JPS5945878A - ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 - Google Patents
ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物Info
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- JPS5945878A JPS5945878A JP57157369A JP15736982A JPS5945878A JP S5945878 A JPS5945878 A JP S5945878A JP 57157369 A JP57157369 A JP 57157369A JP 15736982 A JP15736982 A JP 15736982A JP S5945878 A JPS5945878 A JP S5945878A
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- neomycin
- kanamycin
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- pthn1
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベクタ
ーとして有用な新規なプラスミドを保有する新規な微生
物に関するものであり、より詳しくはネオマイシン、カ
ナマイシン耐性の遺伝子を内部に備え、その分子量が約
２．８メガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂
地図により特徴づけられる新規なプラスミドを保有する
新規なバチルス・ステアロサーモフィルスに関するもの
である。
ーとして有用な新規なプラスミドを保有する新規な微生
物に関するものであり、より詳しくはネオマイシン、カ
ナマイシン耐性の遺伝子を内部に備え、その分子量が約
２．８メガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂
地図により特徴づけられる新規なプラスミドを保有する
新規なバチルス・ステアロサーモフィルスに関するもの
である。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主−ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主−ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０
℃〜３７℃の中温菌である点に問題がある。
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主−ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主−ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０
℃〜３７℃の中温菌である点に問題がある。
一方、好熱性細菌は、生育上限温度が５５℃〜７５℃に
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。従って、好熱
性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つの、
しがも有力な手段と考えられる好熱性細菌の宿主−ベク
ター系の開発研究については、ベクターの有力候補と考
えられるプラスミドの検索を含めても以下の報告しか知
られていない。
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。従って、好熱
性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つの、
しがも有力な手段と考えられる好熱性細菌の宿主−ベク
ター系の開発研究については、ベクターの有力候補と考
えられるプラスミドの検索を含めても以下の報告しか知
られていない。
（１）高度好熱菌よりの染色体外ＤＮＡの分離 ヒ
シヌマ，Ｆ．タナカ，Ｔ．アンド サカグチ，Ｋ．
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１０４，１９３−１９
９（１９７８）（２）薬剤耐性の好熱菌バチルス属細菌
よりの４種類のプラスミドの 分離とその性質の部
分解析 ビングハム，Ａ．Ｈ．Ａ．，ブルトン，Ｃ．Ｊ．
アンド アトキンソン，Ｔ． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１１４，４０１−
４０８（１９７９）（３）バチルス・ステアロサーモフ
ィルスのプラスミドｐＡＢ１２４ の解析及び欠失
誘導体の創製 ビングハム，Ａ．Ｈ．Ａ．，ブルトン，Ｃ．
Ｊ． アンド アトキンソン，Ｔ． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１１９，１０９−
１１５（１９８０）（４）好熱菌バチルス属細菌よりの
薬剤耐性プラスミドの分離と解析、 及び部分欠失
