JPS5892618A - 混合ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は温血動物におけるポリリボシルリピト−ルホス
フｘ　−）　（ｐｏｌｙｒｔｂａａｙｌ　ｒｉｂｉｔｏ
ｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ　）（Ｐ　ＲＰ　）抗体形成を酩
発するため０混合９クチンＶＣ＠する。また１本発明は
病原菌。

ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｍｍｏｐｈｉｌ
ｕｍｉ％ｆ１ｍｍｎｓａｍ）ｂ型によって引き起こされ
る全身的感染に対する活性な免疫を温血動物中に訪発さ
せるための方法に関する。

温血動物中におけるＰＲＰ抗体形成を肪発するための混
合ワクチンが発見された。この混合ワクチンはへモフイ
ルス・インフルエンザエ６Ｗ（例１ｄｃｔｃ−株（Ａ’
７’ＣＣ３１４４１）、Ｒａｂ菌株（ＡＴＣＣ３１５１
２）〕から単離し且つ精製したカプセル状の（６ａｐａ
ｕｊａ−ｒ）多＆＃３ｐｔｔｐ及び百日咳−（Ｈｏｒｄ
ａｔｍｌｌａ　ｐａｒｔ’ｓｔｔａｉｍ’）の外側膜成
分から単喉し且つ精製した抗原から成る。

別の実施形態において該ポリリ？シルリビトールホスフ
ェートがへモフイルス・インフルエン―ｘｈ型Ｒａｋ鉋
体（ＡＴＣＣ３１５１！　）から得られ［１，つ百日咳
−抗原が百日咳−抗原１３ｇ（Ａｆｆ”ＣＣ１０３８０
）から得られる。１！に他の実施態様に２いて、該温血
−物は人の幼児である。

温皿動１中に病原−へモフイルス・インフルエンザエ６
４によって生じる全身的ＰＩＩ４染に対する活性な免疫
を生じさせるための方法もまた＠明された。この方法は
、ヘモフィルス・インフルエンザより型から単離し１１
つ精製したカプセル状多糖類ＰＲＰ及び少なくとも１ｍ
の百日映画の外＠ｓ膜成分ら単離し且つ精製した抗原か
ら成る混合ワクチンの免役原的な咳を投与することから
成る。

ヘモフイルス−インフルエンイエ１ｄｙｊｅ！ＪＩＪ＆
シルリビトールホス□ｉフエー）　（ＰＲＰ）の単離ト
精製は既に知られている・ 百日咳劇（目体１３８）細胞をボルデーソヤング−（Ｂ
ｏｒｄａ　ｔ−Ｇａｎｇｏｗ）　＄地上で生育させ、３
丁℃で一回二次培養し１次いでコーエン（Ｃｏｋｅｓ）
及びホイーラー０へ−ｍｌｅデ）（以下Ｃ０Ｗ、と記載
する）培地の培養に使用する。生育及び培養は、参考と
してここに挙ける。アメリカン・Ｖ−ヤーナル・オプ・
パブリック・ヘルス３ｇ、３７１〜ＩＴ＠（１９４０）
中ＶＣ，：ｙ−ｘｙ（Ｓ０Ｍ。

（ｓｈｏｗ）及びホイーラー（Ｍ、　Ｗ、　Ｗｈｅｅｌ
−デ）が記載しているものと同様である。微生物を４０
０−の醗酵のために培養する種子として、　Ｃ，Ｗ。

プｏｘ　（ｉｒｅｔ＆）（４０ｍ　）中で生育させる。

次いでＣ，Ｗ、　液体培地を用いて４００１の醗酵を行
なう、１４時間の生育後に、遠心分離によって微生物を
採取し、リン酸塩で緩衝した食塩水（０，ｔＭ、ｐＨ’
１．ｏ　）中に懸濁させ且つ０．０１５−のチメロサー
ルによって不活性化する。

外側膜成分はリゾチーム処理方法及び塩化リチウム−酢
酸リチウム（以下ＬｉＣＬ−ＬｉＡａ）方法によって細
胞から単離する。

リゾチーム処理方法 百日咳菌細胞（湿潤型１ｉＬＩＪＩ）を１６−の氷冷し
た蒸留水中にｋｍさせる６次いで下８己の試薬を加える
１（ａ）ｌｉｄの２ＭｘクローｘＩ（＆）ｔｏ−のαＩ
Ａｆ（）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］　、
ＨＣｌ　（以下トリス・ＨＣＩと略す）（４℃において
ｊｌＢ７．８　）　ｔ（ａ）Ｏ４ｉｌＯ１％Ｎ＠ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ７，０）ｚ　及び（ｄ′）１８ｄのＬＯ１１リ
ゾチーム。

