JPS59175896A - ヒト抗体産生方法 - Google Patents
ヒト抗体産生方法Info
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- JPS59175896A JPS59175896A JP58048011A JP4801183A JPS59175896A JP S59175896 A JPS59175896 A JP S59175896A JP 58048011 A JP58048011 A JP 58048011A JP 4801183 A JP4801183 A JP 4801183A JP S59175896 A JPS59175896 A JP S59175896A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒ）Ｂ細胞が腫瘍化してなる細胞株を利用す
るヒト抗体の産生方法に関する。
るヒト抗体の産生方法に関する。
近年、細胞融合技術が急速な発展をとけ、ヒト抗体産生
への応用の期待が高まっている。
への応用の期待が高まっている。
従来、ヒトの抗体を産生しうる雑種細胞の研究は、大別
して以下の二つの方法により行なわれてきた。
して以下の二つの方法により行なわれてきた。
（１）マウス、ラット等のミエローマ細胞株を用いて、
ヒトの抗体産生細胞との雑種細胞を作成する方法。
ヒトの抗体産生細胞との雑種細胞を作成する方法。
（２）ヒトのミエローマを用いて雑種細胞を作る方法。
しかし、第１の方法によるヒト細胞と異種動物細胞株と
の雑種細胞においては、ヒトの染色体が急速に消失する
現象がみられ、長期安定に抗体産生雑種細胞株を獲得す
ることは極めて困難であった。また、第２の方法では、
細胞融合剤として最も用い易いポリエチレングリコール
溶液中で細胞株が急速に死滅してしまったり、ミエロー
マ細胞株的にＩｇＧ型抗型全体全分泌いるために、雑種
細胞を形成せしめることにより始めて分泌される主要な
免疫グロブリンであるＩｇＧ型抗型全体便にスクリーニ
ングすることができないなどの問題があった。
の雑種細胞においては、ヒトの染色体が急速に消失する
現象がみられ、長期安定に抗体産生雑種細胞株を獲得す
ることは極めて困難であった。また、第２の方法では、
細胞融合剤として最も用い易いポリエチレングリコール
溶液中で細胞株が急速に死滅してしまったり、ミエロー
マ細胞株的にＩｇＧ型抗型全体全分泌いるために、雑種
細胞を形成せしめることにより始めて分泌される主要な
免疫グロブリンであるＩｇＧ型抗型全体便にスクリーニ
ングすることができないなどの問題があった。
そこで、本発明者らは、よシ効果的にヒト抗体産生細胞
と融合可能であり、かつ雑種細胞から分泌される各種免
疫グロブリンのうちＩｇＧ型抗型全体易にスクリーニン
グしうる細胞株を種々検討した結果、ヒ）Ｂ細胞が腫瘍
化し、細胞表面にＩｇＡ型免疫グロブリンを有している
細胞株を用いることにより、ポリエチレングリコール等
の細胞融合剤による細胞障害が少なく、より効果的に細
胞融合が可能であり、それによって得られた雑種細胞は
、癌化していない抗体産生細胞由来のＩｇＧ型およびＩ
ｇＭ型などの主要な免役グロブリンを容易に検出しうろ
こと？発見し、本発明全完成するに至った。
と融合可能であり、かつ雑種細胞から分泌される各種免
疫グロブリンのうちＩｇＧ型抗型全体易にスクリーニン
グしうる細胞株を種々検討した結果、ヒ）Ｂ細胞が腫瘍
化し、細胞表面にＩｇＡ型免疫グロブリンを有している
細胞株を用いることにより、ポリエチレングリコール等
の細胞融合剤による細胞障害が少なく、より効果的に細
胞融合が可能であり、それによって得られた雑種細胞は
、癌化していない抗体産生細胞由来のＩｇＧ型およびＩ
ｇＭ型などの主要な免役グロブリンを容易に検出しうろ
こと？発見し、本発明全完成するに至った。
すなわち、本発明は、ヒトＢ細胞が腫瘍化し、細胞表面
にＩｇＡ型免疫グロブリン金有している細胞株（以下、
