JPS59135899A - アルカリプロテア−ゼ酵素の活性測定法 - Google Patents
アルカリプロテア−ゼ酵素の活性測定法Info
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- JPS59135899A JPS59135899A JP968883A JP968883A JPS59135899A JP S59135899 A JPS59135899 A JP S59135899A JP 968883 A JP968883 A JP 968883A JP 968883 A JP968883 A JP 968883A JP S59135899 A JPS59135899 A JP S59135899A
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- hemoglobin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アルカリプロテアーゼ酵素の活性測定法に関
する。更に詳しくは、自動測定分析を可能とさせるアル
カリプロテアーゼ酸素の活性測定法に関する。
する。更に詳しくは、自動測定分析を可能とさせるアル
カリプロテアーゼ酸素の活性測定法に関する。
アルカリプロテアーゼ酵素は、加水分解酵素の一種とし
て、たん白糊の糊抜き、絹の精練、味噌の醸造、食肉の
軟化、肉エキスの製造、フィッシュソリプルの製造、肝
油の抽出率向上、消化剤、懐死組織融解剤、軟膏、薬用
クリーム、ローション、シャンプー、浴用剤、歯磨、口
腔清浄剤、ドライクリーニング、ランドリー洗濯用洗剤
、食器洗剤、皮革脱灰剤、皮革脱毛剤、写真フィルムの
ゼラチン除去、プラステイジの製造などの多くの用途に
用いられている。
て、たん白糊の糊抜き、絹の精練、味噌の醸造、食肉の
軟化、肉エキスの製造、フィッシュソリプルの製造、肝
油の抽出率向上、消化剤、懐死組織融解剤、軟膏、薬用
クリーム、ローション、シャンプー、浴用剤、歯磨、口
腔清浄剤、ドライクリーニング、ランドリー洗濯用洗剤
、食器洗剤、皮革脱灰剤、皮革脱毛剤、写真フィルムの
ゼラチン除去、プラステイジの製造などの多くの用途に
用いられている。
また、アルカリプロテアーゼ酵素を分散させた重合体ド
ープ液を酵素架橋剤含有ゲル化浴中に導き、重合体の膜
状物へのゲル化および架橋を一工程で行わしめて酵素固
定膜とし、（特願昭５７−１６３，３４５号参照）、得
られた酵素固定膜は、チーズ製造時などに使用される限
外ロ過膜のたん白質による目詰りの改善などの目的に有
効に使用することができる。
ープ液を酵素架橋剤含有ゲル化浴中に導き、重合体の膜
状物へのゲル化および架橋を一工程で行わしめて酵素固
定膜とし、（特願昭５７−１６３，３４５号参照）、得
られた酵素固定膜は、チーズ製造時などに使用される限
外ロ過膜のたん白質による目詰りの改善などの目的に有
効に使用することができる。
このような各種用途に用いられるアルカリプロテアーゼ
酵素の活性は、従来から次のようにしてその測定が行わ
れていた。
酵素の活性は、従来から次のようにしてその測定が行わ
れていた。
（１）たん白質からの非たん内性分所産物の生産量を定
量する方法 これの代表的な方法であるフォリン法（アンソン−萩原
氏変法）の場合、アルカリプロテアーゼ酵素の基質（反
応物）としてたん白質であるカゼインを用いるが、その
他に緩衝液、たん白質沈殿剤、発色試薬などとして１２
種類の試薬を準備する必要がある。また、使用器具とし
ては、試験管、ロート、恒温水槽、丸底フラスコ、還流
冷却器、グラスフィルター、ポールピペット、ロ紙、紫
外線および可視光吸光光度計、ビーカーなど１０種類程
度の器具を必要とする。更に、測定操作も８工程に分れ
、準備時間を除いた測定時間だけでも約１．５時間を必
要とする。
量する方法 これの代表的な方法であるフォリン法（アンソン−萩原
氏変法）の場合、アルカリプロテアーゼ酵素の基質（反
応物）としてたん白質であるカゼインを用いるが、その
