JPH04501806A

JPH04501806A - 基質依存性細胞の増殖促進方法

Info

Publication number: JPH04501806A
Application number: JP2508516A
Authority: JP
Inventors: ゲブハード，ティモシー・コンラッド; ヴェーラマル，ウデイ・クマー
Original assignee: ユニシン・ファイバーテック・コーポレーション
Priority date: 1989-05-23
Filing date: 1990-05-23
Publication date: 1992-04-02
Also published as: EP0426830A1; EP0426830A4; WO1990014417A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】基質依存性細胞の増殖促進方法本出願は、係属中の１９８９年５月２３日付は米国出願第０７／３５５．５９０号の継続出願である。

本発明は、一般に中空繊維膜細胞培養バイオリアクター中での基質依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ）細胞の増殖促進方法、およびとくにある種のポリマー中空繊維膜を使用した該増殖促進方法に関する。

複数の中空繊維膜を含むシェルを有するインビトロ細胞培養用の細胞培養装置が、ご（最近公知になった。この装置では、酸素、栄養素その他の化学的刺激物を含む培地が中空繊維膜の中を通して運搬される。栄養素とガスは拡散と外部対流によって中空繊維膜を通して運ばれる。細胞は繊維とシェル壁との間の流体スーペースにおいて増殖する。

中空繊維培養装置は、多くのタイプの細胞をインビトロにおいて高密度に維持するために理想的であると実証されている。中空繊維培養装置の物質輸送特性は栄養素とガスを供給し、培養物から廃物を除去するための効果的な手段である。

種々の孔度を有する半孔質中空繊維膜を選択することができる。適当な孔度を選択することによって、繊維の外側に細胞生成物が維持され、廃棄物と汚染タンパク質は膜の孔を通って中空繊維の内部に入り、廃棄物から除去される。

先行技術の細胞培養装置の例は、米国特許第４，８０４，６２８号とこれに記載されている特許に述べられている。先行技術の中空繊維膜に用いられている物質の例には、コラーゲンを被覆したセルロースアセテート、シリコーンカーボネートおよび毛管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）　（米国特許第３．８２１．０８７号）、ならびに例えば、ポリメチルメタクリレートのようなポリアクリル樹脂を含む多様な天然および合成ポリマー材料（米国特許第４．５４６．０８３号）がある。

米国特許第４゜４３９．３２２号は、血液精製すなわち透析に有用な中空繊維としてペンダントスルホネート基と四級窒素基とを含むイオン性架橋ポリメチルメタクリレートコポリマーを述べている。ラムセイ（Ｒａｍｓａｙ）らの「表面処理と細胞付着（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ａｔｔａｃｈ＋ａｅｎｔ）　Ｊ　、インビトロ、２０巻、１０号（１９８４）は非処理ポリメタクリレートシートが基質依存性細胞に対して比較的不良な付着性を有することを開示している。

ｂ２基質依存性細胞たいていの哺乳動物細胞はそれらが物理的または化学的アフィニテイを示す基質に付着したものとして培養される。この形式の例外は注目に値するものであり、通常造血細胞類または悪性形質転換細胞ラインに属する。付着からの解放が懸濁状態のこのような細胞の培養を非常に促進する。しかし、可能なまたは確立された工業的価値を有する細胞ラインの大きなグループはもっばら基質依存性のカテゴリーに入る。市場価値の高いタンパク質の大部分は組換え体−トランスフェクト細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌ）と悪性形質転換細胞ラインの結果として、このグループに入る。細胞付着と拡散は増殖と分化のために基本的な機能的利点を提供する。表面積のこの増加は基質依存性細胞に必要な有糸分裂刺激剤調節剤のための多くの受容部位（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５ｉｔｅ）を生ずる。

図面の簡単な説明図面は、中空繊維膜の写真である。図１と図２はそれぞれ２０倍および３３倍の倍率で撮影したセルロース膜の写真である。図３と図４は本発明によって製造されるイオン架橋ＰＭＭＡ膜のそれぞれ２０倍および５０倍の写真である。