これ’ｉ ＩｇＡ型Ｂ細胞株という）と、癌化していな
いヒト抗体産生細胞とを、細胞融合せしめて雑種細胞を
形成し、その雑種細胞株を用いて、癌化していない抗体
産生細胞由来の免疫グロブリンを産生ずる方法である。
にＩｇＡ型免疫グロブリン金有している細胞株（以下、
これ’ｉ ＩｇＡ型Ｂ細胞株という）と、癌化していな
いヒト抗体産生細胞とを、細胞融合せしめて雑種細胞を
形成し、その雑種細胞株を用いて、癌化していない抗体
産生細胞由来の免疫グロブリンを産生ずる方法である。
一般に、Ｂ細胞が腫瘍化した細胞株は、補体Ｃ３リセプ
ター、ＩｇＧＦｃリセプター、表面免疫グロブリン等の
うち、少なくとも一つを細胞膜表面に有している浮遊性
細胞株と同定されている。本発明者らは、幾多のＢ細胞
株を比較検討したところ、ＩｇＡ型Ｂ細胞株を用いて雑
種細胞を形成させた場合、癌化していない抗体産生細胞
由来の免疫グロブリンを産生じうろこと、そして、Ｉｇ
Ｇ、 ＩｇＭなどのクラスに属する該免疫グロブリン
の産生量を簡便にスクリーニングしうることを見出した
。
ター、ＩｇＧＦｃリセプター、表面免疫グロブリン等の
うち、少なくとも一つを細胞膜表面に有している浮遊性
細胞株と同定されている。本発明者らは、幾多のＢ細胞
株を比較検討したところ、ＩｇＡ型Ｂ細胞株を用いて雑
種細胞を形成させた場合、癌化していない抗体産生細胞
由来の免疫グロブリンを産生じうろこと、そして、Ｉｇ
Ｇ、 ＩｇＭなどのクラスに属する該免疫グロブリン
の産生量を簡便にスクリーニングしうることを見出した
。
本発明で用いるＩｇＡ 、Ｗ Ｂ細胞株は、ヒトミエロ
ーマに対し、その細胞表面にＩｇＡ型免疫グロブリンを
有している点が異なる。−！た、細胞形態学的に言えば
、ＩｇＡ型Ｂ細胞株では表面の突起状がより多く存在す
ること、および細胞株同志の凝集性がより強いことなど
を挙げることができる。
ーマに対し、その細胞表面にＩｇＡ型免疫グロブリンを
有している点が異なる。−！た、細胞形態学的に言えば
、ＩｇＡ型Ｂ細胞株では表面の突起状がより多く存在す
ること、および細胞株同志の凝集性がより強いことなど
を挙げることができる。
本発明に用いるＩｇＡ型Ｂ細胞株のより好ましいものは
、培養液中に存在させたとき、該液中に細胞株からのＩ
ｇＡの分泌が確認されるような株である。工ｇＡの確認
は、液の上清をエンザイムイムノアツセイ法などで検出
することによって行うことができる。
、培養液中に存在させたとき、該液中に細胞株からのＩ
ｇＡの分泌が確認されるような株である。工ｇＡの確認
は、液の上清をエンザイムイムノアツセイ法などで検出
することによって行うことができる。
ＩｇＡ型Ｂ細胞株の対数増殖期における２倍増殖に要す
る時間は、より速い方が本発明の目的に用いやすく、１
２〜３６時間の範囲にあることが好ましい。
る時間は、より速い方が本発明の目的に用いやすく、１
２〜３６時間の範囲にあることが好ましい。
マイコプラズマ感染等によシ増殖速度が低下した細胞株
は、本発明の目的には適さない。
は、本発明の目的には適さない。
本発明に用いられるＩｇＡ型Ｂ細胞株の例としては、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ ） ２９４巻第１７３頁（１
９８１）に示された０Ｍ１０５６Ａ、そして、成臂：「
モノクロナル抗体とＴセルハイプリドーマ」ハマーリン
グラ編、エルスピア／北オランダ・バイオケミ力Ａ／
、プレス刊（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓａｎｄ ’ｌ’ Ｃｅ１ｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
、 ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇ、Ｊ。
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ ） ２９４巻第１７３頁（１