この混合物を３０℃に加温したのち、その温度で３０分
保つ、３０分の保温後に、４００μＩのデオキシリがヌ
クレアーゼを加えて、溶液の粘度を低下させる。

この愁濁叡を３０℃において６０分間２へ０００Ｘｊ’
（ｌａｏｏｏ回転／分）で遠心分離して、スフェロプラ
スト（ａｐｈｓｒｏｐＬａａｔ）を除去する。上澄液中
の外側膜を布ｋｌｃＬ（０，２Ｎ）でｐＨを一〇に調節
することによって沈澱させ、ａｓ、ｏｏｏｘｙ（１７，
０００［ｇ１転／分）で１５分間遠心分離する。

沈鹸した外ｌ１ＩＩ膜を氷冷した＃貿水で２回洗浄した
のち、−２０℃で保存する。

この処理によって得られるドデシル硫葭ナトリウムーポ
リアクリルアミドｒル電気泳１１１２１における外側膜
成分のデ四フィル（ｐｒｏｆｉｌｍ）を第１図に示す、
ドデシル硫酸ナトリウム−ボリアクリルアｉドｒル電ス
泳動け、０．３３Ａｆのトリス・ＨＣＬ緩衛液（ｐＢ＆
８）とαｌ嘩のドデシル憾酸ナトリウム全含有する１０
ｃｍの１０％アクリルア建ドｒル中で行なう、適用する
前に、試料を０．０６２５Ｍのトリス・ＨＣＬ　（ｐＨ
６，８）、２％のドデシル硫酸ナトリウム、１（ｌのグ
リセリン及び５％の２−メルカプトエタノールを含有す
る緩ｍｇ中に溶解する。

Ｌ４ＣＬ−ＬｉＡ一方法 ２ｉＩのｔＭ詞夏輩の百日咳−細胞を２０１の蒸貿水で
２回洗浄して、４０１１ｊの２０１）　ｍ、ＭＬｉｃｌ
と１００　ｍＭ（ＤＬｉＡｃ　（ｏ　Ｉｉ　６．０　、
コ（Ｄ場合ｕＬｃＡ緩倒剤）中に懸陶させる。この懸濁
液を６１ｍのｆラスピーズの存在下に４５℃において２
時ｒ’！］敏しく振とりする（１６０振励／分）、かく
して得られる混合物を遠心分ｉｖ機に移し、ビーズをα
５−のＬＣＡ緩倫欣によって１回洗浄する。洗浄液を遠
心分離機に加える。次いで混合物を１へ０００回転／分
（１λ０００×ＩＩ）で４℃において１５分間遠心分喘
する。上１ｌｌｔ液を、東め、ｐ＋び４℃において１４
５００回転／分（２５，０００Ｘ＃）で遠心分離する。

次いで果めた上漬液を、予め１０ｍＡ／のトリスＨＣ４
ｄ、液、ｐＨ＆０．２００ｍＭ（ＤＮａＣｌ及びα０２
％（＊ｔ／ｇｉ）ナトリウムアシド（この場合はＴＳ緩
衝液）で平衡させである＆０Ｘ６０ａａのセファｏ−ｘ
（ｓａｐ五ｃｒｏｓｓ）　６　Ｂ　ＣＬカラムに加える
。

カラムをＴＳｐ賃液で溶出する。谷画分の吸光度をＱ　
８０　ｎｍで６１１定する。各ピークの一分を集めて、
１ｑ蛋白質／Ｗ１１まで機動する。

この処理によって得られる外側膜成分のセファロースｓ
Ｂ　　ＣＬカラムクロマトダラフイープロフィルを第２
図に示す、１ａ２図に示す成分−一りＩ及び夏のドデシ
ル個ｔＶナトリウムーボリアクリルア（ドｒル電気泳動
における蛋白質プロフィルを更に、それぞれ第３図と第
４図に示す。

本発明のワクチンの７製に対する出発材料は。

積装したヘモフィルスφイーンフルエンザより型ＰＲＰ
及び百日咳菌から単一１した少なくとも１の積装した外
側膜蛋白質である。外側膜という術飴は包括的なものと
し、ａ胞質腓に対して外側にある１以上の膜を包含する
。すなわち、外側膜という術飴は細胞質膜は除外する。

