JPS59141066A - 特異的結合分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫分析法及び他の特異的結合分析法における
改良に関し、かつまたこの改良分析法を。

実施するために適した物質に関する。

本明細誓において一分析法（ａｓｓａｙ）　’とは試験
されるべき材料（アナライト）の定性的検出又定麓的又
は十定童的測定のための方法を意味する。

本発明は籍に特異的結合分析法に関する。これらの中で
対応する抗体と抗原又はハプテン（例えばホルモン又は
薬剤分子）の結合相互作用を含む免疫分析法は最も音道
である。（しかしながら、特異的結合分析法の中で抗体
以外の物質、例えばアビジン及びビオチン、甲状腺ｖＩ
Ｊ質及びＴＢＣ）等の類似の特異的結合相互作用に基づ
くものもある。これらの他の相互作用は本明細査が関連
する型式の分析法に対する基礎の一部を等しく形成でさ
るものと思われる。） この分析法は特異的結合パートナ−の一つのラベルした
形の使用に基づいている。これらを特異的結合反応が起
こるように配置し、そこでは分析反応の終期において複
合状態と非複合状態中のラベルした形の比率が系に存在
するアナライトの量に依存する。次にラベルした物質の
分康を、反応混合物中で、又はその関連部分中で、例え
ば不均質反応の場合には液相又は固相中でラベルの活性
を測定することを含む適当な方法により測定する。

従来技術において、使用したラベルは放射性ラベル、酵
累ラベル、螢光ラベル及び螺子スピン−共鳴ラベルを含
む。対応する檎類の適当な検出器を使用して測定状態中
のレベルの童に依存する信号レベルを得る。

一般に、賜い感度、広範囲の特異的結合対従って分析さ
れるべき物質に適用できるように分析法型式の適応性、
そして使用に際し単純性を与えるように分析法を実施す
る時に言まれる操作数の減少乞目的とする特異的結合分
析法乞設計することが望ましい。

これらの目的を一度に達することは難しい。例えば、固
体特異的吸着体へアナライトとラベルした結合パートナ
−の連続結合を含む高感度の分析法は不都合にも使用に
際し非常に多くの連続操作を必要とする。他方、他の分
析法、特に（ある場合には）分離工程の必要なしに単一
液体反応相中ですべての必要な反応が起こる螢光免疫分
析法は分析系の無関係成分（皿清含Ｍ容器等）による外
部吸収、散乱及び光放出の故に所望のものより感度が劣
る。

既に螢光ラベル物質として希土類金属イオン、例えばユ
ウロピウムのキレート化誘導体を使用することにより螢
光免役分析法の感度を改良することが提案されているが
、これは励起の際に長寿命の光放出を示し、かつそれ故
に短寿命妨害光放出に比較的ずっと感度の劣る測定装置
により検出できる（　Ｅ、　５ｏｉｎｉ及び１．　）（
６ｍｍｉｌＫ、Ｃ１ｉ、　Ｃｈｅｍ。

（１９７９）２５（３）３５３−３６１、及びＩ　、　
Ｈｅｍｍ１ｌＫ　、Ｅ、　５ｏｉｎｉ及びＴ、　Ｆ５ｖ
ｇｒｅｎ。

Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ　Ｚ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　
（１９８２）　３１１．６５７）。このような市販の装
置はパーキン・エルマーＬ　Ｓ　−５（部品名）螢光分
析計であり、短寿命螢光を検出することができ、かつ試
料のパルス励起後１３．３　ミ’）秒までの種々の幅の
時間区分内で放出される光を選択的に構出できる。

しかしながら、この提案はその適用性にある限定を受け
ると本発明により考えられ、第一には低濃度でラベルと
して使用した時に金属キレートの限定された安定性の故
であり、そして第二にはラベル抗体に使用した時にこの
キレートの発光は免疫榎合体の形成に応答して、例えば
フルオレジインの螢光のように著しく消光性又は増感性
と思われない。それ故に、このキレートは例えば米国特
許第４．１６０．１３１８号に記載されたもののように
消光した螢光定量系の調製に一般に適用できない。

本発明による特異的結合分析法はラベル物質として発光
材料に結合した誘導体の形で関連の特異的結合パートナ
−の一つを利用し、これは１マイクロ秒以上の寿命を有
して（そして通常には１０〜１３０００マイクロ秒の範
囲内）光励起の際には遅延した発光を示し、この遅延発
光は分子状酸素により消光を受け、そして分析反応混合
物（又はその関連した部分）に存在するラベルした物質
の京は分子状酸素による消光を阻止でさる消光阻否ｖＪ
買の存在でタイム−リシルブト測光法より測定される。

反応液中に存在でき、かつ室温、開放雰囲気条件を使用
できる消光阻害物質を見出すことが可能であることは本
発明の屑〈べきかつ有益な面である。この物質の特定例
、例えば亜蝋戚塩、重亜硫酸塩、及びメタ厘亜硫酸塩の
効果を下記に詳細に記載する。