９８１）に示された０Ｍ１０５６Ａ、そして、成臂：「
モノクロナル抗体とＴセルハイプリドーマ」ハマーリン
グラ編、エルスピア／北オランダ・バイオケミ力Ａ／
、プレス刊（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓａｎｄ ’ｌ’ Ｃｅ１ｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
、 ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇ、Ｊ。
ＨＷｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔａｌ、、 Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ／Ｎｏｒｔｈ−ＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒｅｓｓ、 Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、 １９８１ ）
の４３２〜４４４頁に示をれたＧＭ９２３などがある。
ｒ／Ｎｏｒｔｈ−ＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｐｒｅｓｓ、 Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、 １９８１ ）
の４３２〜４４４頁に示をれたＧＭ９２３などがある。
また、一般に、末梢血リンパ球の長期培養により、もし
くはエプスタイン・バール・ウィルスによるウィルス発
癌によって獲得することも可能である。
くはエプスタイン・バール・ウィルスによるウィルス発
癌によって獲得することも可能である。
ＩｇＡ型Ｂ細胞株は、細胞融合剤であるポリエチ〜 ５
− レンゲリコールとの接触に際しても強め耐性を示し、ヒ
トミエローマに比較して、より効果的に雑種細胞株を獲
得することができる。
− レンゲリコールとの接触に際しても強め耐性を示し、ヒ
トミエローマに比較して、より効果的に雑種細胞株を獲
得することができる。
ＩｇＡ型Ｂ細胞株の培養に用いられる培地の基本組成は
、特に制限はないが、１０〜２０％の牛胎児血清を含む
培地ＲＰＭＩ−１６４０が常用される。
、特に制限はないが、１０〜２０％の牛胎児血清を含む
培地ＲＰＭＩ−１６４０が常用される。
本発明に用いられる癌化していないヒト抗体産生細胞は
、末梢リンパ球、リンパ節、膵臓などから獲得ｒ＝Ｊ能
であり、特に制限はないが、通常、取得しやすさから末
梢血リンパ球が用いられる。細胞融合は、融合すべき細
胞を細胞融合剤の存在下、常温で混合すればよい。
、末梢リンパ球、リンパ節、膵臓などから獲得ｒ＝Ｊ能
であり、特に制限はないが、通常、取得しやすさから末
梢血リンパ球が用いられる。細胞融合は、融合すべき細
胞を細胞融合剤の存在下、常温で混合すればよい。
細胞融合剤としては、ポリエチレングリコール溶液、不
活化センダイウィルスなど、種々知られており、特に制
限はないが、調製が簡便であるポリエチレングリコール
溶液が用いやすい。細胞融合後、融合し々かった癌化し
ていない抗体産生細胞は、徐々に死滅してゆき、雑種細
胞株の獲得に特に支障はないが、融合しなかったＩｇＡ
型Ｂ細胞株は死滅しないので、それとの分離は工夫を要
す ６− る。
活化センダイウィルスなど、種々知られており、特に制
限はないが、調製が簡便であるポリエチレングリコール
溶液が用いやすい。細胞融合後、融合し々かった癌化し
ていない抗体産生細胞は、徐々に死滅してゆき、雑種細
胞株の獲得に特に支障はないが、融合しなかったＩｇＡ
型Ｂ細胞株は死滅しないので、それとの分離は工夫を要
す ６− る。
雑種細胞株と融合しなかっ′ｆｃＩｇＡ型Ｂ細胞株との
分離は、個々の融合細胞コロニー間の性状比較により原
理的に実施可能であるが、より用いやすい分離方法とし
