JPS5899416A - アレルギ−反応抑制剤及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアレルギー反応抑制剤及びその製法に関し、詳
しくはストレプトコッカス・ラクチス（８ｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　’１ａｃｔｉｓ＞等の乳酸連鎖球菌の抽
出物を有効成分とするアレルギー反応抑制剤及びその製
法に関するものである。

従来、ストレプトコッカス＠に属する１体、特に活性腸
球菌菌体は整腸剤として用いられている。また、腸内常
在菌種の活性乳酸−十クロ・・ストリジューム菌なども
整腸剤として用いられている。特に活性乳ｆＲ鮒は腸内
で繁殖して乳緻を産生し、腸内腐敗細ＩＩ１軒の発育を
抑え、自然的な整腸作用をｇむとされている。このよう
に整腸剤として用いられる微生物は活性菌であり、その
腸内繁殖が強いことも必要な条件とされている。

また、微生物の菌体成分の一部分を用いた微生物製剤や
多種病原ｌＩ、気道系細菌群を用いた多価抗原製剤、刺
激療法剤などもあるが、１体主成分であるタンパク質は
人間や実験動物にとっては異種タンパク質であり、酵１
ｇ製剤における酵素もウロキナーゼを除いてすべて人間
以外に由来しており、人間にとって異種タンパク質であ
る。

一般に異種タンパク質を生体内に連続投与すると抗体が
産生され、特に筋肉注射による場合に抗体が産生されや
すい。この場合、最も重大な問題は異種タンパク質を抗
原とするアレルギー抗体Ｉｇｇ（免疫グロブリンＥ１血
清、鼻汁、略快、腸液中に存在し、アレルギー状態で全
身的、局所的に増加する。）が産生されることである。

アレルギー抗体が生体内で産生された場合、稀に重篤な
アナフィラキシ−ショックが起きるという免疫反応に基
づく制作用の本質的問題がある。

外来性の異種抗原が生体内に入ることにより惹起される
様々な異種免疫反応の結実現れる病的状態を異種免疫病
と呼び、アレルギー反応の起ｐ方から次のように分類さ
れる。

ａ）　全身型：アナクイック？シーフ日ツクｂ）　局所
皺： （イ）皮膚の変化ニシンマシン、Ｐ−に反応　等（ロ）
呼吸器系の変化二枯草熱、喘息、等（ハ）胃腸管の変化
二食物アレルギー　等これら疾患にみられるアレルギー
反応または過敏症は人間のみならず、種々の動物にもみ
られることである。

本発明者らはモルモットに異種タンパク質を用いて抗体
産生の研究を重ねており、その過程において抗体価の上
昇した実験動物に対して牛乳よシ分離されたストレプト
コッカス１体の抽出物を投与したところ、アレルギー反
応が抑制されるという興味深い知見を得た。本発明者ら
は、当該一体抽出物を異種免疫病の治療・予防に利用で
きるｆｉｌ能性を推察して、異種免疫病の代表的疾患で
あり、しかも実験系の組み易いアレルギー反応の抑制効
果を検討し、非常に有効な結果を得た。本発明はか＼る
知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発
明は乳酸連鎖縁−の細胞内物質を３０％エチルアルコ効
成公表するアレルギー反応抑制剤を提供するものである
。さらに本発明は、乳酸連鎖縁−の水可溶性細胞内物質
の水溶液にエチルアルコールを楓えて３０−エチルアル
コール濃度とし、可溶部と不＃１部に分離する第１の分
離工程と、該第１０分一工程にて分離された可溶部に更
にエチルアルコールを加ｔテｓ　ｏ　％エチルアルコー
ル濃度とし、可溶部と不溶部に分離する第２の分離工程
と、該第２の分離工程による不溶部を分取する工程より
なるアレルギー反応抑制剤の製法を提供するものである
。

本発明で用いる乳酸連鎖縁−としてはアレルギー反応抑
制作用を発揮し得るものであればよく、通常はストレプ
トコッカス・ラクチス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　
１ａｃｔｉｓ　）　　が用いられ、具体的には、たとえ
ばストレプトコッカス−ラクチス・リスター−ロニスＢ
Ｋ−０４１株、同ＢＫ−０４ｚ株などを挙げることがで
きる。

