JPS60234582A - 生物学的材料の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ズの形態で包括（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）することによる
生物学的材料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｌａｔｅｒｉ
ａ＋）の固定化（　ｉ＋＋ｕｉｏｂｉ１ｉｓａｔｉｏｎ
）、この方法によって得られる固定化された生物学的材
料、及び生物転換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎｓ）に対するその用途に関する。

一般に、生物触媒（ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）の固定
化は処理技術及び経済的に利点がもたらされる。固定化
によって化学的及び物理的特性、並びにまた時には生物
触媒の選択性及び特異性を改善することができる。

一般に、固定化方法は次の群に分けることができる： 一什−トげた担体上への吸着 一担体との共有結合 一交差結合 一重合体マトリックスへの包括。

包括法は、その移動範囲に関して、多少均一なメンシュ
及び孔径の格子に重合中に包括される生物材料（ｂｉｏ
ｍａｔｅｒｉａｌ）に基づいている。生物触媒はこの重
合体格子を通過不能であるべきであり。

・方、基質及びこの触媒で行った反応生成物に実際に抵
抗を与えるべきでない。

普通の方法は格子を構成させるために低分子量の親水性
単量体、例えばアクリル酸ヒドロキシエチル、・メタク
リル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシプロビ
ル、メタクリル酸ヒドロキシプロビル、アクリルアミド
等を用い、このものを生物材料の水溶液または水性分散
体と混合し、次に重合させる。

例えば米国特許第３，７８８，８５０号においては、単
官能性アクリルａ誘導体、例えばアクリルアミドを少量
の交す結合剤、例えばＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルア
ミドと共に用いている．米国特許第３．８５９、１８８
号においては、例えばグリコールによるアクリル酸のモ
ノエステルを交す結合剤及び可溶性重合体と共に用いて
いる。米国特許第３，８８０，４９０号には重合体格子
の形成に対して低分子量のアクリル酸及びメタクリル酸
ヒドロキシアルキルの使用が記載されている。

しかしながら、ほとんど全ての方法において。

生物学的材料並びにその基質及び生成物に対する透過の
調節及び再生の困難性が生ずる。しかしながら、これら
のパラメータは固定化する物質として木質的に適合して
いる．加えて、低分子量のアクリル酸誘導体の使用はそ
の毒性のために不利である。生物触媒に対する損傷が重
合中に起こり得るか、或いは重合体中に残存する単量体
が、食品工業または製薬工業において製品を製造するた
めの固定化された生物触媒の用途を極めて制限する。

しかしながら、ほとんど全ての方法において、材料、例
えばフィルム、フォイル、キャスト製品等は外部成形に
よってのみ得ることができる。これらの材料を用いるた
めに、度々続いての処理を行うことが必要であるが、し
かしこの処理によって触媒に対して好ましいビーズにす
ることはほとんど不可能である。

米国特許第３，８６０，４９０号には不活性媒質中で懸
濁重合によってビーズを製造する可能性が記載されてい
るが、しかし、低分子量のアクリル酸及びメタクリル酸
ヒドロキシアルキルを使用するために、この方法には上
記の如き欠点及び困難性がある。

重合可能な物質として、本質的に水に容易に溶解し、１
分子当り２（１またはそれ以上の重合可能な官能基を含
み且つ４００を越える分子量を有する高分子量の重合可
能な化合物を使用することからなる重合可能な化合物中
に包括によって生物学的材料を固定化する方法が見出さ
れた。

従って、本発明は生物学的材料の水溶液または水性分散
体を、水に容易に溶解し、１分子当り２個またはそれ以
−ヒの重合可能な官能基を含み且つ４００を越える分子
量を有する高分子量の重合可能な化合物の水溶液と混和
し、そして該混合物を重合させることを特徴とする重合
可能な化合物中に包括によって生物学的材料を固定化す
る方法に関する。

本発明に従って用いる、好ましくは２個またはそれ以上
の不飽和基を含み且つ硬化可能な高分子量の水溶性化合
物の使用により、透過性の調節及び再生の改善を行うこ
とができ、その理由は、これらの特性が高分子量の水溶
性化合物によって本質的に決定されるためである。加え
て、殊に高分子量の化合物を使用するために、毒性の問
題がない、更に、生物学的材料と混和する前に、低分子
量の毒性汚染物を除去することができる。

更に、水に容易に可溶性の本発明による化合物をまず水
、緩衝剤溶液、塩溶液等の特定量に溶解し、これによっ
てこの重合体溶液をある特性、例えばｐｕ値、塩濃度、
粘度等に関して、生物学的材料の水溶液または水性分散
体に適合させ得ることが見出された。続いて、２種の溶
液または水性重合体溶液及び細胞分散体を混合し、そし
て重合させる。この方法は周囲の媒質中で突然の変化に
さらせない敏感な生物触媒に対して殊に有利であり、こ
の方法によって、重合可能な混合物の製造中に活性度の
損失が木質的に避けられる。

本発明の他の利点は水溶液及び懸濁液に対する重合体の
大きな吸収容量であり、これは水に対する容易な溶解度
と関連する。水性生物学的材料対重合体の重量比１：１
乃至３０：１間が可能であり、４：ｌ乃至２０：１間の
比が殊に適当である。

固定化された生物学的材料の水分含有量は重合前及び後
で多篭であることができるために、生物材料は殊に適当
な無害な環境にあり、これによって活性度を安定に保持
すること、ができ、そして加えて、基質及び生成物の流
れを有利にする０重合体格子の特性は、水に容易に可溶
性の高分子量の重合ｔＩＴｓな化合物の構造及び分子量
を変えることによって、広範囲に変えることができる。

この方法によって、生物学的材料の必要性を満たすため
に交差結合の密度、透過性、膨張反応及び他の特性を最
適にすることが可能である。

固定化された生物材料は実際に成形によって重合中に全
ての所望の形状で得ることができる。

フォイル、フィルム、成形品等を製造することができる
。更に、機械的特性を、増強する織物の配合によって改
善することができる。同様に、電極、膜または他の物質
を被覆することができる。

更に、生物学的材料の水溶液または水性分散体を、水に
容易に可溶性であり、１分子当り２個またはそれ以−ヒ
の重合可能な官能基を含み且つ４００を越える分子量を
有する高分子量の重合可能な化合物の水溶液と混合し、
この混合物を不活性液体媒質中にビーズとして分散させ
、そして重合させることを特徴とする重合した化合物中
に包括によって固定化された生物学的材料の製造方法が
見出された。中間相（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）として殊
に水と非混和性物質、例えば脂肪族、環式脂肪族及び芳
香族炭化水素１例えばヘキサン、シクロヘキサン及びト
ルエン、並びにこれらのハロゲン化された誘導体、更に
アルコール、エーテル、エステルまたは水と非混和性の
他の物質、並びにシリコーン油及びパラフィン油、或い
はこれらの相互の混合物を用いることができる。

この方法によって可能なビーズの形態における生物触媒
の製造は固定化された生物材料の使用において殊に利点
を有している。一方、球状形はカラム反応器に充填する
際に殊に適当であり、良好な流れが確保され、閉鎖を避
けることができ、そして同時に、大きな表面積は生物触
媒における反応に対して良好な反応速度を生ずる。流体
力学的特性のために、また球状形は流れの系において殊
に適当である。