この型式の分析法は幾つかの利点を有することが癲明し
た。かくして、下記のような種々の安定なラベルからラ
ベル物質を選択できる。複数のこのラベルはまた複合体
形成の際に発光性の変更を示し、従って所望に応じて単
一液相、発光−消光タイム−リシルブト発光免疫分析法
又は他の結合分析法の一部となるが、これは刈られる限
り従来達成されていなかった。消光阻害物質の使用は不
活性ガスを用いた起泡又は真空中で測定の実施のような
複雑な操作による酸素を含まない条件を準備することが
必要でなくなる。

一般に、ここに記載する型式の最も好都合な分析法は好
ましくはパルス励起時に励起の終期後少なくとも約５０
マイクロ秒の時間遅延後発光を生じ続ける発光？１７質
を要求する。一般に、発光の時間遅延測定が置かれラベ
ルの発光寿命に比較した長さで測定され、このため好都
合にはできるだけ可能な発光収量が検出できる。前記の
特定の発光装置（Ｐ−Ｅ　ＬＳ−５）を使用する時には
、発光測定をパルス励起の終期から１３．３　ミＩＪ秒
まで続けることができる。

本発明にＺいて使用に通した発元吻質を０２消光可罷な
螢光又はりん光又は両方を示すものから選択できる。例
としてハロゲン化誘導体、時にフルオロフォールの臭素
化及び／又はヨウ素化誘導体が含まれる。

これらの著名な例は特にフルオレジインの臭素化及び／
又はヨウ素化誘導体、例えばエリスロシン及びエオシン
である。より強い信号を生ずるエリスロシンはエオシン
より適している。

また遅延発光ラベルとして、約１Ｍ嬢度で、重い原子の
可溶性化合物、例えばヨウ化ナトリウム及びカリウム、
臭化又はヨウ化ナトリウム又はカリウム、臭化又はヨウ
化セシウム、酢酸鉛、酢酸タリウム又は酢酸鉛タリウム
の存在で、反応又は測定媒体中でフルオロフォールを使
用できる。

本分析法において遅延発光ン利用するために雰囲気ば索
の消光効果に打勝つ必要があり、そしてこれは消光阻害
物質、例えば酸素の消光効果を阻止できる還元′ｆＩ！
ｌＪ質を加えることによって達成できる。この物質の二
つの好適例はメタ重亜硫酸塩、例えばメタ厘亜誠戚ナト
リウム、及び亜誠ｅ塩、例えば亜鍾ｅナトリウムである
。これらの物質は１０−”　Ｍのオーダーの濃度で溶液
で分析系に適切に存在できる。しかしながら、アスコル
ビン酸、′チオサルフェート及びジチオナイトは不適当
であることが本発明者（よる現在までの実験において判
った。

酸素を含まない条件の他のオＵ用し得る方法は反応混合
物の酸素含量を減する又は別に酸素消光効果に打勝つ還
元物質として酵素−基質系の使用が６’）、例えハクル
コース＋グルコースオキシターゼ十カタラーゼ、又はグ
ルコース＋グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ
基質＋ベルオキシダーぜがある。

発光測光を受ける反応混合物又は弛め物質が１ｇノ′形
のオーダーの一度でタンパク質を含有する時より強い信
号が得られることそして非イオン性洗浄剤、例えばトリ
トンＸ−１００（これはポリオキシエチレン化（９−１
０単位／分子）　Ｃｓ−アルキルフェノールである）が
例えば１９／、１３のオーダーの一度で任征する時に更
に増感があることが判明した。

本分析法に使用のためのラベルした物質の調製を、従来
の結合分析法のためのラベル物質な調製するために使用
した方法に類似の方式で一般に実施できる。例えば、利
用し得る工程を使用して結合分析法に必要な多数のタン
パク質及びバッテンの何れかにエリスロシンインチオシ
アネート及びエオシンインチオシアネートを直接に結合
できる。

広く利用し得るカップリング物質の多くを使用して発光
ラベル物質の他の誘導体、例えばカルボン酸な結合でき
る。

本発明の分析法は免疫分析法又は血清又は尿のような生
体液に存在する物質の他の特異的結合分析法のために特
に適し、そして塊状血清成分を分離する必要なしに測定
を実施できる。

従って、特定の具体例では、本発明による分析法は血清
又は尿のような生体液から得られた試料を関心のアナラ
イトの特異的結合パートナ−と免疫学的又は他の特異的
結合反応を行なうこと、そして発光ラベルでラベルした
対応結合物質により−この結合反応の程度を複合体形成
の程度に決定せしめること、そして次に遊離の及び／又
は複合化形で発光ラベル物質の蓋又は分布を測光法によ
り直接に又は間接に測定することを含み、しかもこのラ
ベル発光物質は４００　ｎｍ以上（通常には４５０　ｎ
ｍ以上）の波長を有する光による励起の際に遅延した発
光を生ずることができ、かつ分子状酸素により消光を受
ける共有結合した有機発光物質であること、そしてこの
発光ラベルの測定は分子状酸素による発光の消光を阻止
することができる還元物質又は他の消光阻害物質の存在
でタイム−リシルブト発光測光法により行なわれること
を特徴とする。

