JPS59130196A - 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 - Google Patents
固定化酵素を用いた生体成分の定量法Info
- Publication number
- JPS59130196A JPS59130196A JP313783A JP313783A JPS59130196A JP S59130196 A JPS59130196 A JP S59130196A JP 313783 A JP313783 A JP 313783A JP 313783 A JP313783 A JP 313783A JP S59130196 A JPS59130196 A JP S59130196A
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- JP
- Japan
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- biological sample
- column
- immobilized enzyme
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
木発す１は固定化酵素を用いた生体成分の定量法に関す
る。
る。
従来、生体成分、例えば血清中に微量に存在する胆汁酸
等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば蛍光
光度計等の検出器によって直接検出することが困難な場
合には、酵素の触媒作用を利用して、被測定成分と酵素
の存在下に反応する成分を予め加えておいた試料液を担
体に固定化された酵素が充填され之カラム（これを固定
化酵素カラムと称する）Ｋ導き、そこで被測定成分と反
応成分を反応させ還元型補酵素を生成させ、これを蛍光
検出器により検出し、試料液中に含１れる被測定成分の
量を算出することが行われている。
等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば蛍光
光度計等の検出器によって直接検出することが困難な場
合には、酵素の触媒作用を利用して、被測定成分と酵素
の存在下に反応する成分を予め加えておいた試料液を担
体に固定化された酵素が充填され之カラム（これを固定
化酵素カラムと称する）Ｋ導き、そこで被測定成分と反
応成分を反応させ還元型補酵素を生成させ、これを蛍光
検出器により検出し、試料液中に含１れる被測定成分の
量を算出することが行われている。
そして例えば米国特許第４．１５３．５１３号明細書に
おいては、生体試料液である血清をまず透析し、透析後
の被測定成分を含む生体試料・液を、（イ）検出器のセ
ルに導入してブランク値を検出した後、固定化酵素カラ
ムを通して廃液溜に捨てること、（ロ）透析後の生体試
料液を固定化酵素カラムに通し固定化酵素を利用して反
応させた後に、検出器のセルに導入し、反応生成物を含
有する生体試料液の検出値を検出した後洗液溜に捨てる
こと、の両操作を生体試料液を連続的に流す間に頻繁に
切換えることにより、ブランク値と反応生成物を含有す
る生体試料液の検出値を記録計忙より記録し、これらの
検出結果に基づいて試料液中の被測定成分を定量するこ
とが行なわれている。
おいては、生体試料液である血清をまず透析し、透析後
の被測定成分を含む生体試料・液を、（イ）検出器のセ
ルに導入してブランク値を検出した後、固定化酵素カラ
ムを通して廃液溜に捨てること、（ロ）透析後の生体試
料液を固定化酵素カラムに通し固定化酵素を利用して反
応させた後に、検出器のセルに導入し、反応生成物を含
有する生体試料液の検出値を検出した後洗液溜に捨てる
こと、の両操作を生体試料液を連続的に流す間に頻繁に
切換えることにより、ブランク値と反応生成物を含有す
る生体試料液の検出値を記録計忙より記録し、これらの
検出結果に基づいて試料液中の被測定成分を定量するこ
とが行なわれている。
しかしながら上記の場合では、被測定成分の測定は透析
器による透析と固定化酵素カラムによる酵素反応が定常
状態に入り検出器による検出結果が安定しなければ行な
うことができない。
器による透析と固定化酵素カラムによる酵素反応が定常
状態に入り検出器による検出結果が安定しなければ行な
うことができない。
このため多数の生体試料液中の被測定成分の定量に時間
が掛り、生体試料液が多量−に必要となる。又、〜般的
に固定化酵素は生体試料液中の被測定成分によって徐々
に失活してゆくので、固定化酵素を出来る限り長期間使
用するためには生体試料液量を少くした方がよい。しか
しながら上記の場合には、ジノ換弁をプランタ測定側に
切換えた時にも、検出器のセルを通過した生体試料液は
固定化酵素カラムを通過するという無駄がある。
が掛り、生体試料液が多量−に必要となる。又、〜般的
に固定化酵素は生体試料液中の被測定成分によって徐々