更に、本方法は従来の方法の簡略化及び改善を表わして
いる。球状形が重合中に直ちに得られ、そして処理条件
によって容易に調節することができる。

例えば、重合は不活性液体媒質、例えば脂肪族、環式脂
肪族及び芳香族炭化水素またはその官能性誘導体、或い
はシリコーン油及びパラフィン油中の生物学的材料の未
だ重合していない分散体の状態で行うことができ、分布
に応じてビーズの径を広く変えることができ、これは攪
拌、不活性ガス例えば窒素の吹き込み、或いは水相の他
の計量導入、例えば不活性相中にポンプ導入または噴霧
することによって行うことができる。更に、ビーズの直
径に同様に影響を及ぼす水相または不活性相の粘度、密
度１表面張力等を添加物によって変えることができる。

この方法において、ビーズの平均直径０．０５ｍｍ〜５
ｍｍが可能であり、例えば２ｍ冒より大きい直径のビー
ズは所望の反応に対して高度の拡散抵抗を示す。平均直
径０．２鳳■〜２■Ｉを有するビーズが殊に有利である
。

ビーズの製造の簡易さに加えて、無菌の条件下で生物材
料の取り扱いに関連して、固定化に対する利点があり、
その理由は仕上げた固定した材料に混合する方法を密封
系中で行うことができるためである０次に固定した生物
材料を濾過によって容易に得ることができる。しかしな
がら、混合物全体を０℃以下に冷却し、かくして長期間
材料を保存することができる。また冷却は外部媒質の固
化点を広げることができ、またこの固化点を添加物また
は他の物質の配合によって降下させることができる。

また本発明は、生物学的材料及び高分子量の重合可能な
化合物の双方を含む水相を第二の非水性の不活性相に分
散させてビーズを形成させ、そしてビーズの形態におけ
る該水相を重合させることからなる重合した化合物中に
包括によって固定化された生物学的材料の製造方法に関
する。

重合した化合物中に包括によって固定化された生物学的
材料を製造するこのタイプの方法は、生物学的材料の水
溶液または水性分散体を、水に容易に可溶性であり、１
分子当り２個またはそれ以上の重合可能な官能基を含み
且つ４００を越える分子量を有する高分子量の重合可能
な化合物の水溶液と混合し、この混合物を不活性な液体
媒質に分散させてビーズを形成させ、そして重合させる
ことを特徴とする。

不活性媒質として殊に水と非混和性の物質、例えば脂肪
族、環式脂肪族及び芳香族炭化水素並びにこれらの誘導
体、シリコーン油、パラフィン油またはこれらの相互の
混合物を用いることができる。

水相対不活性相の重量比は１：ｌ乃至ｌ：２０間にすべ
きである。

ビーズを形成させるための水相の分散は攪拌及び／また
は不活性ガスの吹き込みによって、或いは水相を不活性
相中に噴霧することによって行うことができる。

活性線の照射による重合は、不活性相中にわずかに可溶
または不溶性な光増感剤を添加して行うことができる。

固定化に用いる化合物は水溶性で、１分子当り２個また
はそれ以上の重合可能な官能基を含み且つ４００を越え
る分子量、殊にｔ、ｏｏｏ乃至１０，０００間の分子量
を有し、殊にエチレン性不飽和基を有する高分子量の重
合可能な化合物である。

その構造式に関しては、これらの化合物は、高分子量の
親水性化合物と重合可能なエチレン！飽和基を含む化合
物との反応において生成する化合物として述べることが
できる。この反応における双方の反応体は、相互にまた
はそれ自体化学的に結合させ得るか、或いは二官能性ま
たは多官能性試薬の助けによって相互にまたはそれ自体
結合させ得る官能基を含有しなければならない。

このタイプの高分子量の親水性化合物の例はポリエチレ
ングリコール、エチレンオキシドｌプロピレンオキシド
ブロック重合体及び共重合体、アルコキシル化された、
殊にエトキシル化された２価または多価アルコール、並
びに水に容易に可溶性である重合体、例えば全てまたは
一部加水分解されたポリビニルアセテート、水に容易に
可溶性である重縮合物、例えば上記の高分子量の親水性
化合物とジカルボン酸またはポリカルボン酸から製造し
たポリエステル、及び水に容易に可溶性である重付加化
合物、例えば上記の高分子量の親水性化合物とジイソシ
アネートまたはポリインシアネートから製造したポリエ
ーテル−ポリウレタンである。

更に、上記の高分子量の親水性化合物に含まれるヒドロ
キシル基を普通の方法によって、例えばアンモニアとの
反応によって、全てまたは・部アミ７基に転化すること
ができる。

重合可能なエチレン性不飽和基を有する適当な化合物の
例は次のものである：不飽和カルボン酸、酸塩化物、ジ
カルボン酸、酸無水物またはその官能性誘導体。

次のものが好ましいニアクリル酸、メタクリル酸、クロ
トン酸、塩化アクリロイル、塩化メタアクリロイル、イ
タコン酸、フマル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、無
水イタコン酸、アクリル酸グリシジル、メタクリル酸グ
リシジル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒ
ドロキシプロピル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メ
タクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸イソシアナ
トエチル、メタクリル酸イソシアナトエチル及びアクリ
ル酸４−インシアナト−３−メチル−２〜ブチル。

従って、高分子量親水性化合物と重合可能なエチレン性
不飽和化合物との結合の特質は極めて広く変わり、例え
ばエステル、エーテル、ウレタン、アミド、アミン及び
ウレア結合を生ずる。この結合の形成は文献により公知
の方法によって、即ち例えばヒドロキシルまたはアミン
基と酸、酸ハロゲン化物または酸無水物との反応により
対応するエステルまたはアミドを生成させるか、エポキ
シドとの反応により対応するエステルまたはアミドを生
成させるか、或いはインシアネートとの反応によって対
応するウレタンまたはウレアを生成させることによって
行うことができる。

更に、高分子量の親水性化合物とエチレン性不飽和基を
含む化合物との直接結合に加えて、またこの結合を二官
能性または多官飽性試薬によってもたらすこともできる
。

このタイプの二官悌性または多官能性試薬の例は二官能
性または多官能性イソシアネート、例えばイソホロンジ
イソシアネート、トルイレンジイソシアネート、ヘキサ
メチレンジイソシアネート、ビューレット基を含むポリ
イソシアネート［例えばデスモデュール（Ｄｅｓ＋＊ｏ
ｄｕｒ）Ｎ　、ヘキサメチレンジイソシアネートと水と
の反応生成物ｌ、ジイソシアネートと多価アルコールと
の反応において生成するポリイソシアネート（例えばデ
スモデュールし、トルイレンジインシアネートとトリメ
チロールプロパンとの反応生成物）及びジエボキシドま
たはポリエポキシド、例えばビスフェノールＡジグリシ
ジルエーテルまたはジグリシジルへキサヒドロフタレー
トである。これらの試薬の結合は例えばウレタンまたは
エーテルの生成に伴い、高分子量の親水性化合物及びヒ
ドロキシル基を含み且つ重合可能なエチレン性不飽和基
を含む化合物のヒドロキシル基によって生ずる。