本発明のこれらの具体例は反応物質が（＋）アナライト
を特異的に結合することができる免疫吸着朱（１１）ア
ナライトの発光ラベル類似体、及び（ｔｉｔ）ラベル物
質から酵素による発光の消光を阻止することができる消
光阻害物質を含む免疫吸着体免疫分析法を含み；仄に例
えば互いに接触して生体液試料と成分（ｉ）　−（＋＋
：）で結合反応を起こさせること、そして矢に免疫吸着
体から反応漱を分離しかつ前記の条件下でその発光を測
定することによってこの分析法を行なうことができる。

このような分析法において兄反吸着体と発光ラベル類似
体の用量をセットし、お互いに適合させ、そしてそれ自
体周知の方法により計算する。約半分のラベルＣｆｌｌ
えば約２［］〜８ｏ％）がアナライトの不存在で溶液中
に留まるように、しかも分析法の限界で、ごく少量の増
加量のアナライトの存在が結合反応の終期で溶液に最低
量のラベルが留まることを引起こすようにこれらをたび
たび調節する。

別の例の均質分析法は下記のり買を使用する：（１）ア
ナライトと可溶性結合複合体を生ずる、可溶性形のアナ
ライトの特異的結合パートナ−１（＋＋）アナライトの
発光ラベル類似体及び（ｉｉｉ）ラベルした物質から酸
素による発光の消光を阻止でさる物質。

このラベルした類似体（１１）及び特異的結合パートナ
−（１）はお互いとその複合体ができるだけ少ない発光
を示すように選択され、例えば成分（１）が抗体である
時には、その性能が免疫複合体形成によりできるだけ完
全に成分（ＩＩ）の発光を消光するように選択する（消
光は酸素の完全な不存在でも示される）。

次にこの分析法では発光の測定は固相の除去の工程なし
に結合反応の完了から面接に続き、そしてアナライトの
不存在でラベルの発光が成分（１）と結合により最大で
約半分消光され又は増感され（例えば約２０−８０％）
、一方この分析法においてごく少量の増分童のアナライ
トの存在がこの消光の程度に減少を引起こすように成分
（：）及び（１１）の量を決定しかつ適合させる。

本発明はアナライ）　０）個々の同−性及びそれが関与
する特異的結合反応に特に限定されないことは前記の説
明から明らかである。本発明により分析法を行なうこと
ができるアナライトの範囲は例えば下記のものを含む： 薬剤、例えば頚痙剤／抗てんかん剤、例えばプリミドン
、フェニトイン、フェノパルビトン、カルバマゼピン、
エトスフシイミド、バルプロンば；抗生？２Ｉ質、例え
ばアミノグリコシド、例えばデンタマイシン、トフラマ
イシン、アミカシン、不チリマイシン及びシソマイシン
； 抗喘息物質、例えばテオフィリン： 心臓活性又は抗不整脈ｖ！Ｊ質及び関連物質、例えばキ
ニジン、プロプラノロール、オキシブレノロール、プロ
力インアミド及びそのＮ−アセチルメタポライド、リグ
ノカイン、ジゴキシン、ジギトキシン； ホルモン様活性物質及び関連物質、例えば甲状腺ホルモ
ン、ステロイドホルモン、例えばニストリ万一ル及びそ
の共役物、例えばエストリオールサルフェート、プロプ
ステロン、エストラジオール、エストロン−３−ゾルク
ロニド、他のステロイド、胆汁酸、及びコレステロール
： タンパク質及びペプチドホルモン、例えばインシュリン
、クルヵイン、人胎盤ラクトジエン、大成長ホルモン、
人血清アルブミン、免役グロブリン、例えばＩｇＧ　、
　ＩｇＥ　％　ＩｇＡ　％　ＩｇＭ　％　β２−マイク
ログロブリン、甲＄腺−結合グロブリン、ユルチコステ
ロイドー結合グロブリン：肝炎抗原及び杭木例えばＨＢ
ｆｉ面抗原及び対応する抗体。

それ自体免役性ではない上記の物質の場合には血清アル
ブミンのようなタンパク質とのこれらの複合体に対して
公知の方式で抗体を生ずることができる。従来型式の免
疫分析法に関するように、抗体を生ずるためにタンパク
質と複合のため従来のように誘導されたアナライト分子
中の同一の位置でｄ４化により、必要に応じて、発光ラ
ベルを有するアナライトの複合体を形成することが望ま
しい。

本発明を下記の非限定実施例により説明する。

（ａ）　　機器操作 パーキン−ニルマー型ＬＳ−５発光分光計を使用した。

サルステッド、ライセスタ−１英国からのポリスチレン
試験管（４４８４，５５Ｘ１２羽）で実験を行なった。

特記しない限り試料溶液の容量は１．５１ｎｔであった
。Ｋａｍｅｌ、　Ｒ，ｓ、ｌ　Ｌａｎｄｏｎ、Ｊ、及び
Ｓｍ１ｔｈ、　Ｄ、Ｓ、（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　（
１９８０）　２６．１２８１−１２８４）に記載された
ようなアダプターを分光計のクペット呈に入れて試験管
中の浴歇で直接に測定を行なうことができる。

各々５及び１０　ｎｍのモノクロメータ−スリット幅セ
ツティングで、励起と５６６及び５６０　ｎｍの放出波
長でエリスロシンの即発及び遅延螢光を測定した。各々
５及び２０　ｎｍのモノクロメータ−スリット幅セツテ
ィングで、励起と各々５６６及び６９０　ｎｍの放出波
長でりん光を測定した。

