JPS6317811B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明アレルギー反応抑制剤及びその製法に関
し、詳しくはストレプトコツカス・ラクチス
（Streptococcus lactis）等の乳酸連鎖球菌の抽
出物を有効成分とするアレルギー反応抑制剤及び
その製法に関するものである。 従来、ストレプトコツカス属に属する菌体、特
に活性腸球菌菌体は整腸剤として用いられてい
る。また、腸内常在菌種の活性乳酸菌やクロスト
リジユーム菌なども整腸剤として用いられてい
る。特に活性乳酸菌は腸内で繁殖して乳酸を産生
し、腸内腐敗細菌群の発育を抑え、自然的な整腸
作用を営むとされている。このように整腸剤とし
て用いられる微生物は活性菌であり、その腸内繁
殖が強いことも必要な条件とされている。 また、微生物の菌体成分の一部分を用いた微生
物製剤や多種病原菌、気道系細菌群を用いた多価
抗原製剤、刺激療法剤などもあるが、菌体主成分
であるタンパク質は人間や実験動物にとつては異
種タンパク質であり、酵素製剤における酵素もウ
ロキナーゼを除いてすべて人間以外に由来してお
り、人間にとつて異種タンパク質である。 一般に異種タンパク質を生体内に連続投与する
と抗体が産生され、特に筋肉注射による場合に抗
体が産生されやすい。この場合、最も重大な問題
は異種タンパク質を抗原とするアレルギー抗体
IgE（免疫グロブリンＥ、血逝、鼻汁、喀痰、腸
液中に存在し、アレルギー状態で全身的、局所的
に増加する。）が産生されることである。アレル
ギー抗体が生体内で産生された場合、稀に重篤な
アナフイラキシーシヨツクが起きるという免疫反
応に基づく副作用の本質的問題がある。 外来性の異種抗原が生体内に入ることにより惹
起される様々な異種免疫反応の結果現れる病的状
態を異種免疫病と呼び、アレルギー反応の起り方
から次のように分類される。 (a) 全身型：アナフイラキシーシヨツク (b) 局所型： (イ) 皮膚の変化：ジンマシン、Ｐ−Ｋ反応等 (ロ) 呼吸器系の変化：枯草熱、喘息、等 (ハ) 胃腸管の変化：食物アレルギー等 これら疾患にみられるアレルギー反応または過
敏症は人間のみならず、種々の動物にもみられる
ことである。 本発明者らはモルモツトに異種タンパク質を用
いて抗体産生の研究を重ねており、その過程にお
いて抗体価の上昇した実験動物に対して牛乳より
分離されたストレプトコツカス菌体の抽出物を投
与したところ、アレルギー反応が抑制されるとい
う興味深い知見を得た。本発明者らは、当該菌体
抽出物を異種免疫病の治療・予防に利用できる可
能性を推察して、異種免疫病の代表的疾患であ
り、しかも実験系の組み易いアレルギー反応の抑
制効果を検討し、非常に有効な結果を得た。本発
明はかゝる知見に基づいて完成されたものであ
る。すなわち、本発明は乳酸連鎖球菌の細胞内物
質を30％エチルアルコール濃度で分離して得られ
る可溶部を50％エチルアルコール濃度にて再分離
して得られる不溶部を有効成分とするアレルギー
反応抑制剤を提供するものである。さらに本発明
は、乳酸連鎖球菌の水可溶性細胞内物質の水溶液
にエチルアルコールを加えて30％エチルアルコー
ル濃度とし、可溶部と不溶部に分離する第１の分
離工程と、該第１の分離工程にて分離された可溶
部に更にエチルアルコールを加えて50％エチルア
ルコール濃度とし、可溶部と不溶部に分離する第
２の分離工程と、該第２の分離工程による不溶部
を分取する工程よりなるアレルギー反応制剤の製
法を提供するものである。 本発明で用いる乳酸連鎖球菌としてはアレルギ
ー反応抑制作用を発揮し得るものであればよく、
通常はストレプトコツカス・ラクチス
（Streptococcus lactis）が用いられ、具体的に
は、たとえばストレプトコツカス・ラクチス・リ
スター・ロニスBK−042株、同BK−045株など
を挙げることができる。 これらの菌株は、本発明者らによつて市販牛乳
より分離されたものであり、主要な菌学的性質は
以下に示す通りである。 () ストレプトコツカス・ラクチス・リスタ
