JPS6145778B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は広範囲の生理活性有機化合物（リガ
ンド）およびその受容体の存在を定性的かつ定量
的に測定する新規な感度の高い方法に関する。こ
の方法は測定されるべき化合物（リガンド）と構
造的に類似している化合物（リガンド類似体）を
螢光化合物へ結合される試薬を使用する。未知化
合物をリガンドと称し、それと構造的に類似して
いる化合物と螢光体との結合体をリガンド類似体
―螢光体と称し、特異的構造を認識しかつそのよ
うな構造と結合する化合物を受容体と称し、これ
は通常は抗体である。 選択された螢光体は抗体と結合した場合、未結
合に比較して量子収率あるいは発光および／また
は吸収スペクトルのいずれか、またはそれらのす
べてが変化するであろう。この分析方法のために
は、どこかの波長または波長束において放出強度
の変化があればよい。 螢光体抗体がリガンド類似体―螢光体の螢光体
部分に結合する速度および平衝における螢光体抗
体のリガンド類似体―螢光体の螢光体部分への結
合量はリガンド類似体―螢光体のリガンド類似体
部分に結合したリガンド抗体の量に関係がある。
従つて、リガンドと螢光体の両方の抗体をリガン
ド類似体―螢光体および未知物質と混合すれば、
特定の波長または波長束における発光強度を標準
と比較することによつて未知物質中に存在するリ
ガンドの量を決定できる。 好適具体例としては、消光体を受容体に配合す
る。 別の方法として、抗リガンド抗体を含有する未
知物質を螢光体抗体およびリガンド類似体―螢光
体と混合することにより未知物質中の受容体の量
を測定できる。 微量の有機物質の存在を測定する必要が従来継
続して発展してきた。興味のある濃度範囲は約
10^-4ないし10^-12Mあるいはこれ以下である。この
測定方法の使用が有意義である領域は、生理学的
媒体中の誤用された薬の存在の有無、薬物の有効
量の決定、特定の有機物質の存在の有無または量
が病気の診断に関連している場合の病気の診断、
および食物中の微量成分の検定である。生理学的
な興味以外の領域としては、水または他の液体中
のこん跡量の不純物についての科学的研究および
検定、水質コントロール等である。 特異的物質の検定方法は免疫学的分析法の部類
に入る。免疫学的分析法は受容体、通常は抗体で
あつて、１つの有機分子中の特異的な立体構造お
よび電荷分布―エピトープを認識するものを使用
する。これらの抗体は比較的大きな分子、すなわ
ち150000またはそれ以上の分子量の分子であつ
て、蛋白質の性質を有する。したがつて、ほとん
どの興味ある有機化合物について、抗体と有機化
合物の結合によつて分子量が有意に増加し、溶媒
環境に比べて有機化合物の環境が変化する。免疫
学的分析法においては水性溶媒が通常使用され
る。 放射性免疫学的分析法においては、分子量が大
きく増加すると抗体に結合している有機化合物と
未結合有機化合物を分離せしめる。放射性の検出
分子を有することにより、この放射性化合物の結
合物と未結合物との間の分配を測定できる。この
分配は未知物質中に存在する上記有機化合物の濃
度に関係がある。 もう１つの技術は商標FRATの下にシバコンパ
ニー（Syva Company）から市販されているスピ
ンによる免疫学的分析技術である。この技術にお
いては、安定な遊離のラジカル化合物が未知有機
化合物に似た化合物に結合されている。溶液中で
スピンラベル化合物が回転する速度は電子スピン
共鳴スペクトルの高さに影響を及ぼす。スピンラ
ベル化合物が抗体と結合すると、上記速度は未結
合のときよりもかなり低下する。電子スピン共鳴
スペクトルのピークの高さを既知標準物と比較す
ることによつて溶液中に存在する未知化合物の量
を決定できる。 もう１つの技術は検出体として酵素を使用す
る。この技術においては、酵素を未知化合物に結
合させる。商標EMITの下にシバカンパニーによ
り市販されているこの技術において、酵素結合化
合物を抗体に結合させると酵素活性がかなり低下
する。したがつて、酵素活性を測定し、酵素活性
を標準と比較することにより溶液中の未知物質の
量を決定できる。 米国特許第3709868号には放射性免疫学的分析
法が示されており、米国特許第3690834号にはス
ピンによる免疫学的分析法が示されている。米国
特許第3654090号および西ドイツ公開公報第
2223385号には酵素による免疫学的分析法が示さ
れている。興味ある論文としてはLudwing
BrandおよびJames R.Gohlkaの“Fluorescene
Probes for Structure”と題したAnnual Review
of Biochemistry 41、843―868（1972）および
Stryer，Science，162，526（1968）がある。 この発明によれば受容体、通常抗体が入手し得
るか製造できる有機化合物の存在または量ならび
に受容体の量を測定する方法が提供される。この
有機化合物はリガンドと称する。使用される試薬
は(1)リガンド類似体―螢光体（LA―Ｆ）であつ
て、LA―Ｆのリガンド部分が実質的にリガンド
と同じエピトープを有するもの、(2)リガンドに対
する抗体（抗リガンド抗体）であつて、添加され
るかもとから未知物質中にあるもの、および(3)螢
光体に対する抗体（抗螢光体抗体）であつて、好
ましくはそれに少くとも１つの消光体分子を配合
したものである。これらの試薬を適当なPHの水性
媒体中未知試料といつしよにすると、得られる放
出スペクトルが溶液中に存在するリガンドまたは
抗リガンド抗体の量と関連付けられよう。これは
抗螢光体抗体に結合した螢光体の量が未知試料中
に存在するリガンドの量と関連付けられることお
よび未結合螢光体と抗体に結合した螢光体との放
出スペクトルの相違によるものである。 この発明は広範囲の有機化合物であつて、その
受容体が入手できるか製造できるものおよび受容
体自体の存在を測定する新規かつ感度の高い方法
を提供するのであるが、実際、この発明はその存
在または濃度を測定する対象であるリガンドとし
ての抗原またはハプテンについて使用される。試
薬は上記リガンドと共通の少くとも１つのエピト
ープを有する化合物（以下リガンド類似体と称す
る）を螢光体に結合させることによつて製造され
る。このリガンド類似体は通常上記リガンドと実
質的に同一の空間的特徴および電荷分布を有して
受容体部位、たとえば抗体部位に対してリガンド
と充分競合するようにする。リガンド類似体のエ
ピトープは螢光体に充分近いのでほとんどの部分
で螢光体に対する抗体およびリガンドに対する抗
体が同じ分子上に同時に存在し得ない。リガンド
類似体―螢光体が溶液中で螢光体に対する抗体お
よびリガンドに対する抗体といつしよになると、
２つの抗体の結合定数に関係した平衝が成立す
る。 もしリガンドが溶液に導入されると、これらの
抗体とリガンド類似体―螢光体との平衝は、リガ
ンド類似体の抗体の有効濃度が低下するため変化
する。 螢光体の発光スペクトルはその環境に対して敏
感である。よつて、発光スペクトルは螢光体が抗
体と結合すると未結合の場合に比べて変化する。
この変化は量子収率または発光または吸収スペク
トルの変化によつて生じる。単一の波長について
考察し、２つの波長の相対的強度を比較し、ある
いは波長束を積分することによつて、未知試料の
シグナル強度を標準のシグナル強度と比較して未
知試料中のリガンドの存在あるいはその量を測定
できる。 好適具体例としては、抗螢光体抗体を螢光体に
対する消光体と配合させる。消光体分子は螢光体
分子と近距離、通常約100Å未満の距離にあると
螢光として放出されるであろうエネルギーを受容
することにより螢光を阻止し得る分子である。消
光体分子は螢光体分子の発光帯域に重なる吸収帯
域を有するであろう。さらに消光体分子は受容体
に結合した螢光体分子の螢光を低下させる。この
ようにして抗螢光体抗体と結合した螢光体の残余
螢光に由来するバツクグランドも低下する。 この方法をリガンドについて説明するために生
