を示す。 第１４図はプラスミドｐＬＲ５の制限部位と機能地図を
示す。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンベ
ニー第 ／ 図 第２図 第３図 ｓｔＩ 第弘図 旦ηＲＩ ａｍＨＩ 第５図 第 乙 図 第７図 ａｌ Ｉ 第に図 第９図 第７０図 第１／図 第１２図 第７３図 ＥｃｏＲＩ 第１弘図 第１頁の続き １／３６５ １ ／４４ １／’５４ （２多発 明 者 ジエフリー・ティー・フェイアーマ
ン アメリカ合衆国インティアナ州 インディアナポリス・イースト ・カロリー・コート３６１７番地 （７多発 明 者 ジェイムズ・エイ・メイブアメリカ
合衆国インディアナ州 インディアナポリス・リトル・ オーク・レーン７４１０番地
す。第２図はプラスミドｐｆ、１（］の制限部位と機能
地図を示す。第３図はプラスミドｐｌＲ２の制限部位と
機能地図を示す。第４図はプラスミドｐＬＲ４の制限部
位と機能地図を示す。第５図はプラスミドｐＥＬ７．ｌ
の制限部位と機能地図を示１〜。 第６図はプラスミドＰＥＬ７，２の制限部位と機能地図
を示す。第７図はプラスミドＰＥ■、７．３の制限部位
と機能地図を示１゜第８図はプラスミドＰ１“；【−７
４の制限部位と機能地図を示す。第９図はプラスミドｐ
１″：Ｌ７．５の制限部位と機能地図を示す。第１０図
はプラスミドｐＥＬ７．５の制限部位と機能地図を示す
。第１１図はプラスミドＰＥＬ７．７の制限部位と機能
地１火１を示す。第１２図はプラスミドｐＥＬ７８の制
限部位と機能地図を示す。第１３図はプラスミドｐｆ−
Ｒ５の制限部位と機能地図を示す。 第１４図はプラスミドｐＬＲ５の制限部位と機能地図を
示す。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンベ
ニー第 ／ 図 第２図 第３図 ｓｔＩ 第弘図 旦ηＲＩ ａｍＨＩ 第５図 第 乙 図 第７図 ａｌ Ｉ 第に図 第９図 第７０図 第１／図 第１２図 第７３図 ＥｃｏＲＩ 第１弘図 第１頁の続き １／３６５ １ ／４４ １／’５４ （２多発 明 者 ジエフリー・ティー・フェイアーマ
ン アメリカ合衆国インティアナ州 インディアナポリス・イースト ・カロリー・コート３６１７番地 （７多発 明 者 ジェイムズ・エイ・メイブアメリカ
合衆国インディアナ州 インディアナポリス・リトル・ オーク・レーン７４１０番地
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ａ）プラスミドＰＥＬ７ ＜第１プラスミド）お
よび ｂ）プラスミドｐ ＥＬ７の制限フラグメントならひに
形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主細胞
に移入したとき少なくとも１つの抗生物質に対する耐性
を伝達する１つ以上の異なるＤＮＡ断片を含み、機能向
でプラスミドｐＥＬ’７に依存しているもう１つのプラ
スミド（第２プラスミド）を含む１組の組み替えＤＮＡ
クローニング・ベクター。 （２）第２プラスミドの１つ以上のＤＮＡ断片が抗生物
質チオストレプトンおよびネオマイシンのどちらか一方
または両方に対する耐性を伝達する断片である特許請求
の範囲（１）記載の１組のベクター。 （３）プラスミドｐ ＥＬ７である組み替えＩ） Ｎ
Ａクローニング・ベクター。 （４ンプラスミドｐＦ−Ｉ−７の制御堰フラグメントな
らびに形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿
主細胞に移入したとき少なくとも１つの抗生物質に対す
る耐性を伝達する１つ以上の異なるＩ） ＮＡ断片を含
む、機能向でプラスミドｐＥＩ−７に依存したプラスミ
ドである組み替えＩ） Ｎ Ａクローニング・ベクター
。 （５）プラスミドＰＥＬ７．１ 、 ｐＥＬ ７゜２
、 ｐＥＬ７，３ 。 ＰＥＬ７．４ 、 ｐＥＩ−７，５、ｐＥｒ−７，６、
ｐＦ、Ｉ−７，７またはｐＥＬ ７．８である特許請求
の範囲（４）記載のベクター。 （６）プラスミドｐＬＲｌ 、 ＰＩ−Ｒ２またはｐＬ
Ｒ４である組み替えＤＮＡクローニング・ベクター。 （７） ａ）Ｆ、、コリ・プラスミドの抗生物質耐性伝