発明の要約中空繊維バイオリアクター内での基質依存性細胞生産に伴う問題は、最適の細胞増殖と生産物生産を可能にする中空繊維膜を製造する適切な材料の確認である。

ある種のイオン架橋ポリマーが中空繊維バイオリアクター内での基質依存性細胞の最適増殖のためのすぐれた材料を意外にも提供することが、今回判明した。

それゆえ、本発明は、陰イオンと陽イオン置換基と生理的ｐＨにおいてイオン化可能なその塩からなる群から選択されるペンダント基約０．５〜約２０モル％を含むイオン架橋ポリマーからなる中空繊維膜を用いる、中空繊維膜上の基質依存性細胞の増殖を促進する方法に関する。

本発明はまた、中空繊維膜上での基質依存性細胞の増殖促進方法であって、膜がペンダントスルホネート基含有モノマー約０．５〜１０モル含有メチルメタクリレートと、ペンダント四級窒素含有基を有するモノマー約０．５〜１０モル％を含むメチルメタクリレートコポリマーとの混合物からなる方法に関する。

発明の開示本発明に中空繊維として用いられるポリマーは生理的ｐＨにおいてイオン化可能なペンダント基約０．５〜約２０モル％、好ましくは約１〜約５モル％を有するポリマー、好ましくはイオン架橋ポリマーである。イオン化可能な基は陰イオン性または陽イオン性のいずれかであり、下記に挙げるような置換基とその塩とを含む。さらに、陰イオン性基を含むコポリマーは陽イオン性基を含むコポリマーとと結合して、イオン架橋ポリマーを生じ得る。前記コポリマーの好ましいブレンドには、約５：１〜１：５までの比、好ましくはいずれかのタイプの基がやや過剰である、例えば約１．１：１のような比であるようなブレンドを含む。

好ましいポリマーはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のコポリマーである。さらに、他の通常のポリマーをそれらがイオン化可能なペンダント基を有さないとしても、物理的性質の改質のために加えることができる。

陽イオン性基は通常の四級窒素含有基とそれらの塩を含む。好ましい塩はノーリドとスルフェート塩を含み、とくにクロリド塩である。

陰イオン性基にはスルホネート基、例えばスルホン酸とカルボン酸基とその塩とを含む。典型的な塩には、金属陽イオン、例えば−価、二価または三価陽イオン、すなわちナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウムなどの塩、とくにナトリウム塩である。

本発明に使用可能な、好ましいポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）膜とそれらの製造方法は米国特許第４．４３９．３２２号に詳細に記述されており、この特許は本明細書の一部としてここに引用するものである。

好ましいＰＭＭＡ膜は２種類のポリマー：　（ａ）ペンダントスルホネート基を有するモノマー約０．５〜１０モル％を含むメチルメタクリレートコポリマーと；　（ｂ）ペンダント四級窒素含有基を有するモノマー約０．５〜１０モル％を含むメチルメタクリレートコポリマーとからなる。

コポリマーの１つはスルホン基を有する多陰イオンタイプであり、多陽イオンタイプの他方のポリマーは四級窒素含有基を有するので、このコポリマーから製造される膜はイオン架橋した多イオン複合体膜である。

２種類のコポリマーを約１＝９〜９：１までの重量比で混合することができる。

この混合比はコポリマー中のスルホネート基数と四級窒素含有基数とが約５＝１から１＝５まで、好ましくは約２：１から１：２までの比を有することを保証するために選択するのが好ましい。膜の強度の見地から、イオン複合体は実質的に等しい数のスルホネート基と四級窒素含有基から形成すべきである。しかし、コポリマー中のスルホネート基数と四級窒素含有基数とが膜を陽イオン性または陰イオン性にするような比を有することを保証するような混合比を用いることも好ましい。

