JPS59113897A

JPS59113897A - 微生物の検出および分離方法

Info

Publication number: JPS59113897A
Application number: JP58202928A
Authority: JP
Inventors: ジヨセフイン・グロシユ; ゲ−リ−・エイ・ウイルソン; カレン・ウオルウエバ−; クリフオ−ド・オ−・イエ−ル
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1982-11-01
Filing date: 1983-10-31
Publication date: 1984-06-30
Also published as: JPH0355117B2; DK162241B; DE3369702D1; DK498983A; EP0108303A1; EP0108303B1; DK162241C; NO165730C; NO833809L; NO165730B; ATE25405T1; DK498983D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、分泌される又は分泌されない物質のいずれか
を生産する微生物を検出し及び／又は分離する方法に関
する。

代謝生成物及び蛋白質を生産しうる微生物は、工業化学
品、酪農品、抗生物質のような種々の分野の工業及び工
業的用途において重要性が増している。

微生物は、土壌試料の日常的選別により；古典的な遺伝
学的処理技術、例えば紫外線照射及び突然変異種の選別
；或いは遺伝学的物質をある微生物から宿主微生物へ移
行させて宿主微生物の遺伝学的特性を変史させることを
含む組みかえＤＮＡ技術により得ることができる。

各々の場合、所望の特性を有する微生物を検出するため
に一連の微生物を選別しなければならない。そのような
微生物の選別及び分離は微生物の多数のコロニーを生長
させ且つ検査することが普通であり、多大な労力と時間
がかかる。

所望の遺伝学的特徴を有する或いは所望の物質を生産す
る微生物の検出及び分離は、微生物を適当な寒天培地上
で生長させ、るる技術を用いて所望の微生物を検出する
という工程を含む。次いで所望の微生物を他の微生物の
コロニーから除去し、分離する。

いくつかのバクテリヤ菌株において、「基本的」（ｐｒ
ｉｍａｒｙ　）な分離手段が存在し、例えば所望の微生
物がある種の抗生物質に対して耐性がある場合、試験す
べき微生物をそのような抗生物質の存在下に培養し、生
き残った微生物を選別し、分離することができる。反対
に、いくつかの微生物は「基本的な」選別特性を有さな
い。そのような微生物は［選別ｊ　（ｓｃｒｅｅｎｉｎ
ｇ　）技術として言及される生化学試験を用いて選別し
、分離しなければならない。例えば酵素アルファ（α）
−アミラーゼを生産する微生物は、殿粉を寒天培地中に
混入し、微生物を生長させ、寒天をヨウ素と接触させ、
そしてα−アミラーゼを分泌する微生物によって引き起
こされた殿粉の加水分解の存在を指示する寒天の透明な
域を観察することによって選別することができる。

基本的な選別特性或いは生化学的選別試験のいずれかを
包含する寒天培地中で生長する微生物の検査は常法によ
ると手間がかかり１時間を消耗する。寒天板上に生長す
る比較的少数のコロニーに適用できる標準的な分析法が
存在する。

所望の微生物を検出するだめの改良された方法が必要と
されている。それ故に本発明の目的は、少数の処理工程
と材料を用いることによって、寒天培地中で生長する多
数の微生物を検査し、所望の物質を生産する微生物を選
別するための迅速な且つ経済的な手段を提供することで
ある。

本発明は、分泌される又は分泌されない物質を生産する
微生物を検出及び／又は分離する方法に関する。

所望の物質を生産し１つ分泌する微生物を検出し及び分
離する方法は、（ａ）　　無菌の（５ｔｅｒｉｌｅ　）半透過性膜を、
寒天培地表面に関して予じめ決められた方位（ｏｒｉｅ
ｎｔａｔｉｏｎ　）　　で該寒天培地の表面上にかぶせ
て置き、但し該寒天は所望の物質と反応しうる試薬を含
有し；（６）　　該微生物を該膜上で生長させ、そして該微生
物を該膜上に保留させつつ該物質を該寒天培地中へ通過
させ；（Ｃ）　　該膜を該表面から取シ除き、そして該膜を無
菌の環境に保持し；（め　該物質と該試剤との間の検知しうる反応を観察し
；（ｇ）　　核子じめ決められた方位を利用して該物質を
生産する該微生物の位置を同定し；そして（ハ　該微生
物を該膜から除去して該膜がら該微生物を分離する、工程を含む。他に、寒天は試薬を含有する必要がなくて
試薬と接触させてもよい。所望の生成物が生成物及び単
一の試薬間での反応によって検出できないならば、寒天
培地を一連の試薬と接触させ、該物質と試薬の少くとも
１つとの間の検出反応を観察する。