遅延螢光及びりん光の測定において、４ｏｕｓの遅延時
間（ｔｄ）と３００　ｕｓ　Ｏ）デート時間（ｔｇ）！
選択した。（遅延時間は励起光パルスと測定の開始の間
の時間である。デート時間は各光パルス後信号が続いて
測定される時間間隔である。）″応答（ｒｅｓｐｏｕｓ
ｅ　）　’セツティング番号２を有する器具を使用しそ
して「積分モード雪装置を使用して測定を行ない、全測
定時間はすべでの場合で４．２８である。すべての結果
を発光強度の任意のスケールで表現した：この分析法で
は観測された最大発光信号が２．５のオーダーでありそ
して特に下記の定量法条件がこの推奨に対応するように
反応体の濃度を調節することが好都合であると判明した
。

（ｂ）　　水性緩衝液で対照測定 リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍモル／−８、Ｐｉ−
１８，０）’＆通して使用した。エリスロシン（シグマ
、プール、ドアセット、英国）を５μモル／２濃度に緩
衝液に醪解した。下記のりん光信号を測定した： 試　料　　　　　　　　　　　　　信号緩衝液中のエリ
スロシン　　　　　　　０．０１１窒素起泡に続く信号
増加は溶液から酸素のパージから生ずる。ドライアイス
添加後信号増加は多分戚累パージと溶液の温度下降の両
刀を反映する。

リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍモル／！、…８．０
）を通して使用した。

牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又は牛チログロブリン（Ｂ
ＴＧ）　（両タンパク質はシグマ、プール、ドアセット
英国から）の存在で緩！＃液中のエリスロシン（５μモ
ル／詔）のりん光を測定した。

添加剤　　　　　　　　　　　　　　信号ｇｓＡ（１，
９／ぷ）　　　　　　　　　　　２．２５ＢＳ−Ａ−（
２，！ｉＩ／１３　）　　　　　　　　　　　２．３５
ＢＳＡ　Ｃ１０，９／彫）　　　　　　　　　　４．２
３ＢＴＧ　（１ｇ／１３　）　　　　　　　　　　　２
．７２ＢＴＧ　（２，！ｉｌ’／石）　　　　　　　　
　　　３．２４ＢＴＧ　（５ｇ／ｅ３　）　　　　　　
　　　　　５．７３ウム 亜硫酸ナトリウム又はメタ重亜誠酸ナトリウム（両方は
ＢＤＨ、プール、ドアセット、英国から）の存在で１ｍ
ｌ／４３　）リドンｘ−Ｉ　ＤＯ洗浄剤（ＢＤＨ，プー
ル、ドアセット、英国）を含有するｄｍｉ中のエリスロ
シン（１μモル／２）のりん光を測定した。

添加剤　　　　　　　　　　　　信号 亜硫酸ナトリウム（１＆／−８）　　　　　　３６．４
メタ恵亜硫咳ナトリウム（１ｇ／−８）　　　　　　６
５．４他の添加剤と共に、又はなしで、亜硫酸ナトリウ
ムｃｖ存在で緩衝液中のエリスロシン（１０Ｑｒモル／
ぷ）のりん光を測定した。

亜硫酸ナトリウム（１Ｅｌ／ｉ　）　　　　　　０．７
９亜硫酸ナトリウム（１ｇ／、８）、ＢＳＡ　Ｃ１ｇ／
−ｅ　）２．６５ グリセロール（１５容童部）とＢＳＡ　（１１１／−ｅ
　）を含有する緩＃液（１容量部）の混合物中でエリス
ロシンのりん光を測定した。２．５５単位の信号を測定
した。

（ｄ）材料の調製と計算 Ｂｏｕｓｑｕｅｔ　、　Ｅ、Ｗ、及びＡａａｍＳ、　Ｒ
，（Ｊ、　ＡｍｅｒＣｈｅｍ、Ｓｏｃ、（１９３０）５
２，２２４−２２９）の工程に促ってプリミドンの窒素
化と還元によりプリミドンの４−アミノフェニル誘導体
を製造した。

トリエチルアミン１０−／Ｕを含有するジメチルホルム
アミド６００μ沼にこのプリミドン誘導体（６■）？：
浴解した。モノキュラープロープ、ジャンクションシテ
ィ−１ＯＲ１アメリカからのエリスロシン−５−インシ
アネー）（１８Ｔｎ９）を同じ溶媒６００μ影を溶解し
た。この二つの溶液を混合しそして室温に暗中で夜通し
反応を進めた。

この反応混合物を分取用シリカゾル薄層クロマトグラフ
プレート（ワットマン、型ＰＬＫ５Ｆ）に適用シ、これ
をクロロホルム／メタノール／氷酢酸（７０：２５：５
容量部）で展開した。主生成物バンドの区域をプレート
から切り取りそしてこの生成物をメタノールに済離した
。