じる種々の反応を次式によつて示す： １ リガンドが存在しない場合 L.A−Ｆ＋Ab_F＋Ab_LL.A−Ｆ／Ab_F
＋Ab_L／L.A−Ｆ L.A−Ｆ＋ｈν→L.A−Ｆ^*→L.A−Ｆ＋ｈν
^１ Ab_L／L.A−Ｆ＋ｈν→Ab_L／L.A−Ｆ^*
→Ab_L／L.A−Ｆ＋ｈν^１ L.A−Ｆ／Ab_F＋ｈν→L.A−Ｆ^*／Ab_F
→L.A−Ｆ／Ab_F＋ｈν^２ ２ リガンドが存在する場合、さらに次の反応が
加わる。 Ｌ＋Ab_LＬ／Ab_L 上記各式中、L.A−Ｆは螢光体(F)に結合したリ
ガンド類似体（L.A）であり；Ｘ／ＹはＹに結合
したＸ、たとえば螢光体(F)に結合した螢光体に対
する抗体（Ab_F）を表わし；ｈνは光子であつて
１および２は異なる発光強度の光を示している；
＊は励起状態を示す。 一定濃度のL.A−Ｆ、螢光体に対する抗体（抗
螢光体抗体）およびリガンドに対する抗体（抗リ
ガンド抗体）を有する溶液についていえば、リガ
ンドが存在すると抗リガンド抗体の有効量が減少
し、リガンドが存在しない場合の平衡を変化させ
る。発光強度および／または発光した光の波長は
抗体に結合した螢光体と未結合螢光体とでは相違
するので、発光スペクトルは溶液中に存在するリ
ガンドの量に依つて変化するであろう。 分析を行う際、試薬はどんな順序でいつしよに
することもできるが、特定の順序が非常に好まし
いと考えられる根拠がある。その１つは置換が比
較的低速度であることがわかつたことである。す
なわち、いつたんリガンドまたはリガンド類似体
が抗体に結合してしまうと、これを他のもので置
換するには比較的長時間かかる。さらに、リガン
ドとリガンド類似体は両方とも抗体に強く結合で
きるが、その結合定数はこれら２つの間にかなり
差がある。よつて、平衡時にリガンド類似体がリ
ガンドよりかなり高い結合定数を有している場合
は、リガンド類似体を置換したリガンドの量は非
常に少ない。このことはこの方法を高度に不正確
にする。 また、リガンド類似体に結合した抗リガンド抗
体が存在することによつて螢光体への抗螢光体抗
体の結合を妨げることがこの発明の分析方法に不
可欠である。リガンド類似体の抗リガンド抗体の
抗螢光体抗体による置換はゆつくりしており、こ
の測定方法は結合螢光体と未結合螢光体との分布
にもとづいているので、通常、抗リガンド抗体と
リガンド類似体―螢光体は抗螢光体抗体を添加す
る前にいつしよにする。 上述のことを考慮して、通常の添加方法は主と
して２つの変法、すなわち、未知試料および抗リ
ガンド抗体をいつしよにし、リガンド類似体―螢
光体を添加すること；および未知試料、リガンド
類似体―螢光体および抗リガンド抗体をいつしよ
にすることである。静置またはインキユベーシヨ
ン後に比較的安定な状態が得られた場合、単位時
間当り種々の反応種の濃度の再現性ある変化ある
いは種々反応種の実質的に一定の濃度のいずれか
について、有効螢光体を抗螢光体抗体または過剰
に加えた抗螢光体抗体によつて滴定できる。通
常、各添加間に要する最小時間は約２時間未満で
ある。 値は特定の持続時間後に得られる値―速度―あ
るいは長時間かけて非常にゆつくり変化する値と
して測定できる。後者の場合、真の平衡には通常
達しないが、抗体の分配は種々の反応種の相対的
結合定数よりむしろ相対的濃度にもとづいてい
る。値の読みが時間とともにゆつくり変化するで
あろうので、この発明の目的のためには平衡が考
慮されるべきである。 一定の強度の特定の光源を使用して発光スペク
トルを測定し、特定の波長または特定の波長束に
おける発光強度を観察することによつて、得られ
た結果を既知標準と関連付けることができる。こ
の方法を未知試料について、標準について行なつ
たほとんど同じ方法で行なうことによつて、未知
試料中に存在するリガンドの量を定性および定量
的に測定できる。 抗リガンド抗体の量を決定したい場合、抗リガ
ンド抗体を含有しているとみられる未知試料をL.
A−Ｆと混合してから抗螢光体抗体を添加するか
あるいはこれら３成分を同時にいつしよにでき
る。通常、未知試料の添加前にL.A−Ｆと抗螢光
体抗体をいつしよにしたりインキユベートしたり
しない。L.A−Ｆおよび抗螢光体抗体の濃度はリ
ガンド測定のために与えられた比の範囲内にある
抗リガンド抗体の好適範囲の濃度に比例して変化
するであろう。 分析できるリガンドの濃度は約10^-4ないし
10^-12Mであるが、通常は約10^-5ないし10^-11Mで
ある。リガンド類似体―螢光体の濃度も同じ範囲
で変化するが、通常、好適濃度範囲と100の因数
以上相違しない。抗体濃度は一般にリガンド類似
体―螢光体のモル当り結合部位数にして約0.5―
1000：１であるが、通常１―10：１である。結合
部位を測定する方法については米国特許第
3690834号を参照せよ。実際使用される抗体対リ
ガンド類似体および螢光体のモル比は抗体の結合
定数にかなり依存するであろう。 すでに述べたように、媒体は通常水性であつて
一般に20容量％以下の極性有機溶媒を含有する。
種々のアルコール、ケトン、エーテルおよびエス
テルが少量ずつ存在する。 この媒体のPHは通常約６ないし９、好ましくは
約７ないし8.5の範囲にある。種々の緩衝液を使
用して所望のPHを達成し、測定の間それを維持す
ることができる。具体的には、ほう酸塩、燐酸
塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等の緩衝液で
ある。この発明の方法にとつて特定の緩衝液を使
用することが特に重要であることはないが、特定
の分析には１つの緩衝液が他のものより好ましい
ことがある。 特定のリガンドおよび螢光体については、蛋白
質に対する非特異的結合が少しではあるが有意の
量存在する可能性がある。分析媒体の蛋白質濃度
が１重量％未満、好ましくは0.5重量％未満、特
に好ましくは約0.1重量％未満であることが好ま
しい。総蛋白質濃度は、限外過、ゲル過、沈
殿、透析等によつて未知試料をあらかじめ処理す
ることによつて最小にできる。 この分析を行うには中位の温度が使用され、通
常、分析の間は一定の温度が使用される。温度は
通常約15℃ないし40℃の範囲、好ましくは約25℃
ないし40℃である。これより高い温度では抗体の
エピトープへの結合が減少するので望ましくな
い。 この測定を行うにあたつて、分析溶液を螢光光
度計セルに入れる。励起波長の選択は螢光体に依
る。発光スペクトルを測定する特定の波長または
波長束は発光極大および光分散による干渉の量に
よるであろう。単一波長の強い光源を使用するの
が望ましい。このようにすれば、光分散による干
渉が最小となる。従来のモノクロメーター付光源
より大きな強度を有する有用な単色光源は低圧放
出ランプおよびレーザーである。 この発明に使用される第一の試薬はリガンド類
似体―螢光体分子である。この分子は受容体部位
に対してリガンドと競合するか少くともリガンド
に結合している受容体部位に特異的に結合できな
ければならない。 リガンドに対する抗リガンド抗体の結合定数は
リガンド類似体に対する結合定数とあまりかけは
なれていてはいけない。もし、リガンドが螢光を
発するならば、螢光体は測定する波長においてそ
のリガンドが最高濃度において発する発光強度の
少なくとも約100倍の発光強度を有しなければな
らない。リガンドの螢光が低いのは螢光体の吸収
極大とは異なり、発光極大とも異なり、あるいは
量子効率がかなり低いことによる。 上述のように、このリガンドは少なくとも
110、もつと普通には少なくとも125から上限なし
の最大分子量まで広く変化するが、通常1000万を
越えることはない。ほとんどの場合、リガンドと
しての主要な要件はそのリガンドに対する受容体
が製造あるいは入手できるということである。通
常、受容体は極性官能基を有するほとんどの有機
化合物について製造できる。抗原特性を有する化
合物に結合することによつてその抗体が形成でき
る化合物をハプテンという。化学修飾なしに抗体
形成できる化合物を抗原という。Kabat，etal，
Experimental Immunochemistry，Charles C.