達制限フラグメントを含むＥ、コリ機能性レプリコンお
よび ｂ）■プラスミドｐＥＩ−７および ■プラスミドｐＦ、Ｌ７のｆａｌｌ≦艮フラグメントな
らひに形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿
主細胞に移入したとき少なくとも１つの抗生物質に対す
る耐性を伝達する１つ以上の異なるＩ） Ｎ Ａ断片を
含み、機能向でプラスミド１）Ｉ゛土７依存しているも
う１つのプラスミド を含む１組の組み替えＤ Ｎ Ａクローニング・ベクタ
ーからの制限フラグメント を含む、Ｅ、コリにおいて機能性で、スＩ・レプトマイ
セス属菌に移入されたとき機能面でプラスミドｐｔ：Ｌ
７に依存している組み替えＩ） Ｎ Ａり【〕−ニング
・ベクター。 （８）フ０ラスミドｐＬＲ５、ｐｌ、、ｌζ５ 、 ｐ
ＬＲ７、１）ＬＲ９またはｐＬＲｌｌである特許請求の
範囲（７）記載のベクター。 （９）プラスミドｐｌｉｌ、７である組み替え１）ＮＡ
クローニング・ベクターを含む被形質転換無制限宿主細
胞。 ０ｆ）ａ）プラスミドｐＥＩ−７およびｂ）プラスミド
ｐ Ｆ、ｒ−７の制御ｊ艮フラグメントならび（こ形質
転換、細胞分裂および培養のｉｉｌ能な感受性宿主細胞
に移入したとき少なくとも１つの抗生物質 − に対する耐性を伝達する１つ以−１−の異なるｌ） Ｎ
Ａ断片を含み、機能面てプラスミドｐｉ’：ｆ−７に
依存しているもう１つのプラスミド を含む１組の組み替えＩ） Ｎ Ａクロ−ニンノ／゛〜
ベクターを含む特許請求の範囲（９）記載の細胞。 ０１）プラスミドｐＥＩ、７の制限フラグメントならひ
に形質転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主細
胞に移入したとき少なくとも１つの抗生物質に対する耐
性を伝達する１つ以上の異なる１）ＮＡ断片を含む、機
能面でプラスミドＰＩ！：Ｌ７に依存したプラスミドで
ある組み替え１）ＮＡクローニング・ベクターを含む特
許請求の範囲ＧＯ記載の細胞。 ０４ストレプトマイセス、ストレプトスボランジウム、
アクチノプランズ、ノカルディア、マイクロモノスポラ
、バチルスまたはスタフィロコッカス属の無制限細胞で
ある特許請求の範Ｉ、！１ｌ（９） 、 ＧＯまたは０
１）記載の細胞。 （１３ａ） Ｅ、コリ・プラスミドの抗生物質耐性伝達
制限フラグメントを含むＥ、コリ機能性レプリコンおよ
び ４− ｂ）■プラスミドｐＥＬ７および ■プラスミドｐＥＬ７の制限フラグメントならひに形質
転換、細胞分裂および培養の可能な感受性宿主細胞に移
入したとき少なくとも１つの抗生物質に対する耐性を伝
達する１つ以−」１の異なるｌ） Ｎ Ａ断片を含み、
機能面でプラスミド１）Ｅｌ−７に依存しているもう１
つのプラスミド を含む１組の組み替えＩ） Ｎ Ａクローニング・ベク
ターからの制限フラグメント を含む、Ｅ、コリにおいて機能性で、ストレプトマイセ
ス属菌に移入したとき機能面でプラスミドｐ Ｅｌ７に
依存している組み替え］） Ｎ Ａクローニング・ベク
ターを含む被形質転換無制限宿主細胞。 ０ΦＥ、コリである特許請求の範囲（１：９記載の細胞
。 ＯＱストレプトマイセスである特許請求の範囲０４記載
の細胞。 （ＩＱストレプトマイセス属の種フランアエ、アラレオ
ファシェンス、コエリコロールまたはアムホファシエン
スである特許請求の範囲０４または０υ記載の細胞。 ０７１ストレプトマイセス・アムボファシエンスである
特許請求の範囲Ｑｆｉｌ記載の細胞。 α均ストレプトマイセス・アムポファシエンス／ＰＥＬ
７ ＣＮＲＲＬ １２５２３ ）を深部通気培養の条
件下に同化できる炭素〃、窒素源および無機質を含有す
る栄養培地でｐＩ−１５〜９の範囲内で１５〜４５°Ｃ
の範囲の温度で培養して得られる細胞を採取し、溶解し
て、溶解物の上清を溶媒抽出し、抽出物からプラスミド
Ｄ Ｎ Ａを沈澱させ、沈澱物からプラスミドｐＥＬ７
を分離することから成るプラスミドｐＥＬ７の単離方法
。 ０９すυ１ｄｌｌｉ処理したプラスミドｐＩＪ２と呻１
１処理したプラスミドｐＢＲ３２２とを連結することか