ＰＲＰワクチンをｖ！４製するには、凍結乾燥したＰＥ
Ｐをｐｆｉ７．０のリン葭鳩級伽食塩水（ＰＢＸ）中に
溶解する。ＰＲＰ浴液を０，２２μミリポア（ＭｉｌＬ
ｉｐｏデ＃）フィルターを用いる膜濾過によって滅−す
る。滅国したワクチンを使用時まで４℃で保存する。

ＰＲＰ−百日咳回外側膜成分混合ワクチンは。

ＰＲＰを過当な緩衝液中に溶解した種々の濃度の少なく
とも１４１ＪＩの積装した外１１１１膜成分と混合する
ことによって調製する。

実施例Ｉ Ｑ、３　ｗ＋ｌのＰ　ＲＰ給液（Ｉ　Ｗ／　禦ＩＰ　Ｂ
　Ｓ　）及びリゾチーム処理によってａｍｋした＆６ｉ
の百日咳陳外側膜（８３θμＩｉ蛋白賀／Ｍｌ”ＢＳ）
を０．Ｏｌチのチメロサールを含有するＩ　Ｌ　１　ｍ
ｌｔ）ＰＢＳＪＩＣ加えて、１回の服用賞（Ｑ、５ｍｇ
）当り１０μｌのＰＲＰと１００＃＃の蛋白質を含有す
るワクチンとする。

次いで混合ワクチン（１回電当りｏ、　ｓ　ｉｔｇ　）
を若いラットに１週Ｖｃ１回、３瑞間にわたって注射す
る。各ネズンの年令及び血統は同一である。

上記の方法によって別々に調製したワクチンｌ及び２に
対する抗体応答の結果は下表のとおりである暑 １　　　　　　　ｉｌｌ　　　　　５　　　　　８０ｍ
　　　　　　２１１・　　　　６　　　５９６１　　　
　　　７０　　　　　？　　　　　１４１１４　　１０
　８　　ロ０ 最初の注射の３週恢に、血清をＰＲＰＡｋについて−ベ
る。ｐＲｐの測定に対して・ｋ柑するラジオイム／アッ
セイ（ＲＩＡ）方法は文献に記載されている。

前記の方法によって調製したＰＲＰのみを注射したラッ
トは、約ｇｇｓｙ７’ｍのＰＲＰ抗俸力１曲を示す。Ｐ
ＲＰのみを注射し光ラットの年令及び血統は前記混合ワ
クチンを注射したラットと同様である。

実施例２ ｏ、　ａ　ＩＪのｐＲｐ浴液（１η１ｄＰＢｓ）、及び
リゾチーム処理方法に１つて調製した１、５ｉ＊ｔ（１
〜蛋白質１ｖｔＰＢｓ）の百日＠園外ＩＩ膜を、住０１
優のチメロサールを含有する１＆２−のＰＢＳに別えて
、１回の投与首（α５１）当りに１０μｇのＰＲＰと５
０μＩ゛の蛋白質を含有するワクチン溶液とする。

次いでこの混合ワクチン（１回１［：　０．５　Ｎ　）
を若いラットに注射する。注射ｉｉ１ｉｌｌで３週間に
わたって行なう、各ラットの年令と血統は同一である。

上記の手ＩＩＭによって別々に調製したワクチンｌ。

２及び３に対する抗体応答の結果は下ｄ１うのとおりで
ある。

１　　４４（ｌ　　　　ｍ　　　１４４　　　　１　１
５８６！　　　！００　　　８　　１３１１　　　１０
　８８０１１　　８０ＪＩ　　　　？　　　３１！　　
　　１１　８６０４　　１ｇ０　　　８　　　ｇ１１＠
　　　　１！　　１＠４ＰＲＰ抗体損度は最初の注射の
４遅波にＥＸＡによって測定する。使用するＲＩＡの方
法は実施例ＩＫ記ｇきれている。

実施例１の方法によってｖＩ４製したＰＲＰのみを注射
したラットは約２ｆｌｎｌ／ｄのｐＲｐＦｔ体力価を示
す、ｐＲｐのみを注射したラットの年令と血統は上記の
混合ワクチンを注射したラットと同様である。