また本発明による化合物の製造に対して、種々な結合方
法を共に組合せることができる。

しかしながら、高分子量の親水性化合物、エチレン性不
飽和基をもつ化合物及び、適当ならば、二官能性または
多官能性試薬の特質及び割合を、本発明に従って製造さ
れる高分子量の重合可能な化合物が水に容易に可溶性で
あり且つ生物学的材料の水溶液または水性分散体に対し
て大きな吸収容量があるように選ばなければならない。

水溶性の好ましい高分子量の重合可能な化合物として次
のものを挙げることができるニーポリエチレン−ポリオ
ールから製造した化合物、そのヒドロキシル基の一部は
不飽和カルボン酸でエステル化されており、そして残り
の基はイソシアネート基を含む不飽和カルボン酸の誘導
体と反応している。

殊に好ましいものとして次のものを挙げることができる
ニ ー分子量４００以−Ｌを有するポリエチレングリコール
から製造した化合物、そのヒドロキシル基の・部はアク
リル酸またはメタクリル酸でエステル化されており、そ
して残りの基はメタクリル酸インシアナトエチル及び／
またはアクリル酸４−イソシアナト−３−メチル−２−
ブチルと反応している。

製造する際に、ポリエーテル−ポリオールにおけるヒト
ごロキシル基の・部をまずイソシアネート基を含む不飽
和カルボン酸の誘導体と反応させ、次に残りの基を不飽
和カルボン酸でエステル化することができるが、しかし
、まずヒドロキシル基の・部を不飽和カルボン酸と反応
させ、次にヒドロキシル基の残りをインシアネート基を
含む不飽和カルボン酸の誘導体と反応させることが好ま
しい。

更に、水溶性の好ましい高分子量の重合可能な化合物の
例として次のものを挙げることができる： 一ポリエーテルーボリオールから製造した化合物、その
ヒドロキシル基の一部は不飽和カルボン酸でエステル化
されており、そして残りの基は二官能性または多官能性
インシアネートと反応している。

これに関して、殊に好ましいものとして次のものを挙げ
ることができるニ ー４００より大きい分子量を有するポリエチレングリコ
ールから製造した化合物、そのヒドロキシル基の一部は
アクリル酸またはメタクリル酸でエステル化されており
、そして残りの基はイソホロンジイソシアネート、トル
イレンジイソシアネート、ビューレント基を含むポリイ
ソシアネート、またはジイソシアネートと多価アルコー
ルとの反応により生じたポ１ノイソシア才、−トと反応
している。

製造する際に、ポリエーテル−ポリオ−１しのヒドロキ
シル基の一部をまず二官能性またｔ±多官能性イソシア
ネートと反応させ、次に残りの基を不飽和カルボン酸で
エステル化すること力くできる。

しカルながら、まず部分エステル化を行り、Ｘ、次に二
官能性または多官能性イソシアネートとの反応を行うこ
とが更に有利である。

かくして、本発明は、水に容易に溶解する高分子量の重
合可能な化合物を、ヒドロキシリレ基の・部が不飽和カ
ルボン酸でエステル化されており、そして残りの基が二
官能性または多官能性イソシアネートと反応しているポ
リエーテル−ボ１ノオールから製造することを特徴とす
る方法に関する。

本方法はａ）ポリエーテル−ポリオ−Ｊレカく分子量４
００及びこれ以上を有するポリエチレングリコールであ
ることを特徴とする。

重合は不活性ガス下で且つ普通のラジカル開始剤、例え
ばアゾビス（イソブチロニトリル）、過オクタン＠１−
ブチル、過酸化ベンゾイル、ジシクロヘキシルバーオキ
シジカルボネート、メチフレエチルケトンバーオキシド
、クメンヒドロノく−オキシド、アセチルシクロへキサ
ンスルホニルノく−オキシド、過酸化ジクミル、ベルオ
クソニ硫酸力１ノウムまたはベルオクソニ硫酸アンモニ
ウムの存在下において行うことができ、そして酸化還元
系、例えばベルオクソニ硫酸カリウム／ｌノポフラビ゛
ン、ペルオクソニ硫酸カリウム／重亜硫酸ナト１ノウム
、または２価の鉄の過酸化水素化合物によって起こすこ
とができる。同様に、大多数のイし合物、例えばＮ、Ｎ
、Ｎ　’　、Ｎ　’−テトラメチルエチレンジアミンま
たはβ−ジメチルアミノプロピオニトリルを促進剤とし
て作用させることカーできる。

重合に対する他の選択できる方法は活性線による混合物
の照射からなる。この目的に対して、例えば高圧水銀ラ
ンプ、低圧水銀ランプ、ケイ光うンプ、キセノンランプ
、炭素アーク及び太陽光照射が適当である。同様に、電
子ビームまたはγ線による照射が可能であるが、しかし
、生物学的材料に対するある程度の損傷を予想しなけれ
ばならない。また光増感剤によって光重合を促進させる
こともできる。公知の光増感剤、例えばα−カルボニル
アルコール、例えばベンゾインまたはアセトイン、アシ
ロインエーテル、例えばベンゾインメチルエーテル、ベ
ンゾインエチルエーテル及びベンゾインイソプロピルエ
ーテル、α−置換されたアシロイン、例えばα−メチル
ベンゾイン及びα−メトキシベンゾイン等、並びに陰イ
オン性基、例えばカルボン酸、スルホン酸またはアミド
基で修飾し、かくして水溶性にした誘導体を用いること
ができる。

加えて、多環式芳香族化合物、例えばナフトール及びヒ
ドロキシアントラセン、アゾ−アミド、例えば２−シア
ノ−２−ブチルアゾホルムアミド、及び金属塩、例えば
硝酸ウラニル及び塩化鉄、並びにメルカプタン、ジサル
ファイド、ハライド及び染料を用いることができる。

氷方法の経済的有効性に関する利点はまた水に対する高
吸収容量から生ずる一生物学的材料の水溶液または水性
懸濁液対重合体の殊に適当な重量は４：１乃至２０：１
間であり−この中に固定された材料が重合前及び後に含
まれる。一方、この方法によって、重合可能な化合物の
比較的少量中に、生物学的材料の水溶液または水性分散
体の多量の封入をもたらすことができ、他方、この方法
によって、発酵溶液を直ちにまたは濃縮、例えば限外瀘
Ａ（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または遠心分離
に続いて固定化することができる。

しかしながら、加えてまた、固定化前及び後に少量の水
または水溶液を用い、水の割合の一部を他の液体、例え
ばアルコールと入れ換えることもできる。

また水溶液以外中で１例えば脂肪族または芳香族炭化水
素中で固定化された生物学的材料を用いることもできる
。

上記の方法は、細胞または酵素を消毒剤（ｄｉｓｉｎｆ
ｅｃｔａｎｔｓ）　、殺バクテリア剤（ｂａｃｔｅｒｉ
ｃｉｄｅｓ）または殺菌・殺カビ剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄ
ｅｓ）の存在下において固定化し、かくして化学的に滅
菌し、生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）中に移し、
そして反応を開始させる前に、密封された無菌の反応器
系中の滅菌剤を洗い出すことを特徴とする。