本発明に使用可能な中空繊維膜は実質的に円形の中空断面、約５〜５００ミクロンの範囲内の均一な壁の厚さ、および約７０〜１０００ミクロンの内径を有する。膜の多孔度は６ＫＤ〜約３０００ＫＤの分子量排他範囲（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｒａｎｇｅ）を与えるように設計される。

基質依存性細胞ラインの典型的な例は通常の２倍体細胞株、例えばヒト胎児肺細胞、ヒト包皮細胞、ヒト胎児腎細胞、ニワトリ、ウサギ、マウスおよびラットの胚線維芽細胞、チンパンジー胚線維芽細胞、ラットグリア細胞、ネコ科動物胚線維芽細胞および二次サル腎細胞；−次細胞、マウスマクロファージ、ラットすい細胞、ラット肝細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、例えばマウス線維芽細胞、正常ラット肝細胞、チャイニーズハムスターの卵巣と肺の細胞、ベビーノームスター腎細胞、チノパンツー胎仔肺細胞、アフリカミドリザル腎細胞、マウスＬ細胞、ＨｅＬａ、マウスマクロファージ細胞ライン、形質転換イヌ腎細胞、肉腫ライｌレス形質転換ラットグリア細胞とマウス線維芽細胞、ヒトグリオーム細胞、ヒト骨肉腫細胞、マージンダルビー（Ｍａｒｔｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ科動物腎細胞、ＫＢ細胞、アカゲザル腎細胞、マクコイ細胞、ヒト甲状腺癌細胞、ヒト横絞筋肉腫細胞、ラット筋肉誘導線維芽細胞およびウサギ角膜細胞である。

次に、本発明を下記実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、請求の範囲によって定義される発明の範囲を画定または限定するものではない。

実施例１中空繊維バイオリアクター系における基質依存性ヒトグリオーム細胞ラインの培適している。イオン架橋ポリメチルメタクリレ−）　（ＰＭＭＡ）中空繊維［トレイ（Ｔｏｒａｙ）　ｒフィルトライザー（Ｆｉｌｔｒｙｚｅｒ）　Ｊ透析器シリーズ］はバイオリアクターの特別毛管スペース（ＥＣＳ）内への細胞の良好な付着を可能にする。細胞を含まない流れが繊維の内腔を通って流れ、栄養素と細胞集団（ｃｅｌｌ、　ｍａｓｓ）による代謝廃物とを拡散交換する。バイオリアクターの大きな表面積（２０１１つは効果的な物質輸送を可能にし、組織様細胞密度が得られる。グリオーム間葉特別細胞マトリックスタンパク質（ＧＭＥＭ）　、１０００Ｋｄ糖タンパク質がＥＣ８内の細胞によって分泌され、その場で中空繊維膜の１０Ｋｄ分子量カットオフ（ＮＷＣＯ）によって回収される。

通常のバイオリアクターは統合溜め（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）内で開始し、終了する再循環流ループとして形成される。振動ポンプが４００ｖｌ／分でこのループを駆動する。酸素補充のためにバイオリアクターの上流に酸素添加装置を配置した。空気ポンプが酸素添加装置への空気流量を制御する。螺動注入ポンプが新鮮な培地を溜めに供給する。別の螺動ポンプを用いて血清をバイオリアクターＥＣ３に供給し、ＧＭＥＭを回収する。

培養培地の温度とｐＨは溜め内でモニターした。温度は３７℃に一定に維持し、ｐＨは二酸化炭素／炭酸水素塩緩衝系を用いて７．２５に維持した。

系の組み立てと滅菌中空繊維系のオートクレーブ処理可能な部分をあらかじめ組み立てて、滅菌する。滅菌重点中空繊維バイオリアクターと酸素添加装置を系に無菌条件下で組み入れる。完全な組み立て体をベンチトップ系室に移す。すべての付属装置、例えばカーポイ（ｃａｒｂｏｙ）　、ビン、ガスラインおよび器具類をこの組み立て体に接続する。