て、ＩｇＡ型Ｂ細胞株からあらかじめアミノプテリンを
含む培地中で死滅するような酵素欠損株を選択し、細胞
融合用細胞株として用いる方法がある。この方法によれ
ば、細胞融合後、アミノプテリンを含む培地中で培養を
行うことにより、雑種細胞のみを選択的に増殖せしめら
れる。
分離は、個々の融合細胞コロニー間の性状比較により原
理的に実施可能であるが、より用いやすい分離方法とし
て、ＩｇＡ型Ｂ細胞株からあらかじめアミノプテリンを
含む培地中で死滅するような酵素欠損株を選択し、細胞
融合用細胞株として用いる方法がある。この方法によれ
ば、細胞融合後、アミノプテリンを含む培地中で培養を
行うことにより、雑種細胞のみを選択的に増殖せしめら
れる。
この酵素欠損株を選択するためには、例えば、ヒポキサ
ンチン・グアニン・ホスホリボシルトランズフエラーゼ
（以下、ＨＧＰＲＴと略記する）の欠損株を獲得する場
合は、６−チオグアニンもしくは８−アザグアニンなど
の薬剤を含む培地中で増殖しうる細胞株を選択し、また
、チミジン・カイネースの欠損株を獲得する場合は、５
−ブロモデオキシウリジンを含む培地中で増殖しうる細
胞株を選択することにより可能である。
ンチン・グアニン・ホスホリボシルトランズフエラーゼ
（以下、ＨＧＰＲＴと略記する）の欠損株を獲得する場
合は、６−チオグアニンもしくは８−アザグアニンなど
の薬剤を含む培地中で増殖しうる細胞株を選択し、また
、チミジン・カイネースの欠損株を獲得する場合は、５
−ブロモデオキシウリジンを含む培地中で増殖しうる細
胞株を選択することにより可能である。
アミノプテリンの作用は、主にデノボ核酸合成径路を阻
害することが知られているが、同様の効果は、グルタミ
ルトランスフェラーゼの阻害効果を有するアザセリン、
６−ジアシー５−オクソーＬ−ノルロイシン々どによっ
ても得られる。
害することが知られているが、同様の効果は、グルタミ
ルトランスフェラーゼの阻害効果を有するアザセリン、
６−ジアシー５−オクソーＬ−ノルロイシン々どによっ
ても得られる。
アミノプテリンに感受性を示す細胞を得るためには、用
いようとするＩｇＡ型Ｂ細胞株の薬剤感受性の違いによ
り必要な薬剤濃度が異なるため、まず、種々の濃度の薬
剤を含む培地で培養を行い、薬剤非添加時の１／２の増
殖速度を示す薬剤濃度を求める。次に、該濃度の２０〜
１００倍濃度まで２〜６ケ月かけて徐々に薬剤濃度を増
加せしめながら細胞培養を継続することにより、増殖し
た細胞株−＋ｍ択すればよい。よｐ好ましいアミノプテ
リン感受性のＩｇＡ型Ｂ細胞株としては、前述したＩｇ
Ａ型Ｂ細胞株ＧＭ１０５６Ａを６−チオグアニンを含む
培地中で選択し、アミノプテリン感受性細胞株としたＧ
Ｍ１０５６Ａ−ＴＧＲがある。該細胞株は、細胞表面に
ＩｇＡ型免疫グロブリンを有していると共に、その培養
上清中にもＩｇＡが分泌されている。
いようとするＩｇＡ型Ｂ細胞株の薬剤感受性の違いによ
り必要な薬剤濃度が異なるため、まず、種々の濃度の薬
剤を含む培地で培養を行い、薬剤非添加時の１／２の増
殖速度を示す薬剤濃度を求める。次に、該濃度の２０〜
１００倍濃度まで２〜６ケ月かけて徐々に薬剤濃度を増
加せしめながら細胞培養を継続することにより、増殖し
た細胞株−＋ｍ択すればよい。よｐ好ましいアミノプテ
リン感受性のＩｇＡ型Ｂ細胞株としては、前述したＩｇ
Ａ型Ｂ細胞株ＧＭ１０５６Ａを６−チオグアニンを含む
培地中で選択し、アミノプテリン感受性細胞株としたＧ
Ｍ１０５６Ａ−ＴＧＲがある。該細胞株は、細胞表面に
ＩｇＡ型免疫グロブリンを有していると共に、その培養
上清中にもＩｇＡが分泌されている。
該細胞株は微工研に寄託しようとしたが、受付けられな
かった。しかし、液体窒素温度で凍結保存されており、
たえず頒布可能な状態におかれている。
かった。しかし、液体窒素温度で凍結保存されており、
たえず頒布可能な状態におかれている。
以下、細胞融合の詳細について記載する。
ヒトの抗体産生細胞を末梢血より獲得する場合は、フィ