リンばナトリウム緩衝液（１００ｍモル／影、Ｐ）Ｉ８
．ｏ）に希釈後光学密度測定によりエリスロシンーラベ
ルプリミドンの一度を測定し、５４０ｎｍで８．３　Ｘ
　１０’沼モルー１１−上の吸光率と推定される（　Ｍ
ｏｏｒｅ、　Ｃ，、Ｂｏｘｅｒ、　Ｄ、＋及びＧａｒｌ
ａｎｄ、　Ｐ＋ＩＦ、Ｅ、Ｂ、　Ｓ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ
　（１９７９）　１０８．１６１−１６６）。

このメタール生成物溶液を一２０°Ｃで貯蔵した。

フェニル４−位置でプリミドンのアミン誘導体をジアゾ
化しそして確立された工程に従ってＢＳＡに結合した。

羊に生成の免疫性複合体を注射して抗ゾリミドン血清を
生じさせた。

３、希釈剤緩衝液 亜誠酸ナトリウム（２ｇ／４３　）、ＢＳＡ　（１，９
／／？）及びアジ化ナトリウム（１ｇ／、、＆）を含有
するリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍモル／２、ＰＨ
８，０）を特記しない限り通して使用した。

従来の硫酸ナトリウム沈殿法により羊抗ノリミドン血清
の免役グロブリン画分を調製した。この免役グロブリン
（プリミドンに対して特異的抗体な富有する）を希釈剤
緩衝液に元の血清容重に再患濁した。免疫グロブリンの
二倍希釈を調製した。

谷免役グロブリン希釈１００μ２に最終一度（１２Ｄｎ
モル／石）を生ずるようにエリスロシンラベルプリミド
ン１００μ形を刃口えた。室温で６０分間インキュベー
ション後に、希釈剤緩衝液１．４コを加えた。室温で更
に５分後、前記のように（列１）りん光及び遅延螢光を
測定した。非特異的対照として正常な羊血清から免疫グ
ロブリン画分を使用してこの実験をまた行なった。

この結果（第１図）はプリミドンに特異的抗体によるラ
ベルしたプリミドンの結合が約８０％の最大程度にりん
光と遅延螢光の両方の消光を導くことを示す。非特異的
対照疫グロブリンについて何の効果もなかった。

プールした正常な人血清（ＩＬＳ、ニューベリーストリ
ート、ロンドンＥｃ１、英国）にプリミドンを溶解する
ことにより分析法標準を調製した。

谷血清標準１０μ２に最終濃度（１２Ｏｒ＋モル／２）
を生ずるようにエリスロシンーラベルプリミドン１００
μｌを加え、続いて抗ノリミドン兇疫グロブリンを加え
た（　１８．６倍希釈）。室温で６０分間インキュベー
ション後、希釈剤緩衝液１．４−を加えた（免疫グロブ
リンの最終希釈：６００倍）室温で更に５分後、りん光
と遅延螢光を測定した。

結果の標準曲線（第２図）は血清標準中のプリミドンは
限定量のゾリミドンに対する抗体へ結合のためラベルし
たノリミドンと競合することを示す。ラベルしない薬剤
が存在すればする程、結合反応の完了後遊離のままであ
る（抗体非結合）ラベルしたプリミドンの比率が大きく
なり、そしてそれ故にりん光及び遅延螢光信号が大きく
なる。

標準曲線に関する血清の効果を下記の方法でチェックし
た。各ゾリミドン血清標準１０μ石に希釈剤緩衝液１０
０μ！又はプールした正常な人血清１００μ！の何れか
を加え、エリスロシンラベルゾリミドン１００μ！を続
いて、久に抗ノリミドン兇佼グロブリン１ｏｏμ！を刃
口えた（　１８．６借布釈）０呈温で６０分１−インキ
ュベーション後、亜ｍ＆ナトリウム（１０ｇ／Ｕ）、Ｂ
ＳＡ　（１１１／４　）及びアジ化ナトリウムＣ”＃／
−８）を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｎモ
ル／−ｅＸＰＨ８，０）　１．４−を刃口えた。室温で
更に５分後に、りん光を測定した。

この結果（第６図）は分析法混合物中に人血清１００μ
石までの余分の存在は標準曲線に無視し得る効果を有す
ることを示す。

例１に関して示した機器操作と対照測定は本例にも通用
可能である。

こｔらの試剤を前記のように（例１）調製した。

（ｂ）　　仇プリミドン磁化可能同相 シアノデンブロマイド技術を使用して固相ｇ当９抗血ａ
２づの結合比率で羊抗プリミドン血清を磁化可能セルロ
ース／酸化鉄粒子に結合した。

ＰＯｌｌｒｆｅＬｒｚｅＬｎｅｈ−Ｍ、＋　Ｋａｍｅｌ
、　Ｒ，Ｓ、＋　Ｌａｎｄｏｎ、　Ｊ　、＋　　□及び
Ｄａｗｅｓ、　Ｃ，Ｃ，（Ｍｅｔｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ａｎａｌ、　（１９８２）２８．２６７−２９５）
に記載されるように、固相粒子をａｌｌしそして結合を
行なった。

亜硫酸ナトリウム（２，９／−＃）、ＢｓＡ（１ｇ／影
）及びアジ化ナトリウム（１，？／Ｊ）Ｙｔ有するリン
酸ナトリウム緩衝液（１００ｎモル／２、Ｐ）１８．０
）を特記しない限り通して使用した。