プラスミドの創製 （５）サーマス・サーモフィルスから単離されたプラス
ミド（ｐＴＴ １）の物理的性状 エベルハード，Ｍ．Ｄ．，バスクエズ，Ｃ．，バ
レンズエラ，Ｐ． ，ビキュナ，Ｒ． アンド ユデ
レビック，Ａ． Ｐｌａｓｍｉｄ，Ｇ，１−６（１
９８１）（６）プラスミドＤＮＡによるバチルス・ステ
アロサーモフィルスの 形質転換及びバチルス・ス
テアロサーモフィルス、バチルス・ズ ブチルス間
共用ベクターの性質 イマナカ，Ｔ．，フジイ，Ｍ．，アラモリ，Ｉ．
アンド アイバ，Ｓ． Ｊ．Ｂａｃｔ．，１４９（３），８２４−８３０
（１９８２）そので、本発明者らは、その宿主が好熱性
の微生物であって、その内部にネオマイシン、カナマイ
シン耐性の遺伝子を備えた微生物を自然界より検索した
結果、バチルス属に属する一菌株から新規なプラスミド
を得ることに成功した。
シヌマ，Ｆ．タナカ，Ｔ．アンド サカグチ，Ｋ．
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１０４，１９３−１９
９（１９７８）（２）薬剤耐性の好熱菌バチルス属細菌
よりの４種類のプラスミドの 分離とその性質の部
分解析 ビングハム，Ａ．Ｈ．Ａ．，ブルトン，Ｃ．Ｊ．
アンド アトキンソン，Ｔ． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１１４，４０１−
４０８（１９７９）（３）バチルス・ステアロサーモフ
ィルスのプラスミドｐＡＢ１２４ の解析及び欠失
誘導体の創製 ビングハム，Ａ．Ｈ．Ａ．，ブルトン，Ｃ．
Ｊ． アンド アトキンソン，Ｔ． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１１９，１０９−
１１５（１９８０）（４）好熱菌バチルス属細菌よりの
薬剤耐性プラスミドの分離と解析、 及び部分欠失
プラスミドの創製 （５）サーマス・サーモフィルスから単離されたプラス
ミド（ｐＴＴ １）の物理的性状 エベルハード，Ｍ．Ｄ．，バスクエズ，Ｃ．，バ
レンズエラ，Ｐ． ，ビキュナ，Ｒ． アンド ユデ
レビック，Ａ． Ｐｌａｓｍｉｄ，Ｇ，１−６（１
９８１）（６）プラスミドＤＮＡによるバチルス・ステ
アロサーモフィルスの 形質転換及びバチルス・ス
テアロサーモフィルス、バチルス・ズ ブチルス間
共用ベクターの性質 イマナカ，Ｔ．，フジイ，Ｍ．，アラモリ，Ｉ．
アンド アイバ，Ｓ． Ｊ．Ｂａｃｔ．，１４９（３），８２４−８３０
（１９８２）そので、本発明者らは、その宿主が好熱性
の微生物であって、その内部にネオマイシン、カナマイ
シン耐性の遺伝子を備えた微生物を自然界より検索した
結果、バチルス属に属する一菌株から新規なプラスミド
を得ることに成功した。
このプラスミドは前記の制限酵素開裂地図に示され、分
子量は小さく、また種々の制限酵素による特異的な切断
点を有し、ネオマイシン、カナマイシンに対する耐性遺
伝子をプラスミドＤＮＡ上に有している。（以下、木プ
ラスミドを「ｐＴＨＮ１」と略称する。）なお、図に示
されている制限酵素の略称は次のとおりである。
子量は小さく、また種々の制限酵素による特異的な切断
点を有し、ネオマイシン、カナマイシンに対する耐性遺
伝子をプラスミドＤＮＡ上に有している。（以下、木プ
ラスミドを「ｐＴＨＮ１」と略称する。）なお、図に示
されている制限酵素の略称は次のとおりである。
（１）ＡｃｃＩはアシネトバクター・カルコアセティカ
ス由来の酵素（２）ＢｇｌＩＩはバチルス・グロビギー
由来の酵素（３）ＥｃｏＲＩはエシェリヒア・コリ由来
の酵素（４）ＨｈａＩはハエモフィルス・ハエモリティ
カス由来の酵素（５）ＨｐａＩＩはハエモフィルス・パ
ラインフルエンザ由来の酵素（６）ＰｓｔＩはプロビデ
ンシア・ストアルティイ由来の酵素（７）ＴａｑＩはリ
ーマス・アクアティカス由来の酵素を示す。
ス由来の酵素（２）ＢｇｌＩＩはバチルス・グロビギー
由来の酵素（３）ＥｃｏＲＩはエシェリヒア・コリ由来
の酵素（４）ＨｈａＩはハエモフィルス・ハエモリティ
カス由来の酵素（５）ＨｐａＩＩはハエモフィルス・パ
ラインフルエンザ由来の酵素（６）ＰｓｔＩはプロビデ
ンシア・ストアルティイ由来の酵素（７）ＴａｑＩはリ
ーマス・アクアティカス由来の酵素を示す。
以下、ネオマイシン、カナマイシン耐性を有する即知の
好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
表から明らかなように、ｐＴＨＮ１は即知のプラスミド
に較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明らか
に異なっており、新規なプラスミドであることが認めら
れる。
に較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明らか
に異なっており、新規なプラスミドであることが認めら
れる。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須であるが、ｐＴＨＮ１は
好熱菌及び枯草菌での自律的増殖能及びネオマイシン、
カナマイシン耐性という極めて選択に有利なマーカーを
