JPS5916863A - 哺乳類ｐｇｒｆ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトその他の補乳動物の下垂体の機能に影響を
与えるペプチドに関する。特に本発明は下垂体による成
長ホルモンの放出を促進するペプチドを目的とする。

１９５０年代初期から生理学者および臨床医は脳の視床
下部が腺下垂体のすべての分圧、機能を割肌するこ吉を
認識していた。そのｆｌｉｌＪ餌］は神経液性てあり、
視床下部の特殊な神経分泌ニューロンが特殊なポリペプ
チドを産生じ、それらのそれぞれの作用および役割は各
下垂体ホルモンの分泌を急激におよび長期的に誘発する
ものである。今日寸でに下垂体ホルモンである甲状腺刺
激ホルモンおよびプロラクチン（トリぜプチド　ＴＲＦ
）ＶｒＣ関して、下垂体性の生殖腺刺激ホルモンである
黄体形成ホルモンおよびＰ胞成熟ホルモン（デカペプチ
ドＬ／？　１−’、Ｌｌｌ−＃Ｊ、　Ｇ、１．Ｉｌｉ壕
だはＣ７，−１７Ｆ）に１νＩＪＬ−Ｃ１−ま／こ士＋
Ｊｆ体ホルモンであるβ−エンドルツイン（β−ｅｎ、
ｃｉｏγｐ　Ｉｌｉ　ｒ＋、）も・よひ副腎皮質刺激ホ
ルモン（４１アミノ酸ポリ被ブチ１−ＣＩｌｐ”）にＩ
Ｐ、１して（Ｊ視床下部性の放出因子の９、冒生か明ら
かにされている。さらに抑１１ｉ１１因子の特性も明ら
かにされた。すなわち視）末下部１生のノマトスタチン
（ｓｏｍａ−１ｏ　ｓ　ｔ　ａ、　ｔ　ｉ　ｎ、　）は
下垂体レベルて成長ホルモンの分泌を抑：１ｉ！Ｉする
。これらの視床下部性の放出因子およびノマトスタチン
は全合成１ｃより＋１１現きれ、天然「１゛ｑ潰物の同
族体か多４すｉ合成されており、それらのうちあるもの
は天然化合物よりもはるかに高い活性をもつ。

下垂体成長ホルモンＶＣ対応する視床下部性の放出因子
は、今日１てにその存在につき広範な生理学および臨床
的な証明か得られてはいるか、その時１隼（１明らかに
されていない。下垂体性生長ホルモンの放出因子（以下
ＧＲＦ）をｍスｆｌその竹１生を明らかにする際の主要
な問題は、視床下部の谷断片に活性被ブチドが微小量〔
５０〜１５０×１０〜１５モルであると考えられる〕存
在すると思われるこよである。これは他の視床下部性放
出因子についてこれ寸て算出されたいずれのものよりも
はる力・に少叶である。このことと５周（［１するのは
、視床下部性Ｇ　ＲＦが著しく高い効力をもつものであ
るという推論である。

視床下部性ＧＲＦの単離に際しての他の問題（ま、視床
下部抽出液中にきわめて大量の、′マドスタチンか存在
することであった。これはもちろん目的きする生物検定
のいずれをも阻害し、あるいは異常な結果を与えるてあ
ろう。この数年にわたって幾つかの研究所か視床下部性
ＧＲＦを単離し、その特性を明らかにしたさ主張した。

これらの主張はすべてその後文献著者らが認めたように
アーチノアクＮＣ関連するものであった（シャ’）　−
、／４゜Ｖ、Ｓ、ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ、ｅｍ、２
４６　　、　６６４７　　、１９７１；ベーベルＤ、Ｆ
、ら、１３ｉｏｃｌｂｅｍ、ＢｉｏｐｌＬ’ｌｓ、Ｒｅ
ｓ。

Ｃａｎｕｔｕｔｎ、４５　、２３５　、１９７１　）。

これらの誤った主張は、成長ホルモンの放出を評ｉ＋１
１ｉする際に採用する生物倹定か困難なものであること
により一用ニはｉ発明することかてきる。

下框体Ｖこよる成長ホルモン（ＧＪｉ）の放出を促進す
る残基４４閘のポリにブチトかヒト島細胞腫から単離さ
れ、Ａ′〃製され、その慣性か明らか１（され、合成さ
れ、試験された。このペプチドは下記の式％式％ （ これはＰＧＲＦ（ヒト膵性Ｇ　Ｉｃ、　Ｌ’　）である
と考えられ、以下Ｃのように呼ぶ。これはノマトクリニ
ン（ｓ　ｏ　ｒｎ、ａ　ｔ　ｏ　ｃ　ｒ　ｉ　ｎ　ｉ　
ｎ、　）とも呼ばれるてあろう。これと共に他の２種の
高純度波ブチドも単離された。これらはＧｌｉ放出ｌ占
性を示し、ＰＧ　ＲＦ’　（１−３７）遊離酸およびＰ
ＧＲＦｃｌ−４０）遊離酸である。

これらのペプチドは温血動物および水産養殖の冷血動物
の成長を促進するために用いることがてきる。

本発明による薬剤組成物には、桑削学的に受容てきる液
状せたは固体状のギヤリヤーに分散されたＰ　Ｇ　Ｉｅ
　Ｆ、その同族体もしくは生物１舌性をもつ所バ、才た
けこれらのいずれもの無毒性塩がａ寸れる。これらの薬
剤組成物は臨床医学（人類医学および獣医学双方）にお
いて診断または治療の目的て一時的゛ｆたは長期的な投
与に際して用いることかできる。

ペプチドを規定するために用いられる命名法は／ユレー
ダーおよびリュプケ著゛ベブチｌ−頌”（アカテミノク
・プレス（１９６５）Ｉｃより明確にされたものである
。ここては慣用の表現法に従ってＮ−末端を左側に表わ
し、Ｃ−末端を右側に示す。アミノ酸残基が異性体の形
をもつ場合、他に明記しない限り表わされているものは
そのアミノ酸のＬ型である。

本発明は次式 ％式％ （式中ｌ？はＯＩｆ　ｆたはＮ／）２、ｌ？３４はＳｅ
ｒ　またはＡ９ａ、、　／ビ＋８１＊’、　Ａｒ’／　
甘だはＳｅｒ、ｌｌ４ｏはＡＩ！ａ、ｉたはＡｒｇ、　
／１４＋はＡｒｇ、　Ａｒｇ　−Ａｅａ、　Ａｒｑ−Ａ
（４ａ−Ａｒｇ。

Ａｒｇ　−ＡＱａ　−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ、　’！たはｄ
ｅｓ−Ｒ４゜である）の（Ｉ′４造をもつ合成１）　Ｇ
　ＩＩ　／；’ペプチドを提供するものである。−まだ
本発明には、ＩｃかＯＨてあってもＮＨ２て、し）つて
もよい生物活性をもつ断片も含寸れと）。

これらの浸ブチトは適切な方法により、だ吉えげ全円（
１］法により、部分的固相法により、断片縮合法により
、古典的な溶液カップリングｅＫより、−１／こは近年
開発された組み換えＤＮＡ法により合成される４、たと
えば全円１’ｌＪ合成法は文献゛固相イブヂド合成°゛
（スチュ“ノートおよびヤング署、フリーマン社、ザン
ノランンスコ、１９６９年）Ｋ水べられており、米国特
許第４，１０５，６０３号（１９７８年８月８日、ペイ
ルらにイ・］与）明細書の記載により例示される。断片
縮合による合成法は米国特許第３，９７２，８５９号明
細肖（１９７６年８月３１ヨ）に例示されている。他に
用いられる合成法は米国特許第３，８４２，０６７号（
１９７４年、１０月１５日）および同第３，８６２，９
２５−号（１９７５年１月２８日）＠明細書（でより例
示される。組み換えＤＮＡ法を採用した合成ペプチドの
製造は大規模の商業的要求を満足させるために用いられ
るよってある。

カップリング型合成に一般的なことは、各種アミノ酸部
分の不安定な側鎖基金この部位で化学反応か起こるのを
肌面する適切な保護基によって、この基が最終的に除去
される丑で保護することである。同様に通常一般的であ
るのは、アミノ酸才たは断ハ上のα−アミノ基を保護し
、その間にこれかカルボキシル基において反応し、次い
てα−アミン保護基を選択的に除去してこの部位て次き
の反応が起こりうる状態にすることである。従つて合成
の一工程さして、ｄプチド鎖中に希望する順序で（Ｍ置
する各アミノ酸残基を酋−みかつ側釦保勲基か滴り）な
残基に結合した中間化合物を合成するこＬか一般に行わ
れる。

