JPS59184130A - フアクタ−８凝固因子ポリペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、新規なファクター■ポリペプチド類、即ち
、凝固活性を有するタンパク類に関するものである。さ
らに詳しくは、本発明は、古典的な血友病の治療、並び
にヒトおよび哺乳類の血液に対して望ましい凝固挙動を
示す様なポリペプチドまだはポリペプチド複合体のさら
に進んだ研究、および確認を行なう上で有用なものであ
る。

古くから、血漿ファクター■が血液の凝固に重要な役割
を果していること、並びにトロンビンがこのファクター
■の凝固作用を活性化すること、は知られていた。最近
のファクター■確認作業において、ファクター■は少な
くとも２個のポリペプチド、即ち■：Ｃおよび■：にと
称するもの、の複合体であるとの仮定がなされ、しかも
この■：Ｃ部分に凝固活性が存在することが見出された
。

ファクター■：Ｃに対するトロンビンの作用が研究サレ
、トロンビンは、該ファクターを数個の小ペプチドに分
解することにより活性化する、という結論が導き出され
た。しかしながら、これまでどの研究においても、ヒト
におけるトロンビン−誘発性ファクター■活性化作用と
、ヒトのファクター■：Ｃから形成された、はつきシと
決定されたポリペプチドのいずれかとを関連づけること
はできなかった。

例えば、Ｈｏ　ｙ　ｅ　ｒおよびＴｒａｂｏｌｄ　　は
、「ヒトのファクター■に対するトロンビンの影響ｊ　
Ｊ、Ｌａｂ。

Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、　９７：　５Ｏ−６４（１９８１）
、において、ウサギ由来のファクター■：Ｒに対する多
クローン性抗体を用いた免疫吸着剤クロマトグラフィー
により、ヒトのファクター■：Ｃを精製することを追求
している。次いて、彼らはファクター■二〇を精製ヒト
α−トロンビンと共にインキュベートし、トロンビンは
、少量ではファクター■二〇を活性化するが、大量の場
合には該ファクターを殆んど、または全く活性化しない
と結論　　　　　　。

している。彼らはまた、トロンビンの活性化作用　　　
　　　□１はタンパクサイズの減少による、と結論づ伊
ると共に、活性化されたファクター■：Ｃの分子量は約
１１６，０００であると提示した。しかし重要なことは
、彼らはファクター■：Ｃ活性を保持している特定のポ
リペプチド類、および■：Ｃ抗原決定基を同定すること
ができなかった、という点である。

Ｆｕｌ　ｃｈｅｒ　、Ｃ，Ａ、およびＺ　ｉｍｎｃ　ｒ
ｍａ　ｎ　、Ｔ、　Ｓ　、は、「ヘテロローガヌな沈降
抗体によるヒトのファクター■凝固促進性タンパクの確
認Ｊ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、ｏｆ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　７９　：　１６
４８−１６′５２（１９８２）において、血漿濃縮物を
ファクター■：Ｒに対するモノクローナル抗体を含有す
るカラムに通し、吸着されだ■：Ｃ／■：Ｒ複合体から
■：Ｃを溶離し、次いでファクター■：Ｃを第２のカラ
ムで濃縮することによシ、ヒト血漿濃縮物から精製度の
高いヒト、ファクター■：Ｃを得た、と述べている。次
いで、この純化ファクター■：Ｃを、これにトロンビン
を加える前、および後に、ドデシル硫酸ナトリウム／ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（以下１’−Ｓ　ＤＳ　
−ＰＡ’ＧＥＪ　　と呼称）により分析した。純化ファ
クター■：Ｃは、トロンビン添加前には、分子量（Ｍｒ
）　８０，０００および７９，０００の位置に比較的強
い二重線（ダブレット）で示されるもの、並びにこれに
加えてＭｒ約９２，０００の１個をはじめ、少なくとも
６個のより大きいＭ、Ｑ有し僅かに染色されるポリペプ
チドなどを含めて、様々な分子量のポリペプチドに対応
する、広範なバンド配列を５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に示した
。純化ファクター■：Ｃにトロンビンを加えると、トロ
ンビン添加前に認められたポリペプチド全てに、その減
少まだは消失が起きた。

血漿濃縮物の凝固活性はトロンビン添加に伴って上昇し
、トロンビン添加前の該物質に対し最高３倍に達した後
、減少した。純化ファクター■二Ｃの凝固活性もまた、
活性化前の物質の最高３倍に上昇した。このことは、ト
ロンビンがこれらの各場合において、本質的に同じファ
クター■：Ｃ活性化作用を有することを意味する。この
様に、純化ファクター■：Ｃは出発物質の約３２８０倍
の比活性を持っていたと報告されているので、当該技術
分野の人ならば、比活性のこの様な増加は高度に達成さ
れた精製度に起因するものと断定するであろう。この論
文には、賦活化された凝固活性をトロンビンによる活性
化前の純化ファクター■について観察されたバンド中の
特定の１、または１以上の数のポリペプチドに帰属する
根拠となるものは一切含まれていない。

本発明は、以下の特徴を有する、１まだは１以上のポリ
ペプチドを含有するファクター■：Ｃ凝固因子に関する
ものである： （１）１または１以上のポリペプチドは、↑４．約９２
ρ■に相当する位置にバンドを示す；あるいは鴇値約９
２．０００、約ｓｏ、ｏｏｏ、および約７９，０００に
相当する位置；あるいは約９２，０００、約７２ρ美、
および約７１，０００に相当する位置；あるいは約９２
，０００．約８０，０００、約７９，０００．約７２．
０００および約７１，０００に相当する位置にバンドを
示す（但し、鴨はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で測定したものである）； （１１）該凝固因子は１８００単位／ツ以上の凝固比活
性を示す； （１ｆｔ）該凝固因子は少なくとも１０分間以上、持続
した期間中、第（１１）ステップの活性を示す；そして
（１ｖ）該凝固因子はヒト、ファクター■：Ｃ抗体結合
能力を示す。

本発明はまだ、該凝固因子を含有する生物学的製剤、並
びに該凝固因子またはその製剤を投与することによシ、
血友病における凝血異常を治療する方法に関するもので
もある。さらにまた本発明は、ヒトのファクター■：Ｃ
をα−トロζビンで消化し、該消化作用を前述の凝固因
子の存在下に中断し、この凝固因子を回収することによ
り凝固因子を調製する、あるいはその濃縮製剤を製造す
ることに関する。さらに進んで、本発明は、ファクター
■二Ｃに対するモノクローナル抗体を含有している免疫
吸着剤から、凝固活性を喪失することな（■：Ｃポリペ
プチド類を回収する方法に関するものである。

加うるに、本発明はヒトのファクターＭｎ　：　ｃで予
め免疫化したマウスの牌臓細胞とマウスの骨髄腫からの
細胞を融合させることにより得られるハイブリドーマに
よって調製されたＩｇＧクラスのモノクローナル抗体で
あって、ヒトのファクター■：Ｃと反応し、該ヒトのフ
ァクター■：Ｃから導かれるポリペプチド類との間で下
記の反応挙動のうちのいずれか１つを示す抗体を提供す
るものである： （Ａ）Ｍ、、＝９２，０００　ｉＭｒ＝１．８０，００
０およびそれ以上；並びに５４，０００の、その様に導
かれたポリペプチドとは反応し、他方Ｍｒ−４４，００
０；７１、ｏｏｏ　；　７２，０００　；　７９，００
０　；並びにｓｏ、ｏｏｏの、その様に導かれたポリペ
プチドとは反応しない； （１３）Ｍｒ−９２，０００；Ｍｒ−１０８，０００お
よびそれ以上；並びに４４，０００の、その様に導かれ
たポリペプチドとは反応し、他方Ｍｒ−５４，０００ｉ
７１．０００　ｉ　７２，０００　ｉ　７９，０００　
；並びに８ｏ、ｏｏｏの、その様に導かれたポリペプチ
ドとは反応しない； （ＣＩＭｒ−７９，０００および８０，０００；並びに
嶋−１０８，０００およびそれ以上の、その様に導かれ
たポリペプチドとは反応し、他方Ｍｒ−４４，０００ｉ
　５４，０００　ｉ７１，０００　ｉ　７２，０００　
ｉ並びに９２．０００の、その様に導かれたポリペプチ
ドとは反応しない暮 （ＱＭｒ−１０８，０００およびそれ以上の、その様に
導かれたポリペプチドとは反応し、他方、Ｍｒ１０８．
０００以下の、その様に導かれたポリペプチドとは反応
しない（但し、ここで示したＭｒ値はポリペプチド類を
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミトゲ／ｌ’
％気泳動にかけることによシ得られた値である）。

既述した如く、本発明はファクター■：Ｃ凝同活性およ
びファクター■：Ｃ免疫学的挙動　を示すと共に、ドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリ／Ｌ’７ミｌ’ゲ）ｖ
電気泳動（以下［ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥＪと呼称）法
で分析した際に特徴的な残値を示すポリペプチド凝血因
子群を包含するものである。本明細書において、以後「
ポリペプチド複合物」という語句は、物理的にはっきり
と区別できるポリペプチド類の２まだはそれ以上の組合
わせからなる凝固因子を意味するものとする、が、唯一
個の識別可能なポリペプチド、即ち、Ｍｒ−９２，００
０にバンドを示すポリペプチドだけを含有する製剤をも
意味するものとする。