これら０１１株は、本発明者らによって市販牛乳より分
離されたものでわ９，１費な鉋学的性質は以下に示す通
シである。

１）　　ストレプトコッカス・ラクチス拳リスター・ロ
ニスＢＫ−０４２株 ａ）　形態的性質 （１）形　　　　　　　連鎖状球菌 大きさ　　　　　ｏ、６〜ｉ、ｏ声 （２）運動性　　　な　し く３）ダラム染色　　　　　　　十 ｂ）培養的性質 （１）発　育　条　件　通性嫌気性 （２）発　育　温　Ｉｆ　　　４５℃±（３）ゼラ’ｆ
　７の液化　　　− （４）リドマスミルクの還元　　　　十（５）糖類の発
酵 マンノース　士　　マンニット　＋ マルトース　＋　　ザリチン　＋ シ　ｌ糖　士　デンプン− グルコース　＋　　イヌリン　− Ｃ）　生理的性質 （１）オキシダーゼテスト　　− （２７カタツーゼテスト　　　− （ａ）　０−　Ｆテスト　　　　　Ｆ （４）食　塩（６，ｓ％）　　　生育せず（５）ｐ　　
Ｈ（ｌｉｌ、６　）　　　　　生育せず（６１６０℃、
３０分の加熱　　生育せず（７）グルコースから乳酸の
生成率　　９６チ（８）乳酸の旋光性　　　　　Ｄ十 １）ストレプトコッカス・ラクチス・リスター・ロニス
ＢＫ−０４ａ　株ａ）　形態的性質 −（１）　　形　　　連鎖状球菌 大きさ　０．６〜１．Ｏｊ （２）運動性　な　し く３）グラム染色　　　士 ｂ）　培養的性質 （１）発　育　条　件　　通性嫌気性 （２）発　育　温　度　　４　Ｓ’Ｃ＋（３）ゼラチン
の液化　　　− （４）リドマスミルクの還元　　　　　　十（５）糖類
の発酵 マンノース　＋　　　　マンニット　＋マルトース　士
　　　　ザリチン　＋ シ　１糖−デンプン− グルコース　＋　　　　イヌリン　− Ｃ）　生理的性質 （１）オキシダーゼテスト　　− （２）カタラーゼテスト　　　− （３）　０−　Ｆテスト　　　　　Ｆ （４）食　塩（・、５チ）　　　生育せず（５）　ｐ　
　Ｈ（９，４１）　　　　　生育せず（ｓ）　ｓ　ｏ℃
、ｉｏ分の加熱　　生育せず（７１グルコースから乳酸
の生成率　　　９２チ（８）乳酸の旋光性　　　　　Ｄ
＋ 以上の菌学的性質をもとにして、パージ−〇マニユアル
・オプ・ディタミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｈｅ
ｒｇｅｙ’＠Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｘｏｇｙ）　ｍ　７版および
第８版ならびに「乳酸函の研究」（北原覚雄著）Ｋよシ
検索した結果、ストレプトコッカス・ラクチスに該当す
ることが認められた。なお、これらの−株はストレフト
コツカス・ラクチス・リスター・ロニスＢＫ−０４２株
（微工研条寄第７１号）およびストレフトコッカスーラ
クチス・リスターｓ。

ニスＢＫ−ｏ　ａ　ｓ株（黴工研条寄嬉７２号）として
工業技術院微生物工業技術研究所に保管されている。

本発明のアレルギー反応抑制剤ｄ、たとえば以下の操作
によって製造することができる。

乳酸連鎖対−の培養は常法によシ行なえばよく、たとえ
ばＧＹＰ培地を用い、３２〜３１℃で１０〜２４時間、
好ましくは１５〜２０時間培養する。培養終了後、遠心
分離その他の適当な手段によって集菌する。次いで、得
られた菌体を破砕して菌体破砕物を得る。この場合、菌
体は予め蒸留水、生理食塩水、適当な緩衝液（燐酸緩衝
液など）等を用いて予め洗浄しておくことが望ましい。