所望の物質を生産するが分泌しない微生物を検出する方
法は、（ａ）　　無菌の半透過性膜を、寒天培地表面に関して
予じめ決められた方位で該寒天培地の表面上にかぶせて
置き、但し該寒天は上記物質と反応しうる試薬を含有し
；（ｂ）　　上記微生物を該膜上で生長させ；（Ｃ）　　
該微生物をその場で溶解させて該物質を遊離させ、そし
て該微生物を該膜上に保留させつつ該物質を該寒天培地
中に通過させ；（の　該膜を該寒天培地から除去し；（６）　　該物質と該試薬との間の検知しうる反応を観
察し； ω　核子じめ決められた方位を利用して該物質を生産す
る該微生物を検出する、工程を含む。他に寒天は試薬を含有する必要がなくて試
薬と接触させてもよい。所望の分泌されない生成物が生
成物及び単一の試薬間での反応によって検出できないな
らば、寒天培地を一連の試薬と接触させ、該物質と試薬
の少くとも１つとの間の検出反応を観察する。

含まれる微生物の生長の会費条件及び特性に依存して、
広い範囲の寒天培地が本発明で使用するのに適当である
。適当な媒体は技術的に良く知られており、５ｐｉｚｉ
ｚｅｎの最小塩、トリプトース血液寒天基剤及び栄養寒
天を含む。

半透過性膜は、微生物によって生産される物質を寒天培
地へ拡散させ、一方間時に微生物を保留するものが適当
である。例えば、約ＩＸＩ（Ｍ’ミクロン（μ）〜約０
．４５μの範囲の孔径を有する半透過性膜は適当である
。更に半透過性膜は微生物の生産する生成物に化学的に
不活性でなければならない。適当な膜はセルロース、ニ
トロセル−ロース、誘導体化ニトロセルロース、酢酸ニ
トロセルロース、ナイロン及ヒヘキサフルオルプロピレ
ンとテＩドラフルオルエチレンとの共重合体から作るこ
とができる。

ＡＴＣＣ番号はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｒｂｌ
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、　　Ｍａｒｙｌａｎｄ　　）から入手しうる微生物
培養物に関する。Ｂ　Ｇ　Ｓ　Ｃ番号は０ｈｉｏ　５ｔ
ａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｃ７）　Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓＧｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　（Ｃ
ｏｌｕｍｂｕｓ。

０ｈｉｏ）から入手しうる微生物培養物に関するもので
ある。

微生物の生産する物質は酵素、例えばアミラーゼ例えば
α−アミラーゼ；グロテアーゼ、例えばアルカリグロチ
アーゼ；セルラーゼ及びβ−ラクタマーゼを含む。他の
物質は、抗生物質、例えばヘニシリン、ストレプトマイ
シン及びエリトロマイシンのような生成物を含む。また
代謝物例えばピルビン酸、アスコルビン酸及び遺伝蛋白
質例えばカプシド蛋白質（ｃａｐｓｉｄ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）及びβ−ガラクトシダーゼである。

上述の物質を生産する適当な微生物は下表の通シである
：ｍｉｓα−ａｍｙｌａｓｅ） β−ガラクトシダーゼ　大腸菌に１２　（ＡＴＣＣ１０
’１９８）Ｔ４９／Ｃ（ＡＴＣＣ２５９７２）　　　’
ペニシリン　　　　　　　ペニシリウム・クリフケ９ナ
ム４１１６３５）アスコルビン酸　　　　　麦酒酵母菌（ＡＴＣＣす７７
５４）ピルビン酸メチオニン　　　　　　　麦酒酵母菌（ＡＴ（、’Ｃ赤
３２０４９）（アミノ酸） φ２９／ぐクテリオフ　　（ＢＧＳＣＩＰ１９）アージ（カプシド蛋白）後に例示するように、適当な試薬は微生物で生産される
所望の物質と反応し、そして検出しうる反応生成物を与
える試薬を含む。このような反応は同業者には公知であ
る。検出しうる反応は、好ましくは寒天培地中に混入さ
れた単一の試薬を用いて達成することができる。他に一
連の試薬を用い、その１つが所望の生成物と反応して検
出しうる反応生成物を与えせしあてもよい。第１の試薬
を寒天培地に混入し、上記物質がこの寒天培地中へ通過
した後、寒天培地を１つ又はそれ以上の試薬と接触させ
てもよい。他に該物質が寒天培地へ通過した後に、寒天
培地を１つ又はそれ以上の試薬と接触させてもよい。