以下の記述はヒト、ファクター■：Ｃを用いた本発明の
特許請求に係る凝固因子の製造方法を示すものであって
、該ファクター■：Ｃは新規な生成物の同定並びに確認
を、余分なポリペプチドの影響を受けることなく、行な
うだめに高度に精製されている。しかしながら、特に指
示しない限シ、本発明そのものは、それ以前に田発物質
がどの様に処理されたか、を問題にしないということを
強調しておく必要がある。本発明に係る活性なファクタ
ー■：Ｃポリペプチド群は、後に非常に詳しく述べる如
く、トロンビンによる消化、あるいは、同様の作用を有
するプロテアーゼ類、例えばファクターＸａ１ファクタ
ー■λ、またはラッセルのマムシ毒−■などによる消化
によって製造される、のみならず、ＤＮＡ組換え技術、
即ち、当該技術分野で通常の知識を有する人々にとって
は自明の方法により、所望のポリペプチドを製造するた
めの１または１以上の遺伝子を導入された細菌、酵母ま
だはその他の細胞によって所望のポリペプチドを製造す
ることによっても調製することができる。所望の複合物
を得るだめのいずれの工程においても、１または１以上
の他のポリペブチ１類を含Ａ−″複合物””１ＥＩｊｊ
ＬＪｉ４　ｊ　、！Ｊ（“１０１　　　　　　　。

る。

ヒトのファクター■：Ｃを含有するあらゆる血漿または
血漿濃縮物を利用することができる。新規な凝固因子は
、本明細書中に参考として引用したアメリカ特許第４，
３６１，５０９号、１９８２年１１月３０日発行、に記
載されている方法に従って極めて高度に精製されたヒト
のファクター■：Ｃから調製することができる。この方
法においては、血漿または血漿濃縮物の如きファクター
■：Ｃ源を、ファクター■：ｋに対するモノクローナル
抗体類の結合した免疫吸着剤カラムに通している。ファ
クター■：に／■：Ｃ複合体がカラムに吸着され、次い
でファククニ■：Ｃを溶離し、とれをアミンへキシルア
ガローヌの如き第２のカラムに通す。第２のカラムもま
た、ファクター■：Ｃに対する抗体を含有する免疫吸着
剤であってもよい、ということは注目すべきである。フ
ァクター■：Ｃは、α−トロンビンおよび他のプロテア
−ゼ類を伴なうものであってはならない。このファクタ
ー■：Ｃは、例えば０．３Ｍ塩化カルシウムを含有する
ｐＨ約６．８〜約７゜４の緩衝化された食塩中で都合良
く保存することができる。

次いて、ヒトのファクター■二〇を、後述するようなポ
リペプチド複合体の生成に有効な条件下でα−トロンビ
ンによシ消化する。純化α−トロンビンは、Ｆｅｎｔｏ
ｎ、Ｊ、Ｗ、［；Ｆａｓｃｏ、Ｍ、Ｊ、；Ｓｔａｃｋｒ
ｏｗ。

Ａ、Ｂ、；Ａｒｏｎｓｏｎ、Ｄ、Ｌ＋ＨＹｏｕｎｇ、Ａ
、Ｍ、　；およびＦｉｎｌａｙｓｏｎ、Ｊ、Ｓ、著、　
［ヒトトロンビン。α−トロンビンの製造、評価、並び
に性質。Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５２：３５８７−３５９８（１９７７）、
に記載されている方法によって得ることができる。

α−トロンビンおよびファクター■：Ｃを水性の糸、好
ましくはｐＨ約６．８〜約７．４に緩衝化された糸にお
いて一緒にする。トロンビンは、ファクター■二〇と反
応させるに充分な様、ファクター■：Ｃに相当するだけ
の量であって、しかも所望の活性なポリペプチド複合物
を回収し得るよシも以前に、該ファクター■二〇が不活
性なポリペプチドに分解されてしまう程には多くない量
、存在させる必要がある。例示の如く、１−中にファク
ター■：　Ｃ２００’−４００栄位を含む製剤（０，２
ダ／ｒｎｌ）は、α−トロンビン約０．１〜約０．５単
位／ｒｎｌにより消化させる必要がある。消化は室温で
行うことができる蟇温度が高すぎるとクンノマクが変性
し、低すぎると消化の進行が抑制される。

所望のポリペプチド複合体の生成に充分な長さの時間、
消化させておく。適当な時間は、０．１〜約６０分、好
ましくは０．１〜３０分である。１〜１０分の間の時間
が特に適当であることが見出された。しかしながら、至
適時間は、処理されているファクター■：Ｃ出発物質の
一部を用いて行う最小の実験により確認することができ
る、ということは理解されるであろう。至適時間は、残
約９、２．．０００を示すポリペプチドの最大量、およ
びこれに付随して、該Ｍｒ９２，０００ポリペプチドを
著しく分解することなく、約７９，０００および約ｓｏ
、ｏｏｏの残ダブレットを示すタンパク複合物、の各々
を生成する時間である。このＭ２Ｏ，ｏｏ。

−ｓｏ、ｏｏｏダブｌ／７ト複合物は、呑値７１，００
０−７２，０００にダブレットを示す複合物に分解され
だ後、作用を現わすのかもしれない。しかし７１．００
０−７２，０００ダブレツトは、単独ではファクター■
二〇活性を示さない。

次いで、反応混合物に有効量の（Ｐ−アミノフェニル）
メタンスルホニルフルオライド（以下「ｐ　−ＡＰＭＳ
Ｆ　Ｊと略す）または他のトロンビン阻害剤を加えるこ
とによシ消化を中断する。ｐ−ＡＰＭＳＦはα−トロン
ビンがさらにファクター■：Ｃタンパク類と反応するこ
とを阻止するが、これらのタンパク類を分解するもので
はない。ｐ−ＡＰＭＳＦ添加量は、反応混合中に当初存
在していたα−トロン活性１単位につき、約１．５〜約
２．５ミリモルであることが必要である。

ｐ　−ＡＰＭＳＦはＣａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｍｅｄｉｃ
ｉｎａｌＣｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒ　ｙ　Ｃ：ｏｍｐａｎ
ｙ　、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃ　ｉ　ｓ　ｃｏ　、Ｃａ１
ｉｆｏｒｎｉａを通じて入手し得るが、その製造方法は
、Ｌａｕｒａ。

Ｒ，津ｏｂｉｎｓｏｎ　、Ｄ、Ｊ、　；およびＢｉｎｇ
、Ｄ、Ｈ９著ｒ（ｐ−アミノフエニ／ｌ／　）メタンス
ルホニルフルオライド、セリンプロテアーゼの不可逆性
阻害剤」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８０）　１９
　、４８５９−４８６４．４８６１頁に記載されている
。

次にこの反応混合物を、本発明に係るポリペプチド複合
物を濃縮するだめの処理に付すことができる。ポリペプ
チド複合物は、純化型複合体の有する非常に高い活性を
与える形で複合体を得るために、他のファクター■およ
びファクター■以外のタンパク様物質に関して濃縮する
ことが好ましい。精製法としては、例えば限界濾過法、
超遠心分離法、イオン交換法、ゲル透過クロマトグラフ
ィー法、プレパラテイブ電気泳動法、等電点分画電気泳
動法、並びにゲルおよびアフイニテイクロマトグラフイ
ー法などを挙げることができる。

所望の複合物はまた、反応混合物（これは他の方法で予
め濃縮されていてもよい）を複合物のポリペプチド（類
）と反応しうる抗−ヒト■：Ｃ抗体あるいはヒト以外の
■：Ｃに列する同等の抗体を含有する免疫吸着剤カラム
に通すことによシ、濃縮および／または回収することが
できる。抗体類はアガロースに結合している（実施例１
の下欄参照）。複合物の濃縮および／またはその中のあ
るポリペプチドの分離に用いることのできる抗体。

類については後述する。活性■：Ｃ複合物は優先的にカ
ラムに吸着し、次にカルシウムイオンを含む溶液（例、
ＣａＣ１２）　（所望によシ非イオン性界面活性剤をも
含有してよい）によって溶離される。

適当な界面活性剤には、アルキルフェニルポリオキシエ
チレン類、例えばＴｒｉ　ｔｏｎ−Ｘ−Ｚｏｏ、−Ｎ−
１０１、または−Ｘ−４Ｑ５（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）ＨＴｗｅｅｎ−２０、−６０また
は−Ｆ３　Ｑ　（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣＯｏ
）；およびＮｏｎ１ｄｅＬ　Ｐ−４Ｑ（Ｓｉｇｍａ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌＣＯ９）などが含まれるが、これらは全
て化学式のわかった周知の商品である。

用いられるカルシウムイオンおよび界面活性剤の濃度は
ポリペプチド複合物を脱着するに充分な濃度であるべき
だが、溶離剤がポリペプチドを不活性化してしまう程、
高くないことを要する。カルシウムイオンの濃度は約０
．５Ｍまだは約１．０Ｍまで高めることができるが、０
．２５　Ｍが好ましい。

界面活性剤濃度は、約１重量％まで高めることができる
が０．１重量％が好ましい。溶離剤を免疫吸着剤カラム
に約１〜約８床容量／時、好ましくは約３〜約４床容量
／時の速度で適用する。流速が高すぎるとカラムが破壊
され、ポリペプチド複合物の吸着が起こらない危険性が
ある。熟練した実施者ならば、これらの指示を固定床カ
ラム以外の免疫吸着工程に容易に適応させることができ
るであろう。