有している。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須であるが、ｐＴＨＮ１は
好熱菌及び枯草菌での自律的増殖能及びネオマイシン、
カナマイシン耐性という極めて選択に有利なマーカーを
有している。
更にｐＴＨＮ１は図からも明らかなように、ＡｃｃＩ、
ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＰｓｔＩなどの制
限酵素による開裂部位を特定のしかも限られた位置に有
している。このことはｐＴＨＮ１をベクターとして利用
する際に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保
持できるという点で有利である。また、ｐＴＨＮ１は枯
草菌でも好熱菌でもベクターとして利用できる点で有利
である。従って、ｐＴＨＮ１をベクターとして用いるこ
とにより異種遺伝子を同時に枯草菌と好熱菌にクローン
化することも可能である。また、枯草菌とｐＴＨＮ１の
分離源である好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィル
スとは同じバチルス属に属するという共通点を有するた
めその近縁性から既に枯草菌で発現している異種遺伝子
は、好熱菌でも発現される可能性が高いものと考えられ
る。そこで、既に枯草菌にクローン化されている遺伝子
を、本プラスミドを用いて好熱菌に移入する事によって
、もしその遺伝子産物が５５℃付近での耐熱性を有する
ならば、発酵工業における冷却コストの節減が、好熱菌
による発酵生産によって達成される事となる。
ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＰｓｔＩなどの制
限酵素による開裂部位を特定のしかも限られた位置に有
している。このことはｐＴＨＮ１をベクターとして利用
する際に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保
持できるという点で有利である。また、ｐＴＨＮ１は枯
草菌でも好熱菌でもベクターとして利用できる点で有利
である。従って、ｐＴＨＮ１をベクターとして用いるこ
とにより異種遺伝子を同時に枯草菌と好熱菌にクローン
化することも可能である。また、枯草菌とｐＴＨＮ１の
分離源である好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィル
スとは同じバチルス属に属するという共通点を有するた
めその近縁性から既に枯草菌で発現している異種遺伝子
は、好熱菌でも発現される可能性が高いものと考えられ
る。そこで、既に枯草菌にクローン化されている遺伝子
を、本プラスミドを用いて好熱菌に移入する事によって
、もしその遺伝子産物が５５℃付近での耐熱性を有する
ならば、発酵工業における冷却コストの節減が、好熱菌
による発酵生産によって達成される事となる。
また、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
ｐＴＨＮ１の入手は、本発明者らが土壌中から新たに分
離した中等度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィル
スＮ１株をＴＹＳ培地により対数増殖後期迄増殖させて
得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させ
る事によって達せられる。
離した中等度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィル
スＮ１株をＴＹＳ培地により対数増殖後期迄増殖させて
得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させ
る事によって達せられる。
また、バチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株は好気
性の有胞子桿菌、グラム染色陽性であり、生育至適温度
が約５５℃で３７℃では生育しない菌株であるがｐＴＨ
Ｎ１及びテトラサイクリン耐性を有するプラスミドｐＴ
ＨＴ１５を保有する点では従来には認められない新規な
微生物である。
性の有胞子桿菌、グラム染色陽性であり、生育至適温度
が約５５℃で３７℃では生育しない菌株であるがｐＴＨ
Ｎ１及びテトラサイクリン耐性を有するプラスミドｐＴ
ＨＴ１５を保有する点では従来には認められない新規な
微生物である。
また、本菌株はｐＴＨＮ１の他にもテトラサイクリン耐
性の遺伝子を内部に保有し、その分子量が約２．８マガ
ダルトであり、次の図に示される制限酵素地図で特徴づ
けられる新規なプラスミドを保有することが確認できた
。
性の遺伝子を内部に保有し、その分子量が約２．８マガ
ダルトであり、次の図に示される制限酵素地図で特徴づ
けられる新規なプラスミドを保有することが確認できた
。
本菌株は当初ネオマイシン耐性株として土壌中より分離
されたがネオマイシンに対して耐性を示したのみならず
カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリンに対し
ても耐性を示し、エリスロマイシン、クロラムフェニコ
ール、ストレプロマイシンには感受性であった。