同様に本発明の範囲内にある吉考えられるものは次式の
中間体である。

Ｘ’　−Ｔｙｒ（Ｘ２）−Ａｅａ−ＡＳｐＣＸ”　”）
−Ａｅａ、−１１Ｊｅ−Ｐｈｅ−’Ｉ’ｌｒ、ｒ　（Ｘ
’　）　−Ａｓ　ｎ−Ｓ　ｅ　ｒｃＸ５）　−Ｔｙｒ　
（Ｘ２）−Ａｒｑ（Ｘ６）　−Ｌ、！／　ｓ　（Ｘ７）
−Ｖａ、ｅ−Ｌｅｗ−Ｇ（Ｊｙ　−Ｇｔ２ｎ、−Ｌｅｕ
−Ｓ　ｅｒ（、Ｙ　５）−Ａｅａ、　−Ａｒ　ｇ　（Ｘ
６）−Ｌｙｓ　（Ｘ７）　−Ｌｅｕ−Ｌｅ　ｔｔ−Ａｓ
　ｐ（Ｘｌ）−ＩｅＣ−Ｍｅ　ｔ−８ｅｒ（Ｘ５）−Ａ
ｒｇ（Ｘ６）−Ｇ（Ｊｎ−Ｇｅｎ−Ｇ（１’１−Ｇｉｚ
Ｌ（Ｘ３）−Ｒ３４（Ｘ５）−Ａｓｎ−Ｇｅｎ−ＧＲｕ
ＣＸ”）−Ｒ３ｓ（Ｘ”ｏｒ　Ｘ６）−Ｇｅ’／−Ｒ４
ｏ　（λ”　）−ＡｒｑＣＸ６）−Ａｅａ、−／１ｒｑ
（Ｘ’）−Ｚ、ｅｚｌ、−Ｘｇ上記式中Ｘ１は水素原子
またはα−アミノ基保護基である。Ｘ’　Ｋより意図さ
れるα−アミノ基保護基はポリ波ブチドの段階的合成の
分野て有用であることか知られているものである。ｘ’
　ｖｃ＠−すれる（χ−アミノ基保護基には下記のもの
がある。

（１）　　アシル型保獲基、たとえばホルミル基、トリ
フルオルアーセナル基、フタリル基、トルエンスルホニ
ル基（Ｔｏｓ）、ベンゼンスルホニル基、ニトロフェニ
ルスルフェニル基、ｌ−リチルスルフェニルｉ　　ｏ−
二ｌ・ロフエノキシアセチル基、クロルアセチル基、ア
セチル基およびｒ−クロルブチリル基、（２）芳香族ウ
レタン型保護基、たきえげベンジルオキシカルボニル基
（Ｚ）、および置換されたＺ、／ヒ吉ｔｆ４　ｐ−クロ
ルベンジルオキンカルホニル基、ｐ−ニトロヘンシルオ
キシカルボニル基、ｐ−プロムベンジルオキン力ルボニ
ルＡＩＤ、　　ｐ−７トギシベンジルオキシカルボニル
基、　（３）　　脂ｆＬ！ｊ　ＪＡＭ’ウレタン・保護
基、たさえげｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）
、ジイノブロビルメチルオキンカルホ゛ニル基、イノプ
ロビルオキンカルボニル基、エトキシカルボニル基、ア
リルオキシカルボニル基、（４）　　ンクロアルキルウ
レタン型保護基、たと工ばンクロペンチルオキシカルホ
゛ニル基、アダマンチルオキシカルボニル基およびシク
ロへキシルオキシカルボニル基、（５）　　チオウレタ
ン型保護基、たとえばフェニルチオカルボニル基、（６
）アルキルｌξＩＪ保１語基、たとえば１−リフエ：−
ルメチル基（トリチル茫）、ベンジル基、（７）　　ｌ
・リアルキルンラン基／こさえｌ−ｊ”ｌ・リノブルン
ラン。々了寸しいα−アミノ基保護基はＢＯＣである。

Ｘ２はＴｙｒのフェノール件水酸基のための保１獲ノル
てあり、テトラヒドロピラニル 基、トリチル基、ＢｚＡ、ＣＢＺ、４Ｉイｒ−ＣＢＺお
よび２，６−ジクロルベンジル基よりなる群から選ばれ
る。好せしい保護基は２，６−ジクロルベンジル基であ
る。Ｘ２（１水酸基てあってもよい。これは水酸基に保
護暴かないこさを意味する。

Ｘｌは水素原子、−まだはＡｓｐもしくはＧ（ｈｔ．の
カルボギ／ル基のだめのエステル形成型保護基てあり、
８２８、２，６−ジクロルベンジル基、メチル基および
エチル基よりなる群から選ばれる。

Ｘ″１および，Ｙ５は７“ｈ．ｒおよびＳｅｒの水酸基
のだめの保護基てあり、−アセチル基、ベンゾイル基、
ｔ−グチル基、トリチル基、テトラヒドロピラニル基、
１）２９、２，６−ジクロルベンジル基およびＣ　１３
　Ｚよりなる群から選ばれる。好ましい保護基はＢｚＲ
である。Ｘ４および／−ｉたはＸ５は水素原子てあって
もよい。これは水酸基に保護基がないことを意味する。

Ｘ６はＡ７“ｑのクアニジノ基のだめの保護基てあり、
二１・口塞、Ｔｏｓ，　　ＣＢＺ，アダマンチルオキシ
カルボニル基およびＢＯＣよりなる群から選ばれるか、
あるいは水素原子である。

Ｘ７は水素原子寸たはＬｙｓの側鎖アミノ置換基のだめ
の保護基である。適切な側鎖アミン基保護基の具体例は
２−クロルベンジルオキシカルボニル基（　２　−　Ｃ
Ｉ！−Ｚ）、Ｔｏｓ，　ＣＢＺ，　ｔ　−　７ミルオキ
、シ′カルボニル基および１３　０　Ｃである。

ｌｊｌｌ鎖アミノ基保護基の選択は厳密なものではない
か、たたし合成に際してα−アミノ基の脱保Ｊ中て除去
されないものでなければならない。従ってαーアミノ基
保ｄφ基および側鎖アミノ基保獲基は同一てはあり得な
い。

Ｘ８は０１Ｊ、ＯＣＩｉ３、エステル基、アミド基、ヒ
Ｖーｙンド基、−　０　−　ＣＩ−１２−樹脂系支持体
および一ＮＨ−樹脂系支持体よりなる群から選ばれ、Ｏ
ｌｉおよびアミド以外の基は広７’？　Ｖ（−は保護基
と考えられる。

中間体の式１・ておいてＸ’、Ｘ２、Ａ′３、Ｘ４、Ｘ
５、Ｘ６、Ｘ７およ０・Ｘ８の−）も少なくとも１つは
保護基である。・ ペヅチドの合成に用いられ６特定の側鎖保護基を選択す
る際には、下記の規準に従う。（ａ、）　　保護基は合
成の各段階においてα−１ミノ基保護基を除去するだめ
に選（ばれる試薬に対し同条件下て安定てなけれげｌら
ない。（ｂ）　　保護基はカップリング反応条件下てそ
の保護特性を保持しなければならず、同条件下て離脱し
て（１ならない。（ｃ）　　側鎖保護基は希望するアミ
ノ酸配列を含む合成か終ｒし／こ時点て、ペプチド鎖を
変化させない条件下において除去されなければならない
。

被ブチドはメリノイールＭ　（Ｊ、Ａｍ、、ＣｈＣｒｎ
、Ｓｏｃ、。

８５．２１４９（１９６３）〕により阿口述されるよう
に、同相合成法を用いて製造されることが好ましい。た
だしＡｉｌ記のように当業界て知られている他の４目当
する化学合成法も用い勺ことかできる。

固相合成はぜプチドのＣ−末節、１から、保護されたα
−アミノ酸を適１：ＪＪな樹脂にカップリングさせるこ
とにより行われる。この種の出発物質は（Ｘ−アミン基
を１呆獲されたＬｅｕもしくはＡｅａ、　ｆニスデル結
合によりクロルメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル
樹脂に結合させるか、寸たはアミド結合によりＢＨＡ樹
脂もしくはＭＢＩｉＡ樹脂に結合させるこ（！：によっ
て製造することかてきる。ヒドロキノメチル樹脂の製造
について（１，ツビダンスキーら〔ＣＩｔｅｍ、、Ｉｎ
ｄ（ｏンドン）３８．１５９７−９８（１９に　６　）
　］により記述されている。クロルメチル化樹脂はバイ
オ・ラド・ラホラトリー＝ズネニ１（）ｌリフオルニア
州リノチモンド）およびラボーンステムズ社力・ら市販
されている。この種の樹脂の製造についてはスチュワー
トらにより°゛固相啄フｆ　Ｍ　合成“（フリーマン社
、ザンフランノスフ、１９６９年）、第１章、１〜６負
に記載されている。１３　ＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂系支
持体は市販されており、合成される目的ポリペプチドか
Ｃ−末端にα−カルボキシアミド基をもつ場合にのみ一
般に用いられる。