■二Ｃポリペプチド複合物は、ｐＨ約６．８〜７．４に
おいて適当な緩衝液中に回収され、この中には溶離溶液
からのカルシウムイオン並びに界面活性剤も含まれてい
る。実施例１において用いる様に、より低濃度のカルシ
ウムイオンを含有する■：Ｃ緩衝液、等の緩衝液に対し
て上記の溶液を透析することによシ、カルシウム並びに
界面活性剤の濃度を下げ、好ましくは界面活性剤を除去
することができる。本発明の複合物はこの溶液中に、あ
るいは凍結乾燥して保存することができる。この複合物
は血友病性凝血異常の患者に対し、カルシウム濃度を生
理学的に許容し得る様に調節して投与することができ、
その滅菌食塩水溶液を注射投与することができる。

次に示す如く５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、本発明の
凝固因子は、■約９２，０００を示し、正常な状態で約
７９，０００および約８０．０００１１７）Ｍ、Ｊ”ブ
レットを示す物質（その内の幾分かは分解して約７１．
０００および約７２，０００の為ダブレットを示す）を
含むこともある。その純化型においては、このバンドあ
るいはこれら一群のバンドが、本来、現われる唯一のバ
ンドである。しかしながら、本発明はまだ、本発明に係
る凝固因子を含有することを示すタンパク性物質を１０
０％以下、即ち、９５％、９０％、または８０％、７０
％、６０％、さらに少量の３０％、２０％、１０％、あ
るいは１％、含有する生物学的製剤をも包含するもので
あることを認識しておくことが必要である。本発明は従
って、そのファクター■：Ｃ活性が本発明の凝固因子の
存在に起因している様な製剤をも包含するものである。

本発明に係るタンパク複合物は、精製したヒトのファク
ター■：０１前述のアメリカ特許第４，３６１．５０９
号で開示され請求されている方法で精製されたヒトのフ
ァクター■：Ｃなど、よりも高い■：Ｃ凝固比活性（活
性／総タンパク量、ツ）を有する。実際、純化複合物の
活性は数倍であシ、例えば、精製したヒトのファクター
■二〇の３〜５倍、さらに好都合には少なくとも１０倍
、あるいは５０倍もの活性を示す。同様に、本発明の複
合物を、１または１以上の他のタンパク類と一緒に含有
した、従来知られている凝血剤製剤が与えるより高い比
活性を有する生物学的製剤を得ることができる。複合物
、並びにそれを含有する生物学的製剤の比活性は、１８
００単位／ｑ以上、好都合には５，４００単位／ｍｙ、
より好都合な態様では７，５００、さらには１０，００
０単位／”１９以上にも達する。好ましいのは、本発明
製剤の比活性が本発明で用いた精製したヒトのファクタ
ー■：Ｃの３〜５倍、好都合には少なくとも１０倍、５
゜倍、あるいは１００倍にも達することである。

本発明に係るタンパク複合物、およびその生物学的製剤
は、上記の優れた活性が少なくとも約１０分間、好まし
くは少なくとも約３０分間、持続的に存在することを特
徴とする。勿論、活性は一般にもつと長期間安定である
。複合物はまた、ファクター■：Ｃタンパクの免疫学的
特性、即ち、ヒトのファクター■二〇に対する抗体と結
合する性質、を有している。このことは、例えば、以下
に述べる様にファクター■：Ｃに対するモノク０−ナル
抗体を増大させ、この抗体をアガロ−ヌカラムに結合さ
せ、とのカラムに複合物の水溶液を通し、得られた溶液
のファクター■：Ｃ活性を分析することによシ確認する
ことができる。

本発明は、ＰＬ４ｒ−９２，０００および％＝７９，０
００−ｓｏ、ｏｏｏのポリペプチドは、タンパク分解お
よび破壊され易く、結果的に凝血側活性を喪失し易いこ
とで有名な、天然のヒトのファクター■：Ｃに比べて安
定である、という点においても望ましい寄与を果すもの
である。この安定性はこの明細書で述べる処理段階を経
てもポリペプチドの活性が残存している、ということで
証明される。

実施例１ この実施例は、ファクター■：Ｃの市販濃縮物からの精
製並びに精製α−トロンビンによる消化の方法に関する
ものである。ファクター■二Ｃに対するモノクローナル
抗体を製造し、■：Ｃポリペプチドの同定に用いた。消
化過程において数回、消化混合物の一部分に関して■：
Ｃ（凝血）活性、並びに５ＤＳ−ＰＡＧＥに基くタンパ
クのバンドを分析した。

■二〇の精製 全工程は室温で行なった。化学薬品は全て試薬用であっ
た。市販のファクター■濃縮物（Ａｒｍｏ　ｕ　ｒＰｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ提供）を■：Ｃ緩衝液（０，
０２Ｍイミダゾ−／ｌ／１０．１５Ｍ塩化ナトリウム１
０．ＩＭＬ−リジン）ＩＣＩｌｏ、０２％ナトリウムア
ジド、ｐＨ６，８）中に入れて復元した。合計１７，０
００単位の■：Ｃ活性を有するこの試料を比容量２．５
−３．ｏｐ！の免疫吸着剤カラムに入れた。カラムは臭
化シアン−活性化アガロース（セファロース４Ｂ、　Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　、　Ｎ
ｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　）Ｔあり、これに■：Ｒに対する
モノクローナル抗体が共有結合で結合している。前述の
アメリカ特許第４，３６１，５０９号に記載されている
方法に従って抗体を調製し、カラムに吸着させた。抗体
は、５０％硫酸アンモニウムで腹水から沈澱させ、さら
に２回再沈澱させた後、セファロースに対して密度２〜
４　ｑ／ｍｌでカラムに吸着させた。免疫吸着剤を、３
Ｍチオシアン酸ナトリウムによって予め溶離処理し、■
二Ｃ緩衝液（０，０２Ｍイミダ７゛−／ｌ／ＨＣＩ　　
ＰＨ７，０、０，ｌ　　５　　Ｍ　ＮａＣ１、Ｑ、ＩＭ
Ｌ−リジン−ＨＣｌ　、　０．０２％ナトリウムアジド
）で洗浄し、２ｍＭジ−イソプロピルフルオロホスフェ
ートで２回処理した後、濃縮物を加えた。

カラムを０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有■：Ｃ緩衝液２
０Ｊで洗浄し、０．３５Ｍ塩化カルシウムを含有する■
：Ｃ緩衝液で■：ｋから■：Ｃを溶離した。活性な画分
を集め、ＹＭ−ＩＱ膜を備えたＡｍ１ｃｏｎ攪拌室内で
、窒素圧下１００倍に濃縮した。次いで、この濃縮物を
■：Ｃ緩衝液で１：１０に希釈し、０．０２５Ｍ塩化カ
ルシウム含有■：Ｃ緩衝液で平衡させたアミノヘキシル
−セファロヘスの４−カラムに適用し、０．３Ｍ塩化カ
ルシウム含有■：Ｃ緩衝液で流速１０ｍ１１時で溶離す
ると、■二〇が高濃度で得られる。濃縮された免疫吸着
剤プールを０．２５Ｍ塩化カルシウムに調節し、モノク
ローナル抗−フイブリノーゲン、抗−フィブロネクチン
および抗−ＶＷＦ抗体（これらは臭化シアン活性化セフ
ァロースに結合されている）の混合物に対し１／１０（
Ｖ／Ｖ）の割合で、１時間づつ、２回吸着させた。

■二〇に対すゐモノクローナル抗体の製造モノクローナ
ル抗体類は、アメリカ特許第４，３６１．５０９号に記
載されている如くにして、精製■：Ｃを抗原として製造
した。抗体類をＬｉｎｂｒｏ−Ｔｉｔｅｒｔｅｋ（Ｆｌ
ｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｇｌｅｗｏｏ
ｄ。

ＣＡ）プレート類、および、Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅ、オよ
びＰｅｒｌｍａｎｎ、Ｐ、著［酵素結合免疫吸着剤分析
（ＥＬＩＳＡ）、免疫グロブリンＧの定量分析」Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８：８７１−８７４（１９７
１）、に記載の検出系内において、共役ペルオキシダー
ゼ抗体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂ
ｕｒｌｉｎｇａｍｅ。

ＣＡ）を使用し、固相分析法によって選別した。

プレート類を、くぼみごとに精製■：　Ｃ１００ｎｇで
被覆しだ。この研究に用いるだめに選別したクローンの
ＥＬＩＳＡ−陽性培養上澄み液もまた血漿■：Ｃ活性を
阻害した。

精製ヒトα−トロンビン（比活性２５３４　Ｕ／’？、
最終濃度０．５Ｕ／ｒｎｌ）を、Ｑ、　Ｑ　４　ＭＣａ
Ｃｌ　２含有イミダゾ一ル生理食塩水緩衝液中に入れた
精製■：Ｃ（最終濃度１６７μｇ／ｒｎｌ）に加えた。