寒天培地に混入しうる適当な単一の試薬は、グロテアー
ゼと検出しうる反応をするカゼインを含む。一連の試薬
は、α−アミラーゼの検出のための殿粉及びヨウ累；β
−ラクタマーゼを検出するためのポリビニルアルコール
、Ｉ、２．Ｋｌ、ナトリウムテトラポレート、及びペニ
シリン；アスコルビン酸を検出するためのトリクロル酢
酸、４゜７−−／フエニル−１，１０−フェナンス口Ｉ
）７及び第一鉄イオン；及びペニシリウムｎ出するため
のポリビニルアルコール、Ｉ２２、Ｋ１１ナトリウムテ
トラボレート及びβ−ラクタマーゼ、を用いる系を含む
。

実施例！ α−アミラーゼを生産し且つ分泌するＢ、リケニホルミ
ス種（Ａｍｙ）からのＤＮＡを、本明細書に参考文献と
して引用される本特許願と関連出願の特許願（Ａｔｔｏ
ｒｎｅｙ　Ｄｏｃｋｔｔｔ第ＭＳ−１２゜５８号）に記
述されている如き組みがえＩ）ＮＡ技術によって、元々
α−アミラーゼを生産しない又は分泌しない枯草菌種（
ＢＧＳＣ、１ｔ４２８９種）（Ａｍｙ”）に分枝させ、
下記の如くα−アミラーゼを生産する微生物への変態に
関して検査した。

最初クロラムフェニコール（Ｃｍ、）に敏感テある枯草
菌（ＢＧＳＣ，ｌＡ２８９種）（Ａｍｙ−）を用いた。

次いでそれぞれクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）を
与え且つ異質なりＮＡ断片又は遺伝子の任意な配列を含
有する組みかえプラスミド（ｐｌａｓｔｎｉｄ　）　Ｄ
ＮＡ分子の捕集によって枯草菌細胞を変態させた。その
ようなグラスミドの枯草菌細胞への導入は、ＣｍＲの変
態である細胞をもたらした。次いでとのＣｍＲ変態種を
、プラスミドによってもたらされたα−アミラーゼ遺伝
子の導入に由来するα−アミラーゼを生産する能力（Ａ
ｍ！／　）に関して選別した。そのような分枝法は約ｌ
Ｘｌ０’個の枯草菌のコロニーをＡｍｙ＋表現団表現上
て選沖月゛ることを必要とした。

通常の手段により、即ち細胞を膜のない寒天板上で選別
することにより、１００又はそれ以下にすぎないコロニ
ーを各寒天板に見ることができだ。

寒天上のコロニーが混み合っているために１続く所望の
生成物を検出する反応を観察することが不可能であった
。また細胞は検出反゛応段階で死ぬこともあった。

一方膜を用いると、ｉｏ、ｏｏｏ〜１０，０００，００
０の選別すべきコロニーを各寒天板上に生成させること
を可能にした。細胞を含む膜の除去は裸火中の反応を容
易に観察することを可能にし、細胞を生きた状態で保持
せしめた。

１、０００．０００のコロニーの選別を必要とする典型
的な実験は、常法による１　０．０００の寒天板の処理
を営む。後述する如き膜技術を用いれば、そのような選
別が１０にすぎない寒矢板で達成されよう。

トリゾトース血液寒天基材、１％のカサミノ酸（ｃａｓ
ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　）（ｊＪｉｊ’ｃｏ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉ−ｓｓ、　１）ｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈ
ｉｇａｎ　）及び５μｒ／′ｍ／！のクロラムフェニコ
ールを含み、ＬＯ％ＣＩｌ′／Ｖ　）の殿粉をα−アミ
ラーゼに対する試剤として混入した寒天培地を準備した
。高純度の適当な殿粉は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　、５ｏｃ
ｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　Ｃｈ、ｅｍｉｓｔｓ
。

Ｉｎｃ、　（Ｓｔ、　ｐａｕｌ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ
　５５１２１　）から「齢開力及びα−アミラーゼの検
知に特異的」であるとして市販されている殿粉である。

培地の２５一部分を１００ｕのＫ）　ＩＪ皿（板）上に
置いた。この板は有害な影響なしに３週間までの間、密
閉できるプラスチック製のスリーブ中に４℃で貯蔵でき
た。

０．４５μｍの孔の寸法を有する半透過性の膜を次のよ
うに使用した。適当な膜はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ　（Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ｋｉａｓｓａｃ
ｈｌＬｓｅｔｔｓ）から商品名Ｈｙｈｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ　、Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ＦｉｌｔｅｒＤｉｓｃとし
−Ｃ市販されている。