（ｄ）抗体希釈曲線 抗ノリミドン面相懸濁液の２倍希釈を調製した。

各固相希釈１００μ石にエリスロシンラベルプリミドン
（１２’Ｏｎモル／−ｅ）１’００μ２を加えた。一定
に機械的にふりまぜしながら室温で６０分間インキュベ
ーション後（固相粒子を懸濁液に保つ）、希釈剤緩衝液
１．４４を加えそし“て粒子を永久ブロック磁石で沈降
させた。沈降粒子上の上澄液のりん光を測定した。

精米（第４図）は檀々のｊ４　（１）抗プ１，１　ミド
ン固相によるラベルしたゾリミドンの結合の程度を示す
。

（ｅ）分析法標準曲縁 プリミドン皿渭標準１０μ２又は希釈剤緩衝液中に調製
したプリミドン皿清標準１０μ石にエリスロシンラベル
プリミドン１００μ沼をカロえ（最終磯度１２０ｎモル
／石を与える）、続いて抗プリミドン固相懸濁液Ｃ２５
１１／４３）を加えた。一定の機械的ふりヱぜを行ない
ながら至温で６０分間インキュベーション後に、希釈剤
緩衝ｍ　１．４　ｍｇを刃口え、そして前記のように粒
子を磁気的に沈降させた。沈降粒子上の上澄液のりん光
を測定した。

血清中に又は希釈剤緩衝液中に調製した標準で得らねた
結果の標準曲線間で有意な差はなかった。

これは分析上置液に存在する血清成分が遊離のラベルし
たプリミドンのりん光の測定に関して何の効果もないこ
とを示す。

アルブミン（５，９／−６）、亜硫酸ナトリウム（１２
，９／ｌ及びアジ化ナトリウムＣ６１１／４３）を含有
する緩衝液において、これらの例でりん光検出限界はエ
リスロシンに対して５６０ピコモル濃度かつエリスロシ
ンープリミドン複合体に対して１６５ピコモル一度でる
ることが判明した。りん光４命は谷々２１０マイクロ秒
及び２５０マイクロ秒と推定された。

アジ化物の存在はふりまぜ時の俗解による空気の一時的
存在の効果に対して亜誠威塩の存在でエリスロシンりん
光を安定化することが判明した：例えば浴液をアジ化物
の不存在で空気中でふりまぜた時には、りん光は一時的
に消光するが、２−６分で復帰した。アジ化物はこの一
時的消光を阻止した。

例えば前記に使用した抗プリミドン血清の代りに各抗薬
剤又は抗ホルモン血清又は免疫グロブリンの適当な標準
調整品、及び各アナライトとエリスロシンの複合体を使
用して、カルバマゼピン（例６）、チロキシン（１Ｔ４
町）（例４）及びコルチゾル（例５）の場合に、前記の
分析法の適合を実施できる。必要な複合体な公仰の工程
により及び／又は下記のように作ることができる。

（ａ）　　エリスロシンラベル力ルバゼビンのＡ製イミ
ノスチルベン（１，９３，！ｉ’）を無水トルエン（５
０ｍｇ）に俗解する。トルエン中のホスゲンの１２．５
％ｗ／ｗ浴液１０づ（ホスゲン１．１　Ｆ　）にかきま
ぜなから滴刃口でこの浴＃：ヲ刀０えそして１時１ｉ１
湿分を排除しながら還流上混合ｖ！Ｊを刃口熱した。

０℃でこの浴液に新たに再蒸留したエチレンジアミン１
．３’ｄ　（１，２、！Ｖ　＞を加えそして６時間湿分
を排除しながら還流下この混合′１ｌ１２＋？：加熱し
た。０　＝０に冷却すると、白色沈殿が形成し、これを
濾過により分離する。真空上濾液を蒸発乾固し、次にク
ロロホルムから希塩酸へ抽出する１、この無機抽出物＆
ｍアンモニアで塩基性化しそしてクロロホルムで再抽出
する。この有機抽出物を乾燥しく　Ｎａ２ＳＯ４）かつ
蒸発乾固してカルバマゼピン−Ｎ−β−エチルアミン（
１，６ｇ）を生ずる。

エチレンジアミンの代りに１．３−７’ロハンシアミン
、１，２−プロパンジアミン（ゾロピレンジアミン）又
は１，６−ヘキサンジアミン（ヘキサメチレンジアミン
）を直換えて同一の方法により他Ｑ）カルバマゼピン−
Ｎ−アルキルアミンを製造できる。

次に各カルバマゼピン−Ｎ−アルキルアミン誘導体をエ
リスロシン−５−イソチオシアネートと反応させること
ができそして公矧の標準工程に従ってシリカゲル薄ノー
クロマトグラフィーにより反応混合物を分離する。エリ
スロシンラベル力ルパマゼビン生成物を適切にシリカゲ
ルからメタノールに醇離しそして使用に必要になるまで
−２０’Ｃに貯蔵でき、そして次に好適な緩衝液、例え
ば０．２％トリトンＸ−１００及び０．３％アジ化ナト
リウムと共にリン咽ナトリウム、０．１　ＭＸｐＨ８へ
希釈する。