Thomas，Springfield，Illinois，1967参照。 対象となる非重合性化合物は分子量約125ない
し2000である。これらの化合物は構造、機能およ
び生理学的特性の異なる広範囲の化合物である。
これらの化合物は非環式化合物、脂環式化合物ま
たは複素環式化合物、単環式および多環式化合物
である。異原子は酸素、窒素、硫黄、ハロゲン
（フツ素、塩素、臭素およびヨウ素）、ほう素、
燐、周期律表の第1A族および第2A族の金属陽イ
オン等である。 官能基は、アルコール、エーテル、カルボン
酸、エステルおよびアミド、アミン（第一級、第
二級、第三級および第四級）、ハロゲン、ニトリ
ロ、メルカプト等である。通常、これらの化合物
は炭素、水素、酸素、窒素、ハロゲンおよび燐、
特に炭素、水素、酸素および窒素からなり、塩の
場合には適当な金属イオンまたはアンモニウムイ
オンも含まれる。 複素環はピロール、ピリジン、ピペリジン、イ
ンドール、チアゾール、ピペラジン、ピラン、ク
マリン、ピリミジン、プリン、トリアジン、イミ
ダゾール等である。 この方法によつて測定できる化合物は広範囲な
ので、これらの化合物を特定の官能基または環構
造の存在によつて種々のかなり人工的カテゴリー
に分類し特定の官能基を有するものを１クラスず
つにまとめた。 対象となる化合物の第１クラスは複素構成員ま
たは脂肪族鎖上の官能基としてアミノ基を有する
化合物である。これらの化合物は通常分子量110
ないし800、更に普通には約125ないし650であ
る。 このクラスの第１群の化合物はアルカロイドお
よび摂取されたアルカロイドの代謝物である。重
要なアルカロイドの第１群はモルヒネ族のアルカ
ロイドである。この族にはモルヒネ、コデイン、
ヘロイン、モルヒネグルクロニド等が含まれる。 モルヒネアルカロイドおよびその代謝物を検出
する試薬としてのこの発明の方法に使用できるの
はほとんどの場合、次式の化合物である： 式中Ｘは水素以外の原子２〜８個、より普通に
は２〜４個からなる結合基であつて、炭素、水
素、酸素、硫黄および窒素以外の原子を含まず、
好ましくは非―オキソカーボン基を結合官能基の
１部として有する基であつて：Flは後述する螢
光体である。 結合基は具体的にはアセトアミド、アセトイミ
ジノ、サクシネート、オキザレート等である。 アルカロイドの第二群はコカインアルカロイド
であつて、特に代謝物としてベンゾイルエコグニ
ンおよびエコグニンがある。 アルカロイドのもう１つの群はキナ皮アルカロ
イドであつて、キニーネが含まれる。 イソキノリン群のアルカロイドはメスカリンで
ある。 ベンジルイソキノリン群のアルカロイドはパパ
ベリンである。 フタリドイソキノリン群のアルカロイドはナル
コチン、ナルセインおよびコタルニンである。 インドロピリドコリンアルカロイド群はヨヒン
ビンおよびレセルピンである。 麦角アルカロイド群はエルゴタミンおよびリゼ
ルグ酸である。 他のアルカロイド群はストリキニーネアルカロ
イド、ピリジンアルカロイド、ピペリジンアルカ
ロイド、ピロリジンアルカロイド等である。 第一に対象となるアルカロイドはモルヒネ、コ
カイン、メスカリンおよびリゼルグ酸等の濫用薬
物のカテゴリーに入るもので、その存在の有無は
被分析体液について化合物自体またはその代識物
を分析することによつてあきらかとなる。 多数の合成薬が、天然の濫用薬物の生理学的特
性を部分的に又は全体的に模倣している。これら
に含まれるのは、メサドン、メペリジン、アンフ
エタミン、メタンフエタミン、グルテチミド、ジ
フエニルヒダントイン、及びベンズジアゾシクロ
ヘプタン、フエノチアジン及びバルビツレートの
カテゴリーに入る薬物である。 その生理学的特性により興味ある薬物はカテコ
ールアミンと呼ばれるものである。このカテコー
ルアミンにはエピネフリン、エフエドリン、Ｌ―
ドパ及びノルエピネフリンが含まれる。 対象となる他薬物はトランキライザーメプロバ
メートである。対象となる化合物はテトラヒドロ
カンナビノール、カンナビノール、その誘導体、
特にマリジユアナ（marijuana）から誘導される
化合物、その合成変性及び代謝産物である。 特に興味ある別の化合物群はステロイドであ
る。エストロゲン、ゲストゲン、アンドロゲン、
副腎皮質ホルモン、胆汁酸、強心グリコイド、ア
ルギコン、サポニン、サポゲニン等である。 別のクラスの化合物はビタミン、例えばV.A、
Ｂ群（例えばB₁、B₆、B₁₂）、Ｅ、Ｋ等である。 別のクラスの化合物は糖質（単糖類と多糖
類）、特に二糖類及びそれ以上の高級多糖類であ
る。 別のクラスの化合物はプロスタグランジンであ
る。 もう１つの化合物群はペニシリン、アクチノマ
イシン、クロロマイセチル等のような抗生物質で
ある。 対象となる他の化合物はセロトニン、スペルミ
ンおよびフエニルピルビン酸である。 対象となるもう１つのクラスは殺カビ剤、殺虫
剤、殺菌剤および殺線虫剤のような有害生物絶滅
剤である。 別のクラスの化合物はアミノ酸、ポリペプチ
ド、蛋白質である。ポリペプチドは普通、約２〜
100個のアミノ酸単位を含む（普通には分子量は
約12000以下）。大きなポリペプチドは蛋白と呼ば
れ、普通約１〜20個のポリペプチド鎖から構成さ
れる。ポリアミノ酸はポリペプチドと蛋白を包含
する。特に興味あるアミノ酸はチロニン、トリ―
及びテトラヨードである。試薬として２個の抗体
を用いる本発明で用いられるポリアミノ酸は一般
に約5000〜10⁷、普通には10⁴〜10⁶の分子量を持
つ。特に興味あるポリペプチドと蛋白（ポリアミ
ノ酸）はホルモン、グロブリン、抗原及び特異な
生理活性を持つことがわかつている化合物であ
る。 類似した構造特徴を持つ蛋白族、特別の生物作
用を持つ蛋白、特定微生物（特に病原微生物）に
関連した蛋白等については幅広い蛋白が考えられ
る。 以下は構造により分類した蛋白のクラスであ
る。 プロタミン、ヒストミン、アルブミン、グロブ
リン、硬蛋白、リン蛋白、ムコ蛋白、色素蛋白、
リポ蛋白、核蛋白、未分類蛋白、例えばソマロト
ロピン、プロラクチン、インシユリン、ペプシ
ン。 人間の血中に発見される多数の蛋白は臨床上重
要であり、以下のものがある。 プレアルブミン、アルブミン、α_１―リポ蛋
白、α_１―酸糖蛋白、α_１―抗トリプシン、α_１
―糖蛋白、トランスコルチン、４，6S―ポスト
アルブミン、トリプトフアンに乏しいα_１―糖蛋
白、α₁X―糖蛋白、チロキシン結合グロブリ
ン、インタ―α―トリプシン―阻止剤、Gc―グ
ロブリン（Gc1―１）、（Gc2―１）、（Gc2―２）、
ハプトグロビン（Hp1―１）、（Hp―２―１）、
（Hp2―２）、セルロプラスミン、コリンエステラ
ーゼ、α_２―リポ蛋白、α_２―HS―糖蛋白、Zn
―α_２―糖蛋白、α_２―ノイラミノ―糖蛋白、エ
リスロポイエチン、β―リポ蛋白、トランスフエ
リン、ヘモペキシン、フイブリノーゲン、プラス
ミノーゲン、β_２―糖蛋白、β_２―糖蛋白、
免疫グロブリンＧ〔（IgG又はγＧ―グロブリ
ン、分子式：γ₂K₂又はγ_２λ_２〕、免疫グロブ
リンＡ〔（IgA）又はαＡ―グロブリン、分子
式：（α₂K₂）^m又は（α_２λ_２）ⁿ〕、免疫グロブリ
ンＭ〔（IgM）又はαＭ―グロブリン、分子式：
（μ₂K₂）⁵又は（μ_２λ_２）^５〕、免疫グロブリン
Ｄ〔（IgD）又はγＤ―グロブリン（γＤ）、分子
式：（δ₂K₂）又は（δ_２λ_２）〕、免疫グロブリ
ンＥ〔（IgE）又はγＥ―グロブリン（γＥ）、分
子式：（ε₂K₂）又は（ε_２λ_２）〕、フリーライ
トチエーン（Freelight chains）、補体因子：
C′₁，C′_1q，C′_1r，C′_1s，C′₂，C′₃，β₁A，α₂D
，
C′₄，C′₅，C′₆，C′₇，C′₈，C′₉。 重要な凝血因子は次表の通りである。

【表】 重要な蛋白ホルモンは以下のとおりである： ペプチド及び蛋白ホルモン パラチロイドホルモン（パラトルモン）、チロ
カルシトニン、インシユリン、グルカゴン、レラ
キシン、エリスロポイエチン、メラノトロピン
（メラノサイト刺激ホルモン；インターメデイ
ン）、ソマトトロピン（成長ホルモン）、コルチコ
トロピン（アドレノコルチコトロピンホルモ
