JPS59118086A - プロテア−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化微生物を用いるグロテアーゼの製造方法
に関し、さらに詳しくは、プロテアーゼ生産能を有する
微生物をある特定のブレポリマーを用いて固定化させ、
得られた固定化微生物を栄養培地中で培養することを特
徴とする、効率がよくかつ該微生物を繰返し使用しうる
プロテアーゼの製造方法に関するものである。

従来、グロテアーゼは皮革工業、醸造工業、食品・水産
物加工業、あるいは洗剤工業などの分野で広く用いられ
てお９、特に近年、中性プロテアーゼ及びアルカリグロ
テアーゼが家庭用洗剤に使用され、洗浄力向上剤として
高く評価されるようになって、その需要が急速に増大す
るようになった０ しかしながら、従来、グロテアーゼは培養液を満たした
タンク内に微生物菌体を浮遊させながら培養する方法に
よシ製造されているため、効率が悪く、しかも該微生物
菌体を使い捨てにするという問題があった。

ところで、近年、微生物や酵素を高分子ゲル中に閉じ込
めたり、あるいは高分子ゲルに化学的に結合させて固定
化し、種々の有用物質を産生させる方法が開発され、実
用化の可能性が高まってきた。

本発明者らは、このような事情に鑑み、微生物を用いて
効率よくグロテアーゼを製造する方法について鋭意研究
を重ねた結果、微生物の固定化技術に着目し、プロテア
ーゼ生産能を有する微生物をある特定のプレポリマーを
用いて固定化させ、得られた固定化微生物を栄養培地中
で培養することによシ、効率よくグロテアーゼを製造す
ることができ、かつ該微生物を使い捨てることなく再使
用しうろことを見出し、この知見に基づいて本発明を完
成するに至った。

すなわち、本発明は、プロテアーゼ生産能を有する微生
物を含む水性媒体中に末端インシアイ・一ト型ウレタン
プレポリマーを加えて反応させるか、あるいはプロテア
ーゼ生産能を有する微生物を含む水性媒体中に遊離ラジ
カル重合型光硬化性プレボリマーを加え、増感剤の存在
下活性線を照射させ、次いでこのようにして得られた固
定化微生物を栄養培地中で培養することを特徴とするグ
ロテアーゼの製造方法を提供するものである。

本発明方法において用いる微生物は、グロテアーゼ生産
能を有する微生物（以下プロテアーゼ生産微生物と略称
する）であれば特に制限はなく、任意例選択することが
できる。このような微生物としては、例えばバチルス・
ズブチリス、バチルス・サーモプロテイオリテイクス，
バチルス・ステアロサーモフイラス，バチルス・ポリミ
キサ，バチルス・リケニホルミス，バチルス・アミロリ
クファシエンス，クロストリジウム・ヒストリテイクム
，ストレプトマイシス・コリ，ストレプトマイセス・フ
ラテイ，シュードモナス・フルオレセンス，Ｖ−マス・
サーモフイラスセラチア属などのｉ？？？類、及びアス
パルギルス・ニガー，アスバルギルス・オリザエ，ペニ
シリウム・クルクロピリウムなどのカビ類が適当である
。特にアルカリグロテアーゼを生産する微生物としては
バチルス・ズプチリス及びバチルス・リケニホルシス，
中性グロテアーゼを生産する微生物としてはクロストリ
ジウム・ヒストリテイクム及びシュードモナス・フルオ
レセンスが好ましい。さらに、これらの中でバチルス・
リケニホルミスＡＴＣ！Ｏ−１４５８０，バチルス・ズ
ブチリスエＦＯ−３０１３，バチルス・アミロリクファ
シエンスＡＴＯＯ−２３８４２，バチルス・ステアロサ
ーモプロテイオリテイクスＡＴＯＯ−８００５及びサー
マス・サーモフイラスＡＴＯＯ−２７６３４が特に適し
ている。これらの微生物は一般によく知られた微生物で
るク、所望によジ、公的機関又は各種研究機関よ９容易
に入手可能である。

本発明方法においては、プロテアーゼ生産菌の固定化材
料として、末端インシアイ・一ト型ウレタンプレポリマ
ー又は遊離ラジカル重合型元硬化性プレポリマーが用い
られる。通常、微生物の固定化材料には、水性媒体中で
樹脂化又はケル化するに際し、微生物の通や抜けを妨げ
、かつグロテアーゼを自由に通過させるに十分な大きさ
の孔径を有する包括ゲルを形成し、その上該ケルの機械
的強度が良好であ９、また微生物の増殖に悪影響を与え
ないという要件を満たすことが要求されるが、本発明で
用いる上記のプレボリマーは、いずれもこの要件を満た
すものである。