膜を殿粉寒天板上に置くときの方位の印として役立たせ
るために、長さ約５闇の２つ部分を互いに直角にし、て
切り取った。無灰分のｐ紙を細片（約５ｍｉＬＸ５０ｍ
Ｊに切り、殺菌中に膜間に置いた。積み重ねた膜をガラ
ス製ペトリ皿の水中に浸し、オートクレーブ中において
１２０°Ｃで３０分間処理した。

この殺菌した膜を、殺菌したＦ紙ビンセットで無菌移動
させることによシ殿粉板の寒天表面上にかぶせた。寒天
板を回転し、無菌のガラス棒を用いることによってしわ
や空気泡を取シ除き、膜と寒天表面を良く接触させた。

ｐ紙のかけ目の位置を各板の底部に表示した。膜を寒天
のすべての領域で良く接触させるために、殿粉板が新し
く且つ泡のないことが分析の効果に対して必須であった
。

前述した枯草菌１，４２８９の変態に対する方法に従い
、約ｌＸｌ０’のコロニー形成単位／ｍｌ！を含む細胞
０．１−を膜上べ直装置いた。板を右側を上にして１２
〜１８時間、３７℃で培養した。この時間は、微生物に
よって生産されたいずれかのα−アミラーゼが膜を通過
するのに十分であった。

培養期間の後、膜を涙紙ピンセットによシ無菌状態で除
去した。膜を取り除き、無菌のペトリ皿に移し、適当に
標識した。

各殿粉−寒天板を、４〜７秒間ヨウ素蒸気上に直接保持
した。この時ヨウ素蒸気は第２の試剤として機能する。

膜を取シ出し、α−アミラーゼの存在に関して寒天を検
査した。これは高濃度においてコロニーに致命的である
ヨウ素にコロニーをさらすことを必要としなかった。次
いで寒天を光源上に置き、α−アミラーゼ及びヨウ素間
の検出しうる反応、即ち青色の殿粉−ヨウ素の背景に対
して透明な殿粉加水分解域を与える反応を肉眼で観察し
た。この技術により、ＩＸ　１０’　Ａｍｙ−コロニー
の領域に１つのアミラーゼ生産コロニーが検出できた。

この領域の位置を、板をヨウ素で発色させた直後に板の
底に直接印をつけた。これは色が７〜１５秒後に消え始
めるから必要であった。ヨウ素蒸気の工程の代シに、水
性ヨウ素溶液（２％ヨウ化カリウム、０．２％ヨウ素）
２−を用いて領域を観察することもできた。この方法で
ヨウ素を適用すると、蒸気法によるよりも長く色が保持
される。

アミラーゼを生産するコロニーを回収するために、Ａｍ
ｙ＋　細胞を含有する膜を、きれ目を用いてその元の殿
粉ヨウ素寒天板に一致させ且つ上に移し、適切な方位に
配列させた。板を光源上に保つことにより、先に標識し
た領域を膜を通して観察し、濾紙上のコロニーと関連づ
けた。

次いで目的のコロニーを、無菌の楊子でひつかき、その
細胞をトリプトース・ビーフ肉汁（ＴＢＢ）：１％トリ
プトース、０．３％ビーフ抽出物、０．５％ＮａＣ１，
及び０，１％カサミノ酸の１．　Ｏｍｌ中に懸濁させる
ことによって濾紙から除去した。一連の希釈を行ない、
細胞０．１　ｍｌを前述のようにＴＢＡＢ＋殿粉＋’／
ロラムフエニコールの寒天板の上の膜上に置いた。次い
でＡｍｙ＋、ＣｍＲの枯草菌細胞の純粋な培養物が得ら
れるまで上述の膜検出分析を練返した。この方法により
、アミラーゼを生産する１つの分校系が検出され、元々
の凡そｌＸｌ０’のコロニーの全体から分離できた。

本発明の検出法を次の実施例で用いて、β−ラクタマー
ゼを生産しない細胞群中に存在する酵素ベータ（β）−
ラクタマーゼを生産する微生物を検出する。

実施例■ バチルス・リケニホルミス種７４９７ｃ（ｎｃＳＣ）は
β−ラクタマーゼを生産し且つ排出する種である。枯草
菌Ａ１２（ＢＧＳＣ）はβ−ラクタマーゼを生産しない
無胞子仕種である。

