JPS589678B2 - Ｌ− シユセキサンノセイゾウホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−酒石酸の製造方法に関するもので、詳しく
はエポキシ環の開環加水分解する能力を有する酵素によ
るシスーエポキシコハク酸の加水分解反応において該反
応液中に特定の界面活性剤を添加することによって、Ｌ
−酒石酸への加水分解速度をはやめ、その目的とすると
ころは経済的に優れたＬ−酒石酸の製造方法を提供する
ところにある。

従来、Ｌ−酒石酸はもっぱらぶどう酒製造の際に副生ず
る生酒石を原料とする抽出法により製造されてきた。

ところがこのように天然資源に依存する生産方式では常
に原料事情が不安定であり、特に近年、生酒石の不足か
らＬ−酒石酸の供給がひっ迫状態にある。

従って、供給源に不安のない安価な石油化学製品を原料
とする新規な酒石酸の製造方法の開発が強く望まれてき
た。

この意味で、既に知られているマレイン酸を原料とする
合成法による酒石酸の製造法は上記の期待に一部は応え
るものであるが、生成する酒石酸がＤＬ一体（ラセミ体
）であるために、Ｌ−酒石酸に比して溶解度が著しく低
い等の欠点があり、実用的な見地からは難点があった。

また、酒石酸のＤＬ一体から光学分割とラセミ化により
Ｌ−酒石酸を取得する方法も考えられるが、工程が増え
るため経済的な不利を免れ難い。

一方グルコース等を原料とする醗酵法によるＬ−酒石酸
の生成の報告（例えば特公昭４７−３３１５４号公報）
もあるが、収率が低い。

既に本発明者らは、供給源に不安がなく、且つ安価な石
油化学製品であるマレイン酸を原料として、合成法と生
化学的加水分解反応を組み合わせることにより、天然酒
石酸と同じＬ−酒石酸を工業的に製造する方法、即ち過
酸化水素によるエポキシ化によりマレイン酸から容易に
得られるシスーエポキシコハク酸を生化学的にＬ−酒石
酸に変換する方法を提案した（特願昭５０−１７９７３
号）。

本発明はシスーエポキシコハク酸のエポキシ環を開環加
水分解する能力を有する酵素を用いて、適当な条件下で
シスーエポキシコハク酸誘導体を加水分解するに際し、
反応液中に特定の界面活性剤を添加することによりその
加水分解速度が著しく促進されることの知見に基づいて
本発明を完成した。

即ち本発明はエポキシ環を開環加水分解する能力を有す
る酵素の存在下にシスーエポキシコハク酸またはその誘
導体からＬ−酒石酸を反応生成するに際し、該反応液中
に （１）高級脂肪酸塩，アルキルリン酸エステル及びアル
キルポリオキシエチレンリン酸エステルよりなる群から
選ばれた少くとも１種のアニオン性界面活性剤又は （２）ポリオキシエチレンアルキルエーテル，ポリオキ
シエチレンソルビクン脂肪酸エステル及びポリオキシエ
チレンーポリオキシプロピレンブロツクポリマーよりな
る群から選ばれた少くとも１種の非イオン性界面活性剤 を添加することを特徴とするＬ−酒石酸の製造方法であ
る。

本発明において使用するシスーエポキシコハク酸または
その誘導体は、無水マレイン酸，マレイン酸あるいはこ
れらの誘導体を公知の方法、例えば過酸化水素によりエ
ポキシ化することによって容易に得られるものである。

シスーエポキシコハク酸の誘導体としては、そのナトリ
ウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩な
どの無機塩、及び有機塩，エステルまたアミドのような
水溶性のものが用いられる。

使用するシスーエポキシコハク酸またはその誘導体の濃
度は０．１〜３ｍｏｌ／ｌ好ましくは０，１〜１．５ｍ
ｏｌ／ｌがよい。

例えばシスーエポキシコハク酸がＬ−酒石酸に加水分解
されるに従って、固体もしくは濃いシスーエポキシコハ
ク酸溶液を遂次添加し、常にシスーエポキシコハク酸の
濃度が１ｍｏｌ／ｌ程度になるように維持するのもよい
方法である。