対照部分には緩衝液のみを加えた。溶液を室温でインキ
ュベートし、種々の時間間隔をあけて、■：ｃ−トロン
ビン混合物試料を、トロンビンを迅速かつ非可逆的に不
活性化するためにｐ−ＡＰＭＳＦ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａＭｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｃｏ、）の入
った試験管に採取した。ｐ−ＡＰＭＳＦの加水分解を最
少限度に止めるため、ヌトツク溶液（１００ｍＭ／メタ
ノール溶液）を、イミダゾール生理食塩水緩衝液により
■：Ｃ−）ロンビン試料との反応の６０秒前に、１／１
０の比率で希釈した。最終的なｐ−ＡＰＭＳＦ＃度はｌ
ｔｎＭであった。対照部分も、実験の初めにｐ　−ＡＰ
ＭＳＦで同様に処理した。６０分間の時間的経過を終え
た時点で全ての■：Ｃ試料を文献記載の如く、活性化部
分的トロンボプラスチン時間分析法で■：Ｃ活性に関し
て分析し、キの後５ＤＳ−ＰＡＧＥの調製に備えた。

５ＤＳ−ＰＡＧＡ　ｌ一方法Ａ」 不連続なＳＤＳポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動
法は、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ　２２
７　。

６８０−６８５．１９７０の方法に基いて行なった。「
方法Ａ」を次に示す： ■、試料の調製 （１）タンハク試料（理想的にはタンパク５−６０μｇ
を含有するもの５Ｏ−１００ｕｌ）を試料緩衝液に対し
て一夜、室温で透析する。試料がカルシウムイオンヲ含
有する場合には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　
）ｌ　ＱｍＭを試料緩＃液中に含有させる。

（２）透析した試料を試験管に入れ、１／１ｏ容量の１
０％ＳＤＳを加える。試験管をアルミニウム箔で被う。

試料を沸騰中の水浴中で１０分間加熱する。

（３）試料を水浴から出し、５００ｍＭジチオトレイッ
トを１／１０容量、加える。これを５６°Ｃで４時間、
インキュベートスル。

（４）試料を室温まで放冷し、グリセリンストック溶液
およびブロムフェノールブルーストック染料溶液を最終
濃度がそれぞれ１０％および０．０５％になる様に加え
、ゲル上に重層するため調製する。

０．５％ブロムフェノールブルー （３）下層ゲルストック溶液ニドリス塩基１８．２Ｖ、
１０％５ＤＳ４ｒｎｌ、最終容量を１００ｍｌにする。

濃塩酸でｐＨ８，８に調節し、濾過する。

（４）上層ゲルストック溶液ニドリス塩基６．１９１１
’０％Ｓ　Ｄ　５４ｍｌ、最終容量を１００ｍｌにする
。

濃塩酸でｐＨを６．８に調節し、濾過する。

（５）試料緩衝液：　　０．ＯＩＭりん酸す）　ＩＪウ
ム、１、０　％　Ｓ　Ｄ　Ｓ、ｌＱｍＭニナトリウムＥ
ＤＴＡ、最終容量を１７１にする。水酸化ナトリウムま
たはりん酸を加えてｐＨを７．０に調節する。

ミド３（ｌを水５０ｒｎｌに溶かし、ビスアクリルアミ
ドｏ、ｓ〜を加えて溶解させる。最終容量を１００−に
調製する。この溶液を濾過し、４°Ｃで暗所に貯蔵する
。

（７）ストック用電極緩衝液：トリヌ塩基３０．３ｇ、
グリシン１４４．ＩＰ、最終容量を１１にする。

（８）電極緩衝液：　ストック用電極緩衝液１０〇−１
水８９０ｒｎ１１１０％５ＤＳ１０ｒｎ１０（９）スト
ック用りマシーブルー染料溶液＝　１％クマシーブルー
Ｒ２５０を水中に入れたものを少なくとも約３０分間室
温で攪拌して溶解させ、濾過する。

アンモニウムパーサルフェート、暗所ニ保管スル。

毎週新らたに調製する。

■、ゲルの調製並びに操作ニアクリルアミドの鍛縮濃度
−７，５％ （１）下層ゲル溶液 下層ゲル、２〇− 下層ゲルストック溶液　　　　　　　　５．０ｍｌアク
リルアミドストックｉ液５．０ｒｎｌ水　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｍＪＮ、Ｎ、Ｎ
？Ｎ／−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．０
０５ｍ１１０％アンモニウムパーサルフエー）　　０．
４ｍｌ上層ゲル溶液 上層ゲル１０ｒｎｌ 上層ゲルヌトツク溶液　　　　　　　　２．５　ｍｌア
クリルアミドストックｍｅ　　　　　　　１．０＋ｎｌ
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６
・５ｙｄＮＮ　Ｎ’Ｎ’−テトラエチレンジアミン（Ｔ
ＥＭＥＤ）０．０１　ｍ１１０％アンモニウムパーサル
７エー１−　０．０３ｍ１（３）力　法： ａ）１４．５α×９．０α×０，８朋スラブゲルのため
のスラブゲル装置を調製する。この装置は標準的な電気
泳動装置であって、例えば、Ｆｌｏｅ（［ｅｒＳｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ　Ｆｒ
ａｎｃｉｓｃｏ。

Ｃａｌ　ｉ　ｆｏｒｎｉａから人手可能である。

ｂ）ＴＥＭＥＤおヨヒアンモニウムパーサルフエート以
外の下層ゲル成分を５０−の耐圧フラスコに入れ、脱気
する。次いでＴＥＭＥＤおよびアンモニウムパーサルフ
ェートを加えて静かに混合し、即座に下層ゲルを加える
。下層ゲルに水−飽和ブタノールを重層し少なくとも１
時間、好ましくは２〜６時間、そのままにして重合させ
る。

Ｃ）ブタノール層を流し去り、下層ゲルの上面を完全な
上層ゲル混合物で洗浄する。（上層ゲル混合物は、上記
の下層ゲルと同様に、脱気し、Ｔ　ＥＭＥＤおよびアン
モニウムパーサルフェートヲ加えて調製する。） ｄ）上層ゲルを注ぎ入れ、くしを上層ゲル内に、そのく
しの歯の底部と上層ゲル−下層ゲル界面との間隔が少く
とも１．０Ｃ１ｎとなる深さまで入れる。

上層ゲル溶液で可能な限シ一杯に満す。このゲＩしに通
す前、少なくとも１時間上層ゲルを重合させる。

ｅ）くシを取除くには、電極緩衝液を上層ゲルの上面に
ピペット注入した後、くしを静かに取去る。

上層ゲル上面のくぼみを電極緩衝液を用いて数回洗浄す
る。

り作業のだめに装置を組立て、電極緩衝液を加える。試
料（類）を緩衝液層の下方の上層ゲルのくぼみに重層し
て適用する。

ｇ）このゲルを定電流で作動させる： 試料が上層ゲルにある間は８ミリアンペア、試料が下層
ゲルにある間は１５ミリアンペアである。

ブロムフェノールブルー染料の先端が下層ゲルの底面か
ら１．０αになった時点で電気泳動を止める。

ＩＶ、ゲルの固定および染色 参考文献：　Ｆａｉｒｂａｎｋｓ　、Ｇ、、５ｔｅｃｋ
、Ｔ、Ｌ、、およＮ。

びＷａｌｌａｃｈ、Ｄ、Ｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　　ＩＱ　　、　２５Ｑ６〜２６１７．１９７１゜ （１）ゲルを少なくとも１夜、密閉容器内で、２５％イ
ソプロパノ−ｙＶ、１０％酢酸、１％タームシ−ブルー
ストック溶液１０ｒｎｌを含有する最終容量を４００ｍ
１に調節した溶液中で固定化する。

（２）次いで、ゲルを少なくとも１時間、１０％イソプ
ロパツール、１０％酢酸および１％クームシ−ブルース
トック溶液１．０．ｎｌを含有する最終容量を４００ｍ
１に調節した液中に浸す。

（３）このゲルを変化が現われるか、あるいは完全に脱
染色されるまで約４時間、１０％酢酸中に浸漬する。

（４）この脱染色ゲルを、対照を明確にするためにゲル
乾燥機を用いて濾紙上で乾燥させることができる。

このゲルに５−２０＆のタンパクを適用した。

■二Ｃの捨値は還元フィブリノーゲン（Ｍｒ２００．０
００）、ホスホリラーゼＭＭｒ　９５，０００）、ウシ
血清アルブミン（Ｍｒ　６８，０００）、ＩｇＧのＨ鎖
（Ｍｒ　５０，０００）およびオバルミン（Ｍｒ　４３
，０００）を標準とし、移動距離に対して残値を片対数
表にプロットすることにより、還元試料に関して算出し
た。

最終的なゲルの写真プリントによる走査並びに積分は、
Ｚｅｉｎｅｈ軟レーザースキャニング濃度計を用いて行
なった。

結果　純化ファクター■：Ｃの比活性は２０００単位／
〜であった。トロンビンによる純化■：Ｃ活性に対する
賦活作用を６０分間のタイム・コースで分析した。トロ
ンビンを作用させる前の非処理■：Ｃ試料は、Ｍｒ−７
９，０００−８０，０００におけるダブレット、ないし
Ｍｒ−１８８，０００におけるバンドに至る特徴的な■
：Ｃ型配列配列していた。Ｍ、＝１８８，０００以上の
１個のバンド、並びにＭｒ−７９，０００以下の２個の
バンドはモノクローナル抗−■：Ｃ抗体免疫吸着剤と結
合しなかった。まだ、Ｍｌ−＝７９．０００およびＭｒ
−１８８，０００の間のバンドは抗−■二Ｃ抗体と結合
しなかった。