（ｂ）Ｔ４−エリスロシンの調製 トリエチルアミン１０汝１及び１ＭＮａＯＨ１０μ！を
含有するメタノール１００μ沼にシグマかラノＬ−チロ
シン（４，３５ｊダ）′ｌｊ！：浴解する溶解レキュラ
ープローブ（アメリカ）からのエリスロシンインチオシ
アネー）　（２，５Ｉｒ＆　）　′ｆ！：、１０　ｍｌ
／ｉ　）す：ｒ−、ｆ　ｋ　７　ミンを含有するメタノ
ール１００μ沼ニ浴解する。この二つの浴液を混合しそ
して反応な晰甲で５時間進行させる。次にこの反応イ昆
合吻を分取用シリカゲルＴＬＣプレート（ワットマン、
型５６５７）に適用し、こｔをクロロポルム／メタノー
ル／アンモニア（８：６：３）で展開スル。

主バンドを切り離しそして午成物をメタノールに溶離さ
せる。

リン駿ナトリウム緩１斬液（１００ミリモル、ＰＨ８，
０，０，２％トリ）ンＸ−１００及び０．６％アジ化ナ
トリウムを含む）で希釈後元羊否度測定によりＴ４−エ
リスロシンの一度を測定でき、５４゜ｎｍで８．５　Ｘ
　１０’　−ｅ　モ＃−１ｃｍ　”　Ｃｔ）ＩＪＳｔ、
光ｔＡ　トｍ定すれる。

（Ｃ）　　エリスロシンラベルコルチゾルの調製−□− 周知の標準工程に類似の方式でジメチルポルムアミド中
のカルボジイミドカップリング反応によって、市販のコ
ルチダル２１−ヘミスクシネートをチオカルバミル−エ
チレン−シアミン（チオカルバミル−エチレン−ジアミ
ンの周九の調製に類似の方式で調製した）に結合できる
。

カルバマゼピン、チロキシン及びコルチゾルに対するこ
れらの分析法は適合によりこれらが引出されたプリミド
ンに対する分析法と匹敵し得る感度レベルを与えること
が判明した。竹効なｇ度は必要に応じて、特にコルチゾ
ルの場合には、プリミドンに対するぽσ記Ｑ）もより大
きな谷量り患者由来血清の使用によって使用時に増力日
できる。