されたがネオマイシンに対して耐性を示したのみならず
カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリンに対し
ても耐性を示し、エリスロマイシン、クロラムフェニコ
ール、ストレプロマイシンには感受性であった。
なお、本菌株は微工研菌寄第６６６０号として寄託され
ている。
ている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例１（菌株のスクリーニング）
茨城県筑波郡谷田部町の土壌サンプル約１ｇをＴＹＳ培
地（ディフコ・トリプトン２％、ディフコ・イースト・
エキストラクト１％、ＮａＣｌ１％）１００ｍｌに加え
５５℃で約８時間振盪培養後、ネオマイシン（２０μｇ
／ｍｌ）を含むＴＹＳ寒天平板上で生育したコロニーの
一つからバチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株（微
工研菌寄第６６６０号）が得られた。
地（ディフコ・トリプトン２％、ディフコ・イースト・
エキストラクト１％、ＮａＣｌ１％）１００ｍｌに加え
５５℃で約８時間振盪培養後、ネオマイシン（２０μｇ
／ｍｌ）を含むＴＹＳ寒天平板上で生育したコロニーの
一つからバチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株（微
工研菌寄第６６６０号）が得られた。
実施例２
プラスミドｐＴＨＮ１のバチルス・ステアロサーモフィ
ルスＮ１株からの分離 バチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株（微工研菌寄
第６６６０号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍ
ｌのネオマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＴＹＳ培地（デ
ィフコ・バクト・トリプトン２％、ディフコ・イースト
・エキストラクト１％、ＮａＣｌ１％）に接種し５５℃
で１６〜１８時間振盪培養する。この培養液を１ｌのテ
トラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含有するＴＹＳ培地に
接種し、５５℃で５時間培養する。菌体を遠心によって
集め、ＴＥＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭＥＤ
ＴＡ，１００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．５）で洗浄後菌体
湿重量４ｇ当り、１０ｍｌの２５％ショ糖含有ＴＥＳに
懸濁する。リゾチーム（１０μｇ／ｍｌ）を２ｍｌ、０
．２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４ｍｌを加え、０℃
で１０分間静置、続いて３７℃に１０分間保温する。こ
の細胞混合液に２ｍｌの１０％ＳＤＳ、５ｍｌの５Ｍ−
ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１８時間静置する。これを
２８０００ｒｐｍ、１時間の超遠心によって遠心し、上
清を得る。この上清にポリエチレングリコール６０００
を１０％（ｗ／ｖ）加え、２〜３時間０℃に静置２２０
０ｒｐｍ、２分の遠心で沈殿を得る。
ルスＮ１株からの分離 バチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株（微工研菌寄
第６６６０号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍ
ｌのネオマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＴＹＳ培地（デ
ィフコ・バクト・トリプトン２％、ディフコ・イースト
・エキストラクト１％、ＮａＣｌ１％）に接種し５５℃
で１６〜１８時間振盪培養する。この培養液を１ｌのテ
トラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含有するＴＹＳ培地に
接種し、５５℃で５時間培養する。菌体を遠心によって
集め、ＴＥＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭＥＤ
ＴＡ，１００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．５）で洗浄後菌体
湿重量４ｇ当り、１０ｍｌの２５％ショ糖含有ＴＥＳに
懸濁する。リゾチーム（１０μｇ／ｍｌ）を２ｍｌ、０
．２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４ｍｌを加え、０℃
で１０分間静置、続いて３７℃に１０分間保温する。こ
の細胞混合液に２ｍｌの１０％ＳＤＳ、５ｍｌの５Ｍ−
ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１８時間静置する。これを
２８０００ｒｐｍ、１時間の超遠心によって遠心し、上
清を得る。この上清にポリエチレングリコール６０００