−フラスコを用いて完全培地内に展開させる。完全培地は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２％Ｌ−グルタミンを加えたダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改良イーグル培地（ＤＭＥＮ）からなる。細胞はフラッシュ輸送中に緩衝生理的食塩水による洗浄、トリプシン添加および新鮮培地を用いてヘモサイトメーター（ｈｅｍｏｃｕｔｅｏｍｅｔｅｒ）上で生育可能な細胞を計数する。Ｔ−１７５フラスコから適当な接種物が得られた。培養物を遠心分離し、培地中に再懸濁し、接種ビン中に移す。接種物の発生は約１０日間を要する。

■　接種物をバイオリアクターＥＣ８に入れた後、ＥＣ８供給ラインから適当な量のＦＢＳ含有ＤＭＥＮによって残留接種物を洗浄する。

製造　接種後に、細胞集団の迅速な発生に寄与する「増殖段階」が細胞増殖に最適な条件によって開始された。増殖する細胞集団に遅れないように、注入速度を促進する。次に、細胞は増殖段階から維持状態（第３週）に移行する。この場合に、細胞の増殖は停止するが、それらの生育可能性と活性とは保存される。処理（ｒｕｎ）の残りは「製造段階」であり、これは次の４週間２　ｍｇ／ｍｌに維持され、７Ｑ　ｍｇ／日の速度で回収されるＧＭＥＭの製造に寄与する。

基質依存性セルラインがイオン架橋ＰＭＭＡ基質上で好都合に増殖することをさらに説明するために、他のこのような細胞ラインをイオン架橋ＰＭＭＡとセルライン中空繊維とを用いて、インビトロで培養した。クタンデルフエライン腎細胞（Ｃｒａｎｄｅｌｌ　Ｆｅ１ｉｎｅ　Ｈｄｎｅｙ　Ｃｅ１ｌ）　（ＣＲＦＫ）が、このために用いた上皮性質を有する。基質依存性細胞ラインである。（１）細胞の基質選択（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）と（２）中空繊維細胞培養物中への基質材料の可能な使用とを確認するための中空繊維材料によるインビトロでの細胞培養法を下で説明する。この方法を用いて、基質依存性細胞の有効な培養のための基質としてのイオン架橋ＰＭＭＡの利点を実証する。

材料および方法　２種類の中空繊維材料ソース、すなわちイオン架橋ＰＭＭＡとセルロースとを用いた。繊維を洗浄し、オートクレーブ滅菌し、ＣＲＦＫ細胞の等しい培養物を接種した独立Ｔ−フラスコに入れた。培養物を一定期間平静に増殖させた。この期間後に、培養物を観察し、写真撮影した。

１．１つはＰＭＭＡを含み、他方はセルロース繊維を含む中空繊維バイオリアクターを開放し、それらの繊維を取り出した。繊維ソース：ＰＭＭＡ：ｒフィルトライザー」透析器シリーズ、トレイセルロース：ｒＣ−ＤａＫＪ透析器シリーズ、Ｃ，Ｄ、メディカル２、繊維を蒸留水のビーカーに入れ、次いで多量の蒸留水によって数回すすぎ洗いした。

３、各培養には少数の繊維が必要であった。それゆえ、約１〜２Ｃ■３量の繊維の束を蒸留水のビーカーに入れた。使用する繊維をビーカー中でオートクレーブ滅菌した（３０分間、湿式サイクル）。

４、滅菌サイクル後に、繊維を独立Ｔ１７５組織培養フラスコに入れた。

５、ＰＭＭＡ含有フラスコとセルロース繊維含有フラスコの両方に、４０ｘｌＯ ’細胞／ｍｌの細胞濃度のＣＲＦＫ培養物約５０．０１１を加えた。培養培地は、１０％ウシ飴仔血清［ハイクロン（Ｉｌｙｃｌｏｎｅ）　］　と］２％Ｌ−グルタミンラインタカ−］　とを補充したＤＭＥハイグルコース［イルヴイン］からなるものであった。