また％菌体の破砕処理は凍結融解法、ホモジナイザー法
、酵素溶解法、超音波破砕法など既知の物理的、化学的
手法を任意に適用できるが、抽出目的物の安定性確保と
以後の処理工程を考慮すると超音波破砕法が望ましい。

この場合、なるべく低温下で行なうようにすべきである
。

かくして得られた１体破砕物を遠心分離、オ過等の処理
を行ない上澄部または＞Ｐ液を得、必要に応じてｌｌＩ
縮操作を行なう。次に、この上澄部またはりＦ液につい
て半透膜を用いて透析処理して上置部を得る。この上澄
部には１本発明薬剤の有効成分たる乳酸連鎖球菌の細胞
内物質が含まれてい“る。本発明では、この上澄部につ
いて１０％一度のエチルアルコールで処理し、遠心分離
を行ない、上置部を得る。この上澄部には乳酸連鎖球菌
の水ムＩ溶性細胞内物質が含まれている。次いで、Ｃの
ようＫして得られた乳酸連鎖球菌の水可溶性細胞内物質
の水溶液にエチルアルコールを加えて３０嚢工チルアル
コール濃度とし、可溶部と不溶部とに分離する。盆離さ
れた可溶部に対し、更にエチルアルコールを加えて５０
％エチルアルコール１ｌＨｆとし、これを可溶部と不溶
部に分離する。次いで、不溶部を分取することによって
、本発明のアレルギー反応抑制剤の有効成分が得られる
。

本発明のアレルギー反応抑制剤には増量剤、安定剤など
の常用の成分を適宜加えることができる。アレルギー反
応抑制剤の形態は特に制限がなく、たとえば懸濁液や粒
状、粉状などの形態として用いることができる。さらに
、本発明のアレルギー反応抑制剤の投与方法も任意であ
り、たとえば経口投与、腹腔内投与、静脈注射などを任
意に適用できる。

本発明のアレルギー反応抑制剤の特色を列記すれば、以
下の通りである。

（１）各檀タイプｐ異種免疫病に対して有効である。友
とえばアレルギー性気管支喘息、小児喘息、アレルギー
性鼻炎（枯草熱、花粉症）、アトピー性皮膚炎、食物ア
レルギー、薬疹、アレルギー性肝中毒、アレルギー性″
ｓｈ疾患などの予防および治療に有効である。

（２）　　本発明の製剤は微生物函体抽出物を主成分と
しており、実験的には毒性が認められない。また、副作
用もみられないなど安全性がきわめて高い。

（３）　　従来のアレルギー反応抑制剤が多価抗原製剤
であるのに対し５本発明の製剤は単独の菌を用いている
。

（４）シかも本発明に用いる菌は非病原菌である。した
がって、感染の恐れがない。

（５）　　従来の菌製剤は接種法あるいは注射法によら
ねばならなかったが、本発明の製剤はその高い薬効と安
全性の故に経口投与が可能である。したがって、被投与
者に投与抵抗感がないことが期待される。

（６）特に喘息に対して本発明の製剤は１ｇＥ値の下降
が実証されておシ、シかも従来の特異２的減感作療法お
よび非特異的滅感作療法のいずれに４与られない独得の
用途を有している。

次に本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１（有効成分の分離） ストレプトコッカス・ラクチス・リスター・ロニスＢＫ
−０４５株（微工研条寄第７２号）を常６　ｒｃよシ培
養して得た培養物から遠心分離して一体をとり、充分に
水洗して１ｇ、】ｔ４ｆの菌体を得た。

該菌体を水懸濁液として２０ＫＨｚ、　２０　ＧＷ、−
０分の超音波破砕をした。破砕後１３．０００ＸＧ、６
０分間の遠心分離処理をし、第１の上清液（ＳＵＰ−１
）と第１の沈澱物（ＰＰＴ−１３に分けた。該第１の沈
澱物（ＰＰＩ’−１）を水懸濁液として＊　　２　ＧＫ
Ｉ（ｉｓｅ２００Ｗ、２０分間の超音波破砕処理をした
のち、１ａ、　０ＯＯＸＧ、　２０分間の遠心分離操作
を行ない、第２の上清液（ＳＬＪＰ−２）と第２の沈澱
物（ＰＰＴ−２３を得た。