コール・コンレイ液の上部に重層せしめ、４００Ｇ、３
０分の遠心分離を施し、中間層として得られる末梢血リ
ンパ球分画（以下、ＰＢＬと略記する）を用いる。その
他組織中から抗体産生細胞全獲得する場合は、組織を良
く切りきざみ、ステンレスメツシュを用いて固形成分と
リンハ球全分離し、混入した赤血球は、０．１４Ｍ塩化
アンモニウム溶液にて溶血処理を施して除去しておく。
コール・コンレイ液の上部に重層せしめ、４００Ｇ、３
０分の遠心分離を施し、中間層として得られる末梢血リ
ンパ球分画（以下、ＰＢＬと略記する）を用いる。その
他組織中から抗体産生細胞全獲得する場合は、組織を良
く切りきざみ、ステンレスメツシュを用いて固形成分と
リンハ球全分離し、混入した赤血球は、０．１４Ｍ塩化
アンモニウム溶液にて溶血処理を施して除去しておく。
このようにして得られたヒト抗体産生細胞を含む浮遊液
と、アミノプテリン感受性のＩｇＡ型Ｂ細胞株を混合し
、遠心分離操作で牛胎児血清等の蛋白成分を完全に除去
する。
と、アミノプテリン感受性のＩｇＡ型Ｂ細胞株を混合し
、遠心分離操作で牛胎児血清等の蛋白成分を完全に除去
する。
両細胞の混合比率は特に制限Ｆｉ々（，１：１の細胞比
率から一方の細胞を１００倍程度１で過剰 ９− に加えてもよい。
率から一方の細胞を１００倍程度１で過剰 ９− に加えてもよい。
続いて、細胞融合促進剤である分子量１５００〜６００
０のポリエチレングリコールを蛋白質を含まない培地も
しくは平衡塩液に溶解し、３５〜５５％としたものを、
細胞１０７個あたシ０．１〜１−の割合でゆつくシと滴
下し、２〜３分間放置後、蛋白質を含まない培地で洗浄
し、充分にポリエチレングリコールを稀釈する。
０のポリエチレングリコールを蛋白質を含まない培地も
しくは平衡塩液に溶解し、３５〜５５％としたものを、
細胞１０７個あたシ０．１〜１−の割合でゆつくシと滴
下し、２〜３分間放置後、蛋白質を含まない培地で洗浄
し、充分にポリエチレングリコールを稀釈する。
続いて、アミノプテリン感受性のＩｇＡ型Ｂ細胞株を完
全に死滅させる最少〜１００倍濃度Ｏ７ミノプテリン、
および核酸合成のサルベージ回路の基質であるヒポキサ
ンチンおよびチミジン’を含ｔｒ培地に細胞を分散せし
め、９６穴マイクロテストプレートに分注し、炭酸ガス
培養器中にて融合細胞の増殖をはかシ、培養上清中に抗
体を放出せしめる。なお、ヒポキサンチンおよびチミジ
ンの濃度は、細胞障害を示さない範囲ならば特に制限は
ないが、それぞれ１０″′４Ｍおよヒ１，５ Ｘ １０
−５Ｍ程度が望ましい。
全に死滅させる最少〜１００倍濃度Ｏ７ミノプテリン、
および核酸合成のサルベージ回路の基質であるヒポキサ
ンチンおよびチミジン’を含ｔｒ培地に細胞を分散せし
め、９６穴マイクロテストプレートに分注し、炭酸ガス
培養器中にて融合細胞の増殖をはかシ、培養上清中に抗
体を放出せしめる。なお、ヒポキサンチンおよびチミジ
ンの濃度は、細胞障害を示さない範囲ならば特に制限は
ないが、それぞれ１０″′４Ｍおよヒ１，５ Ｘ １０
−５Ｍ程度が望ましい。
本発明のＩｇＡ型Ｂ細胞を用いる利点としては、＝ １
０− （１）４５％程度のポリエチレングリコール液に１０分
程度接触する際の細胞障害が極めて少ない。
０− （１）４５％程度のポリエチレングリコール液に１０分
程度接触する際の細胞障害が極めて少ない。
（２）雑種細胞の増殖が容易である。
（３）ヒト抗体産生細胞の該産生能を容易に細胞株に移
入できる。
入できる。
（４） ＩｇＧ 型、ＩｇＭ型などの抗体産生能を有す
る雑種細胞の検出が極めて容易である。
る雑種細胞の検出が極めて容易である。
などがあげられる。
ヒト抗体は、一般に融合細胞の培養上清から獲得するこ
とが可能である。特定の抗体のみを獲得するためには、
例えば融合細胞株の中から特定の株を選択し、それを培
養器そこから特異的な抗体を分離することができる。ま
た、この雑種細胞株を、拒絶反応やナチュラル・キラー
活性等が抑制された状態の哺乳動物の腹腔内に移植し、