を１０％（ｗ／ｖ）加え、２〜３時間０℃に静置２２０
０ｒｐｍ、２分の遠心で沈殿を得る。
この沈殿を１５ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣｌ及びエ
チジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．６２
に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜４０
時間、平衝密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤＮＡ
のバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウムブ
ロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，２０ｍＭＮａＣｌ）に透析する
事によってプラスミドＤＮＡ溶液が得られる。
チジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．６２
に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜４０
時間、平衝密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤＮＡ
のバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウムブ
ロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，２０ｍＭＮａＣｌ）に透析する
事によってプラスミドＤＮＡ溶液が得られる。
このプラスミドＤＮＡ溶液はｐＴＨＮ１とｐＴＨＴ１５
の混合物であるがこの溶液を０．７％の低融点アガロー
ス（ＢＲＩ社製）による電気泳動に供し、生ずる２つの
バンドのうちｐＴＨＮ１に相当する部分を切り出し、ゲ
ルから溶出する事によって純粋なｐＴＨＮ１が得られる
。
の混合物であるがこの溶液を０．７％の低融点アガロー
ス（ＢＲＩ社製）による電気泳動に供し、生ずる２つの
バンドのうちｐＴＨＮ１に相当する部分を切り出し、ゲ
ルから溶出する事によって純粋なｐＴＨＮ１が得られる
。
低融点アガロースゲルからのＤＮＡの回収は以下の手順
によった。切り出したゲルスライスを６５℃に保温して
融解、、これに２倍量の０．５ｍＭＥＤＴＡを含む５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３
７℃に移し保温する。これに等量の０．１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で飽和させたフェノールを
加え混合、遠心（３０００〜５０００ｒｐｍ、５分）後
、上層の水層を分取する。フェノール抽出をもう一度行
いエーテルによってフェノールを水層より除去した後、
３Ｍ酢酸アンモニウム溶液を１／１０容加え、３容のエ
タノールによりエタノール沈殿を行う。得られた沈殿を
ＴＥＮに溶解してプラスミド溶液とした。
によった。切り出したゲルスライスを６５℃に保温して
融解、、これに２倍量の０．５ｍＭＥＤＴＡを含む５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３
７℃に移し保温する。これに等量の０．１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で飽和させたフェノールを
加え混合、遠心（３０００〜５０００ｒｐｍ、５分）後
、上層の水層を分取する。フェノール抽出をもう一度行
いエーテルによってフェノールを水層より除去した後、
３Ｍ酢酸アンモニウム溶液を１／１０容加え、３容のエ
タノールによりエタノール沈殿を行う。得られた沈殿を
ＴＥＮに溶解してプラスミド溶液とした。
ｐＴＨＮ１の特性決定の手順
ｐＴＨＮ１の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐｅｒ
ｃｏｉｌｃｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
より得られた。この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２
ＤＮＡ（２．６７ｍｄ）、ＣｏｌＦｌＤＮＡ（４．２ｍ
ｄ）及びラムダＤＮＡのＨｉｎｄｍ分解断片（１４．６
、５．８４、４．０５、２．６７、１．０４、１．２１
、０．３４ｍｄ、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲｌ分解断片（
１３．７、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、
２．１３ｍｄ）を用いた。制限酵素による切断は、プラ
スミドＤＮＡ溶液からエタノール沈殿によってＤＮＡを
沈殿させ、適当な緩衝液に溶解して行った。制限酵素は
宝酒造よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気泳動
はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の濃
度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１ｃｍ
当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行った。
ｃｏｉｌｃｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
より得られた。この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２
ＤＮＡ（２．６７ｍｄ）、ＣｏｌＦｌＤＮＡ（４．２ｍ
ｄ）及びラムダＤＮＡのＨｉｎｄｍ分解断片（１４．６
、５．８４、４．０５、２．６７、１．０４、１．２１
、０．３４ｍｄ、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲｌ分解断片（
１３．７、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、
２．１３ｍｄ）を用いた。制限酵素による切断は、プラ
スミドＤＮＡ溶液からエタノール沈殿によってＤＮＡを
沈殿させ、適当な緩衝液に溶解して行った。制限酵素は
宝酒造よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気泳動
はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の濃
度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１ｃｍ
当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行った。
ｐＴＨＮ１が、そのＤＮＡ上にネオマイシン、カナマイ
シン耐性遺伝子を有している事は、枯草菌バチルス・ズ
ブチルスＲＭ１２５株プロトプラストへの形質転換実験
によって確かめられた。バチルス・ズブチルスＲＭ１２
５株のプロトプラストの調整、形質転換、プロトプラス
トの再生の手順はＣｈａｎｇ＆Ｃｏｈｅｎの方法（Ｍｏ
ｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｌ．，１６８，１１１−１１
５（１９７９））によって行った。この方法の概略はＲ
Ｍ１２５株の対数増殖菌体を等張液中でリゾチーム処理
によってプロトプラスト化し、このプロトプラスト懸濁
液にプロスミドＤＮＡ溶液を加え、ポリエチレングリコ
ール６０００によってＤＮＡのプロトプラスト内への取
込みを促した後、再生培地上でプロトプラストから栄養
細胞への再生を図るというものである。
シン耐性遺伝子を有している事は、枯草菌バチルス・ズ
ブチルスＲＭ１２５株プロトプラストへの形質転換実験
によって確かめられた。バチルス・ズブチルスＲＭ１２
５株のプロトプラストの調整、形質転換、プロトプラス
トの再生の手順はＣｈａｎｇ＆Ｃｏｈｅｎの方法（Ｍｏ
ｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｌ．，１６８，１１１−１１
５（１９７９））によって行った。この方法の概略はＲ
Ｍ１２５株の対数増殖菌体を等張液中でリゾチーム処理
によってプロトプラスト化し、このプロトプラスト懸濁
液にプロスミドＤＮＡ溶液を加え、ポリエチレングリコ
ール６０００によってＤＮＡのプロトプラスト内への取
込みを促した後、再生培地上でプロトプラストから栄養
細胞への再生を図るというものである。
ｐＴＨＮ１ＤＮＡ約１μｇを用いて、ＲＭ１２５株のプ
ロトプラスト懸濁液０．５ｍｌ（２×１０３プロトプラ
スト／ｍｌ）に対して形質転換を行ない、再生培地上で
ネオマイシン、カナマイシン耐性株の出現を検討したと
ころ、この際のプロトプラストの再生率１０％（２×１
０８／ｍｌ）に対して１×１０３／ｍｌの頻度でネオマ
イシン、カナマイシン耐性株が生じた。一方、プラスミ
ドＤＮＡ溶液を加えなかった系（コントロール）ではネ
オマイシン、カナマイシン耐性株は２×１０８個以上の
プロトプラストを徹いても生じてはこなかった。
ロトプラスト懸濁液０．５ｍｌ（２×１０３プロトプラ
スト／ｍｌ）に対して形質転換を行ない、再生培地上で
ネオマイシン、カナマイシン耐性株の出現を検討したと
ころ、この際のプロトプラストの再生率１０％（２×１
０８／ｍｌ）に対して１×１０３／ｍｌの頻度でネオマ
イシン、カナマイシン耐性株が生じた。一方、プラスミ
ドＤＮＡ溶液を加えなかった系（コントロール）ではネ
オマイシン、カナマイシン耐性株は２×１０８個以上の
プロトプラストを徹いても生じてはこなかった。
ここで得られてＲＭ１２５株のネオマイシン、カナマイ
シン耐性株よりプラスミドＤＮＡを、バチルス、ステア
ロサーモフィルスＮ１株よりのプラスミドＤＮＡの抽出
の際と同様（リゾチーム処理の温度及び時間が３７℃３
０分間である点が異なる。）の方法で抽出し検討したと
ころ、ｐＴＨＮ１と同一分子量で、制限酵素による切断
パターンも全く同一なプラスミドＤＮＡが回収された。
シン耐性株よりプラスミドＤＮＡを、バチルス、ステア
ロサーモフィルスＮ１株よりのプラスミドＤＮＡの抽出