本発明に適した末端イソシア不一ト型ウレタンプンボリ
マーとしては、例えばポリエチレングリコール、ボリオ
キシプロビレンポリオキシエチレンポリオールなどのポ
リオキシアルキレンボリオールと化学量論的に過剰量の
ポリインシアイ、一トとの反応生成物が挙げられる。

このポリオキシアルキレンポリオールとしては、例エハ
エチレングリコール，フロビレングリコール，グリセリ
ン，ペンタエリスリトールなどの多価アルコール又はエ
チレンジアミン，ジエチレントリアミン，ビベラジン，
アルキルアミンなどのアミン類にエチレンオキシド，プ
ロピレンオキシドなどを付加して得られる分子量約２０
０〜２０，０００好ましくは約５００〜５，０００の、
エチレンオキシド含有割合が約５０重量係以上、好まし
くは約７０重量係以上のものが挙げられる。またポリイ
ソシアネートの例としては、トリレンジインシア坏一ト
，ジフエニルメタンジインシアネート，ヘキサメチレン
ジインシア不−ト，デスモジュールＬ（バイエル社製）
などのトリイソシアイ＝−トナトが挙げられる。

本発明に用いるウレタンプレボリマーは、末端イソシア
坏一ト基の量が２〜１０重量係、好ましくは３〜７重量
係の範囲になるように調製され私このイノシア坏一ト基
の量が２重量係未満では形成されるゲルの強度が小さく
、また１０重量係を超えるとゲル化（ポリマー化）反応
が激しいため、微生物が死滅しやすいので不適当である
。

これらのウレタンプレポリマーを用いて微生物を固定化
する場合、該微生物を含む水性懸濁液にウレタンプレポ
リマーを混合し０．０１〜１０＋＋＋ｍ程度の厚さに１
ｏ分〜２時間放置することにょシ反応してゲル化する。

このゲル化温度は６０℃以下、好壕しくは０〜４０℃の
範囲であって、いずれのウレタンブレポリマーを用いて
もゲル化温度は６０℃を超えないことが望ましく、また
微生物懸濁液は菌体の生存に必要な有機又は無機栄養源
を含むことも可能である。得られた固定化微生物は含水
状態のゲルの５０重量係以下、好ましくは２０重量係以
下であることが望ましいが、固定化後、微生物が増殖す
るので、これ以上の含有割合でも差支えない。

一方、本発明に適した遊離ラジカル重合型光硬化性プレ
ポリマーは、光重合可能なエチレン性不飽和結合を１分
子中に２個以上有する数平均分子量５００〜５０，００
０の水溶性又は水に易分散性のプレポリマーであって、
このようなものとしては、例えばポリエチレングリコー
ルのジアクリレート及びジメタクυレート，ポリオキシ
プロピレンポリオキシエチレンボリオールのポリアクリ
レート及びポリメタクリレート，ポリエチレングリコー
ルの不飽和モノカルボン酸と飽和又は不飽和のポリカル
ボン酸のポリエステル，ポリエチレングリコールと不飽
和モノカルボン酸ヒドロキシアルキルエステルとポリイ
ソシア不一ト化合物とのウレタン化ポリエステル、ポリ
エチレングリコールヲ過剰に用いて祠だウレタン化ポリ
エステルと不飽和カルボン酸とのエステル化物、ヒドロ
キシエチルセルロースなどの水溶性に変性したセルロー
スの不飽和カルボン酸ポリエステルなど多種多様のプレ
ボリマーが挙げられる。

これらの光硬化性プレポリマーは、微生物の水性懸濁液
中で増感剤の存在下、活性線を照射して重合させること
によって、微生物を包み込んだ格子状の架橋ポリマーを
生成する。この光硬化性プレポリマーは活性線が透過し
やすいように０．０１〜１０４程度の厚さで活性線を照
射することが望ましく、その照射時間は約１０秒〜３０
分間が適当である。この活性線は通常２５０〜６００ミ
リミクロンの波長を有するものが好ましく、活性線源と
して、例えば低圧水銀灯、高圧水銀灯、キセノンランプ
、カーボンアークランプ、太陽光などが使用される。