実施例３ （１Ｂ−のｐｎｐｆ６液（１〜１ｄＰＢｓ）、及びＬ−
ＣＬ−ＬｉＡａ法によって単離し之１．５１の白−日咳
菌外側膜ピーク（α８１ｑ蛋白質／ＭＰＢＳ）を。

０．０１−のチメロサールを含有する１１８１のＰＢＳ
に加えて、１回の投与を当り１ｏｓｓの蛋白質を含有す
るワクチン溶液を調製する。

混合ワクチン（１！ｔＪｉ当りｏ、　ｓ　ｍ　）　ｆ次
いで若いラットに注射する。注射は１週１回で３週間に
わたって行なう、各ラットの年令と血統は同様である。

上記の手ｆｉｌによって別々に調製したワクチンｌ。

２及び３に対する抗体応答の結果は下記のとお巾である
Ｉ ＰＲＰ抗体虐度（外１／ｄ） ｌ　　　丁９！　　　　５　　１２４　　　　１　　８
４０１　　　　１４４　　　　ＩＩ　　　　１８８　　
　１０　　　　　Ｔａ２　　　　　　　！　ｓ　６　　
　　　　丁　　　　　　　　６０　　　　　　　１１　
　　　　２７１８４　　１丁・　　　８　　４１１＠　
　　　１！　　　マ８０ＰＲＰ抗体濃度を始めの注射の
４週間後にＲＩＡによって測定する０便用するラジオイ
ムノアッセイ方法は実施例１に記載されている。

実施例１０手順によって調製し九ＰＲＰのみを注射した
ラットは、約２２ｎｉ／ｄのＰＲＰ抗体力価を示す、Ｐ
ＲＰのみを注射したラットの年令・の血統は上記の混合
ワクチンを注射したラットと同様である。

【図面の簡単な説明】

第１図はリゾチーム処理方法によって単一した外＠膜成
分のコ１ツシーブリリアントプルーデシル硫販ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドグル電気泳勧蛋白質プロフィル
である。 第２図はＬｉＣ１−Ｌ１Ａａ方法によって単離した外側
膜成分の２８０％情の波長で測定したセファロースｅＢ
ｃＬクロマトダラフイープロフィルである。 第３図はＬｉＣ１−Ｌ１Ａｔｔ方法に↓って１次いでセ
ファロース５ＢｃＬクロマトグラフイーによって単離し
た、第２図の外側膜成分Ｉのドデシル憶ばナトリウム−
ボリアクリルアきドｒル電気泳動蛋白質プロフィルを示
す。 ｆ！、４図はＬｉＣ１−Ｌ１Ａｅ方法によって１次いで
セファロースｓＢ　ＣＬクロマトグラレイ−によって単
一した。繭２図の外側膜成分厘のドデシル硫酸ナトリウ
ムー４リアクリルアミドｒル電気原動蛋白質グロフィル
を示す。 Φ 匡 眞〜 〜 Φ゛ ｎ Φ 匡 ｓｓｖ 障 ヒ １７６−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈα−’ＦＩＬ
   Ｏ−ｐｈｉｌｗａ　ｉｎｆｌｕｍｓｇａａ）ｂ型から単
   離し且つｆ＃製し九カプセル状多楯類ぼりすがシルリが
   トールホスフ：Ｃ−トｃＰＲＰ）及び百日咳菌（Ｂｏｒ
   ｄａｔｍｌｌａハデを曽１１Ｏ）の外側膜成分から単離
   し且つ精製した抗原から成ることを時像とする温血動物
   中のＰＲＰ抗体形成を誘発させるための混合ワクチン。 ＊　　該ｐＲｐがへモフイルス―インフルエンザより１
   ｉｃＫｌ！１株（Ａ７’ＣＣ３１４４１）から得られる
   特許請求の範囲１３１４１項記載の混合ワクチン。 ！Ｌ　　該Ｐ　ｋ　Ｐ　カへモフイルス・インフルエン
   ザより型Ｒαｂ＠株・（ＡＴ（：’Ｃ３１５１２）から
   得られる特許請求の範囲第１項記載の混合ワクチン。 ４　該百日咳菌抗原が百日咳−菌株１３８（Ａｒｃ（：
   ’１０３８Ｇ）から得られる特許請求のＩＩＬＩＪ囲第
   １．２４たは３項記載の混合ワクチ゛ン。 ＆　咳温血動吻が人間の幼児である替許請求の範囲第４
   項記載の混合ワクチン。 亀　へモフイルス・インフルエンザエ↓型から単離し且
   つ精製したカプセル状多糖類ポリリーシルリピトールホ
   スフエート及び百日＠菌の外側膜成分から単離し且つ精
   製した抗原から成る混合ワクチンの免疫原的曽を投与す
   ることを待機とするフエモフイルス・インフルエンザよ
   り型病原凶によ多生じる全身的感染に対する活性免役を
   温血動物中に一発させるための方法。 ７、該温血ＭＩＩＪＪ物の感染が髄膜炎である特許請求
   の範囲ＩＩＩ項記載の方法。