ン）、チロトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体形
成ホルモン、（間質細胞刺激ホルモン）、ルテオマ
ンモトロピンホルモン（ルテロトロピン、プロラ
クチン）、ゴナドトロピン（緘毛ゴナドトロビ
ン）。 組織ホルモン セクレチン、ガストリン、アンギオテンシン
，、ブラジキニン、人間の胎盤ラクトゲン。 下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン、バソプレシン、放出因子
（RF）（CRF，LRF，TRF，ソマトトロピン―
RF，GRF，FSH―RF，PIF，MIF）。 対象となる他の重合性物質はムコ多糖類と多糖
類である。 微生物から得られる抗原多糖類を例示すると次
の通りである。

【表】 類フラクシヨン
との塩水エキス

【表】 対象化合物以外に、抗原性であり、又それに対
する天然受体が発見できる細胞、ウイルスその他
の生理学的集合体も又分析できる。 分析される微生物は無傷のまま、溶解され、破
砕されあるいは別の方法で細分されてもよく、得
られた組成物又は一部は、例えば抽出により分析
される。対象となる微生物は次の通りである。 コリンバクテリア コリンバクテリウム ジフテリア （Corynebacterium diphtheriae） 肺炎球菌 ジプロコツカス ニユーモニア （Diplococcus pneumoniae） 連鎖球菌 ストレプトコツカス ピオゲネス （Streptococcus pyogenes） ストレプトコツカス サリバルス （Streptococcus salivarus） ブドウ球菌 スタフイロコツカス オーレウス （Staphylococcus aureus） スタフイロコツカス アルブス Staphylococcus albus） ナイセリア ナイセリア メニンギチジス （Neisseria meningitidis） ナイセリア ゴノレア （Neisseria gonorrheac） 腸内菌

【表】 他の腸内菌

【表】 ヘモフイルス―ボーデテラグループ ヘモフイルス インフルエンザ、H.デユク
レイ （Hemophilus influenzae） （H.ducreyi） H.ヘモフイルス （H.hemophilus） H.オージプチクス （H.aegypticus） H.パラインアルエルザ （H.parainfluenzae） ボーデテラ ベルテユシス （Bordetella pertussis） パストイレラ パストイレラ ペスチス （Pasteurella pestis） パストイレラ ツラロイシス （Pasteurella tulareusis） ブルセラ ブルセラ メリテンシス （Brucella melitensis） ブルセラ アボルツス （Brucella abortus） ブルセラ スイス （Brucella suis） 胞子形成好気菌 バチルス アントラシス （Bacillus anthracis） バチルス サブチリス （Bacillus subtilis） バチルス メガテリウム （Bacillus megaterium） バチルス セレウス （Bacillus cereus） 胞子形成嫌気菌 クロストリジム ボツリヌム （Clostridium botulinum） クロストリジウム テタニ （Clostridium tetani） クロストリジウム ペルフリンゲンス （Clostridium perfringens） クロストリジウム ノビイ （Clostridium novyi） クロストリジウム セプチクム （Clostridium septicus） クロストリジウム ヒストリチクム （Clostridium histolyticum） クロストリジウム テルチウム （Clostridium tertium） クロストリジウム ビフエルメンタンス （Clostridium bifermertans） クロストリジウム スポロゲネス （Clostridium sporogenes） ミコバクテリア ミコバクテリウム ツベルクロシス ホミニ
ス （Mycobacterium tuberculosis hominis） ミコバクテリウム ボビス （Mycobacterium bovis） ミコバクテリウム アビウム （Mycobacterium avium） ミコバクテリウム レプラ （Mycobacterium leprae） ミコバクテリウム パラツベルクロシス （Mycobacterium paratuberculosis） 放線菌 真菌状バクテリア アクチノマイセス イスラエリ （Actinomyces israellii） アクチノマイセス ボビス （Actinomycec bovis） アクチノマイセス ナエスルンジ （Actinomyces naeslundii） ノカルジア アステロイデス （Nocardia asteroides） ノカルジア ブラシリエンシス （Nocardis brasiliensis） スピロヘータ トレポネマ パリデユム スピリルム ミヌ
ス （Treponema pallidum）（Spirillum
minus） トレポネマ ペルテヌエ ストレプトバチリ
ス モニリホルミス （Treponema pertenue）（Streptobacillus
monilifornis） トレポネマ カラテウム （Treponema carateum） ボレリア レクレンチス （Borrelia reunrrentis） レプトスピラ イクテロヘモラギア （Leptospira icterohemorrhagiae） レプトスピラ カニコラ （Leptospira canicola） ミコプラズマ ミコプラズマ ニユーモニア （Mycoplasma pneumoniae） 他の病原体 リステリア モノシトゲネス （Listeria monocytogenes） エリシプロトリクス ルシオパチア （Erysipelothrix rhusiopathiae） ストレプトバチルス モニリホルミス （Streptobacillus moniliformis） ドンバニア グラヌロマチス （Donvania granulomatis） バルトネラ バチリホルミス （Bartonella bacilliformis） リケツチ バクテリア状寄生虫 リケツチア プロバゼキ （Rickettsia prowazekii） リケツチア モーセリ （Rickettsia mooseri） リケツチア リケトシ （Rickettsia rickettsii） リケツチア コノリ （Rickettsia conori） リケツチア オーストラリス （Rickettsia australis） リケツチア シビリクス （Rickettsia sibiricus） リケツチア アカリ （Rickettsia akari） リケツチア ツツガムシ （Rickettsia tsutsugamushi） リケツチア ブルネチ （Rickettsia burnetii） リケツチア キンタナ （Rickettsia quintana） クラミデイア 未分類の寄生バクテリア／ウイルス クラミデイア微生物（名称不確定） （Chlomydia agents） 真 菌

【表】

【表】 ウイルス アデノウイルス 疱疹ウイルス ヘルペス シンプレツクス （Herpes simplex） バリセラ（チキン ボツクス） （Varicella（chicken pox） ヘルペス ゾスター（シングレス） （Herpes zoster）（Shingles） ウイルス Ｂ サイトメガロウイルス （Cytomegalovirus） 天然痘ウイルス バリオラ（スモールポツクス） （Variola（smallpox） バクシニア （Vaccinia） ポツクスウイルス ボビス （Poxvirus bovis） パラバクシニア （Paravaccinia） モルスクム コンタギオスム （Molluscum contagiosum） ピコルナウイルス（Piconavirus） ポリオウイフレス （Poliovirus） コクサツキーウイルス （Coxsackievirus） エコーウイルス （Echoviruses） ライノウイルス （Rhinoviruses） 粘液ウイルス インフルエンザ（Ａ，Ｂ，Ｃ） パラインフルエンザ（１―４） ムンプスウイルス （Mumps virus） ニユーキヤツスル 病 ウイルス （Newcastle Disease virus） ミースレス ウイルス （Measles virus） リンダーペスト ウイルス （Rinderdpest virus） カニネ ジステンペラ ウイルス （Canine Distemper Virus） レスピラトリ シンシチアル ウイルス （Respitory Syncytial Virus） ルベラ ウイルス （Rubella Virus） アルボウイルス（Arbovirus） イースタン エキン オイセフアリチス ウ