に失活してゆくので、固定化酵素を出来る限り長期間使
用するためには生体試料液量を少くした方がよい。しか
しながら上記の場合には、ジノ換弁をプランタ測定側に
切換えた時にも、検出器のセルを通過した生体試料液は
固定化酵素カラムを通過するという無駄がある。
換言すれば固定化酵素カラムを通過する生体試料液の半
量は無駄に流れ、固定化酵素カラムの寿命を縮め、又同
定化酵素カラムを通過することにより分析時間を長くす
るものであった。
量は無駄に流れ、固定化酵素カラムの寿命を縮め、又同
定化酵素カラムを通過することにより分析時間を長くす
るものであった。
本発明は上記欠点を解消することを目的とするものであ
り、その要旨とするところは、（イ）生体試料液を、固
定化酵素カラムを経ずに検出器に導く流路に導入し、生
体試料液のブランク値を検出器により検出する工程、 （ロ）生体試料液を、固定化酵素カラムを経て検出器ｔ
／Ｃｉ＃＜流路に導入し、固定化酵素力２ムにおける反
応生成物を含有する生体試料液の検出値を検出器により
検出する工程、 上記（イ）、（ロ）の一方の工程を行ない、次いで該工
程におけると同生体試料液を同量用いることにより他方
の工程を行ない、夫々の工程において、検出器により得
られた検出値に基づいて生体試料液中の被測定成分量を
定量することを特徴とする、固定化酵素を用いた生体成
分の定量法に存する。
り、その要旨とするところは、（イ）生体試料液を、固
定化酵素カラムを経ずに検出器に導く流路に導入し、生
体試料液のブランク値を検出器により検出する工程、 （ロ）生体試料液を、固定化酵素カラムを経て検出器ｔ
／Ｃｉ＃＜流路に導入し、固定化酵素力２ムにおける反
応生成物を含有する生体試料液の検出値を検出器により
検出する工程、 上記（イ）、（ロ）の一方の工程を行ない、次いで該工
程におけると同生体試料液を同量用いることにより他方
の工程を行ない、夫々の工程において、検出器により得
られた検出値に基づいて生体試料液中の被測定成分量を
定量することを特徴とする、固定化酵素を用いた生体成
分の定量法に存する。
次に本発明固定化酵素を用いた生体成分の定量法につい
て更に詳細に説明する。
て更に詳細に説明する。
１は緩衝液槽であり、構内の緩衝液には酵素の作用によ
り被測定成分と反応しうる成分、例えば胆汁酸分析の場
合はＮＡＤ＋にコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド
）等が加えられている。２け定流量ポンプであり、緩衝
液を定流量で送液するために設けられるっ ３は被測定成分を含む生体試料液の注入器であり、注入
器３内で生体試料液と緩衝液とが合流する。
り被測定成分と反応しうる成分、例えば胆汁酸分析の場
合はＮＡＤ＋にコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド
）等が加えられている。２け定流量ポンプであり、緩衝
液を定流量で送液するために設けられるっ ３は被測定成分を含む生体試料液の注入器であり、注入
器３内で生体試料液と緩衝液とが合流する。
検出器７により検出する工程Ｖｉ（イ）、（ロ）の二工
程に分かれる。
程に分かれる。
工程Ｕ）においては、第１図に示すように生体試料液を
、固定化酵素カラム６を経ずに検出器７に導く流路５が
設定される。このためにけ／＜ルプ４が設置され、バル
ブ４の切換えにより生体試料液が流Ｗｔ５を経て直接検
出器７に導くようにされる。注入器３により導入された
生体試料は補酵素を含む緩衝液と混合された後、検出器
７のセルに入り、検出器７により生体試料液のブランク
値が検出される。検出器７による検出結果は記録計９に
より記録される。
、固定化酵素カラム６を経ずに検出器７に導く流路５が
設定される。このためにけ／＜ルプ４が設置され、バル
ブ４の切換えにより生体試料液が流Ｗｔ５を経て直接検
出器７に導くようにされる。注入器３により導入された
生体試料は補酵素を含む緩衝液と混合された後、検出器
７のセルに入り、検出器７により生体試料液のブランク
値が検出される。検出器７による検出結果は記録計９に
より記録される。
工程（ロ）においては、第２閑に示すように生体試料液
を固定化酵素カラム６を経て検出器７に導く流ＩＦ！−
１０が設定される。このためパルプ４が切換えられ、工
程（イ）で使用した流路５は遮断される。生体試料液は
固定化酵素カラム６に導入され、カラム６内で固定化酵
素と接触することによりその触媒作用を受け、被測定成
分が反応して反応生成物を生成する。この反応生成物を
含有する生体試料液は検出器７のセルに入り、検出器７
により反応生成物を含有する生体試料液の値が検出され
、記録計９により記録される。
を固定化酵素カラム６を経て検出器７に導く流ＩＦ！−
１０が設定される。このためパルプ４が切換えられ、工
程（イ）で使用した流路５は遮断される。生体試料液は
固定化酵素カラム６に導入され、カラム６内で固定化酵
素と接触することによりその触媒作用を受け、被測定成