本発明方法においては、前記のようにして得られた固定
化グロテアーゼ生産微生物を栄養培地中で培養してプロ
テアーゼを製造する。この培地に添加する栄養源として
は、例えば炭素源としてブドウ糖、果糖、乳糖、ソルビ
トールなどの糖類、デンプン、セルロース、ベクチンな
どの多糖類、クエン酸、コハク酸のような有機酸類など
が、窒素源としては尿素、アミノ酸、ベプトン、コーン
ステープリカー、酵母エキスなどが、また無機塩類とし
てはリン酸モノカリウム、リン酸ジカリウム、硫酸マグ
不シウムなどのリン、カリウム及ヒイオウの供給物質が
それぞれ適宜使用される。これらの栄養源は前記の例示
に限定されるものではなく、これら以外のものも任意に
使用することができる。また培養液中におけるこれら栄
養源の濃度は微生物の種類、固定化に用いたプレポリマ
ーの種類、微生物の培養条件によク異なるので、プロテ
アーゼを製造する際に、最適条件を選ぶことが望ましい
。

本発明方法を実施するに当シ、培養条件としてｐＨは４
〜８、好ましくは５〜７、温度は１０〜６０℃、好まし
くは２５〜５０℃の範囲が適当である。また、固定化微
生物のプロテアーゼ産生量はその培養条件によって異な
るが、通常５０〜２３０時間で最大となるので、バッチ
形式で培養する場合は培養時間を５０〜２３０時間Ｋ、
流通反応形式の場合は平均滞留時間を５０〜２３０時間
に調節することが望ましい。また、培養装置としては、
例えば従来のかくはん槽型培養槽、振とり培養機、流動
層型培養装置などのほか、充てんカラムなども使用しう
る。

本発明方法によシ製造されたプロテアーゼは培養液中か
ら、例えば塩析、ｐＨ調節、分離膜などによる分離、あ
るいは樹脂による吸着分離などの方法によって、単離、
精製することができる。

本発明のプロテアーゼの製造方法においては、微生物の
固定化に用いたブレポリマーが、微生物の増殖及び産生
じたプロテアーゼの培養液中への移動に実質的に影響を
与えないゲルを形成するため、固定化しない微生物を用
いた場合と同様に培養することができ、むしろプロテア
ーゼ産生量が多いという特徴がある。また、微生物がボ
リマーゲル中に固定化されているため、微生物とプロテ
アーゼを含む培養液との分離が容易でラシ、かつ該微生
物をプロテアーゼの製造に繰返し使用しうるという特徴
がある。さらに、充てん力ラムなどに固定化微生物を充
てんして流通反応形式で連続的にプロテアーゼを製造す
ることができる。したがって、本発明方法は従来のプロ
テアーゼ製造法に比べて、グロテアーゼの製造量が増加
し、その上後工程のプロテアーゼ単離精製工程を簡略化
しつるので、効率が極めてよい。

次に実施例によって本発明をざらに詳細に説明する。

なお、試薬は滅菌処理したのち使用し、操作は無菌室で
行った。

また、培養液はラクトース６０２、コーンステープリカ
ー１０１、ペプトン１７！ｉ′、リン酸ジカリウム１４
？，リン酸モノカリウム６？、クエン酸ナトリウム３′
？、硫酸アンモニウム６グ、炭酸カルシウム０．４Ｍ’
及び硫酸マグネシウム１グを水に溶解し、全量がＩＡに
なるように水分量を調節して製造した。

微生物については、微生物を４８時間スラント培養し、
次いでスラント培養液から１白金耳の菌体を取り出し、
９６時間前培讐して得た前培養液１０−を遠心分離し、
次いで生理食塩水１０ｍ６に分散させて菌体希釈液とし
、これを実験に用いた。

実施例ｌ 分子量１，５００のポリエチレングリコール１モル、キ
シリレンジインノアネート２モル及び２−ヒドロキシエ
チルメタクリレート２モルの反応によシ得られた光硬化
性ブレポリマー５ｆに、光増感剤としてベンゾインエチ
ルエーテル５０〜と生理食塩水５ｍｌ！！を加え、加温
して溶解したのち、バチルス・リケニホルミスＡＴＣ！
Ｏ−１４５８０の菌体希釈液１０−を加えて均一に混合
し、次いでポリエチレンフイ，ルム上に０．５ｍｍの厚
さに展開し、高圧水銀灯によシ光を照射して微生物を固
定した。

次にあらかじめ調製した培養液５ｏ一に体積で２０−の
固定化微生物を加え、振とう培養機を用いて３７℃，１
２０ｓｐｍの条件下で培養を行った。

酵素利用ハンドブック（地人書館発行）２ｏ７頁記載の
方法により培養液中のプロテアーゼを測定した結果、２
１０時間後に最大とな９、そのときの産生量はアルカリ
プロテアーゼ１２５００Ｕ／ｄ、中性プロテアーゼ４８
００Ｕ／ｄであった。