広範囲の他の物質、特に例えばデンタマイシン、トズラ
マイシン、アミカシン及びネチルマイシンに対する適合
によって対応する分析法が得られる。

特に、前記の分析法の有用な適合は複合体を形成するた
めにそれ自体公九の適当な化学カツプリング工程ヲ使用
して（エリスロシンの代りに）４−メチルウムベリフエ
ロン又は他の螢光クマリン又はフラボン、及び・・ロダ
ン化、特に例えば臭素化又はヨウ素化、これらの誘導体
を使用して行なうことができるが、これ自体本発明の一
部を構成しない。４−メチルウムペリフエロン複合体に
対して、励起パルス後約４０マイクロ秒後から約３００
マイクロ秒間瑠感性であり続けるよちなデート慣出器を
使用して、３８０ｎｍで励起の際４５０　ｎｍで遅延螢
光な測定することが好都合である。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗体希釈曲線を示し、プリミドンに抗体による
エリスロシンラベルプリミドンのりん元の消光（遅延発
尤の一型式）及び遅延螢光（遅延発光の別（１）型式）
ｆｚｒ：示す。横軸は抗体Ｑノ最終棺択の数値を示す。 ＃１軸は免役グロブリンの存在なしに侍らｔた数値の６
分率として観測された発光のａ　ｉｉ乞示す。曲線Ａは
非特異約手免疫グロブリンの存在で得られたりん光を示
す（対照）。曲線Ｂは遅延螢光を示し、そして曲ｉｃは
りん光を示し、各々の賜金で指示された希釈でノリミド
ンに対する抗体の存在で得られる。 第２図はエリスロシン−ラベルしたプリミドンのりん光
又は遅延螢光、の測定と共に、血清中のプリミドンの非
分離（均質）分析法のための標準的−を示す。横軸はプ
リミドン譲度（標準）（ミリｇ／形）をボす。縦軸は第
１図と同じ意味をゼする。曲線Ａ及びＢは谷々りん光検
出及び遅延螢光検出からの結果を示す。 第６図はノリミドンの非分離（均買）分析法のための標
準曲線を示し、血１１ｆ効釆の入味を示す。 軸は第２図と同ｌ；意味を有する。点は谷反応混合体中
の血清１００μ形の存在で傅られた結果を示し：交差の
点は緩衝液１００μ沼で対照１区を示す。 第４図は仇プリミドン同相によるエリスロシンラベルプ
リミドンの結合を示す抗体希釈曲線を示す。横軸な・ぎ
当りり同相粒子の量を示す（ｒａｙ　）。 縦軸は固相の不存在で得られた信号の百分率として発光
信号を示す。 第５図はラベルしたプリミドンの遊離画分のりん光の測
定と共に血清中のゾリミドンの固相（分離）分析法のた
めの標準曲線を示す。横軸はｇ２図〜第６図と同じ意味
をゼする。縦軸は第４図と同じ意味な臂する。 代理人　残材　皓 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、１ ７°・帥」１濫貧（り〃） スー Ｆｉｇ、３゜ −に　、４ｍ哨１Ｔ表／ρゾ／４ン１ｊロア・イシドＩ
【βわチ呆（５　　　　　　１．２５　　　　　０．３
１２　　　　　０．０７８４１イゾ岡鶴千−（（〜ンノ Ｆｔ’ｇ、５゜ ０　　　　　２５１０２０４０ １ηミｌ−：４呂１１≧１（反と２２．多りｌ≦ど′］
手続補正書（自発） 昭和５８年１１月　ゲ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第　１７９１０４　　号。 ２、発明の名称 特異的結合分析法 ３、補正をする者 車側との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日イｑ 昭和　　年　　月　　日 ８、補正の内容　　別紙のとおり 手続補正書（方式） 昭和３Ｚ年ノ月／Δ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和にと年特許願第　７７ｆ’／ａｔｙｌ−号２、発明
の名称 昭訃り’Ａ’ａ　ｔ＊＃”ｈ ３、補正をする者 事件との関係　持シ′ト出願人 住　　所 （貨　　垢　　　ユニ１−ハ゛−ナームローセｊ′へ゛
ンノーｉ″う′ヤーフ′４、代理人 一一二 ５、補正命令の日付 昭和５７年　７月Ｓ／日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の浄Ｗ　（内容に変更なし） ４曹へ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　関連の特異的結合パートナ−の一つの誘導体
   又は類似体のラベルした複合体形を使用し、このラベル
   した形が光励起の際遅延した発光を放出することができ
   、特異的結合反応の一成分を形成するアナライトの定性
   的検出又は定量的又は半定量的測定のための特異的結合
   分析を実施する方法において、関連の特異的結合パート
   ナ−の一つ゛のラベルした複合体形が光励起の際遅延し
   た光放出を示す発光物質の誘導体と共に特異的結合パー
   トナ−の誘導体又は類似体を含み、この遅延した光放出
   が分子状酸素により消光を受けることを特徴とし、しか
   も更に分子状酸素による消光を阻止できる有効量の消光
   阻害物質の存在でタイムーリゾルデド（ｔｉｍｅ−ｒｅ
   ｓｏｌｖｅｄ　）測光法の使用によりこの分析法を行な
   うことを特徴とする特異的結合分析法。 （２）前記の消光阻害物質が亜硫酸塩、厘亜硫酸塩又は
   メタ重亜蝋酸塩であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に定義した方法。 （３）　前記の消光阻害物質が１０−２Ｍ“のオーダー
   の濃度で分析反応混合物中に存在することを特徴とする
   特許請求の範囲第２項に定義した方法。 （４）前記の発光物質の誘導体がノ・ロデン化フルオロ
   フォールの誘導体、例えばノ・ロデン化フルオレセイン
   、例えばエリスロシン及びエオシンから、そして螢光ク
   マリン及びフラボン、特に４−メチルウムペリフエロン
   、及びこれらのノへロデン化、特に臭素化及びヨウ素化
   誘導体から選択されることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に定義した方法。 （５）前記の発光物質の誘導体がエリスロシ（インチオ
   シアネート）を含むことを特徴とする特許請求の範囲第
   １項に定義した方法。 （６）　　この分析法が免疫吸着体を利用しかつ結合し
   た複合坏から分離が自由であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に定義した方法。 （力　この分析法が結合の１ｊｌＡ複合体の発光を消光
   するラベルした複合体の特異的結合パートナ−を利用す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に定義した方
   法。 （８）　　アナライトがノリミドン、フェニトイン、フ
   エノバルビトン、カルバマゼピン、エトスフシイミド及
   びバルプロンばを含む薬剤；ゲンタマイシン、トブラマ
   イシン、アミカシン、ネチリマイシン及びシンマイシン
   を含む抗生物質：テオフィリンを含む抗喘息物質；キニ
   ジンプロノラノール、オキシルレノロール、ゾロカイン
   アミド、Ｎ−アセチルプロカインイミド、リグノカイン
   、ジゴキシン及びゾギトキシンを含む心臓活性又は抗不
   廠脈物質及び関連物質；甲状腺ホルモンを含むホルモン
   及ヒエストリオールサルフエート、プロプステロン、エ
   スラジオール、エストロン−３−グルクロニドを含むス
   テロイドホルモン：胆汁酸及びコレステロールを含む他
   のステロイド；及びタンパク質及びペゾチドホルモンか
   ら選択されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   定義した方法。 （９）特許請求の範囲第１項及び実買上例の何れかに関
   して明細書に記載した方法。 （１■　（１）遅延した光放出が分子状酸素により消光
   を受け、光励起の際この遅延した光放出を生ずる発光＠
   負の誘導体と共に特異的結合パートナ−の誘導体又は須
   似体を含む関連の特異的結合パートナ−の一つのラベル
   した複合体形、及び（１１）成分（１）の発光のは素泊
   光を阻止でさる有効量の消光阻害物質を含むことを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に定義した籍異的結合分析
   を実施するための試験キット又は試薬セット。 Ｏυ　更に例を含む明細簀に記載した特徴の何れかを特
   徴とする特許請求の範囲第１０項に定義した試験キット
   又は試薬セット。