分が反応して反応生成物を生成する。この反応生成物を
含有する生体試料液は検出器７のセルに入り、検出器７
により反応生成物を含有する生体試料液の値が検出され
、記録計９により記録される。
例えば胆汁酸分析の場合け、ＮＡＤ＋が加えられた緩衝
液に混合された生体試料液を、酵素３α−Ｈ３Ｄ（３α
−ヒＦロキシステ口イドデヒドロゲナーゼ）が固定化さ
れた担体が充填されている固定化酵素カラムに通して、
胆汁酸とＮＡＤ＋とを反応させ、その結果、胆汁酸と等
モル量の蛍光物質ＮＡＤＨを生成させて該ＮＡＤＨを検
出器（蛍光光度計）で検出するか、又は上記で発生させ
たＮＡＤＨをレザズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの
作用によってＮＡＤＫ酸化させると同時にレサズリンを
還元させて蛍光物質であるレゾルフィンを生成させ、該
レゾルフィンを検出器（蛍光光度計）で検、出する。
液に混合された生体試料液を、酵素３α−Ｈ３Ｄ（３α
−ヒＦロキシステ口イドデヒドロゲナーゼ）が固定化さ
れた担体が充填されている固定化酵素カラムに通して、
胆汁酸とＮＡＤ＋とを反応させ、その結果、胆汁酸と等
モル量の蛍光物質ＮＡＤＨを生成させて該ＮＡＤＨを検
出器（蛍光光度計）で検出するか、又は上記で発生させ
たＮＡＤＨをレザズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの
作用によってＮＡＤＫ酸化させると同時にレサズリンを
還元させて蛍光物質であるレゾルフィンを生成させ、該
レゾルフィンを検出器（蛍光光度計）で検、出する。
このようにして反応生成物を含有する生体試料液の検出
値及びブランク値を検出器７により検出し、蛍光光度一
時間曲線、電流強度一時間曲線等として求め、その面積
の差を計算すると共に、別に測定した検量線から被測定
成分の量を定量することができる。検出器７を出た生体
試料液は廃液槽８に排出される。
値及びブランク値を検出器７により検出し、蛍光光度一
時間曲線、電流強度一時間曲線等として求め、その面積
の差を計算すると共に、別に測定した検量線から被測定
成分の量を定量することができる。検出器７を出た生体
試料液は廃液槽８に排出される。
本発明によれば、ブランク値を検出器により検出する工
程と、反応生成物を含有する生体試料液の検出値を検出
する工程とを行なうに際し、同生体試料液を同量用いる
ことにより検出を行なうものであり、ブランク値を測定
する場合に固定化酵素カラ今に生体試料液を無駄に通過
させないので、固定化酵素カラムの失活をその分防ぐこ
とができ、又生体試料液の使用量もその公吏なく抑える
ことができる。
程と、反応生成物を含有する生体試料液の検出値を検出
する工程とを行なうに際し、同生体試料液を同量用いる
ことにより検出を行なうものであり、ブランク値を測定
する場合に固定化酵素カラ今に生体試料液を無駄に通過
させないので、固定化酵素カラムの失活をその分防ぐこ
とができ、又生体試料液の使用量もその公吏なく抑える
ことができる。
実施例
粒径約８０Ｅクロンのセルロース微粒子を担体として用
い、該微粒子５ｔｎｌにイオン交換水５ｄ、２Ｍ炭酸ナ
トリクム水溶液ＬＯｗｎｅを加えて撹拌したのち、これ
に予めシアン化ブロマイド２ｙを溶解したアセトニトリ
ル１−を加え、激しく撹拌しつつ９０秒間反応させた。
い、該微粒子５ｔｎｌにイオン交換水５ｄ、２Ｍ炭酸ナ
トリクム水溶液ＬＯｗｎｅを加えて撹拌したのち、これ
に予めシアン化ブロマイド２ｙを溶解したアセトニトリ
ル１−を加え、激しく撹拌しつつ９０秒間反応させた。
こうして活性化させたセルロース微粒子をすげや（０，
’Ｉ Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９，５）、イオン交換水及び
０．５Ｍの塩化す） ＩＪウムを含むＱ、１Ｍ炭酸緩衝
液（、Ｐ Ｈ９，５）で洗浄したのち、３（１１−Ｈ８
Ｄ４４ｍｌ／を溶解させた０、５Ｍ（７）塩化ナトリウ
ムを含むα１Ｍ炭酸緩衝液（Ｐ Ｈ９，５） ５−を加
え、室温で２時間撹拌して反応させた。
’Ｉ Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９，５）、イオン交換水及び
０．５Ｍの塩化す） ＩＪウムを含むＱ、１Ｍ炭酸緩衝
液（、Ｐ Ｈ９，５）で洗浄したのち、３（１１−Ｈ８
Ｄ４４ｍｌ／を溶解させた０、５Ｍ（７）塩化ナトリウ
ムを含むα１Ｍ炭酸緩衝液（Ｐ Ｈ９，５） ５−を加
え、室温で２時間撹拌して反応させた。
次に上記の処理により３α−Ｈ５Ｄを固定化した微粒子
表面上なお存在する活性点をブロックで検出器７に達し
、注入後６０秒で、全ての試料液が検出器７を通過した
。ただちに、パルプ４を切り替えることによって、第２
図の流路とし、同一の血清０．０１ ｄを、再び注入器
３妃より注入し緩衝液々混合させた。この＃、刺液は、
固定化酵素力う八６で酵素反応を行った後、注入後２分