ー・ロニスBK−042株 (a) 形態的性質 (1) 形 連鎖状球菌 大きさ 0.6〜1.0μ (2) 運動性 なし (3) グラム染色 ＋ (b) 培養的性質 (1) 発育条件 通性嫌気性 (2) 発育温度 45℃± (3) ゼラチンの液化 − (4) リトマスミルクの還元 ＋ (5) 糖頼の発酵 マンノース ＋ マンニツト ＋ マルトース ＋ ザリチン ＋ シヨ糖 ± デンプン − グルコース ＋ イヌリン − (c) 生理的性質 (1) オキシダーゼテスト − (2) カタラーゼテスト − (3) Ｏ−Ｆテスト Ｆ (4) 食塩（6.5％） 生育せず (5) PH（9.6） 生育せず (6) 60℃、30分の加熱 生成せず (7) グルコースから乳酸の生成率 96％ (8) 乳酸の旋光性 Ｄ＋ () ストレプトコツカス・ラクチス・リスタ
ー・ロニスBK−045株 (a) 形態的性質 (1) 形 連鎖状球菌 大きさ 0.6〜1.0μ (2) 運動性 なし (3)グラム染色 ＋ (b) 培養的性質 (1) 発育条件 通性嫌気性 (2) 発育温度 45℃＋ (3) ゼラチンの液化 − (4) リトマスミルクの還元 ＋ (5) 糖類の発酵 マンノース ＋ マンニツト ＋ マルトース ＋ ザリチン ＋ シヨ糖 − デンプン − グルコース ＋ イヌリン − (c) 生理的性質 (1) オキシダーゼテスト − (2) カタラーゼテスト − (3) Ｏ−Ｆテスト Ｆ (4) 食塩（6.5％） 生育せず (5) PH（9.6） 生育せず (6) 60℃、30分の加熱 生育せず (7) グルコースから乳酸の生成率 92％ (8) 乳酸の旋光性 Ｄ＋ 以上の菌学的性質をもとにして、バージーのマ
ニユアル・オブ・デイタミネイテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第７版および第８版ならびに
「乳酸菌の研究」（北原覚雄著）により検索した結
果、ストレプトコツカス・ラクチスに該当するこ
とが認められた。なお、これらの菌株はストレプ
トコツカス・ラクチス・リスター・ロニスBK−
042株（微工研条寄第71号）およびストレプトコ
ツカス・ラクチス・リスター・ロニスBK−045
株（微工研条寄第72号）として工業技術院微生物
工業技術研究所に保管されている。 本発明のアレルギー反応抑制剤は、たとえば以
下の操作によつて製造することができる。 乳酸連鎖球菌の培養は常法により行なえばよ
く、たとえばGYP培地を用い、32〜37℃で10〜
24時間、好ましくは15〜20時間培養する。培養終
了後、遠心分離その他の適当な手段によつて集菌
する。次いで、得られた菌体を破砕して菌体破砕
物を得る。この場合、菌体は予め蒸留水、生理食
塩水、適当な緩衝液（燐酸緩衝液など）等を用い
て予め洗浄しておくことが望ましい。また、菌体
の破砕処理は凍結融解法、ホモジナイザー法、酵
素溶解法、超音波破砕法など既知の物理的、化学
的手法を任意に適用できるが、抽出目的物の安定
性確保と以後の処理工程を考慮すると超音波破砕
法が望ましい。この場合、なるべく低温下で行な
うようにすべきである。 かくして得られた菌体破砕物を遠心分離、過
等の処理を行ない上澄部または液を得、必要に
応じて濃縮操作を行なう。次に、この上澄部また
は液について半透膜を用いて透析処理を行な
う。透析処理後、透析残渣部を遠心分離して上澄
部を得る。この上澄部には、本発明薬剤の有効成
分たる乳酸連鎖球菌の細胞内物質が含まれてい
る。本発明では、この上澄部について10％濃度の
エチルアルコールで処理し、遠心分離を行ない、
上澄部を得る。この上澄部には乳酸連鎖球菌の水
可溶性細胞内物質が含まれている。次いで、この
ようにして得られた乳酸連鎖球菌の水可溶性細胞
内物質の水溶液にエチルアルコールを加えて30％
エチルアルコール濃度とし、可溶部と不溶部とに
分離する。分離された可溶部に対し、更にエチル
アルコールを加えて50％エチルアルコール濃度と
し、これを可溶部と不溶部に分離する。次いで、
不溶部を分取することによつて、本発明のアレル
ギー反応抑制剤の有効成分が得られる。 本発明のアレルギー反応抑制剤には増量剤、安
定剤などの常用の成分を適宜加えることができ
る。アレルギー反応抑制剤の形態は特に制限がな
く、たとえば懸濁液や粒状、粉状などの形態とし
て用いることができる。さらに、本発明のアレル
ギー反応抑制剤の投与方法も任意であり、たとえ
ば経口投与、腹腔内投与、静脈注射などを任意に