トロンビンによる賦活化タイム・コースの最初、’　　
　　　　　　（７）　５　ｆｆｒｔｓ’Ｊ　’ＴＦ・を
“９２・０００以上１あ、９％／　７　ＣＩ−ナル抗−
■：Ｃ抗体反応性バンドは、１個を除き全てが徐々に消
失し、５分後に■：Ｃ活性が最高に達した時点で検出さ
れなくなった。

Ｍ、＝１２２，０００におけるバンドはいくつかの実験
においてのみトロンビン抵抗性を示しだが、過剰なトロ
ンビン処理の後には、このバンドも、他のいかなるバン
ドも固定化モノクローナル抗−■二〇抗体とは反応しな
かった。

Ｍｒ−９２，０００におけるバンドは、■：Ｃ活性が増
すにつれて強くなった。Ｍｒ＝　７９．　ＯＯＯおよび
ｓ　ｏ、’ｏ　ｏ　ｏにおけるダブレットは、残＝　７
１，０００−７２，０００ダブレツトに変換されると思
われ、■：Ｃ活性の減少する５〜６０分の間では、後者
の形態が優勢であった。Ｍ、＝　５４，０００およびＭ
、、−４４，０００の２個のバンドは５〜６０分の間に
明確に認め得る様になった。いくつかの実験では、Ｍｒ
−＝４４，０００バンドもまたダブレットのように見え
た。嶋＝７１，０００−７２，０００ダブレツト、残＝
５４，０００バンド並びにＭ、＝　４４，０００バンド
は固定化モノクローナル抗−■二〇抗体によっては有意
な程度に除去されなかった。

上で議論したゲルの走査および積分の結果から、ポリペ
プチド濃度と■：Ｃ活性における変化との関連性が考慮
される。結果は表に示されている。

表からイつかる様に、Ｍｒ＝９２，０００バンドはその
濃度か増加した後、■二〇活性と並行して減少した。こ
のことは、Ｍ、−＝９２，０００バンドが、トロンビン
の賦活化作用でその濃度が増大された活性型■：Ｃに相
当することを示唆している。Ｍ、＝５４．０００および
Ｍｆ−＝４４，０００バンドの濃度は、いずれも、１〜
４０分の間、混合物の活性が減少した後でさえも定常的
に増加した。

Ｍｒ＝　７９．　ＯＯＯ−８０，ＯＯＯダブレットの大
部分は、■二〇活性がピークに達する最初の０．１〜１
０分間の間に失なわれ、他方、鴇、−７１，０００−７
２，０００ダブレツトの大部分はこの期間に現われ、■
：Ｃ活性が減少した際にも優勢であった。

これらのデーターは、Ｍｒ−７１，０００−７２，００
０ダブレツトがＭｒ＝７９．　ＯＯＯ−８０，０００ダ
ブレツトから導かれたものであること、並びに残−７１
，０００−７２，０００ダブレツト自身は不活性である
ことを示唆するものである。また、この様なデーターは
、嶋＝７１，０００−７２，０００ダブレットのＭｒ−
９２，０００ポリペプチドと複合体を形成する能力が保
持されている、ということと矛盾しないものである：こ
の複合体もまた活性を有するであろう。

為＝９２，０００ポリペプチドが嶋＝７９，０００−８
０，０００ダブレットと複合体を形成していることの直
接的な証拠は、抗−■：Ｃモノクローナル免疫吸着剤を
用いた実験から導かれる。モノクローナル抗体はＭ、＝
９２，０００ポリペプチドでなく、残＝７９，０００−
８０，０００ダブレットと優先的に反応するということ
が初めて示された。即ち、このことは電気泳動転移実験
において明らかにされた。次いで、モノクローナル抗−
免疫吸着剤は、Ｍｒ−７９，０，ｏ　Ｏ−８０，０００
ダブレツトおよびＭ、＝９２，０００ポリペプチドを共
に溶液中から除去することが示された。Ｍ、；９２，０
００ポリペプチドは、Ｍｒ７９，０００−８０，０００
ダブレツトを結合させたままで、ｌ　Ｑ　ｍ　Ｍ　ＥＤ
ＴＡにより抗−■：Ｃ免疫吸着剤カラムから溶離するこ
とかできた。このダブレットは、続いて３Ｍチオシアン
酸ナトリウムによシ溶離された。以上の実験の結果は、
Ｍｒ−９２，０００ポリペプチドは’ｒ＝　７９゜ｏｏ
ｏ−ｓｏ、ｏｏｏダブレットと複合体を形成していたた
めに免疫吸着剤と結合しだのであり、免疫吸着剤と直接
に結合していたのは、該ダブレットであった、というこ
とを証明している。

実施例■ この実施例では、純化したヒトのファクター■：Ｃを、
既知の抗凝固酵素である純化したヒトの活性化蛋白質Ｃ
（以下、「ＡＰＣＪという）で処理した結果について記
述する。ヒトのファクター■：Ｃを既述した様にして純
化した。ＡＰＣは、トロンビンからＡＰＣを分離するの
にファルマシア（１’ｈａｒｍａｃｉａ）のＦＰＬＣ系
のモ／Ｓカラムを使用した以外はＭａｒｌａｒ、Ｒ，Ａ
、らの方法（Ｂｌｏｏｄ、５９巻、１０６７（１９８２
）、「トロンビン依存性抗凝固酵素、ヒトの活性化蛋白
質Ｃの作用機構」）に従って純化した。

アッセイ 血友病Ａ血漿基質を用いた活性化部分的トロンボプラス
チン・タイムアッセイを使用して、前記の方法で試料の
■：Ｃ活性を分析した。

電気泳動のだめの試料の調製゛ ＡＰ（Ｊ性にはカルシウムイオンが必要であるので、１
０．ＭのＤＡＰＡを含有している１００ｍＭＥＤＴＡの
１／１０容量を、■：Ｃ＋ＡＰＣ部分、対照■：Ｃおよ
びＡＰＣ部分に加えることにより、種々の時間にＡＰＣ
を停止させた。これらの部分標本に１／１０容量の１０
％ドデシル硫酸ナトリウムを添加した。次いで沸騰水浴
中でそれらを５分間加熱し、次いで前記した様に５ＤＳ
−ＰＡＧＥで透析した。

還元した■：Ｃの非連続ドテシル硫酸ナトリウム７．５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、Ｃｏ
ｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ　　ブ／Ｌ／　−Ｒ２５Ｑによ
る染色、ゲルの走査および積分は既述した様に行なった
。

試料調製 ０．３Ｍ塩化カルシウムを含有している■：Ｃ緩衝液０
．３ｍｌ中の■：Ｃの試料３３９μｇを緩衝液（５０ｍ
、Ｍｌ−リス−クロリド、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
５　ｍ　Ｍ塩化カルシウム、０，０２％ナトリウムアジ
ド、ｐＨ７，４）に刻して一夜透析した。

この透析した■：Ｃ試料に、緩衝液１゜０９５−、ウサ
ギ脳ケア　７　！Ｊ　ン９　Ｑ　ｐ、１３　（Ｓｉｇｍ
ａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　、Ｍ
Ｄ、製造業者の指示通り復元し、貯蔵し、融解した）、
および１ｍＭダンシルアルギニンＮ−（３−エチ／ｌ／
−１，５−ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）１５μ
βを加え、最終ＤＡＰＡａ度を１０μＭとしだ。１０　
ＩＬＭ（７）ＤＡＰＡはＡＰＣを有意に阻害しないので
、このＤＡＰＡはＡＰＣに存在する痕跡量のトロンビン
を阻害するために含ませた。試料の最終容量は１．５　
ｙｎｌ、最終■：Ｃ濃度は２２６　ｔ４／ｍｌであった
。この１．５１ｎｌの■：Ｃ試判から４００μｌを取り
、対照とした（■：Ｃと呼ぶ）。残シの１．１ｍｌにＡ
ＰＣ２０ＩＬｉ　１０　ｔｔ’りを加え、最終ＡＰＣ濃
度を９μｇ／−とした（■：Ｃ＋ＡＰＣと呼ぶ）。■二
〇を除いて全ての成分を同じ濃度で含有している第２の
対照試料を調製した（ＡＰＣと呼ぶ）。

■二〇単独、■二〇およびＡＰＣの混合物、ＡＰＣ単独
を３７°Ｃの水浴に入れ、一定のタイム・ポイントで試
料の一部を取シ、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび／または■：
Ｃ活性を分析した。また、長時間３７°Ｃでインキュベ
ートした後、合成基質Ｓ　−２２３８の加水分解で活性
を保持したＡＰＣを、対照において測定した。

結果 純化■：（４ＡＰＣを消化すると、対照の■：Ｃ活性の
ほぼ８５％が失なわれた。■：Ｃ活性のＡｐｃ非活性化
により、稗が９２，０００〜１８８，０００の全ての■
：Ｃポリペプチドが減退し、Ｍ、＝４５゜０００のポリ
ペプチドが生成し、一方Ｍｒ−７９−ｓｏ、ｏｏｏのダ
ブレットはそのまま残った。

ＡＰＣによる、純化■：Ｃの一定時間経過の非活性化に
より、３６０分間に渡って■：Ｃ活性が減少するに従っ
て、特異な■：Ｃポリペプチドが次第に減少することが
わかった。ゲルを走査および積分することにより、Ｍ、
＝１８８，０００のポリペプチドおよびＭ、＝９２，０
００のポリペプチドが■：Ｃ活性と平行して減少してい
くことがわかった。