上記第１の上清液（ＳＵＰ−１）と第２の上清液（８１
ＪＰ−ｚ　）を混合し約８倍の淡度まで濃縮した。

これを蒸留水にて２日間透析し、透析残部（ＲＥＭ−１
）を得た。該透析残部（１１１Ｍ−ｔ　）に蒸留水を加
えて、　　ｌａ、　ｏｏｏｘＱ　２０分間の遠心分離を
行ない、第３の上清液（ＳＵＰ−ｓ）と第３の沈澱部（
ＰＰＰ−ａ）　Ｋ分けた。

上記第３の沈澱部（ＰＰＰ−ｓ）に蒸留水を加えて、１
ｓ、ｏｏｏｘＧ、　２＠−間の遠心分離をし、ｔａ４の
上清液（ＳＵＰ−４）と＠　４　ノ沈澱［（ＰＰＴ−４
）　（得た。

上記第３０上清部（ＳＵＰ−３）と８ｇ４の上清部（Ｓ
ＵＰ−４）とを混合し、この混合液に９９．５　％エチ
ルアルコールヲ徐々に加ＬＣエチルアルコール濃度が約
１０：６−ｔチになったところで添加を停止した。この
とき上記混合液に白濁が観られたので、これを１ｓ・ｏ
ｏｏｘＧ　、　２紛間遠心分離し、第５の上溝液（ＳＵ
Ｐ−５）とｍｓの沈澱部（ＰＰ’ｒ−ｓ　）を得た。

−１記第５の上清液（ＳＵＰ−ｓ）に更にエチルアルコ
ールｋ　加、ｔ　−ｃ　、エチルアルコール濃度カ約ａ
Ｏｙｔ＊になったところで添加を停止した。このときも
白濁が観察されたので、これを１ｓ、　ｏｏｏｘＧ　１
２吟間遠心分離して、第６の上清ｇ　（ＳＵＰ−ｓ）及
び第６の沈澱部（ＰＰＰ−ｓ）に分離した。

一ヒ記第６の上溝液（８（ＪＰ−６）に更にエチルアル
コールを加えて該上清液（ＳＵＰ−６）のエチルアルコ
ール％１１１度を約ＳＯ容ｉｌｔ％とした。この　−と
きも白濁が観察されたので、これを１６．０ＯＯＸＧ２
０分間遠心分離し、第７０上清液（８ＵＰ−７）、！：
　ｉｉｇ　７　（２）　沈澱ｆｆｉ　（ＰＰＴ−７）　
Ｉ／Ｃ分けた。ｖ！、第７　Ｏ沈澱部（ＰＰＰ−７）を
凍結乾燥し、淡黄色の第１の粉末（Ｂ−４）を６６．１
　　ｆ得た。

上記第７の上清液（ＳＵＰ−７）を湯浴中でｉｏ’Ｃ。

３０分間加熱し、これを１５．０ＯＯＸＧ　、　２０分
間遠心分離し、＃！８の沈澱部（ＰＰＰ−ｓ）を得た。

該第８の沈澱部（ＰＰＴ−ｇ）を凍結乾燥し、３．６ｆ
の第２の粉末（Ｂ−ｓ）を得た。

実施例２（受動感作による動物実験） 実施例１で得た第１及び第２の粉末（Ｈ−ｎ。

Ｂ−５）についてそれぞれ動物実験を試みた。

実験には生後４週間、体重３４０〜４６０　ｔの雌モル
モットを用い、これをさらに１週間予備飼育後、健常な
モルモットを選抜して実験に供した。実験動物は予備飼
育、実験期間を通して温度２２±２℃、湿健５０±５％
の恒常飼育室で飼育し、固型飼料と水通水は自由に摂取
させた。