増殖せしめることが可能である。ここで用いる哺乳動物
としては、ヌードマウス等の胸腺欠損動物が用い易い。
とが可能である。特定の抗体のみを獲得するためには、
例えば融合細胞株の中から特定の株を選択し、それを培
養器そこから特異的な抗体を分離することができる。ま
た、この雑種細胞株を、拒絶反応やナチュラル・キラー
活性等が抑制された状態の哺乳動物の腹腔内に移植し、
増殖せしめることが可能である。ここで用いる哺乳動物
としては、ヌードマウス等の胸腺欠損動物が用い易い。
実施例
ヒ） Ｂ ＩＪンバ球由来細胞株ＧＭ１０５６Ａからの
アミノプテリン感受性（ＨＧＰＲＴ欠損）Ｂ細胞株の分
離 ＧＭ１０５６Ａ株を１０チ牛脂児血清を含むＲＰＭ１１
６４０培地で１０８個甘でせ胞株を増殖せしめ、続いて
、同培地に１μ２／−の６−チオグアニンを添加した培
地で１０日間培養を継続した後、２μｆ／１ｎｌ、 ５
ｔｎ／ｍｌ、 １０ ｔｉｔ／ｍｌ、および２０μグ
／−の６−チオグアニンをそれぞれ含む培地で各１５日
間ずつ培養を行い、生細胞集団をマイフロピペラトラ用
いて移していった。最終的に異なったウェルから得られ
た計２５の細胞巡回を獲得した。
アミノプテリン感受性（ＨＧＰＲＴ欠損）Ｂ細胞株の分
離 ＧＭ１０５６Ａ株を１０チ牛脂児血清を含むＲＰＭ１１
６４０培地で１０８個甘でせ胞株を増殖せしめ、続いて
、同培地に１μ２／−の６−チオグアニンを添加した培
地で１０日間培養を継続した後、２μｆ／１ｎｌ、 ５
ｔｎ／ｍｌ、 １０ ｔｉｔ／ｍｌ、および２０μグ
／−の６−チオグアニンをそれぞれ含む培地で各１５日
間ずつ培養を行い、生細胞集団をマイフロピペラトラ用
いて移していった。最終的に異なったウェルから得られ
た計２５の細胞巡回を獲得した。
それぞれのウェルの細胞集団の一部を分けとり、種々の
濃度のアミノプテリンおよび１０チの牛胎児血清を含む
ＲＰＭ１１６４０培地にて培養を試みたところ、４Ｘ１
０−’Ｍ以上のアミノプテリンを含む培地で１０日間培
養した場合に、２５ウエル中２ウエルが死滅した。この
ことよシ、この２ウエルは酵素欠損株であり、アミノプ
テリン感受性細胞株であると判定した。これらの細胞集
団全再度分散せしめ培養を施し、１個の細胞から由来し
たと考えられる細胞集団を獲得し、かつ前述のアミノプ
テリン感受性のあることを再度確かめ、該細胞株を以下
の細胞融合に供した。
濃度のアミノプテリンおよび１０チの牛胎児血清を含む
ＲＰＭ１１６４０培地にて培養を試みたところ、４Ｘ１
０−’Ｍ以上のアミノプテリンを含む培地で１０日間培
養した場合に、２５ウエル中２ウエルが死滅した。この
ことよシ、この２ウエルは酵素欠損株であり、アミノプ
テリン感受性細胞株であると判定した。これらの細胞集
団全再度分散せしめ培養を施し、１個の細胞から由来し
たと考えられる細胞集団を獲得し、かつ前述のアミノプ
テリン感受性のあることを再度確かめ、該細胞株を以下
の細胞融合に供した。
ポリエチレングリコールに対する耐性試験細胞融合の実
施に先立ち、該細胞株がポリエチレングリコールによっ
て受ける細胞障害の程度を検討した。
施に先立ち、該細胞株がポリエチレングリコールによっ
て受ける細胞障害の程度を検討した。
分子量２０００のポリエチレングリコール全４５チ含む
ハンクス液を２−調製し、ｐＨを８．２にあわせた後、
濾過除菌を施した。よ〈ノ・ンクス液で洗浄を施した２
Ｘ １０丁個のＧＭ１０５６Ａ−ＴＧＲに、該ポリエ
チレングリコール溶液を２分３０秒を要して徐々に滴下
し、その後、１分間３７℃にて１ｌｌｌ￥置した。この
とき用いた細胞株ＧＭ１０５６Ａ−ＴＧＲの細胞生存率
を色素トリバンプルーの排除能で測定したところ、９６
チと算定された。
ハンクス液を２−調製し、ｐＨを８．２にあわせた後、
濾過除菌を施した。よ〈ノ・ンクス液で洗浄を施した２
Ｘ １０丁個のＧＭ１０５６Ａ−ＴＧＲに、該ポリエ
チレングリコール溶液を２分３０秒を要して徐々に滴下
し、その後、１分間３７℃にて１ｌｌｌ￥置した。この