中間的な為のもう１つのポリペプチドはＡＰＣにより開
裂されたが、ゲル走査により容易に定量されなかった。

この実験では、ＡＰＣによる消化らしくなく、Ｍｒ＝９
２，０００〜１８８．’０００のある種の■：Ｃポリペ
プチドはＡ　Ｉ）Ｃ消化に抵抗した。

しかし、Ｍｌ；７９−８０，０００のダブレットポリペ
プチドは、ＡＰＣよる消化の場合の様に、ＡＰＣにより
蛋白質分解を受けなかった。

Ｍｒ−４５，０００のポリペプチドは、Ｍ、−１８８゜
０００および９２，０００のポリペプチドの減少につれ
てその濃度が増加する様であシ、これは前者のポリペプ
チドが後者のポリペプチドの分解フラグメントであるこ
とを暗示している。Ｃｏｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅブルー
の染色では、その他の消化生成物は観察されなかった。

実施例■に示しだ様に、■：Ｃのトロンビン活性化の間
、Ｍｌ−＝９２．　ＯＯＯのポリペプチドは、■二〇活
性と平行して増減した。Ｍ、＝９２，０００のポリペプ
チドの蛋白分解と■：Ｃ活性の消失との間に直線関係が
存在するかどうかを調べるために、この時間経過による
非活性化実験のデータを再プロットし、■：Ｃ活性％対
Ｍｒ−９２，０００のポリペプチド％を調べた。■二〇
活性の量は、稗＝９２．０００のポリペプチドの量に比
例している様であった。

本発明のもう１つの目的は、ファクター■：Ｃと、α−
トロンビンの様なプロテアーゼとの反応によって形成さ
れる各種のポリペプチドに対して、予想し得ないことで
あるが、特異なモノクローナル抗体を提供することにあ
る。それぞれの抗体は、トロンビンまたは等価なプロテ
アーゼで活性化も消化もされていないヒトのファクター
■：Ｃと反応する。これらの抗体は、以下に述べる様な
個々の性質によって特徴づけられる。

（〜１つは、ここに記載したＭｒ−９２，０００のポリ
ペプチド、Ｍｒ−１０８，０００およびそれ以上のポリ
ペプチド、および終末−トロンビン消化物中に存在する
稗＝　４４，０００のポリペプチドと反応する。それは
、ここに記載した１Ｖ４ｒ−７９，０００−ｓｏ、ｏｏ
ｏのダブレットを示すポリペプチドとも、ここに記載し
たＭｒ−７１，０００−７２，０００のダブレットを示
すポリペプチドとも反応しない。

■）１つは、ここに記載したＭｒ−９２，０００のポリ
ペプチド、Ｍ、−１０８，０００およびそれ以上のポリ
ペプチド、および終末トロンビン消化物中に存在する残
＝５４，０００のポリペプチドと反応する。それは、こ
こに記載したＭｒ：＝７９，０００−ｓｏ、ｏｏｏのダ
ブレットを示すポリペプチドとも、ここに記載したＭｒ
−７１，０００〜７２，０００のダブレットを示すポリ
ペプチドとも反応しない。

（Ｑ　１つは、Ｍ、、−７９，０００−８０，０００の
ダブレットおよびＭｒ−１０８，ＯＯＯおよびそれ以上
のポリペプチドと反応するが、Ｍ、＝　９２，０００（
７）、ｌ”リペプチド、Ｍｒ−７１，０００−７２，０
００，Ｍｒ＝５４．０００．残＝４４，０００のポリペ
プチドとは反応しない。

（Ｄ）　１つは、Ｍｒ−１０８，０００およびそれ以上
のポリペプチドとのみ反応する。

これらの抗体はそれぞれ、他のポリペプチドをも含んで
いる混合物から、前記の複合体を濃縮するために使用す
ることができる。この様な混合物の１つは、ヒトのファ
クター■：Ｃをα−トロンビンまたは等価なプロテアー
ゼで部分的に消化することにより製造される。もう１つ
のこの様な混合物は、組み換えＤＮＡ技術によって製造
されるものであシ、この場合、所望のポリペプチドまた
は複合体は微生物によって発現され、混合物から他の蛋
白質様化合物で回収されなければならない。

抗体（〜、（ハ）、（９またはｐ）、あるいはこれらの
２つ、３つまたは全てを組み合せたものを実施例１に記
載した様にして免疫吸着剤に付着させることができ、複
合物を含んでいるポリペプチドを含有している混合物の
充填液をカラムに通す。充填溶液中に存在するＭｒが９
２，０００，７９，０００−８０゜０００および７１，
０００−７２，０００であるポリペプチドがカラムに吸
着され、このカラムから、もとの溶液をカラムから洗い
流した後、前記した様にしてこれらのポリペプチドを溶
出させることができる。得られた溶出液は、所望の活性
化■：Ｃ複合物について、充填液と（らべて濃縮されて
いる。

この新規な抗体は、ヒトの■：Ｃとトロンビンまたは他
のプロテアーゼとの反応があったかどうかを検出するだ
めの、分析の目的にも有用である。

というのは、これらの抗体は、その反応の生成物と反応
する能力があるからである。挙動（Ｂ）を持った抗体お
よび挙動（ｑを持った抗体は、いづれかがファクター■
：Ｃと結合すると、■：Ｃ凝固活性を中和することがわ
かった。この性質は、血友病関連障害の診断に有用であ
る。

これらの抗体の発見によシ、ここに記載したポリペプチ
ド複合物の成分を更に特性化することができる。即ち、
Ｍｌ、−９２，０００のバンドを示すポリペプチドは、
トロンビン消化によって破壊されず、Ｍｒ−７９，００
０−８０，０００のダブレットを示すあるいは■＝７１
，０００−７２，０００のダブレットを示すポリペプチ
ドには存在しない（少なくとも）２つのエピトープ（即
ち抗体結合部位）を含んでいる。これらのエピトープの
内の１つは残＝　４４，０００のポリペプチドの上にも
存在し、他方はＭｒ−５４，０００のポリペプチドに存
在する。

即ち、博＝５４，０００および残＝４４，０００のポリ
ペプチドはＭ、＝９２，０００のポリペプチドから誘導
される。また、残＝９２，０００およびＭｆ−＝７９．
０００−８０，０００のポリペプチドは、共通の前駆体
（群）から誘導される。ファクター■：Ｃ凝固活性を中
和する挙動（Ｂ）および（ｑを示す抗体の発見は、Ｍｒ
−９２，０００およびＭｒ−７９，０００＝８０，００
０のポリペプチドが凝固機能に重要であることを支持し
ている。Ｍｒ−７９，ＯＯＯ−８０゜０００のダブレッ
トを示すポリペプチドは、トロンビン消化によって破壊
される。そしてＭ、−９２゜０００のポリペプチドには
存在しないエピトープを含んでいる。

これらのモノクローナル抗体は、ヒトのファクター■：
Ｃの一般的な精製工程によって製造することができる：
即ち、純化■：Ｃに対するモノクローナル抗体を生成さ
せ、純化■：Ｃを部分的に消化、活性化して前記のポリ
ペプチド複合物を生成せしめ、特異なポリペプチドを同
定し、抗−■二Ｃ抗体を活性化生成物と反応させ、それ
が反応したポリペプチド（群）を同定することによりそ
の抗体を特性化する。この一連の操作は実施例■で詳細
に述べる。あるいはまた、部分的トロンビン消化生成物
から、所望の特定のポリペプチドを分離することにより
抗体を製造することもできる。

例えば、所望のポリペプチドと反応することが知られて
いるモノクローナル抗体をカップリングさせたアガロー
スを入れたカラムに免疫吸着させ、次いで溶出し、実施
例■に記載の方法でそのペプチドに対するモノクローナ
ル抗体を高める。

実施例■ ヒトのファクター■：Ｃに対するモノクローナル抗体は
、米国特許第４，３６１，５０９号に記載の方法によっ
て製造された高純化■：Ｃを用いて、以下の手法によっ
て生成させた。

以下の方法に従って、高純化ファクター■二〇をマウス
に注射した。初日に、０．０５　Ｍ　トリス、０．１５
Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、１ｍ
Ｍフェニルメチルヌルボニルフルオライド、トラクロー
ル１ｏ単位／−を含んでいるｐＨ７，３の緩衝液０．１
艷にこの蛋白質１ｏＩＬｇを溶解（または懸濁）し、同
容量のフロイントの完全アジュバントを加えて振盪する
ことにょシ調製ｌ−だ組成物をマウスに腹腔内注射した
。１４日目に、フロイントの完全アジュバントの代りに
７０インドの不完全アジュバントを用いるほかは上に記
載したものと同じものを再びマウスに注射した。２１日
目には、１４日目の注坏］をもう１度行なった。

３８日目に、純化■：Ｃだけを注射した。４２日目に、
マウスの肺臓を摘出し、Ｊ、Ｐ、１３ｒｏｗｎ　　らの
標準的手法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｂｅｍｉ−ｓＬｒｙ、２２５巻、ｐｐ　４９８
０−４９８３　（１９８０）、「モノクローナル抗体に
よる免疫沈殿によって同定される正常および悪性のヒト
細胞の蛋白質抗原」）に従って融合した。この標準的手
法に於いて、５０％ポリエチレングリコールの代シに３
５％ポリエチレングリコールＩ　０００を用いたことが
唯一の変更点であった。