アミノ酸４０個の被ブチドを合成することを希望する場
合、１３　Ｑ　ＣＶｃより保、獲σれたＡｈａをモナー
ンおよびギロンのパイオポリマーズ、１２゜２５．１３
−２５］、９（１９７３）の方ｆ去に従ってクロルメチ
ル化樹脂にカップリングさせる。支持体恒１脂Ｋ　Ｂ　
ＯＣ−／ｌｅａ、をカッシリングさせたのち、たとえば
塩化メチレン中のトリノルオル西′１酸（７’＃’／ｌ
）、ＴＦＡｉ）１独′１／Ｃはジオギザン中のｌｌＣβ
を用いるこさによりα−−１ミノ基保護基を除去する。

脱保護反応はほぼ０゛Ｃから室温１ての１品度て行われ
る。７ユレーダーおよびリュブク著“又ブチド“Ｉ、７
２〜７５頁（アカテミノク・プレス社、１９６５年）に
記載されるように、特ボの（χ−アミノ基保護基を除去
するだめの他の標準的な脱離試薬および条件を用いるこ
とかできる。

ＡＩ２σのα−アミノ基保護基を除去したのち、残りの
（Ｘ−アミン基および１ｔｔｌｌ鎖を、保護されたアミ
ノ酸を希望する順に段階的にカップリングさせ、前記の
中間ｒヒ合物を得るか、あるいは合成に際し各アミノ酸
を別個に添カロする代わりにこれらのうち幾つかを同・
相反名器に添加することかできる。適切なカップリング
試薬を選択することは当技術分封に含１れる。カップリ
ング試薬として％に適切なものはＮ、Ｎ’−ノック口へ
キ／ルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）である。

梗プチトの同１相合成に用いられる活性化試薬はぜブチ
ド技術において周知である。適切な活性化試薬の例は下
記のものである。（１）　　カルボジイミド、たとえば
Ｎ、Ｎ−ジイノブロビル力ルホジイミド、Ｎ−エチル−
＃’−（３−ジメチルアミンプロピル）カルボジイミド
、（２）７アナミトたとえばＮ、Ｎ−ンベンジルンアナ
ミド、（３）　　り−ディミン、（４）イノキサゾリウ
ム塩、たとえばＮ−エチル−５−フェニルイノキサゾリ
ウム−３７−スルホネー１・、（５）項中に１〜４個の
炭素原子を含有し、芳香族の特性をもつ単環式の窒素含
有複素環式アミ　ド、たとえばイミダゾリド、ピラノ゛
リドおよび１　、２　、４−　）　’Ｊアゾリド；有用
な特定の複素環式アミドには、ｌＶ、＃’−カルホ゛ニ
ルジイミダゾール、Ｎ　、　Ｎ’−カルボニル−ジー１
　、２　、４−１−リアノ゛−ルが含寸れる、（６）　
　アルコキノ化アセチレン、／コトえばＩ　）キシアー
ヒチレン、（７）　　アミノ酸のカルボギノル部分と混
合無水物を形成する試薬、たとえばクロル蟻酸エチルお
よびクロル蟻酸イノブチル、ならびニ（８）　　アミノ
酸のｊ）ルボキンル部を上と活性エステルを形成する試
薬、プことえ（づ１個の環窒素原子］二に水酸基金もつ
窒累含有イリ素環式化合物たとえばＮ−ヒドロキノフタ
ルイミド、Ｎ−ヒドロキンスク７ンイミドおよび１−ヒ
トロキ７ベンノ゛トリアノ゛−ル（ｌｌＯＢＴ）。啄ブ
チドのカッブリンク°における他の活性化試薬およびそ
れらの１更用について（沫／コーレーダーおよびリコー
プケによりＡｊｊ’−１１３の文献、１１１章に、およ
びカブール（Ｋａｐｏｏｒ）によりＪ、Ｐｈ、ａｒ、Ｓ
Ｃｉ、、５９　、１−２？　（１９７０）に記述されて
いる。

保穫烙れた各アミノ酸またはアミノ酸配列を約２倍寸だ
はそれ以上過剰に固（１脂反応器に導入し、ジｙ’　チ
ル＊ルム７　ミド（ＤＭＦ）：　ＣＨ２ｃｅ２（１：１
）の媒体中で、１だはＤＭＦもしくはＣｆ４２Ｃβ２単
独の中てカップリング反応を行うことができる。不完全
なカップリング反応が起こった場合、次さ○アミノ酸の
カップリングを行うＡｔ工”Ｋ−１α−アミノ基保護基
の除去前に上記のカップリング操作を繰り返す。合成の
各段階（でおけるカップリング反応の成功は、Ｅ、カイ
ザーらＣＡｎ、ｎ、１．Ｂｉｎｃｈ、ｅｍ、　。

３４．５９５（１９７０））により記述されているよう
にニンヒドリン反応によって監視される。

希望するアミノ酸配列が終了したのち、樹脂からペプチ
ドを離脱させるたけてなく残存するすへての側鎖保護基
ｘ’、ｘ”、ｘ九ｘ５．　ｘ６．　ｘ７およびＸ８１ら
ひにα−アミノ基保獲基Ｘ１　をも離脱略せる試薬（た
とえば液体７）化水素）で処理するこ吉により、支持体
位１脂から中間体ペプチドを分離し、摂ブチドを得る。

代替経路として、アルコーリシスにより支持体位１脂か
ら中間体ペプチドを分離し、得られたＣ−末端アルキル
エステルをその後加水分＊ｌ［より酸に変えることもで
きる。次いていずれの側鎖保護基をも前記の方法または
他の既知の方法、たとえげ接触礒冗（たとえＩｔ：ＩＢ
ａ　Ｓ　（Ｊ４　　十のＰｄ］Ｃより離脱させることか
てきる。脱嬉１のためにフッ化水素を用いる場合Ｌｔ、
脱除のだめにア二ノ−ルおよび４ｉｆｉ化メチルエチル
を反応器に装入することかできる。

−１・記の具体例は固イ［］法により／’　Ｃｚ　Ｉｅ
　ｆｉ’　ｉ、合成するための好寸しい方法を示し／こ
もの−Ｃある。もちろんτｊ応するよりケ・１メかいペ
プチド１す１片の合成は同じ方法で、ｒ４’＋−Ｋ　泌
のいずれかの１．！ｉＡ　ｌ、ておいて必要な数のアミ
ノ酸を除去することＶこより行われること（」理＋Ｗｔ
−Ｊれるてあろう。しかし、生物活性をもつ断片（４Ｎ
−末ψ１゛ンにここ（・て示した（４列を含むべきであ
る古現在は考えられる。

例　　　Ｉ Ｊ、ｌ　−Ｔｙｒ−Ａｅａ、−Ａ、５ｐ−Ａｔ：！ａ　
−ｆｅｅ　−Ｐｈ　ｅ−’Ｊ’ｈ、ｒ−Ａｓ　ｒｔ−８
ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−’Ｖ祿−Ｌｇｕ−Ｇｅ
’／−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−ＡＩＪａ、−Ａｒｇ−
Ｌ３／５−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｇｇｎ、、−Ａｓｐ−１１
！ｅ−Ａｆｅｔ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ／！ｎ−Ｇｇｎ−
Ｇ（１’１−Ｇｔｈｔ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｅｎ−Ｇｅ
ｕ、−Ａ−ｒｇ−Ｇｅ’／−ＡＩＪａ−Ａｒｇ−Ａｔｌ
ａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ 北記代の構造をもつ１）　Ｇ　／ビ、１−″（１−４４
）遊ｉ’ｉｌ酸の合成を、ベックマン社９９０型ペプチ
ド合成器ヲ用いてクロルメチル化・獣脂（ラホ・ンスデ
ムズ社からイ４ｉ　Ｉ−ｒｔＬＺ”＋　０．９　Ａ４ａ
ｇＣｇ／Ｍ　ｋ含イ１するもの）−にで段階的にｒｌつ
だ。樹脂へのＢＯ′ＣＬｅｕ　　のカンプリンクはモナ
ーンら（でより“′バイ侶ボリマーズ“′１２（１９７
３）、２５１３〜２５　Ｌ　９１ｃ示された一般法Ｖこ
より行われ、これ１（より樹脂１９ｔｌ′ｒＣつ〜約０
．２２ミリモルのＬｅｕ、か１買換され／こ。１Ｊｊｆ
、　）／こ浴剤はすべて不活性ガス（好丑しく（コー＼
リウム）ゲ噴入することにより注意深く脱カスされ、１
ｖｆｅｔ残基のイオウ原子を不本意ＶＣ酸化す６「」Ｊ
面性のある酸素の不在を確実なものにした。