反応温度は２０〜６０℃好ましくは２５〜４５℃、ＰＨ
は５〜１０好ましくは６〜９で行うと好適である。

また、本発明に用いる酵素はシスーエポキシコハク酸の
エポキシ環を開裂加水分解する酵素を生成する能力を有
する微生物、例えば本発明者らが先に提案した菌種ノカ
ルディア・タークリカンス（ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｔａ
ｒｔａｒｉｃ ａｎｓ ＮＯＶ．ＳＰ） （微工研菌寄
第２８８２号）などから通常の方法である例えはガラス
粉末やアルミナ粉末などの助剤を加えて乳ばち中ですり
つぶす捕潰法、フレンチプレスを用いる高圧法、音波ま
たは超音波法、その他の方法により細胞を破壊し、遠心
分離で細胞壁画分を分離したあとその上澄液を粗酵素液
として使用すればよい。

上記微生物の培養は通常液体培養で行われ、また固体表
面培養によっても行われる。

培養に用いる培地としては、例えば肉汁等の天然培地も
用いられるが、適当な炭素源（例えばグルコース、蔗糖
、グリセリン、エタノール、インプロバノール、プロピ
レングリコール、ｎ−パラフィンなど）、窒素源（例え
ばアンモニウム塩、硝酸塩、尿素など）その他の無機塩
などから成る合成培地も用いられる。

また培養の際、基質となるべきシスーエポキシコハク酸
を培地に添加して必要酵素を適応的に増強させることも
望ましいことである。

培地のＰＨは５．５〜１１、好ましくは６〜９の範囲で
ある。

培養は好気的に行ない、培養温度は１０〜４５℃、好ま
しくは２５〜４０℃である。

バッチ式の培養では通常半日から１０日間行なう。

培養終了後、遠心分離を行ない、得られた菌体を水又は
上記合成培地から炭素源を除いた培地に、シスーエポキ
シコハク酸を１ ｍｏｌ／ｌ以下の濃度に溶かした溶液
（ＰＨ６〜９）に５〜３０時間、２０〜４０℃で酵素誘
導を行うことが好ましい。

本発明における加水分解反応はバッチ方式、セミバッチ
方式、連続方式などいずれの方式でも行うことが出来る
。

本発明の特徴である反応系に添加する界面活性剤として
は特定されたアニオン性界面活性剤及び非イオン性界面
活性剤に限られるものであって、セチルトリメチルアン
モニウムブロマイド、ラウリルピリジニウムクロライド
などのカチオン性界面活性剤はエポキシ項の開環加水分
解を促進する効果よりもむしろ阻害作用が働く。

一方、アニオン性界面活性剤のなかでも、アルキル硫酸
エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩などのスル
ホン酸塩は阻害剤として作用するが、ラウリル酸ナトリ
ウム等の高級脂肪酸塩．ＤＤＰ−８（日光ケミカルズ社
製）等のアルキル（ポリオキシエチレン）リン酸エステ
ル．ＳＬＰ（日光ケミカルズ社製）等のアルキルリン酸
エステル等のアニオン性は顕著な促進効果を示す。

また、非イオン性界面活性剤のなかではツイーンー８０
（花王．アトラス社製）などのポリオキシエチレンソル
ビクン脂肪酸エステル，プルロニツクＬ−６１（日光ケ
ミカルズ社製）などのポリオキシエチレンーポリオキシ
プロピレンブロツクポリマー，ＢＬ−４．２（日光ケミ
カルズ社製）等のポリオキシエチレンアルキルエーテル
が有効である。

使用する界面活性剤の反応系における濃度は１〜０．０
０１ｗｔ％が好ましく、界面活性剤の種類により最適濃
度は異なる。

このようにして、本発明においては反応液中に特定の界
面活性剤を添加することにシスーエポキシコハク酸から
Ｌ−酒石酸への加水分解速度を向上せしめ、ひいてはＬ
−酒石酸の生成を促進するものであるが、その加水分解
速度を促進する機構については全く知見がなく不明であ
る。

したがって、本発明における特定したアニオン性及び非
イオン性界面活性剤はいずれも統計的な実験によって見
出されたものである。

なお、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドなどの
第４級アンモニウム塩からなるカチオン性界面活性剤は
、シスーエポキシコハク酸を加水分解する能力を有する
微生物を用いてシスーエポキシコハク酸からＬ−酒石酸
を反応生成するに際しては著しくその生成速度を促進す
るが、本発明におけるような細胞より分離したシスーエ
ポキシコハク酸を加水分解する能力を有する酵素を用い
た時は、逆に阻害剤として作用していることから、両者
の反応系においては界面活性剤が全く違った作用機構を
とっているものと考えている。