上記の方法によって固定化された生物学的材料、殊に細
胞または酵素は生物転換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎｓ）に対する生物触媒として用いることができ
る。

本発明に従って固定化する際に興味ある微生物は次のも
のである： 黒色コウジ菌クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉ
ｇｅｒ）　、グルコノバクタ−・サブオキシダンス（Ｇ
ｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　５ｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、
グルコノバクタ−・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
ｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）　、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉｓ　ｒｎｌｉ）　ビーｎ１ＭＪ’＋蹟（Ｓｎｒ
＝ｃｈｔａｒｎｍｖｒ：ｐｓ　ｃｐｒｐｖｉｓｉａｅ）
、プロタミノバクタ−・ルブルム（ｐｒＯｔａ＋ｘｉｎ
。

ｂａｃｔｅｒ　ｒｕｂｒｕ＋ｓ）、セラシアのプリムシ
力（Ｓｅｒｒａｔｉａｐｌｙ＋５ｕｔｈｉｃａ）　、プ
ソイドモナス拳プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕ
ｔｉｄａ）、クンニングハメラ・エレガンス（Ｃｕｎｎ
ｉｎｇｈａｍｅｌｌａ　ｅｌｅｇａｎｓ）、クロストリ
ジウム属（Ｃｌ　ｏｓ　ｔ　ｒ　ｉｄ　ｉａ）、例えば
クロストリジウム・セルモアセティクム（ＣＩｏｓｔｒ
ｉｄｉｕ＋＊　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロ
ストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　
ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、酪酸クロストリジウム（Ｇｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）　、スポロゲネ
ス菌（ＣＩｏｓｔｒｉｄｉｕ＋ｏ　ｓｐｏｒｏｇｅｎｅ
Ｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ■ｉｓ）、ストレプトマイシス・
オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａ
ｃｅｕｓ）＊犬施勿 実施例１ アルコール脱水素酵素の固定化 平均分子量８００を有するポリエチレングリコール［ヒ
エミッシェφベルケ・ヒールス（ＣｈｅｍｉｓｃｈｅＷ
ｅｒｋｅ　Ｈｉｉｌｓ）製１４８．７ｇを、Ｐ　−トル
ｘ−７７、ル＊　７酸０　、５４　ｇ並びにトルエン中
のジーｔｅｒｔ、〜ブチルヒドロキノン５０＋ｓｇ及び
ｐ−メトキシフェノール５０邦の添加によって、アクリ
ル酸４．７ｇでエステル化した。このエステル２５．０
ｇを、デスモラピット（Ｄｅｓｍｏｒａｐｉｄ）ＳＯ［
ラインヒエミー・ライナラ（Ｒｈｅｉｎｃｈｅｍｉｅ　
Ｒｈｅｉｎａｕ）ＧｍｂＨ］４ｍｇの添加によって、メ
タクリル酸インシアナトエチル【ダウ・ケミカルズ（Ｄ
ｏｗ　Ｃｈｅ＋ａｉｃａｌｓ）製］３．９ｇと反応させ
た。

かくして得られた重合可能な樹脂をイルガキューア（Ｉ
ｒｇａｃｕｒｅ）８５１　［チバ・ガイシ（Ｃｉｂａ−
Ｇｅｉｇｙ）１５０＋ｗｇ　、！ｌ−混合し、リン酸塩
緩衝剤（ｐＨ値７．０゜０ＮＭ）２ｇを加えた。アルコ
ール脱水素酵素［酵母によるもの、ベーリンガー會マン
ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）提
供、特異活性４００　Ｕ／＋ｓｇの酵素蛋白質１２０ｍ
ｇを含有１２００■ｇをこの溶液に溶解し、この溶液の
５００ＪＬｌ厚さのフィルムを形成させ、高圧水銀ラン
プで１０分間照射して、固体フィルムを生成させた。

かくして得られた生成物の１１４（アルコール脱水素酵
素３０■ｇに相当）を容量１００ｔＥｊの三角フラスコ
中に小片に切断して入れ、ＮＡＤ　、　Ｌｉ塩（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ＋ｊ＋＊提供）１４２ｍｇ
を含むｏ、１１リスＨＣＩ、ｐｆｌ値８．８　、０．Ｉ
Ｍセミカル八へト、５ｇ分析級エタノールを加えて最終
容量２０ｔＪＬにした。

試料を一定時間で反応溶液から取り出し、希釈後、生成
しているＮＡＩＩＨのＵＶ−ＶＩ’ｌｌｉスペクトルを
測定した。ＭＡＤの総量が約５０分後にＮＡＤＨに還元
され、初期速度は８．１ＪＪ、モル１分であった。かく
して、固定化されたアルコール脱水素酵素は固定化され
た酵素蛋白質の０．２８υＩｒ５Ｈの特異活性を有して
いた。固定化した生成物をくり返し使用することができ
た。

実施例２ アルコール脱水素酵素の固定化 実施例１において得られた重合可能な樹脂１ｇを１．２
−ジフェニル−２−ヒドロキシ−３−［Ｎ−（Ｎ−メチ
ル）ピロリジニウム］−１−プロパノンメチルサルフェ
ー）　５０ｍｇと混合し、リン酸塩緩衝剤（０，０１Ｍ
、ｐｏ値？）　１５ｇを加えた。アルコール脱水素酸素
（酵母によるもの、ベーリンガー提供、マンハイム。

特異活性４００Ｕ／＊ｇの酵素蛋白質１２０■ｇを含有
）２０Ｑｍｇを上記の溶液に溶解し、この溶液を比重０
．８ｇ／ｃ＋ｗ　”を有するシリコーン油／パラフィン
油の混合物１００ｇに滴下し、はげしく攪拌し且つ窒素
を通しながらビーズを生成させ、このものを高圧Ｈｇラ
ンプによって１５分間照射して重合させた。

かくして得られたビーズ１．０８を容量５０■見の二角
フラスコ中で、ｐＨ値８．５の０．１％リン酸カリウム
、　１０ｍＭ　ＮＡＤＨ、１％７セトフルデヒドと共に
、２３０　ｒｐｍ及び３０℃で軌道回転振盪器において
培養した。

６時間後、　用１．．ＮりＮＡＤＨ１７）約５０％　、
　５０ＮＬ％ルカＨＡＤに酸化され、初期速度は０．２
３１Ｌモル／分であった。

実施例３ 脂肪分解酵素の固定化 実施例１による重合可能な樹脂ｔｇをイルガキューア８
５１（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）５０＋ｍｇと混合し、リ
ン酸塩緩衝剤（０，０１Ｍ、　ｐＨ値７）３ｇを加えた
。この溶液に脂肪分解酵素【カンジダ拳シリンドラセア
によるもの、シグマ社（Ｃ：ａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎ
ｄｒａｃｅａ、　Ｓｉｇｎａ）１０．８．ｇを分散させ
た０次に混合物全体をポリアミド織物【モノデュール（
Ｍｏｎｏｄｕｒ）ＰＡ　２５０　Ｎ　、ベルセイグー？
−インダストリエテクスタイリエン（Ｖｅｒｓｅ　ｉｄ
ａｇ−１ｎｄｕｓｔｒｉｅｔｅｘｔｉｌｉｅｎ）Ｇｍｂ
Ｈ）上に塗布し、高圧水銀ランプで照射し、ポリアミド
織物によって増強された固体フィルムを製造した。