とき用いた細胞株ＧＭ１０５６Ａ−ＴＧＲの細胞生存率
を色素トリバンプルーの排除能で測定したところ、９６
チと算定された。
続いて、蛋白成分を含まない培地ＲＰＭ１１６４０を２
〇−用いて、徐々にポリエチレングリコール＝ １３− を稀釈した。この細胞浮遊液をゆるやかに遠心分離し、
１０チの牛胎児血清を含む培地ＲＰＭ１１６４０に再浮
遊せしめた。このポリエチレングリコール処理細胞を含
む培養液を、２４穴の培養用プラスチックプレートの各
穴に１０５個ずつ分注し、炭酸ガス濃度５チ、温度３７
℃に設定した炭酸ガス培養器で６日間培養した後、該細
胞株の生存率を測定したところ、９２％であった。
〇−用いて、徐々にポリエチレングリコール＝ １３− を稀釈した。この細胞浮遊液をゆるやかに遠心分離し、
１０チの牛胎児血清を含む培地ＲＰＭ１１６４０に再浮
遊せしめた。このポリエチレングリコール処理細胞を含
む培養液を、２４穴の培養用プラスチックプレートの各
穴に１０５個ずつ分注し、炭酸ガス濃度５チ、温度３７
℃に設定した炭酸ガス培養器で６日間培養した後、該細
胞株の生存率を測定したところ、９２％であった。
細胞融合
健常者末梢血２０７−（ｚ、抗凝固剤としてヘパリンを
用いて採血し、フィコール・コンレイ液（比重１，０７
７ ）を用いた比重遠心法によシ、新鮮リンパ球２ Ｘ
１０７個を含む浮遊液を獲得した。
用いて採血し、フィコール・コンレイ液（比重１，０７
７ ）を用いた比重遠心法によシ、新鮮リンパ球２ Ｘ
１０７個を含む浮遊液を獲得した。
次いで、該リンパ球を同数の細胞株ＧＭ１０５６Ａ−Ｔ
ＧＲと混和し、ハンクス液で遠心操作ヲ＜シ返し、３回
洗浄後、充分に洗浄液を除いた。
ＧＲと混和し、ハンクス液で遠心操作ヲ＜シ返し、３回
洗浄後、充分に洗浄液を除いた。
細胞融合剤としては、分子量２０００のポリエチレング
リコールを４５係含むハンクス液を２−調製し、ｐＨを
８．２にあわせた後、濾過除菌を施した。この融合促進
剤溶液を洗浄後の両細胞混合−１４− 物に、２分３０秒を要して徐々に滴下し、その後、１分
間５７℃で放置した。
リコールを４５係含むハンクス液を２−調製し、ｐＨを
８．２にあわせた後、濾過除菌を施した。この融合促進
剤溶液を洗浄後の両細胞混合−１４− 物に、２分３０秒を要して徐々に滴下し、その後、１分
間５７℃で放置した。
続いて、蛋白成分を含まない培地ＲＰＭＩ １６４０を
２０−用いて、徐々にポリエチレングリコールを稀釈し
た。この稀釈液をゆるやかに遠心分離し、１０−７Ｍの
アミノプテリン、１０−’Ｍのヒポキサンチンおよび１
．５ Ｘ Ｉ Ｑ”” Ｍのチミジンを含む培地（以下
、Ｉ（ＡＴ培地と略す）８０−でおき替えた。
２０−用いて、徐々にポリエチレングリコールを稀釈し
た。この稀釈液をゆるやかに遠心分離し、１０−７Ｍの
アミノプテリン、１０−’Ｍのヒポキサンチンおよび１
．５ Ｘ Ｉ Ｑ”” Ｍのチミジンを含む培地（以下
、Ｉ（ＡＴ培地と略す）８０−でおき替えた。
９６大の組織培養用マイクロテストプレート４枚を用意
し、各穴２００μｔずつ分注した。４日毎に培地の半量
を新鮮なＨＡＴ培地におき替え、２０日後、倒立顕微鏡
下で細胞集団の増殖が認められた。培養上清中のヒトの
ＩｇＧおよびＩｇＭの存在をペルオキシダーゼ結合抗体
を用いたエンザイムイムノアツセイ法で分析したところ
、７６チの培養穴にヒトのＩｇＧが、３４％の培養穴に
ヒトのＩｇＭがそれぞれ産生されていることが確認され
た。
し、各穴２００μｔずつ分注した。４日毎に培地の半量
を新鮮なＨＡＴ培地におき替え、２０日後、倒立顕微鏡
下で細胞集団の増殖が認められた。培養上清中のヒトの
ＩｇＧおよびＩｇＭの存在をペルオキシダーゼ結合抗体
を用いたエンザイムイムノアツセイ法で分析したところ
、７６チの培養穴にヒトのＩｇＧが、３４％の培養穴に
ヒトのＩｇＭがそれぞれ産生されていることが確認され
た。
比較例