イルス （Eastern Epuine Eucephalitis Virus） ウエスタン エキン オイセフアリチス ウ
イルス （Western Equine Eucephalitis Virus） シンドビス ウイルス （Sindbis Virus） チクングンヤ ウイルス （Chikungunya Virus） センリキ ホレスト ウイルス （Semliki Forest Virus） マヨラ ウイルス （Mayora Virus） セントルイス エンセフアリチス ウイルス （ST.Louis Encephalitis Virus） カルホルニア エンセフアリチス ウイルス （California Encephalitis Virus） コロラド だに熱 ウイルス 黄熱ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス レオウイルス １―３型 （Reovirus） 肝炎ウイルス 肝炎ウイルスＡ型 肝炎ウイルスＢ型 腫瘍ウイルス ラオシヤー ロイケミア ウイルス （Rauscher Leukemia Virus） グロス ウイルス （Gross Virus） マロネイ ロイケミア ウイルス （Moloney Leukemia Virus） フレンド ロイケミア ウイルス （Friend Leukemia Virus） マウス ママリー腫瘍ウイルス （Mouse Mammary Tumor Virus） アビアン ロイコシス ウイルス （Avian Leucosis Virus） ロウス サルコマ ウイルス （Rous Sarcoma Virus） ポリオマ ウイルス （Polyoma Virus） シミアン ウイルス 40 （Simian Virus） パピロマ ウイルス （Papilloma Virus） 微生物からの調製物： ストレプトコツカス ピオゲネス；蛋白 （Streptococcus pyogenes） パステウレラ ペスチス；蛋白トキシン （Pasteurella pestis） クロストリジウム テタニ；トキソイド （Clostridium tetani） クロストリジウム ペルフリンゲス；α―レ
シチナーゼ （Clostridium perfringens） E.コリ；液 トレポネマ レイテリ；蛋白エキス （Treponema reiteri） コリネバクテリウム ジフテリア；トキシン
トキソイド （Corynebacterium diphtheriae） ミコバクテリウム ツベルクロシス；蛋白 （Mycobacterium tuberculosis） M.ツベルクロシス；細胞質 M.ツベルクロシス；培養液とツベルクリ
ン ミコプラズマ ニユーモニア；“粗”抗原 （Mycoplasma pneumoniae） さらに対象となる化合物は次式を有するものであ
る： Hap−Ｘ−Fl 〔式中ＸおよびF1は上記定義のとおりであ
り；Hapは分子量約125ないし1200で、しばし
ば、窒素原子、通常アミノまたはアミドから２な
いし３の脂肪族炭素原子によつて隔てられている
芳香族環（炭素環）を有するハプテン性の薬剤で
ある〕 特に、Hapの定義には次の基が含まれる： 上記各式中ａは０または１であり；Ｒは水素ま
たは炭素数１ないし３のアルコキシであり；Ａは
水素または結合であつて、他の結合といつしよに
なつて二重結合を形成し；φはフエニルである。 具体的な結合基はカルボキシメトキシイミノ、
アセチルグリシル、ブチリルグリシル、グリシ
ル、クロトニルグリシル、アセチル、クロトニ
ル、サクシニルおよびオキザリルである。 ほとんどの場合、リガンド類似体はリガンドの
水素を結合基への結合で置換するであろう。例え
ば、モルヒネについては、フエノール性ヒドロキ
シの水素はアセチル基のメチレンへの結合で置換
できる。結合基への結合で置換された水素は脂肪
族または芳香族のいずれかの炭素、酸素または窒
素に結合する。 いくつかの場合、オキソカルボニルはオキソカ
ルボニルをオキシンに転化することによつて結合
部位として役立つ。他の場合、カルボキシ基のヒ
ドロキシをエステルまたはアミドに置換して結合
基を形成できる。 さらに別のものはエーテルが形成できるヒドロ
キシ基、ジアゾ基が形成できるアミノ基等の他の
基を導入できる官能基を有するものである。 リガンド類似体についての重要な要件は抗体が
リガンドと確認できるほどにリガンドと構造が充
分類似していることである。 添加方法をいろいろ変えられるので、リガンド
とリガンド類似体の結合定数が異なつてもよい
が、10³の因数、好ましくは10²の因数よりも大き
く相違してはならない。 ほとんどの場合、リガンド類似体はリガンドと
その分子全体の大部分とまでいかなくともかなり
の部分について同一または実質的に同一の構造お
よび電荷分布（空間的構造および極性の構造）を
有するであろう。抗体の生産のための抗原を製造
する際のハプテンに対する結合部位は螢光体への
結合に使用されるものと同一であることが多いの
で、抗体への鋳型となるリガンド分子の同一の部
分が、螢光体に結合しているときのリガンド類似
体によつて明らかにされるであろう。 もう１つの抗体がリガンド類似体―螢光体へ結
合するのを妨げる１つの抗体が存在することによ
る立体障害のために、結合基は通常比較的短い。
通常、結合基は25Åよりかなり短く、もつと普通
には20Åより短く、好ましくは15Åより短い。通
常、結合基は約1.5〜10Åであろう。 ポリペプチドおよび蛋白質のようなリガンドと
しての大分子またはマクロ分子については、分子
の表面上に多数の異なるエピトープが得られ、そ
の１つずつに対応する抗体があろう。マクロ分子
が螢光体と結合している場合は、通常非常に多数
の螢光体分子が結合している。螢光体分子とエピ
トープとの空間的関係によつては、抗体のリガン
ドエピトープへの結合と抗体の螢光体への結合が
同時に生じるのを立体的に阻害できたりできなか
つたりする。しかし、通常、エピトープ部位と螢
光体分子の対が多数あり、これらの２つの異なる
抗体には種々の程度の立体的阻害が存在するであ
ろう。リガンド類似体―螢光体分子については、
立体的相互作用が適当に並列している多数のエピ
トープ―螢光体の対が存在する分子を包含するも
のとする。１つのエピトープと１つの螢光体を有
するもつと簡単な分子についても上記のマクロ分
子に存在するエピトープ―螢光体の対について説
明があてはまる。 螢光体を選択するには種々の考慮が払われる。
すでに述べたように、螢光体の選択はある程度リ
ガンドによつて支配される。したがつて、螢光体
は螢光を発するリガンドまたは抗体に結合した該
リガンドよりも長い波長を吸収するものと考慮す
る。 特定のリガンドを決定するに際しての考慮に加
えて、螢光体の選択にはさらに多くの考慮すべき
ことがある。実際的問題として、消光体結合体が
存在しない場合、抗螢光体抗体への結合あるいは
未結合にかかわらず発光スペクトルの変化に関心
があるので、特定の波長での発光強度に対する環
境からの影響が大きいことが望ましい。これは量
子収率のかなりの変化すなわち、結合螢光体から
未結合螢光体へ移行する発光あるいは吸収スペク
トルの変化の結果であるといえる。 蛋白質は約280ｍμの波長で吸収が生じるの
で、螢光体は300ｍμ以上、通常350ｍμ以上、好
ましくは400ｍμ以上で吸収極大を有しなければ
ならない。吸光係数は10よりはるかに大、好まし
くは10³より大、特に好ましくは10⁴より大でなけ
ればならない。 さらに、螢光体は大きなストークスシフトを有