他に緩衝液、たん白質沈殿剤、発色試薬などとして１２
種類の試薬を準備する必要がある。また、使用器具とし
ては、試験管、ロート、恒温水槽、丸底フラスコ、還流
冷却器、グラスフィルター、ポールピペット、ロ紙、紫
外線および可視光吸光光度計、ビーカーなど１０種類程
度の器具を必要とする。更に、測定操作も８工程に分れ
、準備時間を除いた測定時間だけでも約１．５時間を必
要とする。
（２）ペプチド結合の開裂の結果増加する遊離アミノ基
やカルボキシル基を測定する方法 この方法の場合にも、上記（１）の場合と同等の器具や
時間を必要とする。
やカルボキシル基を測定する方法 この方法の場合にも、上記（１）の場合と同等の器具や
時間を必要とする。
このように、従来法はいずれも煩雑で到底自動測定分析
などに適用し得ないが、本発明に係るアルカリプロテア
ーゼ酵素の活性測定法によれば、ヘモグロビンにアルカ
リプロテアーゼ酵素を作用させ、波長３９０〜４１０ｎ
ｍにおける単位時間当りの吸光度の低下を測定すること
により、アルカリプロテアーゼ活性を測定し得るので、
自動測定分析を可能とさせる。
などに適用し得ないが、本発明に係るアルカリプロテア
ーゼ酵素の活性測定法によれば、ヘモグロビンにアルカ
リプロテアーゼ酵素を作用させ、波長３９０〜４１０ｎ
ｍにおける単位時間当りの吸光度の低下を測定すること
により、アルカリプロテアーゼ活性を測定し得るので、
自動測定分析を可能とさせる。
本発明の活性測定法によれば、ヘモグロビンにアルカリ
プロテアーゼ酵素を作用させることにより、ヘモグロビ
ンの構造が破壊されるので、その破壊速度をヘモグロビ
ンの特有吸収である４０４ｎｍの波長でヘモグロビン残
存物について測定することにより、アルカリプロテアー
ゼ酵素の活性を測定せんとするものである。
プロテアーゼ酵素を作用させることにより、ヘモグロビ
ンの構造が破壊されるので、その破壊速度をヘモグロビ
ンの特有吸収である４０４ｎｍの波長でヘモグロビン残
存物について測定することにより、アルカリプロテアー
ゼ酵素の活性を測定せんとするものである。
従って、この活性測定法によれば、紫外線および可視光
吸光光度計のセル中で、ヘモグロビンとアルカリプロテ
アーゼ酵素を緩衝液中で接触させるだけで足り、それ以
外に殆んど試薬や装置を必要とはせず、しかも短時間で
測定が可能なので、自動測定分析をも可能とさせる。
吸光光度計のセル中で、ヘモグロビンとアルカリプロテ
アーゼ酵素を緩衝液中で接触させるだけで足り、それ以
外に殆んど試薬や装置を必要とはせず、しかも短時間で
測定が可能なので、自動測定分析をも可能とさせる。
ヘモグロビンへのアルカリプロプアーゼ酵素の作用は、
中性付近のｐＨ、約２０〜３５℃の温度などの一般的条
件下で行われるが、活性および吸光度低下係数などは特
定の作用条件に対して特定の値として与えられる。
中性付近のｐＨ、約２０〜３５℃の温度などの一般的条
件下で行われるが、活性および吸光度低下係数などは特
定の作用条件に対して特定の値として与えられる。
前述の如く、ヘモグロビンは４０４ｎｍの波長をピーク
とする特有の吸収を示すが、これにアルカリプロテアー
ゼ酵素を作用させると、経時的に４０４ｎｍをピークと
する特有吸収の吸光度低下がみられるが、このとき３９
０〜４１０ｎｍの波長の範囲内では時間に比例して吸光
度の低下がみられ、それ以外の波長では比例関係とはな
らない。従って、波長３９０〜４１０ｎｍの範囲は、比
例関係が成立するばかりではなく、波長によって異なる
吸光度低下係数もこの範囲内では大きいので計測上測定
がし易く、この点からもこの範囲内の波長、特に４０４
ｎｍの波長力が測定に用いられる。
とする特有の吸収を示すが、これにアルカリプロテアー
ゼ酵素を作用させると、経時的に４０４ｎｍをピークと
する特有吸収の吸光度低下がみられるが、このとき３９
０〜４１０ｎｍの波長の範囲内では時間に比例して吸光
度の低下がみられ、それ以外の波長では比例関係とはな
らない。従って、波長３９０〜４１０ｎｍの範囲は、比
例関係が成立するばかりではなく、波長によって異なる