本発明において反応終了後、公知の方法例えば酒石酸カ
ルシウムとして沈澱させるなどの方法により反応液より
Ｌ−酒石酸を容易に得ることが出来る。

得られたし一酒石酸はペーパークロマトグラフのＲｆ値
、濾紙電気泳動の移動度、ＩＲ，ＮＭＲ旋光度、元素分
析などから天然と同じＬ−酒石酸であることを確認した
。

以下実施例により本発明を具体的に説明するが本発明は
決してこれのみに限定されるものではない。

実施例 １ プロピレングリコール １％ ＮＨ２ＣＯＮＨ２ ０．３％ＫＨ２ＰＯ
４ ０．１ ５％Ｎａ２ＨＰ０４
ｏ．１ ５％ＭｇＳ０４・７Ｈ２０
０．０５％ＦｅＳＯ ・７Ｈ２０ ０．０
０１％４ ＣａＣｌ２・２Ｈ２０ ０．００１％ＭｎＳＯ
４・４Ｈ２０ ０．０００２％酵母エキス
０．０２％ ＰＨ ７．０ 尿素を除く成分を含む培地をあらかじめ１２１℃１５分
間蒸気殺菌したものに、別途濾過滅菌した尿素を添加し
、苛性ソーダでＰＨを調整し、最終的に上記組成とＰＨ
になるように培地を調整し、５００ｍｌ肩付振とうフラ
スコに５０ｍｌ分注した。

この培地に菌種ノカルディア・タータリカンス（ Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ｔａｒｔａｒｉｃａｎｓ ＮＯＶ． Ｓ
Ｐ） （微工研菌寄第２８８２０号）を１白金耳接種し
、３０℃で１００時間培養を行なった。

培養終了後、遠心分離で菌体を集め、上記培地からプロ
ピレングリコールを除き、代りにシスーエポキシコハク
酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌになるように加えた培地
に、乾燥菌体として５ ｇ／ｌになる濃度に懸濁し３０
℃２０時間酵素誘導を行なった。

再び遠心分離で集菌を行い、０．７ｍＯｌ／ｌのシスー
エポキシコハク酸ナトリウム溶液（ ＰＨ７．０）１０
ｍｌに乾燥菌体として１ ０ ｇ／ｌの濃度になるよう
に菌体を懸濁し、０〜５℃に冷却して超音波処理（２０
ＫＨＺ，６０Ｗ，１ ０分）を行なった。

超音波処理後、細胞壁画分を除去した上澄液に、第１表
に示す界面活性剤を所定の濃度添加して、３７℃で振と
うしながら反応を行なった。

５時間後、生成したＬ−酒石酸の定量した結果を第１表
に示す。

界面活性剤の添加により、反応速度の顕著な促進が認め
られる。

比較例 １ 実施例１において調整したシスーエポキシコハク酸ナト
リウム（ ＰＨ ７．０ ） １ ０ｍｌの酵素溶液に
カチオン性界面活性剤であるセチルトリメチルアンモニ
ウムブロマイド，アニオン性界面活性剤のうち硫酸塩で
あるラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホ
ン酸ナトリウムを各々０．１，０．０５，０．０２５，
０．０１２５ｗｔ％添加して、同様に反応を行なったが
、５時間ではＬ−酒石酸の生成は認められなかった。

実施例 ２ 実施例１において界面活性剤ＤＤＰ−８およびプルロニ
ツク（ Ｐ ｌｕｒｏｎｉｃ） Ｌ−６ １を０．０２
５％添加した系について、５時間後に新たにシスーエポ
キシコハク酸ナトリウム１． ４ｍｏｌ／ｌ （ ＰＨ
７．０）１０ｍｌを加えて同様に反応を行った。

２２時間後Ｌ−酒石酸が各々１５６ｇ／７，１００ｇ／
ｌの濃度で生成した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エポキシ環を開裂加水分解する能力を有する酵素の
   存在下にシスーエポキシコハク酸またはその誘導体から
   Ｌ−酒石酸を反応生成するに際し、該反応液中に （１）高級脂肪酸塩，アルキルリン酸エステル及びアル
   キルポリオキシエチレンリン酸エステルよりなる群から
   選ばれた少くとも１種のアニオン性界面活性剤又は （２）ポリオキシエチレンアルキルエーテル，ポリオキ
   シエチレンソルビクン脂肪酸エステル及びポリオキシエ
   チレンポリオキシプロピレンブロツクポリマーよりなる
   群から選ばれた少くとも１種の非イオン性界面活性剤 を添加することを特徴とするＬ−酒石酸の製造方法。