脱保護本および中和ののち、滅ブチ１−釦を樹脂上に段
階的に形成をせた。脱保護基、中和、および谷アミノ酸
の添加は一般に米国特許／；ｇ３，９０４゜５９４号明
細肖、（ギレミンら）に詳述されろ方法に従って行われ
た。カンブリングは詳ポ１１１には下記の表に従って行
われた。

１　　ＣＩＪ？Ｃｅ２洗Ｓ）　（２回）　　　　　　　
　　０．５４　　ＣＪＩ２ＣＩ！２先θ（３回）０．５
５　　Ｃ１１３０１１洗浄（２回）０．５７　Ｃｌ１３
（刀Ｊ洗浄（２回）０．５９　　Ｃノ１３０１１洗ｇ＋
（２回）　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５１
　０　　　ＣＨ２Ｃ１ｈ　Ｙ先ｇ＋（２回）０．５１２
　　Ｃ１１２Ｃ召２（ｋ、浄（１回）０．５１３　５０
％ジ）ｆルホルム７ミドＣＣＩ−ｂｃｅｚ中）０．５先
争（２回） １５Ｃ１ｉ３θＩ−１洗浄（２回）０．５１６　　ＣＴ
ｏ　Ｃ１ｈ　洗浄（２回）０．５１８　　ＣＨ２ＣＣ２
（ｋ浄（２回）ｏ、５１９　　ＣＨｓＯＩＩ先浄（２回
）０．５米　ＡｓＩ？およびＧＱｎＯカップリングのた
めにはこの工程に１．１３６モル過剰の１−ヒドロギシ
ベンゾトリアノ゛−ルＣｌｌ０Ｂｔ）を装入した。

要約すると、カップリンク°反応のだめには樹脂１ｇに
つき塩化メチレン中のＢＯＣ−保睡アミノ酸１ミリモル
、および１豆化メチレン中の０．５Ａ／・ＤＣＣＩもし
くは塩化メチレン中の３０％ＤＡ４Ｆ１当量を２時間１
吏用した。Ａｒｇをカップリングさせる場合は、１０％
ＤＭＦおよび塩化メチレンの混合物を用いた。Ｓｅｒお
よびＴｈ、ｒの側鎖水酸基の保護基としてはＢｚ（ｌを
使用した。ｚ、ｙｓｏＩＩＩ鎖の保護基としては２−ク
ロル−ベンジルオキシカルボニル（２Ｃｅ−Ｚ）を用い
た。Ａｒｇのグアニジノ基を１呆、漁スルだメＦ　Ｌｔ
　’ｊ’ａ　ｓ　’７　ＬｔＪ　イ、に　Ｑ　？／、お
よびＡｓｐ（Ｄカルボギンル基はＢｚｅエステルとして
保護された。

’Ｉ’ｙｒのフェノール性水酸基は２．６−ジクロルベ
ンジル基により保穫された。合成、終了時に、下記の組
成物か得られた。

Ｘ　’−Ｔｙｒ（Ｎ２）　−Ａｅａ、−Ａｓ　ｐ　（Ｘ
′）−ＡＱａ、　−１ｅ　ｅ　−Ｐｈｅ　−Ｔｈ、ｒ（
Ｘ’　）−Ａ、ｑ　ｎ、−８ｅｒ（Ｘ　５）　−７’ｙ
　ｒ（Ｘ’　）−Ａｒ　ｑ（Ｎ６）−Ｌｙ　、９（Ｘ　
７）　−Ｖａ、０−Ｌｅｕ−Ｇｅ’／−Ｇ９ｎ、−Ｌｅ
ｕ、−８ｅｒ　（Ｘ　５）−４１≧１ＣＬ−Ａｒ　ｇ　
（Ｎ６）　−Ｌ’／　ｓ　（、！Ｙ７）−Ｌｅ　ｗ−Ｌ
ｅｕ−Ｇ（Ｊｒ＋、−Ａｓ　ｐｃＸ”　）　−１（！ｅ
−Ａ４ｅｔ−８ｃｒ（Ｎ５）−Ａｒｇ（Ｘ”）−Ｇｅｎ
、−Ｇｌｌｎ−Ｇｌ’／−Ｇｌｌｕ（Ｘ”　）−３ｅｒ
（Ｎ５）−Ａｓｎ、−Ｇｅｎ−ＧＱｕ（Ｎ３）−Ａｒｑ
ＣＸ６）　−Ｇｌｌｙ−Ａ（２ａ　−Ａｒ　ｇ（Ｎ６）
−Ａｅａ−Ａｒ　ｇ　ＣＸ’　）−Ｌｅ　ｕ、−８ 上記式中Ｘ１は１３０Ｃ，Ｘ”は２，６−ンクロルベン
ジル％、ｘ３はベンジルエステル、Ｎ４　は）Ｊｚｅ、
　Ｎ５はＢｚ（１，Ｘ’はｉ’ｏｓ、　Ｎ７は２Ｃｅ−
Ｚオヨｏ：ｘ８＋１−ｏ−ｃｔｉ２−ヘンセン−ポリス
チレン樹脂系支持体である。

１′ケ後の７“ｙｒ残基が樹脂にカップリングしたのち
、Ｃｆ１２Ｃ（１２中（Ｄ４５％ｉ’ＦＡてＢＯＣ基を
除去した。

得られた保穫されたにプチド鎖を分離し、保護基を除去
するため、これをペプチド鎖１ｇにつきアニノールｌ、
５＋ｕｇ、硫化メチルエチル０．２５ｍ１およびフッ化
水素Ｃ１Ｃ１１Ｆ）１０！て一２０’ＣＩＣおいて腎時
間、およびｏ′Ｇにおいて１４時間処理した。高度の真
空下でＩｉＦを除去したのち、残存ずろ樹脂−ペプチド
を乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホンレムで交互に
洗浄し、次いてペプチドを脱ガスした２Ｎｔ＋’＋酸水
溶液で抽出した。酢酸抽出液の凍結乾燥により、白色の
綿毛状物質が得られた。

分離され、保護基を除去されたこのペプチドをθ（いて
３０％酢酸に溶解し、セフーアデノクスＧ−５０微細ゲ
ル濾過［（かけた。

次いて０．０１　ｈｆ−Ｎ１１４０Ａｃ　（ｐｌｉ　４
．５　）　４　Ｕ　Ｏｍｌを含有する混合フラスコに０
．４　Ａ／−ＮＨ４０Ａｃ（ｐＨ６，５）　１βを浦Ｊ
下することにより形成された凹形密度勾配を用いてＣＭ
−３２力ルボギノメチルセルロース（ワットマン社製）
陽イオン交換クロマトダラフイー（１，８Ｘ　１８ｃｍ
、　　Ｖｂｅｄ＝　５　Ｏｍｌ　）　Ｉｃよってペプチ
ドをさらに精製した。最終梢製はセファデックスＧ−５
０微細支持体（ファル−ｖシフ社製）ヒて＃量刑系とし
てｎＢｕ、０１／　：　ＥＩＯＩ？ピリジン°０．２％
Ｎ　　ＨＯＡｃ　（４°１：１ニア）を用いる分配りＩ
クー２トダラフイー１でより行われた。

オ′１１１製の詳細は一般１′こリンクらによりＢ７：
ｏｃｌｔｅｍ、。

１）ｉｏｙＩ＋、ｙ、ｑ、／Ｉ！ａ’ｓ、Ｃｏ咽７！フ
７．．，９５．９４５（１９８０）に示されている。ク
ロマトダラフイ−の両分はＴＬＣ＋でより注意探り１．
ζ３視され、実質的な純度を示す両分のみを集めた。

アミノ酸分析は加水分解ののち密閉した試１倹管中てＡ
ｕｕ、１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１２６　、１４４−１５
６（１９８２）に記載した方法を採用し、正確な配列が
得られたことを調へ゛るためリクイマート社１１１型ア
ミノ酸分４ノｉ器を用いて行われ、下記の結果をイ丑た
。

Ａｓｚ（３，６２）、ｉ’ｈ、ｒ　（０，７５）、Ｓｅ
ｒ　（３，５）、ＧＡ！ｘ　（６，８３）、Ｇｅ’／　
（２，８７）　、Ａｉ”ａ（５，１０）、Ｖａｅ（０，
９）、Ａ４ｅｔ　（１，２３）、Ｈ！ｅ　（１，８４）
、Ｌｅｕ、　（５，０４５）　　、　　７’ｙｒ　　（
２，０９）　、ｌノｈｅＣＯ，９１）　、Ｌｙｓ　（２
，３１）、およびＡフ・（７（６，６１）分析によって
配列の正しいごとが６′在認された。