吸光度低下係数もこの範囲内では大きいので計測上測定
がし易く、この点からもこの範囲内の波長、特に４０４
ｎｍの波長力が測定に用いられる。
次に、実施例について本発明を説明する。
実施例
０．００１Ｍ酢酸カルシウム、０．０２Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび０．１Ｍ塩化ナトリウムよりなる酢酸緩衝液（
ＰＨ７．５）に、１ｍｇ／ｍｌの濃度でアルカリプロテ
アーゼ酵素（長瀬産業製品、起源枯草菌）を溶解させ、
アルカリプロテアーゼ活性測定試薬を調製した。
ムおよび０．１Ｍ塩化ナトリウムよりなる酢酸緩衝液（
ＰＨ７．５）に、１ｍｇ／ｍｌの濃度でアルカリプロテ
アーゼ酵素（長瀬産業製品、起源枯草菌）を溶解させ、
アルカリプロテアーゼ活性測定試薬を調製した。
このアルカリプロテアーゼ活性測定試薬２．５ｍｌを紫
外線および可視光吸光光度計のセルに入れ、次いで上記
酢酸緩衝液で２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したヘモグロ
ビン（シグマ社製品、起源牛血清）の溶液２．５ｍｌを
セル中に加える。
外線および可視光吸光光度計のセルに入れ、次いで上記
酢酸緩衝液で２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したヘモグロ
ビン（シグマ社製品、起源牛血清）の溶液２．５ｍｌを
セル中に加える。
２０℃の状態で混合した時点を反応開始温度として、波
長４０４ｎｍにおける吸光度の変化を、０．５ｍｌ酵素
／ｍｌ緩衝液を対照液として経時的に測定した。測定結
果は、第１図のグラフに示される如く、毎分当り０．０
００５３の直線的な吸光度低下を示している。
長４０４ｎｍにおける吸光度の変化を、０．５ｍｌ酵素
／ｍｌ緩衝液を対照液として経時的に測定した。測定結
果は、第１図のグラフに示される如く、毎分当り０．０
００５３の直線的な吸光度低下を示している。
参考例
アルカリプロテアーゼ酵素の一般的な活性測定法である
アンソン−萩原氏変法によって、実施例で用いられたア
ルカリプロテアーゼ酵素の活性測定を行なった。
アンソン−萩原氏変法によって、実施例で用いられたア
ルカリプロテアーゼ酵素の活性測定を行なった。
即ち、実施例で用いられた酢酸緩衝液を用い、アルカリ
プロテアーゼ酵素０．３ｍｇを、基質としてのミルクカ
ゼイン（ハマースタイン社製品）３０ｍｇに対し３０℃
、１０分間の条件下で作用させたところ、アルカリプロ
テアーゼ酵素１ｇに対して、１分間で０．０２ｇのアミ
ノ酸チロシンが生成した。
プロテアーゼ酵素０．３ｍｇを、基質としてのミルクカ
ゼイン（ハマースタイン社製品）３０ｍｇに対し３０℃
、１０分間の条件下で作用させたところ、アルカリプロ
テアーゼ酵素１ｇに対して、１分間で０．０２ｇのアミ
ノ酸チロシンが生成した。
ｐＨ７．５、３０℃で１分間に１μｍｏｌのチロシンを
生成せしめるアルカリプロテアーゼ酵素の量を１Ｕとす
ると、上記チロシン生成量は、アルカリプロテアーゼ酵
素１ｇ当りの活性が１１８Ｕであることを示している。
生成せしめるアルカリプロテアーゼ酵素の量を１Ｕとす
ると、上記チロシン生成量は、アルカリプロテアーゼ酵
素１ｇ当りの活性が１１８Ｕであることを示している。
即ち、上記作用条件下でミルクカゼインにアルカリプロ
テアーゼを作用させると、その吸光度は０．９となり、
第２図に示されるチロシン検量線から、この吸光度に対
応する生成チロシン量は１２８／１１×１０−６（ｇ）
となる。これを、測定上の希釈倍率より算出される数１
１／２を乗じ、単位時間（分）当りのモル数（分子量１
８１）に換算すると、 １２８／１１×１０−６×１１／２×１／１０＝６．４
×１０−６ｇ／ＭＭ＝０．０３５４μｍｏｌ／ｍｍ これを使用した酵素（ｇ）に換算すると、次のようにな
る。
テアーゼを作用させると、その吸光度は０．９となり、
第２図に示されるチロシン検量線から、この吸光度に対
応する生成チロシン量は１２８／１１×１０−６（ｇ）