両方の微生物を、トリプトン（１）ｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ
ｒα−１ｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈｉ
ｇａｎ　）　　１０　Ｖ　／　ｌ。

イースト抽出物（Ｄｉｆｃｏ　）　　５り／ｌ、ＮａＣ
１５ｒ／１及０＝グルコース４１／ＩＩからなる肉汁中
で３７℃下に生長させた。Ｂ、リケニホルミス１４９／
Ｃを約ｌＸｌ０’／ｆｎｌの細胞の濃度まで生長させ、
及び枯草菌、４１２を約Ｉ　Ｘ　１０”７ｍｌまで生長
させた。適当な希釈物を、トリプトース血液寒天基剤（
１）ｉｆｃｏ）、０．１％カシミノ酸（Ｄｉｆｃｏ　）
　及ヒＯ，？　５％ポリビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　　ｓｔ、　　Ｌｏｗｉ
ｓ。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　）　　を含有する寒天板に植えつけ
ることによって細胞の濃度を決定した。

半透過性膜を実施例■に記述したように調製した。それ
ぞれトリプトース血液寒天基剤、０，１％のカシミノ酸
及び０．７５％のポリビニルアルコール（β−ラクタマ
ーゼに対する第１の試剤）２５−を含有する１００１鮨
のベトリ皿の組に、無菌の半透過性の膜濾紙で覆い、無
菌のピンセット及びガラス棒で膜と寒天表面との間の接
触を完全にした。濾紙のきれ目の位置を各寒天板の底部
に印した。枯草菌Ａ１２培養物の適当な希釈物を、濾紙
表面上に植えつける希釈物０．１−がＩ×１０１１１１
ＸＩＯ’又はｌＸｌ０’の細胞を含有するように作った
。各希釈物に対して４つの寒天板の組を準備した。Ｂ、
リケニホルミス７４９７Ｃの適当な希釈物を、濾紙表面
上に植えつける希釈物０．１−が１．１０．４０又は１
００の細胞を有するように作った。そのような希釈物の
それぞれ１つを、枯草菌Ａ１２の細胞を予じめ広げた板
の組の各々に植えつけだ。寒天板を右側を上にして１２
〜１８時間３７℃で培養した。この期間は、微生物の生
産するいずれかのβ−ラクタマーゼが膜を通過するのに
十分であった。

培養期間の後、膜を濾紙ビンセットにより無菌状態で除
去し、無菌のペトリ皿に移し、適当に標識した。次いで
各寒天板を、０．３２ＮＫＩ中０．０８Ａ’　　Ｉ、及
び１％ＣＷ／Ｖ）のナトリウムテトラゾレートを含む溶
液３〜５−で３０〜６０秒間処理した。このＩ２、ＫＩ
及びす）　ＩＪウムテトラ？レートは組合さって第２の
試剤として機能し、寒天中に暗青色のポリビニルアルコ
ール−ヨウ素錯合体を生成させた。次いで寒天板を除水
し、続いて第３の試剤としてのペニシリンＧの、０．１
Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，８、中の１％（Ｗ／Ｖ
）溶液３〜５−で処理した。この寒天板を光源上に置き
、暗い背景上に現われる透明な域を肉眼で観察した。こ
の透明な域は寒天中のβ−ラクタマーゼによるペニシリ
ンＧの加水分解によって生じた。β−ラクタマーゼを生
産しないｌＸｌ０”コロニー／寒天板の黒い背景の中に
１つのβ−ラクタマーゼを生産するコロニーを検出する
ことができた。

本発明の検出方法を次の実施例で記述するように利用し
て、プロテアーゼを生産しない微生物の分布中に存在す
るプロテアーゼ酵素を生産する微生物を検出し、分離す
ることができた。

実施例■ 枯草菌ＳＲ２２（ＥＧＳＣ種ｌ５１０）はプロテアーゼ
を生産しない微生物である。Ｂ、アミロリクイファシェ
ンスＨ（ＢＧＳＣ種１０，４２）はプロテアーゼを生産
する微生物である。

１、ｏ％のＢａｃｔｏ−Ｎｒｂｔｒｉｅｎｔ寒天（Ｄｉ
ｆｃｏ）の寒天培地を準備し、依然液体である間に、最
終培地力２．５％Ｃ１４’／Ｖ）の乾燥ミルクであるよ
うに、「トリス」でｐＨ８，０に平衡化させた脱脂イン
スタント乾燥ミルク（試剤として）の−菌溶液と混合し
た。適当なインスタント乾燥ミルクはＧａｌｌｏｗ’ａ
ｙ−Ｗｅｓｔ　　Ｃｏ、、　Ｆｏｎｄ　ｄｕ　ｌａｃ。