上記の重合体に封入した脂肪分解酵素ＩＢＯｍｇ、切断
フォイル７２ｃｍ２相当を！（２０４０ｍ１中にてスク
ロースパルミテートステアレート１５【セル八（Ｓｅｒ
ｖａ）提供、ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）
１２ｇと共に２５℃で培養した。遊離した脂肪酸を、ｐ
Ｈ値を一定にして（ｐＨ値７．１）、０．１Ｎ　ＮａＯ
Ｈで滴定した。

固定化された脂肪分解酵素の活性度は乾燥脂肪分解酵素
の５．８履ＵｌｌＩｇとして計算された（１０−１分当
り遊離した脂肪酸のｌＩＬモル）。

実施例４ 脂肪分解酵素の固定化 オクタエチレングリコール１９７ｇを、ｐ−トルエンス
ルホン酸２ｇ並びにトルエン中のジーｔｅｒｔ、−ブチ
ルヒドロキノン０．３５ｇ及びｐ−メトキシフェノール
０．３５ｇの添加によって、アクリル酸３６ｇでエステ
ル化した。かくして得られたエステル１００ｇをイソホ
ランジイソシアネート４７ｇ及びデステラビットＳＯの
９０■ｇと反応させた。

かくして得られた重合可能な樹脂５ｇをｐＨ値７．０の
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝剤２ｇに溶解し、脂肪分
解酵素懸濁液（カンジダ・シリンドラセアによる脂肪分
解酵素、シグマ社提供：固体分含有量１７＄）　８ｇと
混合し、イルガキュー７６５１（チバーガイジ）１００
１１ｇを加えた。この水性脂肪分解酵素混合物をポリア
ミド増強織物（モノデュールＰＡ　２５０　Ｎ、ベルセ
イダー７−インダストリエテクスタイリエンＧ＋ｒｂＨ
）上に塗布し、高圧ｎｇランプで１０分間照射して重合
させた。

かくして得られた固定化された脂肪分解酵素７２ＣＩ１
１２を水４ｈ＋ｕ中にｐＨ値７．１で導入し、スクロー
スパルミテートステアレート１５（セル八により提供、
ハイデルベルグ）　１．０ｇを２５℃で加えた。遊離し
た脂肪酸を、ＰｔＩ値を一定にして０．ＩＮ　ＮａＯＨ
で滴定した。各時間に０．ＩＮ　ＮａＯＨ２，７４＋ｓ
Ｊｌを消費し、これは遊離脂肪酸２７４ルモルに相当し
た。脂肪酸のＭｌｌは固定化した脂肪分解酵素フォイル
ｃＩＢ２当り０．０Ｅｉ５　ＩＬモル／分として計算さ
れた。

実施例５ エステル分解酵素の固定化 実施例１において製造したエステル２５．０ｇを。

デスモラピッドＳＯ（ラインヒエミー・ライナラＧｍｂ
Ｈ）７．５ｇを添加して、デスモデュールＮ［バイエル
・ニー争ジー（Ｂａｙｅｒ　ＡＧ）、レベルクーゼン（
Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）１２．３ｇ及びイソフォロンジ
イソシアネー）１．４ｇと反応させた。

かくして得られた重合可能な樹脂５ｇ、イルガキューア
８５１（チバーガイジ）２５０＋ｗｇ、リン酸塩緩衝剤
（０，０１Ｍ、ｐＨ値？）８．５ｇ及びエステル分解酵
素懸濁液（ブタ肝臓による、ベーリンガーーマンハイム
ＧｍｂＨ）　３ｍ　ｌを混合し、ポリアミド織物（モノ
デュールＰＡ　２５０　Ｎ、ベルセイダー７−インダス
トリエテクスタイリエンＧｓｂＨ）上に塗布した。高圧
水銀ランプで照射した後、ポリアミド織物で増強された
フィルムが得られた。

かくして得られたエステル分解酵素フォイル３６Ｃ腸２
をｐＨ値７．０で０．１Ｍリン酸ナトリウム４５謬見中
にて、メタノール中のジメチルニトロテレフタレートの
１００ｍＭ溶液５層文と共に回転振盪器上にて３０℃で
培養した。

反応溶液をＨＰＬＣによって分析した。出発化合物は４
８時間後にもはや検出できなかった。ニトロテレフタル
酸の２種のモジエステル及び少量のニトロテレフタル酸
が生成した。

実施例６ Ｌ−ラフチー１脱水素酵素の固定化 実施例５に用いた重合可能な樹脂５ｇをフェニルグリオ
キシル酸２５０ｍｇ、リン酢塩緩衝剤（０，０ＩＭ、ｐ
Ｈ値７）５ｇ及びＬ−ラクテート脱水素酵素懸濁液（ブ
タ筋肉によるもの、ベーリンガー・マンハイム（ｉｍｂ
Ｈ，酵素蛋白質１０ｍｇ／ｍ文含有、特異活性度的５５
ｏＵ／ｍｇ）３腸見と混合し、この混合物を処理し、フ
ィルムを生成させた。

かくして得られたフィルムの半分、酵素蛋白質的１５■
８を含有する、を切り刻み、容量１００■文の三角フラ
スコ中で０．１Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ値８．０
）２０ｍ文、１０ｍＭ　ＮＡＤＨ、０，０５Ｍピルビン
酸Ｎａ塩と共に培養した。温度は３０℃であり、この反
応溶液を振盪器によって２００ストロ一ク１分で振盪し
た。

試料を時々取り出し、希釈した後、ＮＡＤＨの減少を、
参照として固定化されたし一ラクテート脱水素酵素を含
まぬブランク試料を用いて、測光によって測定した。Ｎ
ＡＤＨの全量が８０分後にＭＡＤに酸化された。初期速
度は３．８鉢モル／分として測定され、これは包括され
た酵素蛋白質の０．２６０／ｓｇの特人情性に相当した
。

実施例７ Ｌ−ラクテート脱水素酵素の固定化 実施例５において得られた重合可能な樹脂１ｇな１．２
−ジフェニル−２−ヒドロキシ−３−［Ｎ−（Ｎ−メチ
ル）ピロリジニウム１−１−プロピノンメチルサルクェ
ート５０ｍｇと混合し、リン酸塩緩衝剤（０，０１Ｍ。

ｐＨ値７）１．５ｇを加えた。この溶液にＬ−ラクテー
ト脱水素酵素（ブタ筋肉によるもの、ベーリンガー社提
供、マンハイム、酵素蛋白質１０Ｉ１ｇ１層立合有、特
質活性度５５０１１／＋ｎｇ）０．８ｍｆｆ１を溶解し
、この溶液を比重０．９ｇ／ｃ膳３のシリコーン油ｌパ
ラフィン油の混合物１００ｇに滴下し、はげしく撹拌し
且つ窒素を通気しながらビーズを形成させ、このものを
高圧）１ｇランプで１５分間照射して重合させた。