することが望ましい。すなわち、螢光体の吸収極
大と発光極大との間の波長の差がかなりあること
が好ましい。 さらに、生理学的液体が関与する場合、螢光体
の蛋白質への非特異的結合が考慮される。好適螢
光体は非特異的結合が最小限であつて、主たるま
たは唯一の作用が螢光体の抗体への結合であるよ
うなものである。 多くの種々の螢光体が前出の論文、すなわち
StryerおよびBrandのものに記載されている。 上述の望ましい特性を多く有する螢光体の１群
はキサンテン色素であつて、３，６―ジヒドロキ
シ―９―フエニルキサントヒドロールから得られ
るフルオレセインおよび３，６―ジアミノ―９―
フエニルキサントヒドロールから得られるローザ
ミンおよびローダミンを含む。ローダミンとフル
オレセインは９―０―カルボキシフエニルキサン
トヒドロールの誘導体である。 これらの化合物は結合部位または結合できる官
能基として使用できるフエニル基に置換基を有す
るものが市販されている。たとえば、アミノおよ
びイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物
が市販されている。 もう１群の螢光性化合物はα位またはβ位；通
常α位にアミノ基を有するナフチルアミン類であ
る。これらのナフチルアミノ化合物は、１―ジメ
チルアミノナフチル―５―スルホネート、１―ア
ニリノ―８―ナフタレンスルホネートおよび２―
ｐ―トルイジニル―６―ナフタレンスルホネート
である。これらのナフタレン化合物は蛋白質に対
するいくつかの非特異的結合を有するので蛋白質
の量を最小限にした分析媒体中で使用する必要が
ある。 すでに述べたように、結合基は螢光体上に存在
する官能基またはリガンド類似体上に存在する官
能基から誘導される。螢光体またはリガンド類似
体のどちらかを修飾してこれら２つの化合物の間
に必要な結合を提供できる。 消光体は螢光体の発光帯域に重なる吸収帯域を
有するように選択された色素である。ここで螢光
体および消光体の発光帯域および吸収帯域という
場合、分析媒体中で観察され、分析媒体および蛋
白質に対する結合によつて影響を受ける場合の帯
域であつて、別の異なる環境において測定され報
告された帯域をいうのではない。消光体の受容
体、通常抗体への配分方法は螢光体をポリペプチ
ドへ配合する方法と同一である。通常、受容体の
分子量100000、もつと普通には75000につき少く
とも１つの消光体分子が存在し、受容体の分子量
1000、もつと普通には2000、好ましくは5000につ
き１以上の消光体分子が存在することはないであ
ろう。多くの色素が水溶性が低く、受容体を不溶
化するおそれがあるので主として溶解度を主とし
て考慮する。 受容体としての抗体には、通常約２ないし25、
もつと普通には２ないし20、好ましくは２ないし
16、もつと好ましくは４ないし16分子の消光体が
存在するであろう。フアブフラグメント
（Fabfragment）には通常１ないし16、もつと普
通には１ないし12分子の消光体が存在するであろ
う。 下記例はこの発明の説明のためのものであつ
て、この発明を限定するものではない。ただし温
度はセツ氏である。 例 ダンシル（dansyl）―BSA（牛血清アルブミ
ン）結合体の調製 シンチレーシヨンバイアルに10.0mlの0.1MPO₄
緩衝液（PH７）および500mgのBSA（7.8×10^-6モ
ル）（マイルスラボラトリーズ社製）を入れた。
次いで100mgの１―ジメチルアミノナフチル―５
―スルフリルクロリド（DANSC）（3.7×10^-4）
（日本の生化学工業株式会社製）を１mlのアセト
ンに溶解させて加えた。この混合物を施栓し、ア
ルミニウム箔で被い、渦動ミキサーの中央の穴に
置いて一晩低速度で振とうした。翌朝綿栓を通し
て過剰のDANSCを去した。液をセフアデツ
クスＧ―25の５×70cmカラムに通し、0.1MPO₄
（PH７）の緩衝液で流速50ml／時間で溶出して９
mlづつのフラクシヨンを集めた。フラクシヨンNo.
57ないしNo.76を集め（黄色ないし橙色）、ダウ
（Dow）中空繊維を通して限外過して濃縮し
た。この濃厚溶液は蛋白含量４mg／mlであつた。
この溶液を0.15MNaClに調節し、0.25μのミリポ
アフイルターを通して過することにより滅菌し
た。２mlずつの試料を滅菌バイアルに入れ注射剤
とした。 このダンシル―BSA結合体を紫外線分析し
て、340ｍμにおける吸収を認めたことにより
BSA上ダンシルが存在することを確認した。3.3
×10³の蛋白質上のダンシルついてのεの実験値
を使用して計算すると、この結合体のハプテン数
は13.5ダンシル／BSAであつた。 この結合体の螢光特性は簡単にしらべられた。
パラメーターは338ｍμにおける励起極大および
498ｍμにおける発光極大であつた。 インシユリン―ダンシル結合体の調製 ３mlの飽和NaHCO₃を含有するシンチレーシヨ
ンバイアルに16.7mg（2.9×10^-6モル）の豚のイ
ンシユリンを入れた。この溶液に１mlのジオキサ
ン中に溶解させた9.6mg（3.6×10^-5モル）の
DANSCを加えた。すぐ黄色沈澱が生じ、0.5mlの
ジオキサンを加えるとすぐ溶解した。0.5mlの水
を添加して非常にかすかな白色沈澱物（炭酸塩）
を溶解して透明にした。次いでこの溶液に施栓し
てアルミ箔で被い、渦動ミキサーの中央の穴に置
き一晩穏かに振とうした。翌朝この溶液を酢酸で
PH５に酸性化し、次いでセフアデツクスＧ―10の
2.5×30cmカラムに通し、0.2MHOAcで流速10
ml／時間で溶出した。フラクシヨン容量は1.6ml
であつた。４つのピークが見られた。第一のピー
ク（フラクシヨンNo.17―22）はダンシル―蛋白質
結合体に典型的な螢光発光および励起スペクトル
を示していた。 フルオレセイン―BSA結合体の調製 シンチレーシヨンバイアルに180mgのBSA（2.6
×10^-6モル）（ペンテツクス（Pentex）社製、結
晶）を180mgのK₂CO₃を含有する６mlの水に溶解
せしめたものを入れた。これに18.3mgのフルオレ
セインイソシオシアネート（FITC）（4.85×10^-5
モル）を加え、この混合物に施栓し、アルミ箔で
被い、渦動ミキサーの中央の穴に置き、室温で穏
やかに一晩振とうした。翌朝、反応混合物を
1NHClでPH４に酸性化し（重い沈澱が生じる）、
0.1NNaOHでPH８の塩基性にし、セフアデツクス
Ｇ―10の2.5×30cmカラムに通し、0.05M燐酸塩
緩衝液（PH8.0）で5.4ml／時間で溶出して0.9mlず
つのフラクシヨンを得た。フラクシヨンNo.43―72
をプールした。ハプテン数は493ｍμにおける結
合体の紫外線吸収および蛋白質結合フルオレセイ
ンの吸光係数7.2×10⁴から計算した結果、14.5で
あつた。 インシユリン―フルオレセイン結合体の調製 シンチレーシヨンバイアルに3.5mlの0.1M炭酸
塩緩衝液（PH9.2）および3.5mlの0.15MNaClに溶
解させた35.1mlの豚インシユリン（6.1×10^-6モ
ル）を入れた。この溶液に4.8mgのFITC（1.2×
10^-5モル）を添加し、このバイアルを施栓し、ア
ルミ箔で被い、渦動ミキサーの中央の穴に置き一
晩穏やかに振とうした。翌朝この混合物を1NHCl
を通気してPH３に酸性化しフルオレセインチオカ
ルバミルインシユリンを沈澱が溶解するまで
1NNaOHで塩基性とした。この橙色の溶液をセフ
アデツクスＧ―10の2.5×35cmカラムに通し、
0.05M燐酸塩緩衝液（PH7.4）および0.15MNaClで
溶出した。溶出速度は12ml／時間であつて、２ml
ずつのフラクシヨンを得た。フラクシヨンNo.24―
23が高度に螢光性であつたのでプールした。これ
らのフラクシヨンをあらかじめ0.05Mトリス緩衝
液（PH7.1）、7M尿素溶液、0.1MNaClで平衡化し
ておいたDEAEセフアデツクスの2.5×30cmカラ
ムに直接通した。この後、0.1Mないし1.0Mの直
線的な食塩の濃度勾配の食塩水500mlにより12
ml／時間の溶出速度で溶出して２mlずつのフラク
シヨンを得た。280ｍμで監視することにより、
最終（第４）ピークが完全に溶出されるまで塩濃