１１’１ｓｃｏｎｓｉｎから商品ｐｅａｋｅとして入手
しうる。

培地２５ｄ部分を各ベトリ皿中へ注いだ。

実施例１に記述するように、無菌の半透過性膜を寒天板
の表面上に置き、印をつけた。

Ｉ　Ｘ　１０’の枯草菌Ｓ２２細胞及びｌＸｌ０’のＢ
、アミロリクイファシェンスＲ細胞を含有する懸濁液０
．１−の容量をｒ紙上に直装置いた。寒天板を右側を上
にして３７℃で４８時間培養した。

微生物によって生産されるいずれかのプロテアーゼが膜
を通過するのに十分な時間である培養期間後、膜を実施
例１に記述するように無菌状態で除去し、移し、標識し
た。

次いで寒天中の凝集したミルク蛋百質の濁った背景中の
透明な域を肉眼で直接見ることによって寒天板を検査し
た。この透明な領域はＢ、アミロリクイファシェンスＢ
微生物によって生産され且つ分泌されたプロテアーゼと
寒天中に存在する試剤との間の反応によるミルク蛋白質
（カゼイン）の加水分解を示す。

Ｂ、アミロリクイファシェンスのプロテアーゼを生産す
る微生物を実施例１に記述したように膜から分離した。

カゼイン以外のプロテアーゼに対する基質も寒天培地中
に試剤と七て混入できた。１つのそのような基質は牛の
血清アルブミン（、Ｂ　ＳＡフラクショ７　Ｖ　、　Ｍ
ｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、。

Ｅｌｋｈａｒｔ　、　　Ｉｎｄｉａｎａ　）　テｌる。

微生物の生長後、ＢＳＡを試剤として含有する寒天を３
％（Ｖ／Ｖ）の酢酸の溶液で処理し、加水分解の領域を
肉眼で観察しだ。［参照、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　’
ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　　５８０　：
　３３９〜３５５（１９７９）］。

次の実施例では、アスコルビン酸を生産且つ分泌しない
微生物の分布中に存在するアスコルビン酸を生産且つ分
泌するイースト又は他の微生物の検出のために使用でき
た。

実施例■ Ａン屋の麦酒酵母菌ＡＴＣＣ７７５４はアスコルビン酸
を生産且つ分泌するイースト菌種である。

この種を適当な栄養液中において約ｌＸｌＯ７又はｌＸ
ｌ０’細胞／−の濃度まで生長させた。

半透過性の膜を実施例■に記述したように準備した。そ
れぞれトリプトース血液寒天基剤及び０．１％のカサミ
ノ酸の２５−を含む１００朋のペトリ皿の組を調製した
。この寒天板に実施例Ｉに記述したように半透過性膜で
覆い、膜表面上に植えつけた希釈物０．１　ｄがｌＸｌ
０’〜ｌＸｌ０’の細胞を含有するように麦酒酵母菌の
適当な希釈剤を作った。

この板を右側を上にして３７℃で約１２〜１８時間培養
し、微生物によって生産されたいずれかのアスコルビン
酸を膜を通過させた。

培養期間の後、膜を実施例１に記述したように除去した
。各板を次の一連の試剤で処理した：エタノール中０．
４％燐酸１．　Ｏｒｎｌｉエタノール中０．５％４，７
−ジフェニル−１，１０−フエナンスロリン２．．０ゴ
及びエタノール中０．０３％ＦｅＣｌ３１．０ゴ寒天板を３０℃で培養し、光源上に置いて、アスコルビ
ン酸の存在を示す第一鉄イオン及びフェナンスロリン間
の赤色のキレートの生成を肉眼で見た。アスコルビン酸
を生産するコロニーを実施例■に記述したように除去し
、分離した。

ペニシリンを生産且つ分泌しない微生物群中に存在する
ペニシリンを生産且つ分泌する微生物を検出し、分離す
る試験は、実施例■に記述したβ−ラクタマーゼ法に基
づいて行なうことができた。

実施例Ｖペニシリウム・クリソｒナムＡＴＣＣ９４８０を、適当
な寒天培養液中において約ｌＸｌ０’／ｄの細胞の濃度
まで生長させた。

半透過性の膜を実施例１に記述したように準備した。そ
れぞれトリプトース血液寒天基剤及び０、１９６のカシ
ミノ酸を含み、また０７５％のポリビニルアルコールを
第１の試剤として含有する１００朋のペトリ皿の組を準
備した。