モルモット感作方法はウサギ（体重３ｋｇ前後）にｘ％
α−アミラーゼ（枯草菌より得られる結晶細菌性α−ア
ミラーゼ）とフロイント補助液（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃ
ｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）　　を１：１（重
量比）に混合した懸濁液を１ｍ／Ｂｏｄｙ−を週２回、
４週間筋肉注射によって行なった。このウサギより得た
抗α−アミラーゼ家兎面７−（抗体価×３２）をそれぞ
れのモルモットに２　ｍｊ／Ｂｏａｙ　ｗｋを腹腔内投
与し、被動感作を行なった。

１Ｊｉｌ　’ａピ実施例１によって得たストレプトコッ
カス・ラクチス菌体抽出物の投与はそれぞれ１群６匹を
使用し、抗α−アミラーゼ家兎血虜被働感作を行なう前
にそれぞれ３日前より第１の粉末（Ｂ−ａ）は水に溶か
し、第２の粉末（Ｈ−ｓ）は水に懸濁して両ゾンデを用
いて４日連続経口投与を行なった。投与は１日に１回で
１　ｏｑ／回でめった。

前記被動感作を行なってから４８時間後に１．６８ｊ！
の円筒型チャンバーに入れ、１ｄｌｈａ−アミラーゼ溶
液を超音波ネブライザーを用いてｏ　、　ｓ　１分の噴
霧条件で１０分間噴霧吸引させ、その間に惹起されるモ
ルモットのアレルギーシ冒ツク症状を観察した。抑制効
果は処置各群の平均ショック係数、標準偏差値、及びｔ
検定値を比較して判断し友。なお、ショック症状の程度
は表−１の如く評価した。

それぞれの粉末投与群及び無投与群のショック症状は表
−２に示すとおシであった。

無処置対照群では、いずれのモルモットも１％ｍ−アミ
ラーぞ噴ＩＩ−始３分後位より呼吸促迫し約２分後よシ
時折吃逆およびけいれん、放尿等が見られるようになり
、噴Ｉｌ！終了時にはチアノーゼ、後肢のマヒおよび全
身性アナフィラキシ−シソツク死が２例（Ｂ−４の場合
）および１例（Ｂ−５の場合）に−められた。

一方、菌体抽出物処置＃は無処ｌｔ群に比ベショック死
が１例及び２例あったと言えども全身性アナフィラキシ
−抑制効果は極めて有意なものであることが認められた
。

実施例３（能動感作による動物実験） 実施例２と同様にして健常なモルモッ・ト２９匹を選び
、うち９匹を無投与対象群とした。

実験動物は予備飼育、実験期間を通して温度３雪士雪℃
、湿度！！Ｏ＋Ｓ％の恒常飼育室で飼育し、固型飼料と
水道水は自由に摂取させた。

１４ａ−アミラーゼを２９匹のモルモット参考例　　　
　　　　　　　ＬＤｓ　＋ＢＫ−ｏ４ｉ休の凍結乾燥製
品（Ｂ−ａ）について毒性試験を行なり九。結果を表−
４に示す。

死の様子・・・投与ｌｉｍより全身けいれんを伴い死に
至る。

回復するマウスはｌｓ分機で対象 群との間に差異は認められなくな る。

）値・・・ＬＤ５０≦４ｚｏｑ／＃と推定される。

極東脂肪酸株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）乳酸連鎖球菌の細胞内物質を３０チ工チルアルコ
   ールａ度で分離して得られる可溶部をｓＯ％エチルアル
   コール濃度にて再分離して得られる不溶部を有効成分と
   するアレルギーｘｆルフルコールを加して３　Ｇ％エチ
   ルアルコール嬢度とし、可溶部と不溶部に分離する第１
   の分離工程と、 該第１の分離工程にて分離された可溶部に更にエチルア
   ルコールを加えて５０−エチルアルコール＃虻とし、可
   溶部と不溶部に分離する第２の分離工程と、 該第２の分離工程による不溶部を分取する工程よりなる
   アレルギー反応抑制剤の製法。