度を1.0Mに維持した。純度をCAM、トリス―バ
ルビタール緩衝液（PH8.8）上で電気泳動により
分析した。泳動を50分間125Vで続行し、ポンソ
―Ｓで染めた。すべてのスポツトが螢光性であつ
た。 モルヒネ―フルオレセイン結合体の調製 反応容器に２mlDMF中68.8mg（0.2ミリモル）
のO³―カルボキシメチルモルヒネを入れ、混合
物を−５℃に冷却し、26μ（0.2ミリモル）の
クロル蟻酸イソブチルを加えた。この混合物を次
いで45分間撹拌した。得られた溶液を0.05mlずつ
氷浴中で冷却した１mlのブタノール中36mgの４―
アミノフルオレセイン塩酸塩（シグマアイソマー
（Sigma isomer）．HCl）にゆつくり添加し
た。この混合物をそのまま90分静置した。 この反応混合物を直接予備薄層クロマトグラフ
イーにかけて、CHCl₃：MeOH：HOAcの75：
50：10の混合物で溶出した。クロマトグラフイー
を繰返した後、生成物をシリコンゲルから水酸化
ナトリウムのメタノール溶液で抽出した。メタノ
ールを蒸発させて、水を加え、得られた沈澱を徹
底的に洗つた。生成物を再び水酸化ナトリウムの
メタノール溶液に溶解し、水を加え、メタノール
を蒸発させ、PHをHClで8.0に調節し、所望の生
成物の溶液を得た。 チロキシン―フルオレセイン結合体の調製 反応容器に165mg（0.2ミリモル）のメチルチロ
キシン塩酸塩、８mlの蒸留したばかりのテトラヒ
ドロフラン（THF）および15mlの水性炭酸塩緩
衝液（PH9.2、0.1M）を入れた。窒素ガスで空気
を追い出した後、２mlのTHF：炭酸塩緩衝液
１：１の混合物中77.8mg（0.2ミリモル）のFITC
を撹拌しながら５分かけて加えた。7.8まで低下
していたPHを2NNaOHで９に調節した。 冷蔵庫で１晩貯蔵した後、混合物を20mlの酢酸
エチルと20mlの1NHClの混合物に注加した。各層
を分離し、水性層を20mlの酢酸エチルで１回洗
い、有機層をいつしよにした。有機層を30mlずつ
の1NHClで４回、200mlずつのブラインで２回洗
い、硫酸マグネシウムで乾燥し、揮発成分を真空
除去した。 さらに生成物を精製するために、10mgのシリカ
ゲルを使用し、展開剤として25容量％のジエチル
エーテルと75容量％のCH₂Cl₂との混合物95容量
％と氷酢酸５容量％を使用して予備薄層クロマト
グラフイーにかけた。中間の帯域を分離し、
THFで抽出し、溶媒を蒸発させて75mgの残渣を
得た。この残渣を上記と同じ溶媒系とシリカゲル
を使用して再びクロマトグラフイーにかけて55mg
の所望の生成物を得た。 ジフエニルヒダントイン―フルオレセイン結
合体の調製 窒素雰囲気下に乾燥DMF中１―カルボキシメ
チルジフエニルヒダントインの撹拌した溶液に、
１モル等量のSOCl₂を滴加した。溶液を一晩室温
で撹拌後、溶媒を真空除去し、１等量ずつのトリ
エチルアミンとフルオレセインアミンを乾燥
DMFに溶解したものを加え、この混合物を24時
間撹拌した。この溶媒を部分的に真空除去し、残
渣を予備薄層クロマトグラフイー（シリカゲル；
メタノールとクロロホルムの容量比１：１の混合
物）で精製した。速く移動する螢光体がジフエニ
ルヒダントインを示し、これから所望の生成物を
得た。 Ｎ―グリチルフルオレセインアミンとの結合 Ａ 50mlの酢酸エチル中で1.04ｇのフルオレセイ
ンアミンを懸濁し、１等量のクロルアセチルク
ロリドを加え、この混合物を無水条件下に４時
間再還流した。生成物が黄色固体として析出し
予備薄層クロマトグラフイー（シリカゲル；溶
媒系―HCCl₃とMeOHの容量比３：１の混合
物）で精製した。20mlのエタノール（無水）中
50mgのＮ―クロルアセチルフルオレセインアミ
ンの溶液をアンモニアで飽和させ、容器を密封
し、反応混合物を室温で48時間撹拌した。溶媒
を除去して所望の生成物を黄色固体として得
た。 Ｂ −10℃の0.5mlの乾燥DMF中所望のカルボン
酸(1)およびトリエチルアミン(2)の撹拌溶液にク
ロル蟻酸イソブチル(3)を加えた。0.5時間後、
乾燥DMF中過剰のＮ―グリシルフルオレセイ
ンアミンを加え、混合物を一晩撹拌し、溶媒を
真空除去した。この生成物を予備薄層クロマト
グラフイー（シリカゲル；溶媒系―HCCl₃と
MeOHの重量比１：１の混合物）によつて精製
し、速く移動する帯が螢光性化合物として興味
ある化合物であることがわかつた。

【表】 ローダミンの抗フルオレセイン抗体への結合 フルオレセインに対する抗血清１mlずつを50％
飽和硫酸アンモニウム液に対して沈澱させ、この
沈澱を１mlの0.1MK₂HPO₄に溶解し、同じ溶液に
対して透析して９mg／mlの濃度を有する溶液を得
た。反応容器に0.4ml（3.6mg）の抗（フルオレセ
イン）抗血清および0.17mlのグリセリンを入れ、
PHを9.5とし、100μのDMF中0.8mgのテトラメ
チルローダミンイソチオシアネートを加え室温で
撹拌した。３時間反応を続行した後、この溶液を
セフアデツクスLH―20カラム（0.9×15cm）に注
加し、抗（フルオレセイン）を１mlの溶液として
回収した。 この化合物の有用性を確認するために、下記分
析を行なつた。使用した機器のセルによつて異な
る結果が出るので、同じセルを使用した場合にの
み絶対値を比較することができた。使用した螢光
光度計はPerkin―Elmer MPF―2aであつた。螢
光体に対する抗体は通常の方法によつて調製し
た。牛血清アルブミン結合体を羊に注射し、適当
な時間の後、通常の方法によつて抗体を採取し
た。抗体を得るための典型的方法については、 Microbiology，Hober Medical Dirision，
Harper and Rowe，1969；Landsteiner，
Specificity of Seriological Reactions，Dover
Publications，New York，1962；Kabat，et
al，supra；and Williams，et，al，Methods in
Immunology and Immunochemistry，vol.1，
Academic Press，New York，1967。 使用された試薬は次のとおりである： FLUMO（フルオレセイン―モルヒネ 結合体、
例）３×10^-6M、水中；抗フルオレセイン抗
体、結合部位において5.6×10^-6M、0.05M燐酸塩
緩衝液でPH8.0とした水中；抗モルヒネ、結合部
位において２×10^-4M、0.05Mトリス―HCl緩衝
液でPH8.0とした生理塩水中；１の生理塩水当
り0.05MのトリスからなるPH8.0の緩衝液。アヘ
ン溶液はml当り1000μｇのコデインを含有してい
た。この溶液を緩衝液で最終濃度４mlまで希釈し
た。 上記機器の感度を４に合せてすべての測定を行
なつた。各溶液を下記表の左から右へ記載した順
に混合した。励起光は460nmであつて、放出光は
10nmの巾をもたせて516nmで読んだ。 下記表に結果を示した。

【表】

【表】 読みがあつても何の試薬も記載されていないも
のは、緩衝液のみがセル内に存在する。読み時間
は最初の読みから結果として報告されている読み
までの時間的間隔であつて、最初の読みは混合後
できるだけ早く行なつている。 これらの結果はコデインとフルオレセイン―モ
ルヒネとの間に何ら競合がない場合読みが比較的
安定していることを示している。セルNo.２はシグ
ナル強度が５分後に1.5単位、90分後に2.5単位変
化している。セルNo.４の結果は上記各抗体につい
て、大部分最初の５分で読みが変化し、残りの85
分間では0.5単位の変化があるだけであることを
示している。セルNo.１における結果はコデインを
上記２つの抗体の混合物に加えた場合の読みが実
質的に安定していることを示している。90分間に
わたつて0.5単位の変化があるにすぎない。最後
に、セルNo.３における結果はコデインとフルオレ
セイン―モルヒネの存在下に両方の抗体について
シグナル強度が90分間に6.5単位変化したことを
示している。 したがつて、フルオレセイン―モルヒネおよび
フルオレセインとモルヒネの両方に対する抗体の
混合物にコデインを導入すると螢光の検出可能な