例　　　２ １１−Ｔｙｒ−Ａｅａ−Ａｓｐ−Ａｅａ−１ｅｅ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｈｅ−１’ｌｒ、ｒ−Ａｓｎ−８ａｒ−Ｔｙｒ−
Ａｒｑ−Ｌ’１ｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｅ’１−Ｇｔ２
ａ−Ｌｅｕ、−３ｅｒ−Ａｅａ、−Ａｒｇ−Ｌ’／５−
Ｌｅｕ−Ｌｅｖｂ−Ｇｅｒｔ−Ａｓｐ−１ｅｅ−Ａｌｅ
　ｔ−Ｓ　ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ（ｈｔ−Ｇ（！ｎ−Ｇに！
’／−Ｇｅｕ−８ｅｒ−７’Ｈｓｎ−Ｇｅｔ＋、−Ｇｅ
ｗ−Ａｒｇ−Ｇｅ’／−Ａｅａ−０１１ｉｓ上記弐の構
造をもつＰＧＲＦ（１−４０）の合成をベックマン社９
９０型にブチド合成器を用いて例１に記載した方法によ
りクロルメチル化樹脂上て段階的に行った。ＴＬＣおよ
びＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いてこのペプチドは実質的に純
粋−Ｃあると判定された。

正しい配列が得られたことを調べるため、力１」水分解
ののちアミノ酸分析を行い、下記の結果を得た。

Ａｓｘ　（３，８９）、Ｔｈｒ　（０，８８）　、５ｅ
ｒＣ３，６６）、Ｇｅｘ　（７，０４）、Ｇｅｙ　（３
，０７）、Ａｈａ（４，０２）、ＶｃｔＲ（０，９６）
、Ｉｖｌｅｔ　（１，０１）、ｌｅｅ　（１，８６）、
Ｌｅｕ　（４，２８）、Ｔ’／ｒ　（２，０）、Ｐｈｅ
　（０，８６）、Ｌｙｓ　（２，２４，）、およびＡｒ
ｇ　（４，１５）。

分析により配列の正しいことか確認された。

例　　　２Ａ ／／　−Ｔ’ｌ　ｒ−Ａｅａ、−Ａｓ　ｐ−Ａｅａ−１
ｅｅ−１’ｌｔ、ａ−Ｔｈｒ−Ａｓ　ｎ−８ｅｒ−Ｔｙ
　ｒ　−Ａｒｇ−Ｌｙ　ｓ　−１１ａ、　ｌ　−Ｌ（！
　ｗ−Ｇｅ’／　−Ｇｅ　ｎ、−Ｌｅ　ｗ−８ｅ　ｒ　
−ＡＩ！（Ｌ−Ａｊｏａ−Ｌｙｓ−ＬＣｕ−Ｌｅｕ、−
Ｇ（２ａ−Ａｓｐ−１（ｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
−Ｇ（！ｎ−Ｇ　ｅｎ、−ＧＯ’／−Ｇ（２７ｔ−８ｅ
ｒ−Ｑ／ｉ　　ｉ、ｑｃｏルｄｕ、ｃｔｅｄ 」−和式の構造をもつＰＣＩＩＦＣｌ−３４）遊離酸の
合成を、ベックマン社９９０型ペプチド合成器を用いて
例１に記載した方法によりクロルメチル化ｌｌ７ｊ脂ヒ
て段階的に行つ／こ。ｉ’　ＬＣ；および１−Ｊ　／’
　Ｌ　Ｃを用いてこのペプチドは実質的に純粋であると
判ボされた。

正しい配列が得られたことを調べるため加水分）リイの
のちアミノ酸分析を行い、下記の結果を得た。

Ａｓｘ　（２，８７）、Ｔｈ、ｒ　（０，７８）１．’
；ｅｒ　（３，７８）、Ｇｅｘ　（５，１１）、Ｇｔ！
’／　（１，９Ｂ　）、ＡＢａ（３，０３）、Ｖａｎ（
０，８８）、Ｉｖｊｅｔ（０，９６）、ＩＩＩＣＣ１，
８８）、ＬｅｕＣ４，１４）、Ｔｙｒ　（２，０５）、
Ｐｈ、ｅ　（１，０７）、Ｌ’／ｓＣ２，２９）、およ
びＡｒｇＣ３，２２）。

分析により配列の正しいことか確認され／こ。

例　　　２Ｂ １１−　Ｔ’／ｒ−Ａｅａ、−Ａｓｐ−Ａｌ）ａ−１ｅ
ｅ　−Ｐｈ、ｅ−Ｔｌｂｒ−Ｊｓ　ｔｔ−８ｅ　ｒ　−
Ｔ’／ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌｌ−Ｌｅｕ−Ｇ（！
’／−Ｇｌ！ｎ−Ｌｅｕ−８ｅ　ｒ−Ａｅａ−Ａｒｇ−
Ｌｙ８−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｇｅｎ−Ａｓｐ−１１！ｅ−
八ｉｅｔ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ（！ｎ−Ｇｅｎ−ＯＨ上
記式の構造をもつＰＧＲＦ（１−３１）遊離酸の合成を
ベックマン社９９０型ペプチド合成器を用いて例２１で
記載した方法によりクロルメチル化樹脂上て段階的１ｃ
行った。７’　Ｌ　Ｃおよび１ｌＩ）Ｌ　Ｃを用いてこ
のペプチドは実質的に純粋であると判定された。

正しい配列が得られたことを調べるため、加水分解のの
ｈアミノ酸分析を行い、下記の結果を得た。

ＡｓｘＣ２，７３）、Ｔｈ、ｒ（０，７５）、Ｓｅｒ　
（２，７７）、Ｇ（ｌｘ（３，９５）、Ｇｊ？ｙ（０，
９８）、Ａｅａ　（３，０６）、ＶａｌＣ０，８０）、
Ｍｅｔ　（０，９８）、Ｉ（３ｅ　（１，７７）、Ｌｅ
ｕＣ４，２８）、Ｔｙｒ　（２，２Ｂ、　）、Ｐｈ、ｅ
（１，１４）、Ｌｙｓ　（２，３４）、およびＡ？・ｑ
（３，２２）。

分相により配列の正しいことか（１’ｔｆ＝　ｇされた
。

例　　　２Ｇ ／；／−７’ｙｒ−Ａｅａ、−Ａｓｐ−Ａｅａ、−１ｅ
ｅ−１ツノｔ、ａ−１’ｈ、ｒ−Ａｓｎ、−８ｅｒ−１
’ｙｒ−Ａｒｇ−７，’１ｓ−Ｖａｅ−Ｌｅｕ−Ｇ（’
！’Ｊ　−Ｇｌｌｎ−Ｌｅ　ｕ、−８ｅｒ−Ａｅａ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙ　ｓ　−Ｌｅ　ｕ、−Ｌｅｕ−Ｇｅｎ−Ａｓ
　７１−　ＩＲａ　−Ａｆａ　ｔ　−Ｓ　ｅ　ｒ　−０
１４ 上記式の構造をもつＰＣＩ？、Ｉ；’ＣＩ−２８）遊離
酸の合成をベックマン社９９０　（１＋Ｈｑペプチド合
成器を用いて例１に記載した方法によりクロルメチル化
樹脂」二で段階的に行つだ。Ｔ　Ｌ　Ｃおよびｌ１ＰＬ
Ｃを用いてこの被ブチドは実質的シて純粋てあ６と判定
された。

正しい配列が得られたことを調べろため、加水分１リイ
ののちアミノ酸分析を行い、下記の結果を得た。

ＡＳｘ（２，６６）、Ｔｈ、ｒ　（０，７３）、Ｓｅｒ
　（２，６６）、Ｇ９ｘＣ１，９８）、Ｇｌｊ’／　（
０，８１）、Ａｅａ　（２，８９）、Ｖａｅ（、０，９
０）、Ａｈｔ　（１，１５）、ｆｅｅ（１，７２）、Ｌ
ｅｕＣ４，１４）　　、　　’ｌ’ｙｒ　（２，４３）
　、　Ｐｈｅ　（１，５８）　、Ｌ！／８Ｃ２，１５）
、およびＡ、ｒｇ　（２，１９’　）。

分析により配列の正しいこさか確認された。

例　　　３ ＩＩ　−１”／ｒ−Ａｅａ″−Ａｓｐ−Ａｅａ−１１！
ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ、−５ｅｒ−１”／ｒ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｅ−Ｌｅｕ、−ＧＡ’／−Ｇｅｎ−
Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｅａ、−Ａｒｇ−Ｌ’／５−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ、−Ｇ（２ｎ−Ａｓｐ−Ｊ（！ｅ−Ｍｅｔ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｅｎ−Ｇｅｎ−Ｇ（！’１−Ｇ（ｈｔ
−８ｅｒ−Ａｓｎ、−Ｇｌ！ｎ−ＧｔＪｕ−Ａｒｇ−Ｇ
に３’／−Ａｅａ、−Ａｒｇ−Ａ（Ｊａ、−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｗ−Ｎｌｆ２上記式の構造をもつＰＧＲＦＣ１−４４
）の合成をベックマン社９９０型被ブチド合成器を用い
てＡ４　Ｂ　Ｉｉ　Ａ樹脂上て例１に記載した方法によ
り段階的に行った。７’　Ｌ　ＣおよびＩｉ　ｌ）　Ｌ
　Ｃを用いてこのイブチドは実質的に純粋であるき判定
された。