ヒトのミエローマ株Ｕ −２６６（Ｃ１ｉｎｉｃａｌＥ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ
ｌ、７ （１９７０）第４７７頁〜第４８９頁に示され
ている〕を用いて、実施例と同様の方法でアミノプテリ
ン感受性細胞を分離し、株化した。
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ
ｌ、７ （１９７０）第４７７頁〜第４８９頁に示され
ている〕を用いて、実施例と同様の方法でアミノプテリ
ン感受性細胞を分離し、株化した。
該株のポリエチレングリコールに対する感受性を、実施
例１と同様の方法で測定した結果、実験前の生存率が９
３優のところ、ポリエチレングリコール処理して３日間
培養後では２３％の生存率であった。
例１と同様の方法で測定した結果、実験前の生存率が９
３優のところ、ポリエチレングリコール処理して３日間
培養後では２３％の生存率であった。
次に、実施例と同様の操作で健常者のリンパ球との細胞
融合を行った。２０日間の培養後に生存細胞を検鏡によ
り検索したところ、全く認められず、捷た培養上清中の
ＩｇＧおよびＩｇＭはいずれも全く検出されなかった。
融合を行った。２０日間の培養後に生存細胞を検鏡によ
り検索したところ、全く認められず、捷た培養上清中の
ＩｇＧおよびＩｇＭはいずれも全く検出されなかった。
Claims (2)
- （１） ヒ）Ｂ細胞が腫瘍化し、細胞表面にＩｇＡ型
免疫グロブリンを有している細胞株と、癌化していない
ヒト抗体産生細胞とを、細胞融合してなる雑種細胞を用
いることを特徴とするヒト抗体の産生方法。 - （２） ヒ）Ｂ細胞が腫瘍化し、細胞表面にＩｇＡ型
免疫グロブリン金有している細胞株が、アミノプテリン
を含む培地中で生存しえないものである特許請求の範囲
第１項記載のヒト抗体の産生方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58048011A JPS59175896A (ja) | 1983-03-24 | 1983-03-24 | ヒト抗体産生方法 |
| DE8383105615T DE3379055D1 (en) | 1982-06-09 | 1983-06-08 | Method for producing human antibody |
| EP83105615A EP0096839B1 (en) | 1982-06-09 | 1983-06-08 | Method for producing human antibody |
| US06/750,199 US4833077A (en) | 1982-06-09 | 1985-07-01 | Method for producing human antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58048011A JPS59175896A (ja) | 1983-03-24 | 1983-03-24 | ヒト抗体産生方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59175896A true JPS59175896A (ja) | 1984-10-04 |
Family
ID=12791355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58048011A Pending JPS59175896A (ja) | 1982-06-09 | 1983-03-24 | ヒト抗体産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59175896A (ja) |
-
1983
- 1983-03-24 JP JP58048011A patent/JPS59175896A/ja active Pending
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