適用できる。 本発明のアレルギー反応抑制剤の特色を列記す
れば、以下の通りである。 (1) 各種タイプの異種免疫病に対して有効であ
る。たとえばアレルギー性気管支喘息、小児喘
息、アレルギー性鼻炎（枯草熱、花粉症）、ア
トピー性皮膚炎、食物アレルギー、薬疹、アレ
ルギー性肝中毒、アレルギー性胃腸疾患などの
予防および治療に有効である。 (2) 本発明の製剤は微生物菌体抽出物を主成分と
しており、実験的には毒性が認められない。ま
た、副作用もみられないなど安全性がきわめて
高い。 (3) 従来のアレルギー反応抑制剤が多価抗原製剤
であるのに対し、本発明の製剤は単独の菌を用
いている。 (4) しかも本発明に用いる菌は非病原菌である。
したがつて、感染の恐れがない。 (5) 従来の菌製剤は接種法あるいは注射法によら
ねばならなかつたが、本発明の製剤はその高い
薬効と安定性の故に経口投与が可能である。し
たがつて、被投与者に投与抵抗感がないことが
期待される。 (6) 特に喘息に対して本発明の製剤は１ｇＥ値の
下降が実証されており、しかも従来の特異的減
感作療法および非特異的減感作療法のいずれに
もみられない独得の用途を有している。 次に本発明を実施例により詳しく説明する。 実施例 １ （有効成分の分離） ストレプトコツカス・ラクチス・リスター・ロ
ニスBK−045株（微工研条寄第72号）を常法に
より培養して得た培養物から遠心分離して菌体を
とり、充分に水洗して16114ｇの菌体を得た。 該菌体を水懸濁液として20KHz、200W、60分
の超音波破砕をした。破砕後13000×Ｇ、60分間
の遠心分離処理をし、第１の上清液（SUP−１）
と第１の沈澱物（PPT−１）に分けた。該第１
の沈澱物（PPT−１）を水懸濁液として、20K
Hz、200W、20分間の超音波破砕処理をしたのち、
13000×Ｇ、20分間の遠心分離操作を行ない、第
２の上清液（SUP−２）と第２の沈澱物（PPT
−２）を得た。 上記第１の上清液（SUP−１）と第２の上清
液（SUP−２）を混合し約８倍の濃度まで濃縮
した。これを蒸留水にて２日間透析し、透析残部
（REM−１）を得た。該透析残部（REM−１）
に蒸留水を加えて、13000×Ｇ、20分間の遠心分
離を行ない、第３の上清液（SUP−３）と第３
の沈澱部（PPT−３）に分けた。 上記第３の沈澱部（PPT−３）に蒸留水を加
えて、13000×Ｇ、20分間の遠心分離をし、第４
の上清液（SUP−４）と第４の沈澱部（PPT−
４）を得た。 上記第３の上清部（SUP−３）と第４の上清
部（SUP−４）とを混合し、この混合液に99.5％
エチルアルコールを徐々を加えてエチルアルコー
ル濃度が約10容量％になつたところで添加を停止
した。このとき上記混合液に白濁が観られたの
で、これを15000×Ｇ、20分間遠心分離し、第５
の上清液（SUP−５）の第５の沈澱部（PPT−
５）を得た。 上記第５の上清液（SUP−５）に更にエチル
アルコールを加えて、エチルアルコール濃度が約
30容量％になつたところで添加を停止した。この
ときも白濁が観察されたので、これを15000×Ｇ、
20分間遠心分離して、第６の上清液（SUP−６）
及び第６の沈澱部（PPT−６）に分離した。 上記第６の上清液（SUP−６）に更にエチル
アルコールを加えて該上清液（SUP−６）のエ
チルアルコール濃度を約50容量％とした。このと
きも白濁が観察されたので、これを15000×G20
分間遠心分離し、第７の上清液（SUP−７）と
第７の沈澱部（PPT−７）に分けた。該第７の
沈澱部（PPT−７）を凍結乾燥し、淡黄色の第
１の粉末（Ｂ−４）を66.1ｇ得た。 上記第７の上清液（SUP−７）を湯浴中で60
℃、30分間加熱し、これを15000×Ｇ、20分間遠
心分離し、第８の沈澱部（PPT−８）を得た。
該第８の沈澱部（PPT−８）を凍結乾燥し、3.6
ｇの第２の粉末（Ｂ−５）を得た。 実施例 ２ （受動感作による動物実験） 実施例１で得た第１及び第２の粉末（Ｂ−４、
Ｂ−５）についてそれぞれ動物実験を試みた。 実験には生後４週間、体重340〜460ｇの雌モル
モツトを用い、これをさらに１週間予備飼育後、
健常なモルモツトを選抜して実験に供した。実験
動物は予備飼育、実験期間を通して温度22±２