一方、固定しないバチルス・りヶニホルミスを用いた場
合はアルカリプロテアーゼ７，８００Ｕ／７、中性グロ
テアーゼ３，ＯＯＯＵ／ｍｌであり、固定化微生物を用
いた場合の方が１．６倍多かった。

実施例２ 実施例１で用いた固定化微生物を実施例１と同じ培養条
件で７２時間培養した。培養液中のプロテアーゼ量はア
ルカリプロテアーゼがａ，ｓｏｏＵ／一、中性プロテア
ーゼが１，４ｏｏｕ／ｙであった。

次に培養液から固定化微生物をろ別して回収し、生理食
塩水で洗浄後、新たに培養液５０−を加えて、前記と同
じ条件で培養を繰り返した。同様にして１０回培養を繰
り返した。その結果を第１表に示す。

一方、比較として固定化しない微生物を用いて同条件で
繰９返し培養を行った。この場合、培養後、微生物は８
，０００ｒｐｍで遠心分離し、次いで生理食塩水で洗浄
して、次の培養実験に用いた。その結果を第１表に示す
。

第１表から明らかなように、固定化微生物は繰り返し培
養ができ、しかもその際のプロテアーゼの産生量が高水
準に維持されるが、微生物を固定化しないで用いた場合
は繰シ返し培養が難しく、グロテアーゼの産生量も低い
ことがわかる。

実施例３ 光硬化性プレポリマーとしてＮＫエステノレ２３Ｇ（新
中村化学工業■製，分子量１，０００のポ１ノエチレン
グリコールのジメタクリレート）を用いて、実施例１の
方法に準じてノくチノレス・１ノケニホノレミスを固定
化し、実施例１と同様にして培養したところ、培養時間
２００時間でプロテアーゼの産生量は最大となり、この
ときのアノレカ１ノプロテアーゼは比９ｏｏｕ／＋４中
性プロテアーゼは４５００Ｕ／ｒｎｌであった。これは
固定化しない微生物を用いた場合の１．５倍の産生量で
あった。

実施例４ バチルス・リケニホノベスノ代りニ、ノクチノレスアン
ヤリクファルエンスＡＴＣＣ−２３８４２，ノくチノレ
スズブチリスエＦＣ−３０１３．，Ｃチノレスステアロ
サーモフイラスＡＴＣＣ−８００５及びサーマス・サー
モフイラスＡＴＣＣ−２７６３４を用いて、実施ｆ１１
１をくり返した。その結果を、第２表に示す。

実施例５ 分子量２，０００のポリエチレングリコール１モルとト
リレンジイソシアネート２モルとを反応させて得られた
イノシアネート含有率３．５％の末端イソシアネート型
ウレタンプレポリマー５ｆｉ′ニ、バチルス・リケニホ
ルミスＡＴＣ！Ｏ−１４５８０の菌体希釈液１０ｍｌ．
を２５℃で加え、かきまぜたのち、１時間放置して固定
化微生物を製造した。

得られた固定化微生物を適当な大きさに切断し、その体
積２０ｍｌをあらかじめ調製した培養液５ｏｉに加え、
振とう培養機を用いて３７℃，１２ｏＳｐｍの条件下で
培養を行った。グロテアーセの産生量は１９０時間後に
最大となり、このときのアルカリプロテアーゼの量は１
２，０００Ｕ／ｒｎｌｌ、中性プロテアーゼの量は４，
７００Ｕ／ｍであシ、固定化しない微生物を用いた場合
のそれぞれ１．５倍及び１．６倍であった。

実施例６ 実施例５で用いた固定化微生物を使い、実施例５と同じ
条件で７２時間培養を行った。産生されたプロテアーゼ
量はアルカリプロテアーゼが３，７ｏｏｕ／一、中性プ
ロテアーゼが１，３００Ｕ／一であった。

次に培養液から固定化微生物をろ別して回収し生理食塩
水で洗浄したのち、新たに培養液５０ｒｎｌ．を加え、
同条件で培養を繰シ返しだ。同様にして繰シ返し培養を
１０回行なった。その結果を第２表に示す。

一方、比較として微生物を固定化しないで同じ培養条件
で繰り返し培養を行った。この場合、微生物は培養液を
８．００Ｏｒｐｍで遠心分離し、生理食塩水で洗浄して
次の培養実験に用いた。その結果を第３表に示す。