得られたビーズを容量１００ＩＩｆｔの三角フラスコ中
にて、０．ＩＮリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ値８．０）
　２０ｍ１、ｆｏｗｌ　ＮＡＤＨ、０，０５Ｍピルビン
酸Ｈａ塩と共に３０℃及び２００ｒＰ腫で培養した。

試料を取り出し、希釈し、参照としてブランク試料を用
いて、ＮＡＤＨの減少を測光によって分析した。

ＮＡＤ）Ｉの全量が３時間後にＭＡＤに酸化された。初
ＩＩ速度は１．４　ｇモル／分であった。

実施例８ パン酵母の固定化 平均分子量１．０００を有するポリエチレングリコール
（ヒエミッシェ・ベルケ９ヒールス）　１００゜０ｇを
、ｐ−トルエンスルホン酸０．９２ｇ並びにトルエン中
のジーｔｅｒｔ、−ブチルヒドロキノン０．１ｇ及びｐ
−メトキシフェノール０．１ｇの添加によって、アクリ
ル酸７．２ｇでエステル化した。

かくして得られたエステル７５．０ｇを、デスモラピッ
ドＳＯの９ｍｇの添加によって、インホロンジイソシア
ネー）　８．３ｇと反応させた。

この重合可能な樹脂５．０ｇをイルガキューア６５１（
チバーガイジ）Ｏ−１ｇ及び緩衝剤溶液（０，０１Ｍ、
ｐＨ値７）１．０ｇと混合した。この溶液にパン酵母（
固体含有１Ｉｒ２５％）１３．７ｇ及び緩衝剤溶液（０
，０ＩＭ、　ｐｏ値７）１３．７ｇの混合物を加えた。

かくして得られた混合物をポリアミド織物上に噴真し、
高圧水銀ランプによって照射し、固体フィルムを生成さ
せた。

かくして得られたフィルム３８ｃｍ’をそのＮＡＩＩＨ
酸化酵素活性に対して効力検定した。この目的のために
、フィルムを切り刻み、容量２００■見の三角フラスコ
に入れ、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝剤、ＰＨ値８．
０．及びＮＡＤＨ（級工、ベーエリンガー社・マンハイ
ム）３８０ｍｇを加えて最終容量５０ｍＪｌにし、この
混合物を、参照として固定化されたパン酵母を含まぬブ
ランク試料と共に、回転振盪器によって２００ｒｐ■及
び３０℃で培養した。

固定化された酵母細胞は５．３川モル１時の速度でＮＡ
ＩＩＨを酸化し、この値は４８時間にわたって測定した
平均値である。この反応を酵素系と組合せて、　０２に
よるＭＡＤの再生に用いることができた。

実施例９ パン酵母の固定化 平均分子量１，５５０を有するポリエチレンクリコール
（ヒエミッシェｅベルケ争ヒールス）　：１８゜９ｇヲ
、トルエン中のＰ−）ルエンスルホン酸２゜３ｇ、ジー
ｔｅｒｔ、−ブチルヒドロキノン０．２３ｇ及びｐ−メ
トキシフェノール０．２３ｇの添加によって、アクリル
酸９．８ｇでエステル化した。

かくして得られたエステル１８５．８ｇを、デスモラピ
、ドＳＯの３６＋＊ｇの添加によって、メタクリル酸イ
ンシアナトエチル（ダウ・ケミカルズ）　１８．２ｇと
反応させた。

この重合可能な樹脂９．０ｇをイルガキューア８５１の
９０＋ｍｇ及びリン酸塩緩衝剤（０，０１Ｍ、ｐＨ値？
）２．７ｇと混合した。かくして得られた溶液をパン酵
母２０．Ｏｇ及びリン酸塩緩衝剤（０，０ＩＮ、ｐＨ値
？）２０．０ｇの混合物に加え、このものから５００　
ｇ＋ｓ厚さのフィルムを形成させ、高圧水銀ランプで照
射して重合させた。

かくして得られたフォイル３８ｃ＋＊”をＮＡＤＨ酸化
酵素話性に対して効力検定した。このフォイルを切り刻
み、容量２００ａＪＬの三角フラスコに入れ、０．０５
Ｎリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ値８．０、及びＮＡＤＨ
（＆ｌＩ、ベーリンカー社提供、マンハイム）３８０層
ｇを加えて最終容量５０■見にし、この混合物を、参照
として同・組成の、但し固定化されたパン酵母を含まぬ
ブランク試料と共に、回転振盪器によって２０Ｏｒｐｍ
及び３０℃で培養した。　ＮＡ［ｌＩ（が７．４　ＩＬ
モル／時の速度で酸化され、この値は４８時間にわたっ
て測定した平均値である。

実施例１０ パン酵母の固定化 実施例８による重合可能な樹脂５．０ｇをフェこルグリ
オキシル酸０．１ｇ及び緩衝剤溶液（０，０ＩＮ、　ｐ
Ｈ値７Ｎ、Ｏｇと混合した。この溶液にパン酵母（固体
含有量２５駕）１３．７ｇ及びｐＨ値７の緩衝剤溶液１
３．７ｇを加えた。かくして得られた混合物を、比重０
．８８７ＣＭ８を有するパラフィン油及びシリコーン油
の混合物２００ｍ文中に撹拌し且つ窒素通気しながら、
ビーズとして分散させ、そして高圧水銀ランプを用いて
重合させた。

このビーズ１５ｇを容量２００■見の二角フラスコ中テ
ｐＨ値８．０　（７）０．０１Ｍリン酸カリウム５０ｍ
Ｍ、１ｍＭＮＡＤＨ（＆Ｉ　ＩＩ　、　ヘ−！Ｊンカー
　社１１供、マンハイム）と共に軌道回転振盪器により
２５℃及び２３Ｏｒｐ層で培養した。

固定化した酵母細胞のＮＡＤＨ酸化酵素活性を、参照と
して酵母細胞を含まぬブランク試料で測光して、ＮＡＤ
Ｈ含有量の減少を測定した。

固定化した生成物１５ｇは０．２４０の活性度を有して
いた（ＩＵ＝１分間当り酸化されたＮＡＤＨの１＝モル
）。この反応を酵素系と組合せてＭＡＤを再生するため
に用いることができた。

実施例１１ パン酵母の固定化 実施例９による重合可能な樹脂３．０ｇをフェニルグリ
オキシル酸９０＋ｓｇと混合し、リン酸塩緩衝剤（０，
０１Ｍ、ｐＨ値？）２．７０ｇを加えた。

かくして得られた溶液をパン酵母２（ＬＯｇ及びリン酸
塩緩衝剤（０，０ＩＮ、　ｐＨ値？）２０．０ｇの混合
物に加え、このものから実施例１０と同様にしてビーズ
を卿造した。

湿ったビーズ１５ｇを容量２００■見の三角フラスコ中
でｐｉ値８．０の０．０１Ｍリン酸カリウム５０■又、
１＋ｉＭ　ＮＡＤＨ（ベーリンガー社提供、マンハイム
）と共に軌道回転振盪器により２５℃及びｆ３０ｒｐｍ
で培養した。　ＮＡＤ）Ｉの測光測定に基づき、ビーズ
１５ｇは０゜１４０の活性度を有していた。