℃、湿度50±５％の恒常飼育室で飼育し、固型飼
料と水道水は自由に摂取させた。 モルモツト感作方法はウサギ（体重３Kg前後）
に１％α−アミラーゼ（枯草菌より得られる結晶
細菌性α−アミラーゼ）とフロインド補助液
（Freund′s Complete adjuvant）を１：１（重量
比）に混合した懸濁液を１ml／Body量を週２回、
４週間筋肉注射によつて行なつた。このウサギよ
り得た抗α−アミラーゼ家兎血清（抗体価×32）
をそれぞれのモルモツトに２ml／Body量を腹腔
内投与し、被働感作を行なつた。 前記実施例１によつて得たストレプトコツカ
ス・ラクチス菌体抽出物の投与はそれぞれ１群６
匹を使用し、抗α−アミラーゼ家兎血清被働感作
を行なう前にそれぞれ３日前より第１の粉末（Ｂ
−４）は水に溶かし、第２の粉末（Ｂ−５）は水
に懸濁して胃ゾンテを用いて４日連続経口投与を
行なつた。投与は１日に１回で10mg／回であつ
た。 前記被動感作を行なつてから48時間後に1.68
の円筒舷チヤンバーに入れ、１％α−アミラーゼ
溶液を超音波ネブライザーを用いて0.5ml／分の
噴霧条件で10分間噴霧吸引させ、その間に惹起さ
れるモルモツトのアレルギーシヨツク症状を観察
した。抑制効果は処置各群の平均シヨツク係数、
標準偏差値、及びｔ検定値を比較して判断した。
なお、シヨツク症状の程度は表−１の如く評価し
た。それぞれの粉末投与群及び無投与群のシヨツ
ク症状は表−２に示すとおりであつた。

【表】

【表】 ※ ※
無処置対照群では、いずれのモルモツトも１％
α−アミラーゼ噴霧開始３分後位より呼吸促迫し
約５分後より時折吃逆およびけいれん、放尿等が
見られるようになり、噴霧終了時にはチアノー
ゼ、後肢のマヒおよび全身性アナフイラキシーシ
ヨツク死が２例（Ｂ−４の場合）および１例（Ｂ
−５の場合）に認められた。 一方、菌体抽出物処置群は無処理群に比べシヨ
ツク死が１例及び２例あつたと言えども全身性ア
ナフイラキシー抑制効果は極めて有意なものであ
ることが認められた。 実施例 ３ （能動感作による動物実験） 実施例２と同様にして健常なモルモツト29匹を
選び、うち９匹を無投与対象群とした。実験動物
は予備飼育、実験期間を通して温度22±２℃、湿
度50′±５％の恒常飼育室で飼育し、固型飼料と
水道水は自由に摂取させた。 １％α−アミラーゼを29匹のモルモツトを1.68
のチヤンバーに入れて0.5ml／分、10分間吸入
させた。吸入は１日１回７日間連続の感作を行な
つた。感作開始後11日目（即ち感作終了後４日
目）から、実施例１で得られた粉末（Ｂ−４、Ｂ
−５）を１群10匹としてそれぞれの群に経口投与
した。投与方法は実施例２と同じく、第１の粉末
（Ｂ−４）は水に溶かし、第２の粉末（Ｂ−５）
は水に懸濁させて胃ゾンデにて経口投与した。投
与量は１日１回10mgで投与期間は４日間であつ
た。 最終の投与が終了して約１時間後に、アナフイ
ラキシーシヨツクの試験を行なつた。これには実
施例２と同じくモルモツトを1.68のチヤンバー
に入れ、0.5ml／分、10分間の噴霧条件で１％α
−アミラーゼ溶液を吸引させ、その間に惹起され
るモルモツトのアレルギーシヨツク症状を観察し
た。なお、シヨツク症状の程度は表−１の如く評
価した。結果は表−３に示すとおりであつた。

【表】

【表】 ※ ※
参考例 BK−045株の凍結乾燥製品（Ｂ−４）につい
て毒性試験を行なつた。結果を表−４に示す。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 乳酸連鎖球菌の細胞内物質を30％エチルアル
   コール濃度で分離して得られる可溶部を50％エチ
   ルアルコール濃度にて再分離して得られる不溶部
   を有効成分とするアレルギー反応抑制剤。 ２ 乳酸連鎖球菌の水可溶性細胞内物質の水溶液
   にエチルアルコールを加えて30％エチルアルコー
   ル濃度とし、可溶部と不溶部に分離する第１の分
   離工程と、 該第１の分離工程にて分離された可溶部に更に
   エチルアルコールを加えて50％エチルアルコール
   濃度とし、可溶部と不溶部に分離する第２の分離
   工程と、 該第２の分離工程による不溶部を分取する工程
   よりなるアレルギー反応抑制剤の製法。