実施例■の［■：Ｃに対するモノクローナル抗体の製造
」の項に記載した分析法を使って抗体を選択した。ただ
し、■：Ｃ活性を中和しなかった抗体もサブクローンし
、以下の如く処理した。

陽性であったクローンを２回ザブクローンし、■：Ｃに
対する抗体を産生ずる安定なりローンを、細胞の注射を
行なう少なくとも４日前にプリスタン０．５　ｙｎｌを
腹腔内に入れて予め処置したＢａ１ｂ／Ｃマウスの腹膜
腔に注射した。ハイブリドーマ細胞を、牛胎児血清を含
まないＤｅｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地０．５ｍ／
中、マウス竺たシ約５Ｘ、１０６細胞の濃度で注射した
。むくんできたらマウスを穿刺し、腹水を約１０単位／
１ｎｌでヘパリン中に集めた。複数のマウスからの腹水
を合わせ、モノクローナルＩｇＧの単離に都合の良い量
とした。５０％硫酸アンモニウムを使って腹水から抗体
を沈殿させ、更に２回再沈殿させた。この様にして生成
せしめた前記のΦ）、（ｑおよびｐ）に相当する抗−■
二Ｃ抗体はアガロースビーズに結合され、溶液からの純
化■：Ｃと結合することが示された。

■二〇の別のバッチ、１つは非処理、１つはトロンビン
蛋白分解にかけだものを実施例■に記載した５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ工程で分析した。次いで各バンドを電気泳動法的
に（ウェスタン転移）、ゲルからニトロセルロース片に
転移させた。使用した装置はＢｉｏ−Ｒａｄ　ｒＴｒａ
ｎｓ−ＢｌｏｔＪ　ｃｅｌ　ｌおよびＢｉｏ−Ｒａｄ　
モア’　／ｌ／　１６０．１．６動力供給（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ
、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　テあった。

転移緩衝液は、ＰＨ８，３，２０％メタノールに加えた
グリシンを含む２５ｍＭトリスであった。転移は９０ボ
ルト、１０ミリアンペアで１６−２４時間行なった。

抗体のそれぞれと反応させた特定のポリペプチドは、Ｗ
ｏＭ、Ｂｕｒｎｅｔ　Ｌｅの採用した方法、［つｘ７ｐ
７−プロッティングＪ　（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉ　５ｔｒｙ、１１２巻、１９ｓ−２ｏ３頁
（１９８１）、「ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲルから非改良ニトロセルロースへの電気泳動法
による蛋白質の転移および抗体並びに放射性沃素化蛋白
質Ａを用いたＸ線撮影」）を用いて決定した。

「緩衝液ＤＪは１０ｍＭトリス・クロライド、０、ｌ　
５ＭＮａＣ１，０，０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７，
４であった。

■、緩衝液Ｄ１００ｒｎｌと０．２５％ゼラチンを含ん
でいる皿に、転移した蛋白質を持ったニトロセルロール
片を入れる。この皿を回転振盪器の上に置き、ゆつくシ
と３０分間振盪させる。

２．この皿にモノクローナル抗体を添加する（０．１〜
１％の腹水まだは純化１ｇ０１ツ）。１２０分間振盪す
る。

３、ニトロセルロース片を次の様にして洗浄する（ａ）
緩衝液Ｄ１００ｍｌで１０分間。

（１））緩衝液Ｄ１００ｍｌおよび０．０５％のＮｏｎ
１ｄｅｔ−Ｐ−４０で３０分間、１０および２０分でか
える。

（Ｃ）緩衝液Ｄ１００ｙｎｌで１０分。

４、緩衝液Ｄ＋０．２．．５％ゼラチンおよび■　標識
純化ウサギ抗−マウヌＩｇＧ中にニトロセルロース片を
３０分間浸す。

５、ニトロセルロース片を次の様にして洗浄する（ａ）
緩衝液Ｄ１００−で１０分間。

（１））緩衝液Ｄ　＋　０．１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−
４Ｑおよび０５ＭＮａＣ１１００＋ｎＪで１６−２４時
間。

（Ｃ）緩衝液Ｄ１００ｙｄで１０分間。

６、ニトロセルロース片を２枚の濾紙にはさんで吸い取
り、このニトロセルロース片を密封プラスチック袋に入
れて保存する。

７、どの抗体とポリペプチド類が反応したかを調べるた
めに、 （ａ）文献に記載されている既知の標準的手法によシ、
ニトロセルロース片のオートラジオグラフを調製する。

（ｂ）このオートラジオグラフを、■二〇を転移させた
がモノクローナル抗体と反応させる代りに、Ｃｏｏｍａ
　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ　　ブ／Ｌ／−Ｒ２５０で染色したニ
トロセルロール片と比較する。

これらの手順によシ、以下の個々の抗体が生成したこと
がわかった。

Ｍｌ−９２，０００のポリペプチド、残＝　１０８，０
００およびそれより大きいポリペプチド類、終末トロン
ビン消化物中に存在するＭｒ−５４，０００または４４
．０００のポリペプチド類の一方または他方、と反応し
た４つの抗体、その他のポリペプチドはなし。このこと
は、後者の２つのポリペプチド類の起源は、Ｍｌ−＝　
９２．　ＯＯＯのポリペプチドのトロンビン開裂から来
ていることを示している。これはまた、Ｍ、−９２，０
００のポリペプチド上の２っのエピトープはその開裂に
生き残ったこと、およびこれらのエピトープはＭ、　７
９．　ＯＯＯ−８０，０００ダブレツト上に存在しない
ことを示している。

５番目の抗体はＭ、−７９，０００−８０，０００のダ
ブレットおよびＭｆ＝１０８，０００およびそれ以上の
ポリペプチド類と反応したが、Ｍ、＝　９２．０００の
ポリペプチドおよび終末トロンビン消化物中に存在する
ポリペプチドのいずれとも反応しなかった。このことは
、Ｍ、＝７９，０００−８０，０００のダブレットは一
＝９２，０００のポリペプチド上に存在しないエピトー
プを持っていること、およびそのエピトープはＭｌ−＝
７９，０００−８０，０００のダブレットのトロンビン
消化により破壊されることを示している。

これら５つの抗体の反応挙動は、Ｍｒ−９２，０００お
よび傅＝７９，０００−８０，０００のポリペプチドが
、共通の前駆体（群）から導かれることを示している。

第６番目の抗体は、Ｍ、＝１０８，０００およびそれ以
上のポリペプチド類とだけ反応した。これは、終末トロ
ンビン消化物中に存在するいずれのポリペプチドとも反
応しなかったので、それが反応したエピトープはトロン
ビン消化によって破壊されることがわかる。

これらの抗体の１つまだはそれ以上の生物学的製剤を調
製または貯蔵するには、相当するモノクローナルＩｇＧ
を、ヘパリン化した収集腹水から、収集後直ちに分離し
てもよいし、あるいは、その貯蔵溶液の冷凍部分を融解
してもよい。新しい試料であるか冷凍した試料であるか
に関係なく、この溶液は４°Ｃにして、同容量の燐酸緩
衝食塩溶液（ＰＢＳ）（ＰＢＳ：１．６　ｆ燐酸ナトリ
ウム、−塩基−水和物ｉ８．４ｆ燐酸ナトリウム、二塩
基無水物逼６１．４Ｆ塩化ナトリウム；水を加えて７１
　ｉ　ｐ８７．２）で処理する。この希釈した腹水は、
４°Ｃで攪拌下に流加することにより沈殿する。遠心分
離は、好ましくは１４．．０００　ｒＰｍで６０分間（
３ｏ。

０００×ｇ）で行なう。腹水の上澄液を更にＳＡＳで２
回沈殿させ、沈殿と上澄液の混合物を攪拌し、第１回目
のサイクルと同様にして遠心分離する。

３回目の沈殿から得たペレットを希釈した腹水と同じ量
のＰＢＳに再懸濁し、ＰＢＳに対して徹底的に透析する
。透析袋中に現れた凝固物は２０°Ｃで遠心分離して除
去する。透析したＩｇＧを、室温で、５％水酸化アルミ
ニウム水溶液と共に攪拌して吸着させ、吸着後２０’Ｃ
で遠心分離する。この吸着処理を、第１回目以降は２．
５％水酸化アルミニウム溶液を用いて少なくとも更に３
回くシ返す。この吸着させだＩｇＧを４°Ｃにし、上記
した様にＳＡＳで１回再沈殿させる。この沈殿させたペ
レットは、使用するまで一２０°Ｃで貯蔵することがで
きる。

モノクローナル抗体類を精製し、それらを含有している
生物学的製剤を保持するだめの２つの好ましい方法がＰ
、Ｌ、Ｅｙら（Ｉｍｍｕｎ　ｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒ
ｙ。

１５巻、４２９−４３６頁、「蛋白質Ａ−セファロース
を用いたマウス血清からの純化１　ｇＧｌ、■ｇＧ２ａ
およびＩｇＧ２ｂ免疫グロブリン類の分離」およびＣ１
Ｂｒｕｃｋら（Ｊ、Ｉｒｒｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、５３巻、３１３−３１９頁（１９８２）
、［Ｉ）ＥＡＥ　Ａｔ　［１−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅクロマ
トグラフィーによる腹水からのマウスモノクローナル抗
体の一工程精製法」）によって記載されている。