となる。これを、測定上の希釈倍率より算出される数１
１／２を乗じ、単位時間（分）当りのモル数（分子量１
８１）に換算すると、 １２８／１１×１０−６×１１／２×１／１０＝６．４
×１０−６ｇ／ＭＭ＝０．０３５４μｍｏｌ／ｍｍ これを使用した酵素（ｇ）に換算すると、次のようにな
る。
０．０３５４／０．０００３＝１１８μｍｏｌ／ｍｍ・
ｇ＝１１８Ｕ／ｇ以上の実施例および参考例の結果から
、実施例での毎分当りの吸光度低下０．０００５３は、
アンソン−萩原氏変法で測定したアルカリプロテアーゼ
酵素１ｇ当り１１８Ｕの活性に相当することが分る。
ｇ＝１１８Ｕ／ｇ以上の実施例および参考例の結果から
、実施例での毎分当りの吸光度低下０．０００５３は、
アンソン−萩原氏変法で測定したアルカリプロテアーゼ
酵素１ｇ当り１１８Ｕの活性に相当することが分る。
そして、このような活性値を、各測定試料毎に求めてお
けば、後は吸光度の低下を測定するのみで、容易に活性
を算出することがてきる。
けば、後は吸光度の低下を測定するのみで、容易に活性
を算出することがてきる。
第１図は、本発明に係るアルカリプロテアーゼ酵素の活
性測定法を経時的な吸光度変化として示したグラフであ
る。また、第２図は、参考例のアンソン−萩原氏変法に
よるチロシン検量線を示したグラフであり、チロシン量
と波長６６０ｎｍにおける吸光度との関係を示している
。 代理人 弁理士 吉田 俊夫 Ａ） ＼ ０ １０ ２０ ３０１図 ４０ ５０ ６０
性測定法を経時的な吸光度変化として示したグラフであ
る。また、第２図は、参考例のアンソン−萩原氏変法に
よるチロシン検量線を示したグラフであり、チロシン量
と波長６６０ｎｍにおける吸光度との関係を示している
。 代理人 弁理士 吉田 俊夫 Ａ） ＼ ０ １０ ２０ ３０１図 ４０ ５０ ６０
Claims (1)
- １．ヘモグロビンにアルカリプロテアーゼ酵素を作用さ
せ、波長３９０〜４１０ｎｍにおける単位時間当りの暖
光度の低下を測定することにより、アルカリプロテアー
ゼ活性を測定することを特徴とするアルカリプロテアー
ゼ酵素の活性測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP968883A JPS59135899A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | アルカリプロテア−ゼ酵素の活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP968883A JPS59135899A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | アルカリプロテア−ゼ酵素の活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59135899A true JPS59135899A (ja) | 1984-08-04 |
| JPH0376918B2 JPH0376918B2 (ja) | 1991-12-06 |
Family
ID=11727151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP968883A Granted JPS59135899A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | アルカリプロテア−ゼ酵素の活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59135899A (ja) |
-
1983
- 1983-01-24 JP JP968883A patent/JPS59135899A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0376918B2 (ja) | 1991-12-06 |
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