ら成るプラスミドｐＬ）Ｌｌの製造方法。 （イ）Ｈｉｎｄ ＩＩＩ処理したプラスミドｐＵ６ζ唐
り］′１１処理したプラスミドｐＢＲ３２２とを連結す
ることから成るプラスミドＰ目（２の製造方法。 （ハ）μｉｍ Ｉ−（１処理したプラスミドＰＬＲ２と
ヤ思ｔｌ Ｉ処理したプラスミドｐＢＲ３２２とを連結
することから成るプラスミドｐＬＲ４の製造方法。 （ハ）感受性宿主細胞に移入したとき少なくとも１つの
抗生物質に対する耐性を伝達する１つ以上の異なるＩ）
Ｎ Ａ断片をプラスミドｐＥＬ７の制限フラグメント
と連結し得られる組み替えｌ） Ｎ Ａを自己連結させ
て当該機能依存型プラスミド゛を製造することを含む、
機能面でプラスミドＰ目、７に依存したプラスミドの製
造方法。 （ハ）Ｉ） Ｎ Ａ断片が抗生物質チオストレプトンす
る耐性を伝達する特許請求の範囲（２）記載の方法。 Ｎ Ｂａｍ Ｉ−１ １処理したプラスミドＩ）Ｉ 、
Ｒ ２と１％；ｕｎｌｌｌ処理したプラスミドｐＥＬ７
とを連結することから成るプラスミドｐｌ’：Ｉ− ７
． １および１）？’．ｌ・７２を製造する特許請求の
範囲〃や記載の方法。 （２）Ｉ） Ｎ Ａ断片か抗生物質ネオマイシンに対す
る耐性を伝達する特Ｗ１−請求の範Ｌ！ｌ（ＬＡ記載の
方ｆＪテ。 （至）Ｉ’ｓｔｌ処理したプラスミドｐａｌζ１とＰｓ
＋ １処理したプラスミドｐＥ１７とを連結すること
かり成るプラスミドｐＥＬ ７． ３およびＨ）ｔ：Ｌ
７， ４を製造する特許請求の範囲（ハ）記載の方法
。 （ハ）］） Ｎ Ａ断片が抗生物質チオストレプトンお
よびネオマイシンに対する耐性を伝達する特許請求の範
囲＠記載の方法。 ＠ＰｓｔＩ処理したプラスミドｐＥＩ−７および真ト■
処理したプラスミドｐｌｉＬ ７， ｌの混合物とＰｓ
ｔ− １処理したプラスミドｐ ＬＲｌ とを連結する
ことから成るプラスミドｐＥＬ ７． ５およびｐＥＩ
− ７． ５を製造する特許請求の範囲＠記載の方法。 翰Ｐｓｔｌ処理したプラスミドｐＥＩ−７およびＩ’ｓ
ｔＩ処理したプラスミドＰＩ！：Ｉ− ７． ２の混
合物とＰｓｔｌ処理したプラスミドｐＬＲ ｌとを連結
することから成るプラスミドｐＥ■． ７． ７および
ｐＥＬ ７． ｓを製造する特許請求の範囲＠記載の方
法。 （至）ａ） Ｋコリ・プラスミドの抗生物質耐性伝達制
限フラグメントを含むＥ．コリ機能性レプリコンおよび ｂ）■プラスミドｐＥＬ７および ■プラスミドＩ）ｌ！：Ｉ−７のＩｌｌ ＋≦艮フラグ
メントならひ（こ形質転換、細胞分裂および培養の可能
な感受性宿主細胞に移入したとき少なくとも１つの抗生
物質に対する耐性を伝達する１つ以上の異なるｌ） Ｎ
Ａ断片を含み、機能面でブラスミｌＳｐｌ上７に依存
しているもう１つのプラスミド を含む１組の組み替えＩ） Ｎ Ａクローニンクーベク
ターからの制限フラグメント を含む、Ｅ．コリにおいて機能性で、ストレプトマイセ
ス ｐＥＩ−、７に依存しているプラスミドの製造力を夫。 ０υｌｓａｍｌ−１ １処理したプラスミドＰト、１７
と！Ｓａ＋ｉ＋ｌｌ １処理したプラスミドｐ １ｓ
ｔｔ ３２ ２とを連結することから成るプラスミドｐ
ＬＲ５およびｐｌ−、Ｒｆｉを製造する特許請求の範囲
（７）記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/312,446 US4416994A (en) | 1981-10-19 | 1981-10-19 | Plasmid pEL7 and related cloning vectors for use in streptomyces and related organisms |
| US312446 | 1981-10-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5879997A true JPS5879997A (ja) | 1983-05-13 |
Family
ID=23211479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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