次いで寒天板を実施例Ｂに記述したように培養し、微生
物によって生産されるいずれかのペニシリンを膜を通過
させた。

次いで半透過性の膜を除去し、無菌のペトリ皿に移し、
適当に標識した。各板を、第２の試剤として役立つ０．
８ＯＮ　　Ｉ２．０．３２ＮＫＩ及び１％ナトリウム？
レートで処理し、暗青色のポリビニルアルコール−ヨウ
素錯合体の生成を観察した。寒天板を除水し、続いてβ
−ラクタマーゼの溶液で処理した。板を光源上に置き、
β−ラクタマーゼによるペニシリンの加水分解のために
暗色の背景上に現われる透明な領域を肉眼で観察した。

ペニシリンを生産するコロニーは、実施例夏に記述した
ように膜から除去し且つ分離することができた。

本発明の方法を用いて、β−ガラクトシダーゼを生産し
ない微生物群中に存在するβ−がラクトシダーゼを生産
する大腸菌微生物を検出した。この場合、この検出分析
は、酵素β−がラクト、シダーゼが遺伝蛋白質としても
機能するということに基づいている。

実施例■ ランダムなマウスの遺伝子配列を有するシラスミドを含
むβ−ガラクトシダーゼの欠けた（ｌａｃ−）大腸菌の
細胞〔参照、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏ−Ｑｙ、６８，４３２（１９７９）’ＩＩのバンク
（ｂａｎｋ）を標準的な組みかえＤＮＡ技術に従って調
製した。

ＤＮＡ組みかえ技術によれば、少数のβ−ガラクトシダ
ーゼを生産する有機体は、β−ガラクトシダーゼに対す
るマウスの遺伝子の分校に由来して作ることができる。

寒天培地は０．５％のＮａＣ１，０，４％のカザミノ酸
、１０μｔ　／　ｓｆのチミン、及び１．５％のＢａｃ
ｔｏ−Ａｇａｒ　（１）ｉｆｃｏ　）からなった。　こ
の寒天培地が依然溶融している間（４５°Ｃ）、β−ガ
ラクトシダーゼに対して特異的なｆｉｆ製又は粗抗血清
の適当量を試剤として添加した。抗血清の調製及び分析
に対して必要とされる濃度の決定に関する手順はＡｆｅ
ｔｌＬｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ、ｏｌｏｇ’ｌｔ＋　
６８　＋４３０〜４３１　、４３５〜４３６及び４３７
〜４３８に見出すことができる。次いで媒体を１２ｍＩ
Ｖ／板の量で１００朋のノラスチツク製ペトリ皿に注ぎ
、薄い層にしだ。

無菌の半透過性膜を実施例１に記述したように板の表面
−ヒに配置し、印をつけた。

大腸菌の細胞を膜上に広げ、３７℃で２４時間培養した
。細胞の生長に従い、寒天板の覆いを除去し、この板を
クロロホルム又はトルエン蒸気源の上にひつくり返し、
コロニーを膜上に溶解させた。他に板にトルエン又はク
ロロホルムの細かい霧を噴霧することができた。次いで
この板を蒸気フード下に放置し、残存するクロロホルム
又はトルエンを蒸発させた。β−ガラクトシダーゼが膜
を通って寒天板中に拡散した約４時間後に膜を除去し、
標識し、貯蔵した。

次いでこの寒天板を、寒天中に存在する抗体との錯合体
でのβ−ガラクトシダーゼの存在を示す沈降素の生成し
た濁った領域に関して光源上で観察した。適当な膜を寒
天の表面上に再配置してβ−ガラクトシダーゼを生産す
るコロニーの位置ヲ決めた。

β−ガラクトシダーゼの寒天板上での検出け、寒天の表
面を０．６％の寒天及び８０μｆ／ｍｌの５−ブロム−
４−クロル−３−インドリル−β、ｄ−ガラクトシド（
Ｘ　Ｇ　）　（Ｂａｃｈｅｍ、　ＭａｒｉｎａＤｅｌ　
Ｒａｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）からなる溶液２−
で覆い、３７℃で９０分間培養することによっても行な
うことができた。このＸＧはβ−ガラクトシダーゼに対
する基質として働き、酵素による加水分解時に青色の領
域を形成した。

上記方法で同定−された適当な大腸菌のコロニーの生活
細胞は、クロロホルム又はトルエンにさらしてない分析
のものと同一の手順で調製した寒天板の複製から回収す
ることができた。