の際と同様（リゾチーム処理の温度及び時間が３７℃３
０分間である点が異なる。）の方法で抽出し検討したと
ころ、ｐＴＨＮ１と同一分子量で、制限酵素による切断
パターンも全く同一なプラスミドＤＮＡが回収された。
この事実は、ｐＴＨＮ１がネオマイシン、カナマイシン
耐性遺伝子を有しており、このプラスミドがＲＭ１２５
株に入った事によってＲＭ１２５株がネオマイシン、カ
ナマイシン耐性の形質を示すに到った事を証明するもの
である。同時に、ｐＴＨＮ１が、好熱菌及び枯草菌で、
自律的増殖能及び形質の発現が可能なプラスミドである
事、つまり本プラスミドが両菌株でベクターとして利用
し得る事実を明らかにするものである。
耐性遺伝子を有しており、このプラスミドがＲＭ１２５
株に入った事によってＲＭ１２５株がネオマイシン、カ
ナマイシン耐性の形質を示すに到った事を証明するもの
である。同時に、ｐＴＨＮ１が、好熱菌及び枯草菌で、
自律的増殖能及び形質の発現が可能なプラスミドである
事、つまり本プラスミドが両菌株でベクターとして利用
し得る事実を明らかにするものである。
ナオマイシン、カナマイシン耐性を有する好熱菌のプラ
スミドとしては前記の表に示したとおりであるが、ｐＴ
ＨＮ１と他のものでは前述のように明らかに異なってお
り、ｐＴＨＮ１は従来認められない新規なプラスミドで
ある。
スミドとしては前記の表に示したとおりであるが、ｐＴ
ＨＮ１と他のものでは前述のように明らかに異なってお
り、ｐＴＨＮ１は従来認められない新規なプラスミドで
ある。
図面はｐＴＨＮ１の制限酵素開裂地図を示し、図中のＡ
ｃｃＩはアシネトバクター・カルコアセティカス由来の
酵素、ＢｇｌＩＩはバチルス・グロビギー由来の酵素、
ＥｃｏＲＩはエシェリヒア・コリ由来の酵素、ＨｈａＩ
はハエモフィルス・ハエモリティカス由来の酵素、Ｈｐ
ａＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の
酵素、ＰｓｔＩはプロビデンシア・ストアルティイ由来
の酵素、ＴａｑＩはサーマス・アクアティカス由来の酵
素をそれぞれ示している。
ｃｃＩはアシネトバクター・カルコアセティカス由来の
酵素、ＢｇｌＩＩはバチルス・グロビギー由来の酵素、
ＥｃｏＲＩはエシェリヒア・コリ由来の酵素、ＨｈａＩ
はハエモフィルス・ハエモリティカス由来の酵素、Ｈｐ
ａＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の
酵素、ＰｓｔＩはプロビデンシア・ストアルティイ由来
の酵素、ＴａｑＩはサーマス・アクアティカス由来の酵
素をそれぞれ示している。
Claims (1)
- ネオマイシン、カナマイシン耐性の遺伝子を内部に備え
、その分子量が約３．０メガダルトンであり、図に示さ
れる制限酵素地図で特徴づけられるプラスミドを保有す
る新規なバチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57157369A JPS5945354B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57157369A JPS5945354B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5945878A true JPS5945878A (ja) | 1984-03-14 |
| JPS5945354B2 JPS5945354B2 (ja) | 1984-11-06 |
Family
ID=15648142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57157369A Expired JPS5945354B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5945354B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894337A (en) * | 1989-01-17 | 1990-01-16 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Process for the bioproduction of cyclic hydroxides |
-
1982
- 1982-09-09 JP JP57157369A patent/JPS5945354B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894337A (en) * | 1989-01-17 | 1990-01-16 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Process for the bioproduction of cyclic hydroxides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5945354B2 (ja) | 1984-11-06 |
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