で、全ての試料液が検出器７を通過した。検出器７によ
る検出は、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍＫ
より行い、！３図に示す、蛍光強度一時間曲線を得た。
表面上なお存在する活性点をブロックで検出器７に達し
、注入後６０秒で、全ての試料液が検出器７を通過した
。ただちに、パルプ４を切り替えることによって、第２
図の流路とし、同一の血清０．０１ ｄを、再び注入器
３妃より注入し緩衝液々混合させた。この＃、刺液は、
固定化酵素力う八６で酵素反応を行った後、注入後２分
で、全ての試料液が検出器７を通過した。検出器７によ
る検出は、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍＫ
より行い、！３図に示す、蛍光強度一時間曲線を得た。
第３図のピーク（ｂ）の面積と、ピーク（８月の面積の
差より、別に求めた検量線から、被検血清中の胆汁酸濃
度を定量し、た結果は８μＭであった。
差より、別に求めた検量線から、被検血清中の胆汁酸濃
度を定量し、た結果は８μＭであった。
実施例２
実施例１の、固定化酵素充填カラムの調製の、３ａ？−
Ｈ５Ｄを、７α−Ｈ３ＤＫ！き換エテ、７α−Ｈ５Ｄ固
定化酵素カラムを用意し、これを第１図のカラム６さし
て、実施例１と同様の操作で、急性肝炎患者の、セレス
ニン筋肉注射後４０分の血清を注入した。検出器７によ
る検する’＝−ａ３、Ｑ、Ｑ５％の２−メルカプトエタ
ノールを含むｏ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ８，０
）中で４℃で２時間反応させた。
Ｈ５Ｄを、７α−Ｈ３ＤＫ！き換エテ、７α−Ｈ５Ｄ固
定化酵素カラムを用意し、これを第１図のカラム６さし
て、実施例１と同様の操作で、急性肝炎患者の、セレス
ニン筋肉注射後４０分の血清を注入した。検出器７によ
る検する’＝−ａ３、Ｑ、Ｑ５％の２−メルカプトエタ
ノールを含むｏ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ８，０
）中で４℃で２時間反応させた。
かくして得られた＃素固定化微粒子を０，５Ｍの塩化す
）リクムを含む０．１ Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５、Ｏ）
、イオン交換水及び０．５ Ｍの塩化す） Ｕラムを含
む０．１Ｍ炭酸Ｈ街液（、Ｐ Ｈ９，５）で繰り返し洗
浄したのち、長さ１００ｓｘ、内径４鯉のカラムに充填
し、固定化酵素カラムを用意し念。
）リクムを含む０．１ Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５、Ｏ）
、イオン交換水及び０．５ Ｍの塩化す） Ｕラムを含
む０．１Ｍ炭酸Ｈ街液（、Ｐ Ｈ９，５）で繰り返し洗
浄したのち、長さ１００ｓｘ、内径４鯉のカラムに充填
し、固定化酵素カラムを用意し念。
上記のようにして得恋、３α−Ｈ５Ｄ固定化酵素カラム
を第１図の固定化酵素力う八６として用イ、ｌ ｆｆ中
１ｃＮＡＤ＋１９９ｑ（ｉ７含ム０．１ Ｍビロリン酸
緩衝液（Ｐ Ｈ９，５）を緩衝液槽１に入れ、１ずパル
プ４を、第１図の状態にしてから、定流量ポンプ２で、
１−７分の流量で送液し、送液が安定した時点で、ａ唐
人の早朝空腹時に採取した血清α０１ ｄを注入器９３
により注入し、緩衝液と混合させた。かくして得られた
試料液Ｉ−ｉ第１図の流路で流れ、注入後２０秒出は、
柳本製作所製ボルタンメ）！Ｉ−ＶＭＤ −１を用いて
行い、第３図に示す電流強度一時間曲線を得た。第４図
のピーク（ｂ）の面積と、ピーク（ａ＞の面積の差より
、別に求めた検量線から、血清中の胆汁酸濃度を定量し
た結果８μＭであった１、
を第１図の固定化酵素力う八６として用イ、ｌ ｆｆ中
１ｃＮＡＤ＋１９９ｑ（ｉ７含ム０．１ Ｍビロリン酸
緩衝液（Ｐ Ｈ９，５）を緩衝液槽１に入れ、１ずパル
プ４を、第１図の状態にしてから、定流量ポンプ２で、
１−７分の流量で送液し、送液が安定した時点で、ａ唐
人の早朝空腹時に採取した血清α０１ ｄを注入器９３
により注入し、緩衝液と混合させた。かくして得られた
試料液Ｉ−ｉ第１図の流路で流れ、注入後２０秒出は、
柳本製作所製ボルタンメ）！Ｉ−ＶＭＤ −１を用いて
行い、第３図に示す電流強度一時間曲線を得た。第４図
のピーク（ｂ）の面積と、ピーク（ａ＞の面積の差より
、別に求めた検量線から、血清中の胆汁酸濃度を定量し
た結果８μＭであった１、
第１図は本発明の実施態様の例を示し、ブランク値を検
出する工程を示す説明図、第２図は反応生成物を含有す
る生体試料液の検出値を得る工程を示す説明図、第３図
は実施例１における検出結果の記録図、第４図は実施例
２における検出結果の記録図である。 符号の説明 １緩衝液槽、λ定流量ポンプ、３．試料注入器、表パル
プ、５．流路、６．固定化酵素カラム、７．検出器、８