上述したように、本発明の方法は、それ自体免疫性であ
る或いは適当なハシテンへの結合で免疫性にすることの
できる他の基質に関しても使用することができる。

アメリカ合衆国インディアナ用４６５１４エルクハート・キングズランドコート２３２１５

Claims

【特許請求の範囲】１、所望の物質を生産し且つ分泌する微生物を検出し且
つ分離する方法であって、（ａ）　　無菌の半透過性膜を、寒天培地表面に関して
予じめ決められた方位で該寒天培地の表面上にかぶせて
置き、但し該寒天は上記物質と反応しうる試薬を含有し
；（ｂ）該微生物を該膜上で生長させ、そして該微生物を
該膜上に保留させつつ該物質を該寒天培地中へ通過させ
；（Ｃ）　　該膜を該表面から取シ除き、そして該膜を無
菌の環境に保持し；（ｄ′）該物質と該試薬との間の検知しうる反応を観察
し；（ｇ）　　核子じめ決められた方位を利用して該物質を
生産する該微生物の位置を同定し：そして（イ）該微生物を該膜から除去して該膜から該微生物を
分離する、工程を含んでなる該微生物を検出し且つ分離する方法。２、所望の物質を生産し且つ分泌する微生物を検出し且
つ分離する方法であって、（（Ｚ）　　無菌の半透過性膜を、寒天培地表面に関し
て予じめ決められた方位で該寒天培地の表面上にかぶせ
て置き；（ｂ）　　該微生物を該膜上で生長させ、そして該微生
物を該膜上に保留させつつ該物質を該寒天培地中へ通過
させ；（Ｃ）　　該膜を該表面から取シ除き、そして該膜を無
菌の環境に保持し；　′ （ｄ）　　該寒天を１つ又はそれ以上の試薬と接触させ
、そして該物質と該試薬の少くとも１つとの間の検知し
うる反応を観察し；（ｅ）核子じめ決められた方位を利用して該物質を生産
する該微生物の位置を同定し；そして（イ）該微生物を該膜から除去して該膜から該微生物を
分離する、工程を含んでなる該微生物を検出し且つ分離する方法。３、該寒天が試薬を含有する特許請求の範囲第２項記載
の方法。４、該微生物が桿菌種、ストレプトマイシス種、ラクト
バチルス種、ゝ連鎖球菌種、及びイースト菌からなる群
から選択される特許請求の範囲第１゜２又は３項記載の
方法。５、該物質が蛋白質、酵素、抗生物質、免疫物質及び代
謝物からなる群から選択される特許請求の範囲第１，２
又は３項記載の方法。６、該試薬が物質、抗体及び化合物からなる群から選択
される特許請求の範囲第１又は２項記載の方法。７、非分泌性の所望の物質を生産する微生物を検出する
方法であって、（α）無菌の半透過性膜を、寒天培地表面に関して予じ
め決められた方位で該寒天培地の表面上にかぶせて置き
、但し該寒天は上記物質と反応しうる試薬を含有し；（ｂ）上記微生物を該膜上で生長させ；（Ｃ）　　該微
生物をその場で溶解させて該物質を遊離させ、そして該
微生物を該膜上に保留させつつ該物質を該寒天培地中に
通過させ；（力　該膜を該寒天培地から除去し；（ｇ）　　Ｈ物質と該試薬との間の検知しつる反応を観
察し；ｃ／）核子しめ決められた方位を利用して該物質を生産
する該微生物を検出する、工程を含んでなる非分泌性の該物質を生産する微生物の
検出法。＆　非分泌性の所望の物質を生産する微生物を検出する
方法であって、（α）無白の半透過性膜を、寒天培地表面に関して予じ
め決められた方位で該寒天培地の表面上にかぶせて置き
；（ｂ）上記微生物を該膜上で生長させ；（Ｃ）　　該微
生物をその場で溶解させて該物質を遊離させ、そして該
微生物を該膜上に保留させつつ該物質を該寒天培地中に
通過させ；（カ　該膜を該寒天培地から除去し；（ｇ）　　該寒天ｆ：１つ又はそれ以上の試薬と接触さ
せ及び該物質と該試薬との間の検知しうる反応を観察し
：（イ）核子じめ決められた方位を利用して該物質を生産
する該微生物を検出する、工程を含んでなる非分泌性の該物質を生産する微生物の
検出法。９、該寒天が試薬を含有する特許請求の範囲第８項記載
の方法。１０、　　該微生物が大腸菌である特許請求の範囲第７
，８又は９項記載の方法。