実施例１２ パン酵母の固定化 リン酸塩緩衝剤（０，ＯＩＮ、ＰＨ値７．０）４．０ｇ
を実施例１３による重合可能な樹脂１０ｇに加えて溶液
を生成させた。かくして得られた溶液をパン酵母１７．
５名及びリン酸塩緩衝剤（０，０１Ｍ、ｐＨ値７．０）
　１７．５ｇの混合物に加えた０次いでこれに過硫酸ア
ンモニウム０．２ｇを溶解し、Ｎ、Ｎ、Ｎ　’　、Ｎ　
’−テトラメチルエチレンジアミン０．２ｇを加えた。

ビーカー中で十分に混合した後、この溶液は数分以内に
重合した。

生じた塊を小片（約５　Ｘ５　Ｘ３■１）に切断し、実
施例９と同様にして、ＮＡＤＨ酸化酵素活性を効力検定
した。この分析に湿った重合体ｌｅｇを用いた。

ＮＡＤ）ｌはＩＬ３ＩＬモル／時の速度で酸化された。

対照実験を同様な組成、但し固定化されたパン酵母を含
まぬ混合物を用いて平行して行ったが、この混合物ＮＡ
ＤＨ含有量の減少は見出されなかった。

実施例１３ プロタミノバクタ−・ルブルムの固定化実施例９による
エステル１１０．０ｇを、１５層ｇのデスモラピッドＳ
Ｏの添加によって、イソホロンジイソシアネート７．４
ｇと反応させた。

かくして得られた重合可能なアクリル樹脂５．０ｇを５
０ｍｇのイルガキューア６５１と混合し、リン酸塩緩衝
剤（０−０１Ｍ、　ｐｉ値？）２．０ｇを加えて溶液を
生成させた。スクロース転位酵素を生成させるために、
菌株プロタミノバクタ−・ルブルム（ＣＢＳ　５７４．
７７）を用いた。栄養液は５ｚシロツプ、２％）ウモロ
コシ浸漬液及び０．０５χ（’Ｈ４）　２　ＨＰＯｓか
らなり、ＰＨ値は７．２であった。容ｉｌｌの三角フラ
スコ中の栄養液２００層文にプロタミノバクタ−・ルブ
ルム懸濁液１ａ＋ＫＬを接種した。発酵を軌道回転振盪
器によって３１℃で１５時間続けた。

容量３０又の発酵容器中の上記の栄養液２０文にこの予
備培養物を接種し、モして３１”０で１８時間発酵させ
た０発酵溶液を限外濾過によってファクターｌＯで濃縮
した。

この濃縮した発酵溶液１７．５ｇを上記のアクリル樹脂
溶液と混合し、ポリアミド織物（モノデュールＰＡ　２
５ＯＮ、ベルセイダー７−インダストリエテクスタイリ
エンＧｍｂＨ）に塗布した。高圧水銀ランプで１５分間
照射した後、ポリアミド−増強されたフィルムを生じた
。

固定化されたプロタミノバクタ−・ルブルム細胞を効力
検定するために、そのスクロース転位酵素活性を測定し
た。この目的のために、フォイル３８ｃｍ２を回転振盪
器上で、ｐＨ値７．０の５０％スクロース溶液５０ｍ　
ｌ中にて３０℃で培養し、試料を種、ヤな時間に取り出
した。スクロースのイソマルツロースへの転化をＨＰＬ
Ｃによって測定した。転化速度は０．ｆｆ０ｇ／時スク
ロースであり、これは乾燥細胞の８２００／ｇに相当し
た。１分当り転化されたスクロース　ＩＩＬモルはＩＵ
に相当する。

実施例１４ プロタミノバクタ−會ルブルムの固定化実施例１３と同
様にして、プロタミノバクタ−・ルブルム（ＣＢＳ　５
７４．７７）を培養した。

実施例９による重合可能な樹脂２０ｇにリン酸塩緩衝剤
（０，０１Ｍ、ｐＨ値７．０）６ｇを加えた。かくして
得られた溶液を、限外濾過によってファクター約１０で
濃縮したプロタミノバクタ−・ルブルム細胞１８０ｇと
混合し−た。この溶液に過硫酸アンモニウム０゜４ｇを
溶解した後、Ｎ、Ｎ、Ｎ　’　、Ｎ　’−テトラメチル
エチレンジアミン０．４ｇを加え、この混合物を十分に
混合し、数個の皿に速かに注ぎ、注いだ物質の層の厚さ
が約３履腸になるようにした。数分後に重合を始め、重
合したディスクを５　Ｘ５　Ｘ３＋ｓ層の大きさの小片
に切断し、これを容量５０軸見のカラムに充填した。

流速的９０ｍＭ／時に固定した後、５０％スクロース溶
液中のスクロース７２％が３０℃でイソマルツロース及
び副生成物に転化された。流速を１３５票交７時に増加
させた場合、スクロースの転化は５２．７２に減少した
。

実施例１５ プロタミノバクタ−・ルブルムの固定化スクロース転位
酵素を生成させるために、菌株プロタミノバクタ−・ル
ブルム（ＣＢＳ　５７４．７７）を用い、このものを実
施例１３と同様にして培養した。

実施例９において得られた重合可能なアクリル樹脂１０
ｇをリン酸塩緩衝剤（０，０１Ｍ、　ｐＨ偵？）３．０
ｇ及びイルガキューア（チバーガイジ）５００厘ｇと混
合した。この溶液にプロタミノバクタ−・ルブルム細胞
を含み且つ限外濾過によって濃縮した発酵溶液７０ｇを
加え、この混合物を比重０．９５ｇ／ｃｍ”を有するシ
リコーン油４６０ｇに滴下した。ビーズを形成させるた
めに、Ｌ記の細胞含有混合物の分散をはげしく攪拌し且
つ窒素通気によって行い、このものを２個の高圧水銀ラ
ンプで１／２時間照射して重合させた。

かくして得られたビーズ８．０ｇを容量２００１に見の
三角フラスコ中にて、ｐＨ値７．０の５０％スクロース
溶涜５Ｏｙｌｆｔと共に、軌道回転振盪器によって２３
Ｏｒｐｍで培養した。この反応溶液をＨＰＬＣによって
分析した。固定化されたプロタミノバクタ−細胞は１時
間当リスクロース０．３２ｇを転化した。

実施例１６ プロタミノバクタ−０ルブルムの固定化実施例１３と同
様にして、プロタミノバクタ・−・ルブルムＣＣＢ５５
７４．７７）を培養した。

実施例９によるエステル１１０ｇを、１５１ｇのデスモ
ラピッドＳＯの添加によって、イソホロンジイソシアネ
ート７．４ｇと反応させた。

かくして得られた重合可能なアクリル樹脂１０ｇをｐＨ
値７．０の０．０１Ｍリン酸塩緩衝剤４ｇ、１．２−ジ
フェニル−２−ヒドロキシ−３−［Ｎ−（Ｎ−メチル）
ピロリジウム１−１−プロパノンメチルサルフェート５
００ＩＩｇ及び濃縮した発酵溶液と混合し、この混合物
を比重０．９ｇ／ｃｍ　３を有するシリコーン油／パラ
フィン油混合物３００ｇに加え、実施例１５と同様にし
てビーズを製造した。