特許出願人　スクリップヌ・クリニック・アンド・リサ
ーチ・ファンデーション 代　理　人　弁理士　青白　葆　外１名手続補正書、え
） 昭和５９年　５月１０日 特許庁長　官　殿 １事件の表示 昭和５９年特許願第　　　　６５０３８　　号２発明の
名称 ファクターｖｍｌ固因子ポリペプチド類３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国カリフォルニア、う・ジョラ、ノ
ース・トレイ・パインズ・ロード１０６６６番名称　ス
クリップス・クリニック・アンド・リサーチ・ファンデ
ーション ４、代理人 住所　大阪府大阪市東区本町２−１０　本町ビル内−−
コ ア、補正の内容 別紙の通り。

（１）出願の際、ゼロックスで複写した明細書を提出致
しましたので正調整したちのを提出致します。

尚、内容についての補正は行なっておりません。

（２）「特許出願人」の欄の代表者の氏名を記載した願
書および同副本ならびに委任状（訳文付）を提出致しま
す。

８、添付書類 （１）特許順　　　　　正・副各１通 （２）明細書　　　　　１通 （３）委　任　状（訳文付）　　　　　　　１通以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １以下の特徴を有する、１若しくはそれ以上のポリペプ
   チドを含有しているファクター■：Ｃ凝固因子： （１）１若しくはそれ以上の該ポリペプチドは、ドデシ
   ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
   かけた場合、残＝約９２，０００に相当する点に１つの
   バンドを示すか、残＝約９２，０００、約ｓ　ｏ、ｏ　
   ｏ　ｏおよび約７９，０００ｉ嶋＝約９２，０００、約
   ７２，０００および約７１，０ＯＯｉまたは残＝約９２
   ，０００、約ｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ、約７９，０００、約
   ７２．０００および約７１，０００に相当する魚群にバ
   ンド群を示し、 （ＩＩ）該凝固因子は１８００単位／巧より高い凝固比
   活性を示し、 ０ｉｉ）該凝固因子は少なくとも約１０分の連続した期
   間に渡って（１１）で示しだ活性を示し、ＯＶ）　該凝
   固因子はヒトのファクター■：Ｃ抗体結合能を示す。 ２、（４）に於ける比活性が５４００単位／π７以上で
   ある第１項に記載の凝固因子。 ３、活性型のα−トロンビンおよび等価なプロテアーゼ
   を含んでいない第１項または第２項に記載の凝固因子。 ４、α−トロンビンまだは等価なプロテアーゼによるヒ
   トのファクター■：Ｃの消化によって製造される第１項
   〜第３項のいずれかに記載の凝固因子。 ５、Ｍｒカ９２．　ＯＯ０以上のバンドを示すポリペプ
   チドを実質的に含んでいない第１項〜第４項のいずれか
   に記載の凝固因子。 ６、第１項〜第５項のいずれかに記載の７アクター■二
   〇＠固因子を少なくとも約１重量％含有している生物学
   的製剤。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ニア
   、ｉ＃ＩａｌｌｌＤ−０３０〜９５□％＊＊ｔ、？イ、
   ａ　　　　：第６項に記載の生物学的製剤。 ８、該凝固因子を６０〜９０重量％含有している第６項
   に記載の生物学的製剤。 ９．薬学的に許容し得る食塩溶液に溶解されている状態
   の第６項〜第８項のいずれかに記載の生物学的製剤。 １０、以下の諸工程からなるファクター■二〇凝固因子
   の調製法： （ａ）有効量のプロテアーゼを用い、消化条件下、消化
   混合物中でヒトのファクター■：Ｃを消化して第１項に
   記載の凝固因子を生成せしめ、（ｂ）凝固因子が消化混
   合物中に存在する間に工程（ａ）の消化を中止し、次い
   で （Ｃ）得られた凝固因子を回収する。 １１、ヒトのファクター■：Ｃを予め精製しておく第１
   ０項に記載の調製法。 １２、ヒトのファクター■：Ｃエピトープに対する複数
   のモノクローナル抗体を含んでいる免疫吸着剤に活性型
   の凝固因子を吸着させ、凝固因子を変性させることなく
   免疫吸着剤から凝固因子を脱着させるに有効な溶離条件
   下でカルシウムイオン含有水溶液で免疫吸着剤から凝固
   因子を溶離させることを特徴とする第１項に記載の凝固
   因子の回収法。 １３、該溶液が約１．０Ｍまでのカルシウムイオンを含
   んでおシ、該溶液を１時間当たり約８床容量までの容量
   で免疫吸着剤に適用する第１２項に記載の回収法。 １４、モノクローナル抗体群がＩｇＧクラスのものであ
   虱マウスの骨髄腫からの細胞とヒトのファクター■二〇
   で予め免疫されだマウスからの牌臓細胞との融合によ多
   形成されたハイブリドーマによって生産されるものであ
   り、該抗体群はヒトのファクター■：Ｃと反応し、ヒト
   のファクター■：Ｃから誘導される凝固因子と以下の反
   応挙動の］つを示すものである第１２項または第１３項
   に記載の回収法： （Ａ）Ｍｒ＝９２，０００．　Ｍ、＝　１８０，０００
   およびそれ以上、および５４，０００のポリペプチド群
   と反応し、博＝４４，０００，７１，０００，７２，０
   ００゜７９．０００およびｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏのポリペ
   プチド群とは反応しない、 （Ｂ）Ｍｒ−９２，０００、Ｍ、＝１０８，０００およ
   びそれ以上、および４４，０００のポリペプチド群と反
   応し、Ｍｒ＝５４，０００，７１，０００，７２，００
   ０．７９．０００およびｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏのポリペプ
   チド群とは反応しない、 （ＱＭｒ＝　７９．０００および８０，０００、および
   残−１０８，０００およびそれ以上のポリペプチド群と
   反応し、Ｍｒ−４４，０００，５４，０００，７１，６
   ００，７２，０００および９２，０００のポリペプチド
   群とは反応しない、 （Ｄ）Ｍｒ−１０８，０００およびそれ以上のポリペプ
   チド群と反応し、為が１０８，０００以下のポリペプチ
   ド群とは反応しない （ただし、為はポリペプチドをドデシル硫酸ナトリウム
   ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて測定した値で
   ある）。 １５、７　’７　ス（７）　骨髄腫からの細胞と、ヒト
   のファクター■：Ｃで予め免疫されたマウスからの牌臓
   細胞との融合により形成されたハイブリドーマによって
   生産されるＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であって
   、ヒトの７アクター■二〇と反応し、ヒトノファクター
   ■二〇から誘導されるポリペプチドと以下に示す反応挙
   動の内の１つを示すモノクローナル抗体： （Ａ）Ｍ、−９２，０００、鵬＝　１８０，００　ｏオ
   よびそれ以上、および５４，０００のポリペプチド群と
   反応シ、Ｍｒ−４４，０００，７１，０００，７２，ｏ
   ｏｏ、７９．０００および８０，０００のポリペプチド
   群とは反応しない、 （Ｂ）Ｍｒ＝　９２，０００、Ｍｌ、−１０８，ｏｏｏ
   およびそれ以上、および４４，０００のポリペプチド群
   と反応シ、Ｍｒ−５４，０００，７１，０００，７２，
   ０００，７９，０００および８ｏ、ｏｏｏのポリペプチ
   ド群とは反応しない、 （ＱＭｒ＝　７９，０００および８０，０００、および
   Ｍｒ＝１０８，０００およびそれ以上のポリペプチド群
   と反応し、Ｍ、−４４，０００，５４，０００，’　７
   １ρ００．７２，０００および９２．０００のポリペプ
   チド群とは反応しない、 （至）Ｍｒ−１０８，０００およびそれ以上のポリペプ
   チド群と反応し、為が１０８，０００以下のポリペプチ
   ド群とは反応しない （たたし、為はポリペプチドをドデシル硫酸ナトリウム
   ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて測定した値で
   ある）。 １６、挙動（Ｂ）または（ｑを示すモノクローナル抗体
   であって、ヒトのファクター■：Ｃと結合すると該ファ
   クター■：Ｃの凝固活性を中和することを特徴とする第
   １５項に記載のモノクローナル抗体。 ］　７．（ａ）第１５項に記載の反応挙動（Ａ）を示し
   、他の３つの反応挙動を示す抗体群を実質的に含んでい
   ない抗体、まだは （ｂ）第１５項に記載の反応挙動（至）を示し、他の３
   つの反応挙動を示す抗体群を実質的に含んでいない抗体
   、または （Ｃ）第１５項に記載の反応挙動（ｑを示し、他の３つ
   の反応挙動を示す抗体群を実質的に含んでいない抗体、
   または （ｄ）第１５項に記載の反応挙動（Ｄ）を示し、他の３
   つの反応挙動を示す抗体群を実質的に含んでいない抗体
   、を含有してなる生物学的製剤。 １８、第１５項の反応挙動（へおよび（Ｂ）を示す抗体
   の混合物であって、反応挙動（ｑおよびｐ）を示す抗体
   群を実質的に含んでいない混合物を含有してなる生物学
   的製剤。 １９、第１５項の反応挙動（〜、（Ｂ）および（ｑを示
   す抗体の混合物であって、反応挙動ηを示す抗体を実質
   的に含んでいない混合物を含有してなる生物学的製剤。 ２０、第１５項に記載の反応挙動（〜、（Ｂ）、（ｑま
   だは（９を示す抗体と結合した固状の免疫学的に不活性
   な吸着物質の粒子を含有してなる免疫吸着剤カラム。 ２１、吸着物質がアガロースである第２０項に記載のカ
   ラム。