正しい配列が得られたことを調べるため、加水分解のの
ちアミノ酸分析を行い、下記の結果を得た。

Ａｓｘ（３，７５）、Ｔｈｒ　（０，８０）、δ’、ｅ
ｒ（３，６０）、ＧＩｌｘＣ６，９８）、ｃｅｙ　（３
，１６）、ＡｅａＣ５，０４）、ＶａｔｌＣＯ，７７）
、Ｍｅｔ　（１，０２）、ＩｅｅＣ１，７９）、Ｌｅｕ
（５，４，１）、Ｔｙｒｃ２．０３）、Ｐｈ、ｅ　（０
，８４）、ＬｙｓＣ２，３９）、ｕ、ｒｔｄ　ＡｒｇＣ
６，４３）。

分析により配列の１１゛シいことが確認された。

例　　　４ １１−７’ｙｒ−ＡＲａ−Ａｓｐ−Ａ（ｌａ、−１１；
Ｊｅ　−Ｐ）Ｉ　ｅ−’ｌ’ｈｒ−／４．Ｓｎ、−８　
ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌ’／　Ｓ−１１ａ、Ｒ−Ｌｅ
ｕ、−Ｇｅｌ−Ｌｅｎ−Ｌｅｕ−Ｓ　ｃｒ　−ＡＲａ−
Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　５−Ｌｅ　ｗ−Ｌｅ　ｒｔ、−Ｇｅｎ
、−Ａｓ　ｐ−１（Ｊｅ　−Ａｆａ　／、　−８ｅｒ　
−Ａｒ　ｇ　−Ｇｅｎ、−Ｇｅ　ＴＬ−Ｇｅ　’／　−
Ｇ（！ｕ、　−Ａ（２ａ、　−Ａｓ　ｎ、　−Ｇ（！ｎ
、−Ｇ（！ｗ−８ｅｒ−Ｇｅｙ−Ａｒｇ−０１１上記式
のＩ′ｉＡ造をもつＰ　Ｇ　ＲＦ’同族体の合成をベッ
クマン社９９０型にブチト合成器を用いてラボ・／スデ
ムズ社から得られるクロルメチル化樹脂上て例ＩＫ記載
した方法により段階的に行った。

’／”　Ｌ　ＣおよびＨＰ　ＬＣｐ用いてこの被ブチド
は実質的に純粋であると判定された。

正しい配列か得られたことを調べるため、加水分解のの
ちアミノ酸分析全行い、下記の結果を得だ。

Ａｓｘ（４，３５）、ｉ’ｈｒ　（１，０６）１．”Ｅ
ｅｒ　（３，８０）、Ｇ（ｌｘｃ　７．５３　）、Ｇａ
ｙｌ、９６）、Ａ（：Ｊａ、　（４，０５）、Ｖａ、ｅ
ＣＯ，９７）、Ａｈｔ　（０，８６）、ｆｅｅ　（１，
９４’）、ＬｅｕＣ３，７０）、ＴｙｒＣ２，０５）、
Ｐｈｅ（１，０６）、Ｌ’／ＳＣ２，０６）、ａ、ｎｄ
　ＡｒｇＣ３，５３）。

分析により配列の正しいこさか確認された。

例　　　５ Ｈ−Ｔ’／ｒ−Ａｅａ−Ａｓｐ−ＡＩ！ａ−１１！ｅ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−８ｅｒ−−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ｖａｅ−Ｌｅｕ−ＧＲ’／−Ｇｅｎ、−Ｌｅｕ
、−８ｅｒ−Ａｅａ−Ａｒｇ−Ｌ　ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ（！ａ−Ａｓｐ−Ｊｅｅ−ｔＩＩｅｔ−５ｅｒ−
Ａｒｇ−Ｇｅｎ−Ｇｌｈｔ−Ｇ（！’／−Ｇｌｕ−８ｅ
ｒ−Ａ、ｓｎ、−Ｇ（ｈｔ−ＧＲｒｔ−Ａｒｑ−Ｇｌ！
’／−Ａｅａ、−Ｎｌ−１２」二記式の構造をもつＰＧ
ＲＦ（１−４０）−アミドをベックマン社９９０型被ブ
チト合成器を用いてＡｆ　１３１１　Ａ樹脂上て例１に
記載した方法により段階的に行った。Ｔ　Ｌ　Ｃおよび
Ｉｆ　／）Ｌ　Ｃ（ｉ＝用いてこの被ブチドは実質的に
純粋である吉判定された。

正しい配列が得られたことを確認するため加水分解のの
ちアミノ酸分析を行い、下記の結果を得た。

ＡｓｘＣ３，７６）、ＴｈｒＣＯ，８８）、Ｓｅｒ　（
３，６８）、ＧＱｘＣ６，８９）、Ｇ＃ｙ（３，１２）
、ＡＩＪａ、（４，０８）、Ｖａｔ）Ｃ０，８８）、Ｍ
ａｔ　（１，３６）、ｌｅｅ　（１，７６）、Ｌｅｕ（
４，２４）、Ｔｙｒ　（２，００）、Ｐｈ、ｅ　（０，
８０）、Ｌｙｓｃ　２．８２　）、ｔｔｒｔｄ　Ａ、ｒ
ｇＣ４，Ｌ　６　）。

分七１１・′ＣＪニリ自己夕ｌ］の正しいことがイ１宥
°１．忍ぜれだ。

例　　　６ Ｈ−１”１ｒ−Ａｅａ−Ａｓｐ−Ａｌ１ａ−１ρｅ−Ｐ
ｈｅ−１’ｈ、ｒ−Ａｓｎ、−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ｌｙｓ−１７ａｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ！　ｙ−Ｇ（ｈｌ−
ＩＪｅｗ−３ｅｒ−ＡＩ！ａ　−／１７−１７−Ｌ’／
　ｓ　−Ｌｅｔｔ−Ｌｅ　ｕ、−Ｇ（ｈｒ、−ｙ−１ｓ
　７１−　ＩＩ！　ａ　−Ａ４ｅ　ｔ　＝Ｓｅ　ｒ　−
Ａｒ　ｇ−Ｇ（ｈｔ−Ｇｌ！　ｎ、−Ｇｔ！　’Ｊ−Ｇ
ｅｕ、−８　ｅ　ｔ゛−Ａｓ　ｎ　−Ｇｌ！　ｕ、−Ｇ
　ｅ　ｚｔ、　−０１ｉ 上記式の構造をもつＰＧＩ１１＝”ＣＩ−３７）ｔガ離
酸の合成をベックマン社９９０型にブチド合成器ケ用い
て例１に記載した方法によりクロルメチル化樹脂上で段
階的に行った。７′ＬＣおよびＩｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用い
てこのペプチドは実質的に純粋であると判定された。

正しい配列か得られたことを調べるだめ、加水分解のの
ちアミノ酸分析をｒｌい、下記の結果を得た。

Ａｓｘ（３，９２）、１’ｈ、ｒＣα７９）、５ｅｒ（
３，６２）、Ｇ（ｈば７．０５）、Ｇｅｙ（１’Ｊ７）
、ＡｅａＣ３，１７）、１１ａ、、ｇ（１，０３）、Ａ
４ｅｔ　（１，０）、Ｉ（！’ｅ（１，９１）、Ｌｅｕ
Ｃ４，３７）、’Ｉ”ｙｒ（１，８６）、Ｐｈｅ　（０
，７６）、Ｌｙｓ（２，１５）、およびＡｒ０Ｃ３，４
０）。

分析により配列の正しいことが確認された。

例　　　６Ａ １−１−　Ｔ’／ｒ−Ａｅａ−Ａｓ　ｐ−Ａｌ２ａ−１
（ｌｅ　−Ｐｈ、ｅ−Ｔｈ、ｒ−Ａｓ　ｎ、−８ｅ　ｒ
　−７”Ｊｒ−Ａｒｇ−Ｌ’／５−ＶａＲ−Ｌｅ　７Ｌ
−Ｇ（！’／−Ｇｅｒｔ−Ｌｅｕ、−３ｅｒ−Ａｅａ−
Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｃｗ−Ｌｅｕ−Ｇ（ｌｎ−Ａｓｐ−
１（ｌｅ　−Ａｈ　ｔ　−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ（ｈＩ−
Ｇｅｎ、−ＧＩ２’！−Ｇ（ｈｔ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇ
ｔ２ｎ−Ｇ（ｈｔ−Ｎｊｉ。