第３表から明らかなように固定化微生物は繰シ返し培養
が可能であり、しかもプロテアーゼの産生量が高水準に
維持されるが、微生物を固定化しない場合は繰シ返し培
養が難しく、プロテアーゼの産生量が低いことがわかる
。

実施例７ 分子量１，５００のポリエチレングリコール１モル、プ
ロピレングリコールを開始剤とするボリオキシプロピレ
ンーポリオキシエチレンクリコール（エチレンオキシド
含量７０重量％，分子量３０００）１モル及びトリレン
ジインシアネート４モルを反応させて得られた末端イン
シアネート型ウレタンプレポリマー（インシアネート含
有率４．７％）を用いて実施例５を繰り返しだ。

産生されたグロテアーゼの量はアルカリプロテアーゼが
１１，５００Ｕ／ｄ、中性プロテアーゼが４，６００Ｕ
／一であシ、固定化しない微生物を用いた場合に比べて
、それぞれ１．４倍及び１．５倍であった。

実施例８ ハチルス・リケニホルミスの代９に、バチルス・アシャ
リクファルエンスＡＴＣＣ−２３８４２，バチルス・ズ
ブチリスエＦＯ−３０１３，バチルス・ステアロサーモ
フイラスＡＴＣ！Ｃ−８００５及びサーマスサーモフイ
ラスＡＴＣＣ−２７６３４を用いて実施例５をく９返し
た。その結果を第４表に示す。

手続補正書 昭和５８年２月１６日 特許庁長官 ＋１叶若杉和夫殿 ■ →仕牡ｍ １事件の表示 昭和５７年特許願第２３４４３６号 ２発明の名称 グロテアーゼの製造方法 ３袖正をする者 事件との関係特許出Ｈ人 住所東京都墨田区本所一丁目３番７号 エ８ライ７７株式会社 代表渚小林敦 ４代理人 〒１０４東京都中央区銀座６丁目４番５号土屋ビル５階
（７１８２）弁理士阿形サｔ！（『 ｔｉｆｆｉ（５７１）９９２０１年ｉ頂５補正命令の日
付自発 ７補正の対象明細書の発明の詳細な説明の欄８．補正の
内容 （１）明細書第４ページ第１４行目［サーモフイラスセ
ラチア属」ヲ「サーモフイラス、セラチア属」に訂正し
ます。

（２）同第４ページ下から２行目「リケニホルシス」を
１リケニホルミス」に訂正します。

（３）同第５ページ第６行目「ステアロサーモプロテイ
オリテイクス」ヲ［ステアロサーモフイラス］に訂正し
ます。

（４）同第７ページ下から２行目「菌体」ヲ１微生物」
に訂正し″ｉ丁。

（５）同第１０ページ下から４行目「６ｏｃｒｔ「７５
℃」に訂正します。

（６）同第１３ページ第１１行目「培養液」ヲ１培地」
に訂正します。

（７）同第１７ページ下から６〜４行目を以下のとおシ
訂正します。

「バチルス・リクニホルミスの代シに、バチルス・７ミ
ロリクファシエンスＡＴＣＣ−２３８４２，バチルスー
ズブチリスＩＦＯ−３０１３、バチルス●ステアロサ」 （８）同第１８ページ第２表微生物の種類の欄の「ハチ
ノレス吻アシャリクファノレエンス」ヲ１バチルス・ア
ミ口リクファシエンス」に訂正します。

（９）同第２０ページ第７行目「第２」を「第３」に訂
正し″！．ｆ０ （１０）同第２２ページ下から５行目「アシャリクファ
ルエンスＪｋｌアミロリクファシェンス」に訂正します
。

０］）同第２２ページ下から３行目「サーマスサーモフ
イラス」ヲ「サーマス●サーモフィラス」ニ訂正します
。

αシ同第２３ページ第４表微生物の種類の欄の［バチル
ス・アシャリクファルエ／ス」ヲ「バチルス●アミ口リ
クファシェンス」に訂正します。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １プロテアーゼ生産能を有する微生物を含む水性媒体中
   に末端インシア不一ト型ウレタンプレボリマーを加えて
   反応させ、次いでこのようにして得られた固定化微生物
   を栄養培地中で培養することを特徴とするグロテアーゼ
   の製造方法０ ２プロテアーゼ生産能を有する微生物を含む水性媒体中
   に遊離ラジカル重合型光硬柁性ブレポリマーを加え、増
   感剤の存在下活性線を照射させ、次いでこのようにして
   得られた固定化微生物を栄養培地中で培養することを特
   徴とするプロテアーゼの製造方法。