６、両フラスコを３７℃、７．５％ＣＯ！下にセットしたインキュベーターに入れた。

７、実験開始後から種々な時間に顕微鏡検査下で培養物とそれらの増殖進行とを観察した。実験開始後４日目に、写真撮影を行った。

畔　両フラスコ表面で細胞は良好に、期待通りに増殖した。しかし、Ｐ　ＭＭＡ繊維のみが細胞付着と増殖を示した。セット繊維では細胞増殖が観察されなかった。２種類の繊維のＣＲＦＫ細胞増殖促進力の差は写真に明白に認められる。

写真の説明１、セルロース（２０ｘ）２、セルロース（３３ｘ）セルロース繊維では細胞増殖は認められなかった（図１と図２）。繊維知覚の細胞の存在が認められるが、両者の間に相互作用は見られなかった。

３、ＰＭＭＡ　（２０ｘ）図３では、繊維表面全体で増殖する細胞が観察され、像部では細胞コントラストが容易に見られる。

４、ＰＭＭＡ　（５０ｘ）図４のＰＭＭＡ繊維のクローズアップでは、細胞が中空繊維の全外面に付着するのが示される。これは培養物中の全ＰＭＭＡ繊維に共通して見られた。

浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　ｆ　ｃルロース甲空ＫＲＬ　ｒｚｏｘ＞ＦＩＧ、３　イオ＞４ｓ　ＰＭＭＡｖ空Ｊリ−Ｕ　Ｉｇ　（２０Ｘ　）ＦＩＧ、　４　／Ｉ　Ｋ　ンｖ’１＃ＰＨＨＡ　＋’ｌｆ＄、Ｈ（５０×）手続補正書（昆）平成　３年り２月／／咋圓

Claims

【特許請求の範囲】

１．中空繊維膜上での基質依存性細胞の増殖の促進方法において、陰イオン性および陽イオン性置換基ならびに生理的ｐＨにおいてイオン化可能であるこれらの塩からなる群より選択したペンダント基約０．５〜約２０モル％を含むイオン架橋ポリマーからなる中空繊維膜を用いることからなる方法。
２．陽イオン性置換基を四級窒素含有基とその塩とからなる群より選択する請求項１の方法。
３．陰イオン性置換基をスルホネート基、カルボン酸基およびこれらの塩からなる群より選択する請求項１の方法。
４．ポリマーが陰イオン置換基含有コポリマーと陽イオン性置換基含有コポリマーとのブレンドからなる請求項１の方法。
５．中空繊維膜上での基質依存性細胞の増殖の促進方法において；膜がペンダントスルホネート基を有するモノマー約０．５〜１０モル％を含むメチルメタクリレートコポリマーと、ペンダント四級窒素含有基を有するモノマー約０．５〜１０モル％を含むメチルメタクリレートコポリマーとの混合物からなる方法。
６．コポリマー中のスルホネート含有基と四級窒素含有基とが約５：１〜１：５の範囲内の比で存在する請求項５の方法。
７．コポリマー中にビニルモノマーをさらに含む請求項５の方法。
８．基質依存性細胞がヒトグリオーム細胞である請求項１の方法。
９．基質依存性細胞がヒトグリオーム細胞である請求項５の方法。
１０．細胞培養バイオリアクター内の中空繊維膜上での基質依存性細胞の増殖促進方法であって、ペンダントスルホネート基を有するモノマーが約１〜約５モル％と、ペンダント四級窒素含有基を含むモノマー約１〜約５モル％を含み、いずれかのペンダント基をやや過剰に含むメチルメタクリレートコポリマーからなる中空繊維膜を用いることからなる方法。