上記式の構造をもつＰＧＲＦＣ１−３７）アミドの合成
ヲベノクマン社９９０型ペプチド合成器を用いてＡＩ　
Ｂ　Ｉｉ　Ａ樹脂上て例１に記載した方法により行った
。ｉ’　Ｌ　ＣおよびＩｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いてこのペ
プチドは実質的に純粋であると判定された。

正しい配列が得られたことを調べるため、加水分解のの
ちアミノ酸分析を行い、下記の結果を得だ。

Ａｓｘ（４，０２）、Ｔｈｒ　（０，８０）、５ｅｒ（
３，４９）、（＃、（６，９０）、Ｇ（１’／　（１，
９２）、Ａｌ１ａ（３，０８）、Ｖａ（２Ｃ１，０５）
、Ｍｅｔ　（１，０１）、ｆｅｅ　（１，７７）、Ｌｅ
ｕＣ４，０５）、７’ｙｒ（２，０２）、Ｐｈｅ　（−
１，１４）、Ｌｙｓ（２，５０）、および／１？’！７
（３，２７）。

分析により配列の正しいことが１１１１認されブこ。

例　　　７ 成長ホルモンの放出を］足進す合にブチトの有効性を制
定する／こめ、例２の合成ｐｃｔｘｌ−’Ｃｌ−４０）
を用いて、当セル濃度の抽出精製した天然１）ＧＩＩＦ
ＣＩ−４０）および下垂体細胞からの成長ホルモンの放
出を促進する既知の有効性をもつＧＲＦ標準品との密接
な比較のもとにインビトロ検定を行った。標準品はブラ
シー　（Ｂｒａｚｅａ、ｒｔ）らのエンドクリ１０ジー
、Ｖｏ（！、１１０　、．４！￥Ｊ８（１９８２）に記
載され定義されており、下垂体細胞単層生物、回定ニお
いてＧｌｉ放出に関して最大値の半分の応答を生じる量
のラット視床下部由来の製剤である。

はぼ４〜５］ヨ前に摘出されたラット下垂体の細胞を含
む培養物を用いた。定められた標準培地の培養物しよひ
成長ホルモンの分泌に顛適と考えられるＪ＠養物の双方
をブラシーらのレギュラトリー・ぜブタイズ、１，２５
５．１９８１に記載された一般法により比較試験に用い
た。被験物質に関するインキュベーションを３〜４時間
行い、培地の一部を取り出して処理し、それらの免疫反
応性ＧＨ（ｉｒＧＨ）を十分に特性が明らかにされたラ
ジオイムンアノセイによりＪｌｌ定しだ。

この比較試験の結果、表ＩＫ示すように等モル比におい
て合成ＰＧＲＦＣ１−４０）は天然被ブチドの完全な生
物活性をもつ。合成ペプチドのＥＤａｏは約１１３ピコ
ダラムてあり、これはこれ寸でＧｌｉ放出因子と主張さ
れた他のいかなる分子よりもはるかに効力が高い。

表　　（ ０，６８牟１命　　　　　　　　　１７３上０．４１．
２５　〃２３０＋５ ２．５０　　　　”　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　３４７−ト　１３５．００　　　　）’　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４７４　」
っ３１０．００〃６７４：、に６ 天然ＰＧｌビＦ（１−４０） １２．５　　ｘｉＯ−１５モル　　　　　２３４土１７
２５　　　Ｘｌ０−１５モル　　　　　３５１１１７５
　Ｑ　　　ｘ　ＩＱ　−＋　５モル　　　　　５２８七
１６１００　　　Ｘｌ□−１５モル　　　　　７２０　
＋３２２００　　　Ｘｌ０−”モル　　　　　７４８上
７−１駁ハｕＱユユニ幻リー １０　　　ＸＩＯ”　　モ／ｌ／　　　　　２６９＋２
０１（ＪＯＸｌ０−１５　モ／ｌ／　　　　　　７０１
ｆ６１０００　　　ｘＩＱ　”　　モ／ｌ／　　　　　
　９９０上４２成長ホルモンの分泌に関するインビトロ
試験のホカ、ベントハルビタールて麻酔した正常な雄ラ
ット（体１１約２ｏｏｇ）［合成被ヅチドを注射するＣ
とによりインビボ試験も行った。表１１に示した結果か
ら、合成ＰＧＲＦペプチドは下垂体性成長ホルモンの分
泌に対する強力な刺激剤であることが示される。

追７Ｊｔｌ試験から、例４の合成Ｐ　Ｇ　ＲＦは天然Ｊ
）Ｇ１１！ＦＣ１−４０）と実質的に等しい生物学的効
力を示し、例６お・よび６，４の合成断片もきわめて実
質的な生物学的効力を示すことか知られた。

さらにＣ末−喘にα−カルポキキサトをもつ実施イ列５
のＰＧＲＦ（１−４０）””プチドは、例７て試験され
た合成波ブチドの生物学的効力○実質的に２倍をもって
いた。

例　　　８ 天然／）ＧＲＦ（］−４０）および天然Ｐ　Ｇ　ｌ？、
Ｆ′（１−４４）を用いて例７に記載したイ〕／ビトロ
検定を繰り返し、その結果天然ＰＧＲＦＣ１，−４４）
は約２倍以上の生物学的効力を示すことか知られた。

他の試験から、例１て合成された合成Ｐ　Ｇ　ＲＦ（１
−４４）遊離酸は天然ＰＧＲＦ（１−４４）よりも若干
低い効力を示し、合成ＰＣＩＩＦＣ１−４４）アミドは
天然ＰＧＲＦＣ１−４４）と実質的に等しい効力を示す
ことが知られた。合成ＰＧｌンＦ（１−４４）アミドは
実験動物（ラット）４０）が示すものと等しい型のＧｌ
ｌ放出活性を示し、ただしＰＧｕｔ”ＣＩ　−４０）遊
離酸よりも効力が約２．５〜３，０倍高い（＋１λ量基
準）。

米国て生首れる子供７０００〜１．５０．０００人のう
ち約１人は下手体性成長ホルモン欠損症すなわち゛下垂
体性小人“て′！ｔ）ることか知られている〇すなわち
彼らはその血液中に正常な水準の下垂体性Ｇｌｉを欠如
しているため小人である。これらの患者は大部分か正常
な下垂体をもっており、これらの問題の原因はＧＨに対
する視宋下部性放出因子の合成または分圧、か欠９ｒ＋
　していることであると提示する臨床的根拠がある。合
成Ｊ−’　Ｇ　ｙｚ　Ｆはこれ１てヒト下垂体性Ｇｌｉ
、すなわちもっばらヒ１、下垂体から死体解剖に除して
得られるきわめて高価な製剤の注射によって治療されで
きたこれらの症例のだめの理想的な治療法とかるこさか
期待されている。ＤＮＡ組み換え法により製造されるヒ
トＧＩＩは文献中には示されているが現在のところ常用
するために得られるものではない。合成ＰＧＲＦはこれ
よりもはるかに簡単な分子であり、この種の下垂体性小
人が数十万人いると推定される世界中て開用されるため
に著しい利点をもつけすである。

合成ＰＧＲＦはＧ１−１分泌に関して下垂体の機能を特
異的Ｉ（評価するものとして最初にヂ（］られた分子で
あるので、医師が下垂体機能の特異的な欠損を疑うすべ
ての症例においてＧＩＩ分ｇＫ関する最ＶＪのルーチン
試験を提供する。従って合成Ｐ　Ｇ　ＲＦはＧ　Ｈ分〜
、能を評価するために診断法さして現在採用されている
頻雑な方法（アルギニン注入、低血糖、Ｌ　−１）　Ｏ
Ｐ　Ａ注射など）に代わるべきものである。

合成Ｐ　Ｇ　ＲＦは医師か陽性の窒素平衡および同化作
用を希望する臨床医学的症例すべて、たとえば傷の治癒
、広範囲の火傷の治療、広範囲の外科手術に伴う術後期
間その他の医学的衰弱状態、ならびに多くの老人医学的
症状および未熟状聾で出産した７１児の小児医学的症状
において興味深いものとなるはずである。充実性腫瘍の
だめの広範囲の放射線療法中およびその成り患者におい
ても、同化作用を刺激するため、丑ノｃ造血系の斡＋ｉ
′１１１胞の刺激に対するＧ　Ｉｉの作用を利用すζ）
、／ζめ１ζ、Ｇ７１分、づビ、・７）ル１ｊ激（沫興
味深い。合ＨＪ、と？　Ｃｒ　／ゼＬ゛・ξ）゛チトは
ヒト疋没与するため１′乙１少ど、〕テ上も約ε）３係
、杼壕しくは少なくとも９８％の純度をもたなければな
らない。この純度は、目的とするー？プチドが存在する
類似役ブチドおよびｄフチド断片ずへてのうちで上記の
屯喰係を構成しなければならないこさを、啄味する。