．廃液槽、９．記録計 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 ｓ ｆＢ 基 利 才 ｊ 図 ） （乙 才 ２ 図 ４１１Ｊ
出する工程を示す説明図、第２図は反応生成物を含有す
る生体試料液の検出値を得る工程を示す説明図、第３図
は実施例１における検出結果の記録図、第４図は実施例
２における検出結果の記録図である。 符号の説明 １緩衝液槽、λ定流量ポンプ、３．試料注入器、表パル
プ、５．流路、６．固定化酵素カラム、７．検出器、８
．廃液槽、９．記録計 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 ｓ ｆＢ 基 利 才 ｊ 図 ） （乙 才 ２ 図 ４１１Ｊ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｔ（イ）生体試料液を、固定化酵素カラムを経ずに検出
器に導く流路に導入し、生体試料液のブランク値を検出
器により検出する工程、 （ロ）生体試料液を、固定化酵素カラムを経て検出器に
導く流路に導入し、固定化酵素カラムにおける反応生成
物を含有する生体試料液の検出値を検出器により検出す
る工程、 上記（イ）、仲）の一方の工程を行ない、次いで該工程
におけると同生体試料液を同量用いることにより他方の
工程を行ない、夫々の工程において、検出器により得ら
れた検出値に基づいて生体試料液中の被測定成分量を定
量することを特徴とする、固定化酵素を用いた生体成分
の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP313783A JPS59130196A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP313783A JPS59130196A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59130196A true JPS59130196A (ja) | 1984-07-26 |
Family
ID=11548960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP313783A Pending JPS59130196A (ja) | 1983-01-11 | 1983-01-11 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59130196A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4661445A (en) * | 1985-05-24 | 1987-04-28 | Saxinger W Carl | Competitive ELISA for the detection of HTLV-III antibodies |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5510523A (en) * | 1978-07-10 | 1980-01-25 | Hitachi Ltd | Analyzer using enzyme |
| JPS5570741A (en) * | 1978-11-21 | 1980-05-28 | Hitachi Ltd | Substrate analysis method |
| JPS5847484A (ja) * | 1981-09-12 | 1983-03-19 | Rikagaku Kenkyusho | 生体試料分析装置 |
-
1983
- 1983-01-11 JP JP313783A patent/JPS59130196A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5510523A (en) * | 1978-07-10 | 1980-01-25 | Hitachi Ltd | Analyzer using enzyme |
| JPS5570741A (en) * | 1978-11-21 | 1980-05-28 | Hitachi Ltd | Substrate analysis method |
| JPS5847484A (ja) * | 1981-09-12 | 1983-03-19 | Rikagaku Kenkyusho | 生体試料分析装置 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4661445A (en) * | 1985-05-24 | 1987-04-28 | Saxinger W Carl | Competitive ELISA for the detection of HTLV-III antibodies |
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