かくして得られたビーズ６．０ｇを実施例１５と同様に
して、５０％スクロース溶液で試験した。固定化された
プロタミノバクタ−細胞は１時間当リスクロース０．Ｈ
ｇを転化した。

実施例１７ プロタミノバクタ−・ルブルムの固定化実施例１３と同
様にして、プロタミノバクター−ルブルム（Ｃ：ＢＳ　
５７４．７？）を培養した。

実施例１６による重合可能な樹脂１０ｇをリン酸塩緩衝
剤（０，０１Ｍ、ＰＨ値７．０）４ｇ及び濃縮した発酵
溶液３５ｇ　と混合し、これに過硫酸アンモニウム０．
３ｇを溶解した。この混合物を、　Ｎ、Ｎ、Ｎ　′、Ｎ
　’−テトラメチルエチレンジアミン０．３ｇを溶解し
た比重０゜９７ｇ／ｃｍ３のシリコーン油２，０００ｇ
にはげしく攪拌しながら滴下し、この水性混合物を分散
させてビーズを形成させ、そして短時間以内に重合させ
た。

ビーズの全体の塊を長さ２５ｃｍ及び直径２ｃｍのカラ
ムに充填し、付着したシリコーン油を５０％スクロース
溶液と入れ換え、カラムを４５℃で連続的に操作した。

疏速２８＋ｏＪ１／時で、５０％０％スフ１：Ｉ−ス＋
７）５４．５２がイソマルツロース及び副生成物に転化
された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ！、生物学的材料の水溶液または水性分散体を、水に容
   易に溶解し、１分子当り２個またはそれ以上の歌合可能
   な官能基を含み且つ４００を越える分子量を有する高分
   子量の重合可能な化合物の水溶液と混合し、そして該混
   合物を重合させることを特徴とする重合した化合物中に
   包括によって生物学的材料を固定化する方法。 ２、生物学的材料及び高分子量の重合可能な化合物の双
   方を含む水性相を第二の非水性中間相に分散させてビー
   ズを形成させ、そしてビーズの形態における該水性相を
   重合させることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３、生物学的材料の水溶液または水性分散体を、水に容
   易に溶解し、１分子当り２個またはそれ以上の重合可能
   な官能基を含み且つ４００を越える分子量を有する高分
   子量の重合可能な化合物の水溶液と混合し、この混合物
   を不活性な液体媒質に分散させてビーズを形成させ、そ
   して重合させることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   及び第２項記載の方法。 ４、不活性相として、殊に水と非混和性物質、例えば脂
   肪族、環式脂肪族及び芳香族炭化水素及びその誘導体、
   シリコーン油、パラフィン油並びにその相互の混合物を
   用いる特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方
   法。 ５、平均直径０．０５１〜５ｍ腸、好ましくはＱ　、　
   ２＋ｕ＋〜２ｍａ＋　、殊に好ましくは０．５ｍ＋ｓ　
   〜１．５＋ｓｍのビーズを製造する特許請求の範囲第１
   〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、水性相対中間相の重量比が１＝１乃至１：２０間で
   ある特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法
   。 ７、ビーズを形成させるために水性相の分散を攪拌及び
   ／または不活性ガスの吹き込み、或いは水性相の中間相
   中への噴霧によって行う特許請求の範囲第１〜８項のい
   ずれかに記載の方法。 ８、ラジカル重合開始剤及び／またはラジカル重合開始
   剤系及び／または促進剤を加える特許請求の範囲第１〜
   ７項のいずれかに記載の方法。 ８、水に可溶性のラジカル重合開始剤、殊にベルオクソ
   ニ硫酸アンモニウム、及び水に可溶性の促進剤、例えば
   Ｎ、Ｎ、Ｎ　’　、Ｎ　′−テトラメチルエチレンジア
   ミンを加える特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記
   載の方法。 １０、光開始剤を加え、そして重合を照射によって行う
   特許請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の方法。 ！１．不活性相中にわずかに可溶性または不溶性である
   光増感剤を添加して、重合を活性線の照射によって行う
   特許請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の方法。 １２、生物学的材料の水溶液または水性分散体対水に容
   易に可溶性な高分子量の重合可能な化合物またはその水
   溶液の重喰比がｌ：ｌ乃至３０：１間、殊に４：１乃至
   ２０：１間である特許請求の範囲第１−１１項のいずれ
   かに記載の方法。 １３、水に容易に溶解する高分子量の重合可能な化合物
   を、一部のヒドロキシル基が不飽和カルボン酸でエステ
   ル化され、そして残りがイソシアネート基を含む誘導体
   と反応している不飽和カルボン酸のポリエーテル−ポリ
   オールから製造する特許請求の範囲第１〜１２項のいず
   れかに記載の方法。 １４、　ａ）ポリエーテル−ポリオールが４００及びそ
   れ以上の分子量を有するポリエチレングリコールであり
   、 ｂ）不飽和カルボン酸がアクリル酸及び／またはメタク
   リル酸であり、 Ｃ）二官能性または多官能性インシアネートがインホロ
   ンジイソシアネート、トルイレンジイソシアネート、ヘ
   キサメチレンジイソシアネート、ビューレット基を含む
   ポリイソシアネート及び／またはジイソシアネートと多
   価アルコールとの反応によって生成したポリイソシアネ
   ートである 特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、水に容易に可溶性の高分子量の重合可能な化合物
   を、　一部のヒドロキシル基が不飽和カルボン酸でエス
   テル化され、そして残りが二官能性または多官能性イン
   シアネートと反応しているポリエーテル−ポリオールか
   ら製造する特許請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記
   載の方法。 １８、　ａ）ポリエーテル−ポリオールが４００及びそ
   れ以北の分子酸を有するポリエチレングリコールであり
   、 ｂ）不飽和カルボン酸がアクリル酸及び／またはメタク
   リル酸であり、 Ｃ）二官能性または多官能性イソシアネートがインホロ
   ンジイソシアネート、トルイレンジイソシアネート、ヘ
   キサメチレンジイソシアネート、ビューレット基を含む
   ポリイソシアネート及び／またはジイソシアネートと多
   価アルコールとの反応によって生成したポリイソシアネ
   ートである 特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、固定化に対して、適当ならば前もって濃縮した後
   の発酵溶液を直接用いる特許請求の範囲第１〜１６項の
   いずれかに記載の方法。 １８、細胞または酵素を消毒剤、殺バクテリア剤または
   殺菌９殺カビ剤の存在下において固定化し、かくして化
   学的に滅菌し、生物反応器中に移し、そして反応を開始
   させる前に、密封された無菌の反応器系中の該滅菌剤を
   洗い出すことからなる特許請求の範囲第１〜１７項のい
   ずれかに記載の方法。 ＋９．特許請求の範囲第１〜１８項のいずれかに記載の
   方法によって得られる固定化された生物学的材料。 ２０　特許請求の範囲第１〜１８項のいずれかに記載の
   方法によって得られる固定化されたプロタミノバクタ−
   管ルブルム細胞。 ２１、生物転換のための特許請求の範囲第１〜１８項の
   いずれかに記載の方法による固定化された生物学的材料
   の使用。