変化がみられる。 さらに、例で調製されたインシユリン―フル
オレセイン結合体について研究した。 インシユリンについて研究の結果、モノ置換イ
ンシユリンのみが免疫的に活性であることがわか
つた。したがつて、モノ置換インシユリンのみを
分析に使用した。フルオレセイン―インシユリン
をPH8.0の0.05M燐酸塩緩衝液中１×10^-10Mの濃
度で使用した。使用した抗インシユリン溶液は結
合部位において１×10^-10Mであつた（マイル
ス・ラボラトリーズ製）。インシユリンをプラス
チツク容器中で２日にわたつて10^-9Mで平衡さ
せ、最終希釈物において所望の濃度を与える量を
使用した。このインシユリンは0.1M炭酸塩生理
塩水溶液中で使用した。フルオレセイン―インシ
ユリンを２×10^-10M貯蔵液とし、２日間PH8.0の
0.05M燐酸塩緩衝液中で平衡にした。フルオレセ
イン―インシユリン、インシユリンおよび抗イン
シユリンといつしよにし、水で希釈し、１時間イ
ンキユベートした。この時間の終りに、120μ
の抗フルオレセインをPH8.0の0.05M燐酸塩緩衝
液中結合部位において5.6×10^-8Mの濃度で加え
た。試薬の添加順序は下記表の左から右への順で
ある。室温でインキユベートした。フルオレセイ
ン―インシユリンを添加して室温で１時間第二の
インキユベートを行う前に37℃で１時間インシユ
リンと抗インシユリンをインキユベートできるよ
うに添加順を変化させた場合も結果はほとんど同
じであつた。上述と同じに螢光光度計をセツトし
た。下記表は種々の材料の使用量および発光スペ
クトルの変化を示している。

【表】 上記表は存在するインシユリンの量を増加させ
ることによつて、螢光の増加が見られた。 最後に、下記は消光体結合抗（フルオレセイ
ン）抗体、つまりローダミン結合抗（フルオレセ
イン）抗体を使用して得られた結果である。 分析を行うにあたつて、200μの緩衝液
（0.1MK₂HPO₄、PH7.8、0.05％NaN₃）をフルオレ
セイン／hIgG比14：１を有するフルオレセイン
結合hIgG（1.6×10^-9M）30μおよびあらかじ
め決めておいた量の抗（hIgG）といつしよに
し、混合物を室温で0.5時間インキユベートし
た。この時間の終りに、2.75mlの緩衝液を加え、
10倍希釈したローダミン結合抗（フルオレセイ
ン）抗体50μを加えた。次いで試料の螢光を読
んだ。下記表は2.4mg／mlの濃度で加えた抗
（hIgG）抗体の量を示している。

【表】 上記結果からローダミン結合抗（フルオレセイ
ン）抗体が螢光体に対する有効な消光体であるこ
とが明らかである。さらに、抗（hIgG）抗体の
量を増すと抗（フルオレセイン）抗体による消光
から螢光を保護する作用が強まる。 次の分析において、hIgGの濃度を変化させる
と限定された量の抗（hIgG）抗体に対してフル
オレセイン結合hIgGと競合させた。プロトコー
ルを使用してフルオレセイン結合hIgG（1.6×
10^-9M）100μ、種々の濃度のhIgG100μおよ
び約0.4mg／mlの濃度の抗（hIgG）抗体20μを
いつしよにした。この混合物を室温で0.5時間イ
ンキユベートし、27.5mlの上記緩衝液および50μ
の10倍希釈ローダミン結合抗（フルオレセイ
ン）抗体を添加し、混合物をさらに0.5時間イン
キユベートした。次いで0.5時間後に螢光を読ん
だ。下表はその結果を示している。 表 hIgG（Ｍ） 螢 光 ― 85，84 １×10^-7 10，９ １×10^-8 10，11 １×10^-9 59，63 １×10^-10 76，80 １×10^-11 82，87 hIgGが存在すると抗（hIgG）抗体と結合し、
フルオレセイン結合hIgGに結合できる抗
（hIgG）抗体が減少する。このように、hIgGが高
濃度のときは、フルオレセインは抗（hIgG）抗
体によつて保護されずにローダミン結合抗（フル
オレセイン）抗体によつて消光される。 上記の結果から少容量の非常に低濃度のリガン
ドでも分析できる場合には非常に鋭敏な分析法で
ある。適当な螢光体を選択することにより、高感
度と精密度が達成される。この方法は、約100な
いし1000の範囲の分子量を有する小さな薬物分
子、約500ないし何桁もの大きさの分子のポリペ
プチドおよび他の有機化合物のような広範囲のタ
イプのリガンドを分析できる。従来他の免疫分析
に使用されてきた技術、たとえば抗体の形成方
法、リガンドの螢光体への結合、および抗体のリ
ガンドおよび螢光体への結合を最適にする種々の
パラメータ等はこの分析法にも有用である。 分析を行う場合、あらかじめ決められたプロト
コールに従つて、最大の感度を与えるように選択
した相対的割合の試薬をキツトの形で提供するこ
とが特に有利である。試薬を組合せて提供するこ
とにより分析操作誤差を減少でき、被分析物の濃
度の変化に対して最良の反応をするように試薬の
比をあらかじめ決めることができる。これらの試
薬は凍結粉末あるいは水性濃縮液として、さらに
緩衝液、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤等を含有せ
しめて提供するのがよい。 この発明は例示または例によつて詳細に説明さ
れたが理解を助けるためであり、これに限定され
ることなく特定の変化および修正もこの発明の範
囲内にあることは明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料中のリガンドまたは抗リガンド抗体の存
   在を検出する方法において： 水性媒体中で (i) 試料、 (ii) リガンド類似体―螢光体であつて、該リガン
   ド類似体が該抗リガンド抗体によつて特異的に
   認識されうるものであり、該リガンド類似体と
   螢光体とが結合基によつて充分接近して結合さ
   れているのでリガンド類似体―螢光体への抗リ
   ガンド抗体および抗螢光体抗体の同時結合が立
   体的に阻止される上記リガンド類似体―螢光
   体、および (iii) リガンドの定量のための抗リガンド抗体、を
   いつしよにし、最後に (iv) 消光体結合抗螢光体抗体を加え； 次いで、少なくとも１つの波長において、この媒
   体からの螢光の強さを既知量のリガンドまたは抗
   リガンド抗体を含有する標準と比較しながら測定
   することからなる前記方法。 ２ 上記水性媒体のPHが６ないし９であり、リガ
   ンド類似体―螢光体の濃度が10^-4ないし10^-12Mで
   あり、該媒体の温度が約15ないし40℃である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 上記消光体結合抗螢光体抗体が平均２ないし
   25の消光体対抗螢光体抗体比を持つている特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ４ 上記リガンドがポリ（アミノ酸）である特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ５ 上記リガンドがアルカロイドである特許請求
   の範囲第２項記載の方法。 ６ 上記リガンドがステロイドである特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ７ 上記リガンドが合成薬剤である特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 ８ 上記螢光体がフルオレセインであり、上記消
   光体がローダミンである特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 ９ 試料中のリガンドまたは抗リガンド抗体の存
   在を検出するための試薬キツトであつて、リガン
   ド類似体―螢光体と消光体結合抗螢光体抗体とを
   検出の感度を最適にする相対割合で備えた前記試
   薬キツト。 １０ 抗リガンド抗体を備えた特許請求の範囲第
   ９項記載の試薬キツト。 １１ ローダミン結合抗フルオレセイン抗体。 １２ 上記螢光が上記螢光体に由来する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。