生物活性金もつ被ブチドは大部分が最初に認識さ１１．
たもの以外の生物活性をもつことが認められている。こ
のような前例からみて、Ｐ　ＣＩＩ　Ｆは実際上興味深
い下垂体外活性をもつことが見出−ＪＪｚる見込みがあ
る。ＰＧｌＩ！Ｆはヒトの膵１藏腫瘍から抽出、単離さ
れたが、全体的な経験および実験に基づいて、ＰＧＲＦ
’ＣＩ〜４４）アミドのアミノ酸配列はヒト視床下部性
のＧ　Ｈ放出因子の配列と同一であると信じられている
。

合成Ｐ　Ｇ　／＜　Ｆ″′！！′！！ブチド動物その他
のｉ：＋Ｍ面動物に長期没−リすることにより同化作用
か促進され、従って筋肉敏に一関して体重か増加すると
期待される。水産養９１０において魚類その他の冷血海
水１助物を飼育して生育を促進するために用いることも
］′一定されている。ＩＩＩＩＩ！！′！／Ｉには約５
係程度の低い錘ＩＣ−て投７うすることも許容できる。

合成ｐ　ｃ；　ｔｚ　ｐ’またはその無毒性」豆を、薬
剤組成物を形成子る薬剤学的に受容てきるギヤリヤー譜
組み合わせてヒトを含む哺乳動物に静脈内、皮下、筋肉
内寸たは経Ｅコ的に投与することがてきる。この１９１
ｊは、治療されるへき受容者かこの種の治療ケ心安とす
る場合に、成長ホルモンの放出を刺激するために医師に
より採用することができる。必・ＰｊニアＳ、用量は治
療でれる特定の状態、状！専の重症度、および目的さす
る治療の期間に応じて変わるてあろう。

この種のペプチドはしげしげ、薬剤学的に受容できる無
）性の塩／ことえは酸１寸加塩５寸たはたさえは能鉛、
鉄など乏の金属錯体（これらは本発明の１・１的のため
の塩と考えられる）の形で投与され素酸塩、硫酸塩、リ
ン酸塩、マＬ／イノ酸」島、西′１１俊塙、クエン酸塩
、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アヌコルビン
酸塩、酒石酸塩などである１、活性成分を錠剤の形で］
ジＪうずべきである場合、錠剤には結合剤、たとえばト
ラガカン１、コーンスターチ−もしくはゼラチン；崩壊
剤、たとえばアルギン自架；および滑沢前］したとえば
ステアリンｒ俊マダネンウムか含有されていてもよい。

ｔｉ、状での投与を希望する場合、目−味剤および／′
−１／こけ香１床削を用いてもよく、等張食」漏液、リ
ン酸ＪＭ緩衝液などに入れて静脈内投与すにとも行われ
る。

これらのペプチドは医師の指導のもとに投与されるべき
てあり、架剤組成物は通常はペプチドを、慣用される薬
剤学的に受容てきるキャリヤーと共に含有するてあろう
。通常は用砒は受容者の体止ｌ　ｌｃｇ当たりペプチド
約２０〜約２０００ツーノグラムてル）ろう。

本発明者らに現在知られている最良の形態を構成する好
丑しい実施態様に関して本発明を記述し／ξか、特ｉｔ
’ｌ’　Ｊｔ求の範囲に示した本発明の範囲を逸脱する
ことなく当業者に明らかｆＸ各種の変更および修ｉＥを
行うことがてきる。：！：解すべきてル）る。たとえば
４４員子の釦における変更、特にペプチドのカルボキン
末端に始する削除を今日既知の実験１１′）例に従って
行い、長さ４０残基以下てあり、Ｃ−末端Ｋ　Ｎ１１２
−１たはＯＩＩをもち、ペプチドの効力のすべて１ブこ
はきわめて実質的な部分を保持する断ハ、たとえば／’
ＧＲＦ（１−２７）を製造する。

ことかでき、これらのペプチドは本発明の範囲内にある
と考えられる。さらにいずれかの末端もしくは両末端に
旬加を行い、および／または一般１（ペプチド化学の全
搬的技術において周知のように天然残基の代わりに一般
的に等しい残基を用いて、本発明の範囲から逸脱するこ
となく天然ポリペプチドの効力の少なくとも実質的な部
分をもつ同族体を製造することがてきる。

第１頁の続き 優先権主張　＠１９８２年９月１５日■米国（ｔＪｓ）
■４１８２４８ ０発　明　者　ベーター・ボーエン アメリカ合衆国カリフォルニア 州９２０２４エンシニタス・ハニー クーム・コート１４７ ０発　明　者　ポール・アーネスト・ブラゼウア・ジュ
ニア− アメリカ合衆国カリフォルニア ナｌ’１９２１２２サン・デイエゴ・カミノ・ノブエラ
７７５８ ０発　明　者　ロジャー・チャールズ・ルイス・ジリミ
ン アメリカ合衆国カリフォルニア 州９２０３７う・ホーラ・エンセリ ア・ドライブ７３１６ 特許庁Ｊ：官若　杉　和　夫殿 １事件の表示 昭和（と年特許願第　　／（絹（２２号２、発明の名称 ・ｔｉｔ　、’ｆ（代１”　４１；：、　Ｆ６、補正を
する者 事件との関係　　特許出願人 住所 各１′１、　ワ−１ノ１（′ノ・イ、ステ〈、−１−バ
ーへイ／ｊ　＋、）　’、　ｊｌｌｆ、　　７クテ５．
−ス４、代理人 ５補正の対象

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式 ％式％ （式中ｌＩ！はＯＩｆ　’ｉたはＭＢ２．　Ｒ３，はＳ
   ｅｒ　ｉたはＭ！ａ、、　　／ど、８はＡｒｇ　または
   ３　ｅ　ｒ　、　Ｒ４ｏはＡ、ｅａまたはＡｒｇ、　　
   Ｒ４、ｌｉ　　Ａｒｇ、　　Ａｒｑ　−Ａ／２ａ、　、
   　　、４ｒｇ　　−Ａｅａ−Ａｒｇ。 Ａｒｇ　−ＡＩＪａ　−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ、　’ｉたは
   ｔｌｅｓ−１ｅ４＋である）の構造をもつ合成ペゾチド
   組成物捷たはその生物活性をもつ断ハもしくはその無毒
   性塩。
2. （２）　　Ｒ３４か３ｅｒ、Ｒ３ｓかＡｒｇ、　Ｒ４０
   かＡｅａであるｑ寺許請求の範囲〜）１項記載の式の構
   造をもつ合成ｄブチド。
3. （３）　　ｌｅ：ｕがＡ（ｌａ、、１７３８かＳｅｒ、
   　Ｉｅ４ｏかＡｒｇである特許請求の範囲第１項記載の
   式の構造をもつ合成波ブチド。
4. （４）　　／？４．かＡｒｇ−Ａｅａ、　−Ａｒｇ　−
   Ｌｃｔｔである特５′［８青求の範囲第１項ないし第３
   項のいずれかに記載の式の１′１η造をもつ合成波ブチ
   ド。
5. （５）ＲがＭＢ２である特許請求の範囲第１項ないし第
   ４項のいずれかに記載の式の４１４造をもつ合成ペプチ
   ド。
6. （６）　　ｎ　ｆＪＳＯＨである特許請求の範囲第１項
   ないし第４項のいずれかに記載の式の構造をもつ合成に
   ブチト′。
7. （７）次式 ％式％ （ の構造をもつ特許請求の範囲第１項記載の被プチド。
8. （８）特許請求の範囲ｆＪ１項ないし第７項のいずれか
   に記載の化合物のイ１効計ｒ投与すること（でより忙１
   ・以外の（晶面動物において成長ホルモンの放出を刺激
   すう方法。
9. （９）冷血動物○生育を・促進するのＶＣ有効な欲の特
   許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載のｆ
   ヒ合物を投−りするこ吉により水産４夕１（（を改良す
   る方ｌ去。
10. （１０）　　ｑ奇ｒＰ＋請求の範囲第１項ないし第７項
    のいずれかに記載の化合物、およびこれの薬剤学的に受
    容てきる液体もしくは固体のキャリヤーを含む、ヒｌに
    おいて成長ホルモンの放出を刺激する薬剤組成物。
11. （１１）　　％ｉ’ｌ’請求の範囲第１項ないし第７項
    のいずれかに記載の化合物を有効量投与することにより
    哺乳動物における下垂体、哉能の特異的欠損を診断し、
    成長ホルモンの放出を監視する方法。
12. （１２）ヒトにおける成長ホルモンの放出を刺激するだ
    めの特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記
    載の組成物。
13. （１３）ヒト以外の副面動物の成長を促進するだめの特
    許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の組
    成物。
14. （１４）水産養殖ＶＣおいて冷血動物の成長を促進する
    だめの特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに
    記載の組成物。