JPS59187002A - 薬理活性を有するオリゴ糖分画およびその製造法 - Google Patents
薬理活性を有するオリゴ糖分画およびその製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
物活性を有するオリゴ糖分画（ｏｆ ｉｇｏｓａｃｃｈ
ａｒｉｄｅｆｒａｃｔ ｉｏｎｓ）の化学的製造法に関
する。
ａｒｉｄｅｆｒａｃｔ ｉｏｎｓ）の化学的製造法に関
する。
本発明はまたかくしてえられるオリゴ糖分゛画に関する
。
。
ヘパリン由来のオリゴ糖および該オリゴ糖を含むオリゴ
糖分画が有益な血液の抗Ｘａ活性を有することが知られ
ており、これは比較的低い抗凝血（ａｎＮｃｏａｇｕｌ
ａｎｔ）活性と関連した高い抗血栓（ａｎｔ ｉｔｈｒ
ｏｉｂｏｔ ｉｃ）活性に対応１１ｊルもノテアルと信
じられている。
糖分画が有益な血液の抗Ｘａ活性を有することが知られ
ており、これは比較的低い抗凝血（ａｎＮｃｏａｇｕｌ
ａｎｔ）活性と関連した高い抗血栓（ａｎｔ ｉｔｈｒ
ｏｉｂｏｔ ｉｃ）活性に対応１１ｊルもノテアルと信
じられている。
かかるオリゴ糖および（または）オリゴ糖分画は平均分
子量が約５０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ）と比較的
低分子量であり、一般に脱型台 （ｄｅｐｏｌｖｌｅｒｉｚａｔｉｏｎ）法といわれてい
る分解方法によりヘパリンからえられ、該方法は出発物
質のヘパリンの分子量よりも低分子量のフラグメントを
生成する。かかる方法には、酵素的方法と化学的方法の
実質的に２つのタイプがある。
子量が約５０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ）と比較的
低分子量であり、一般に脱型台 （ｄｅｐｏｌｖｌｅｒｉｚａｔｉｏｎ）法といわれてい
る分解方法によりヘパリンからえられ、該方法は出発物
質のヘパリンの分子量よりも低分子量のフラグメントを
生成する。かかる方法には、酵素的方法と化学的方法の
実質的に２つのタイプがある。
公知の化学的方法は硝酸処理、常圧もしくは高圧下での
過酸化物による酸化および過ヨウ素酸物による酸化の工
程を含む。
過酸化物による酸化および過ヨウ素酸物による酸化の工
程を含む。
Ｓ．Ｅ．ラスカー（Ｓ． Ｅ． Ｌａｓｋｅｒ）著の［
マウスにおいて経口活性を有するヘパリンの低分子量誘
導体Ｊ （Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｈｅｄ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ
．、Ｖｏｌ．５２）および［ヘパリンの構造機能および
臨床的示唆（ｔＪｅｐ −ａｒｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌｉｍ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）Ｊ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓ
ｓ Ｎ．Ｙ． ｐ１１９ 〜１３０（１９７５））には
ヘパリンの水溶液をアスコルビン酸およびカプリンサル
フェート（ｃｕｐｒｉｃ ｓｕｌｐｈａｔｅ）の存在下
に４０℃で２４時間インキュベーションしてヘパリンを
脱型台化する方法が記載されている。該著者によればカ
プリンイオンにより誘導される生成物による汚染を避る
ためには前記力プリンサルフエートを過酸化水素の３％
溶液に置き換えることができ、この方法が好ましい。
マウスにおいて経口活性を有するヘパリンの低分子量誘
導体Ｊ （Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｈｅｄ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ
．、Ｖｏｌ．５２）および［ヘパリンの構造機能および
臨床的示唆（ｔＪｅｐ −ａｒｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌｉｍ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）Ｊ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓ
ｓ Ｎ．Ｙ． ｐ１１９ 〜１３０（１９７５））には
ヘパリンの水溶液をアスコルビン酸およびカプリンサル
フェート（ｃｕｐｒｉｃ ｓｕｌｐｈａｔｅ）の存在下
に４０℃で２４時間インキュベーションしてヘパリンを
脱型台化する方法が記載されている。該著者によればカ
プリンイオンにより誘導される生成物による汚染を避る
ためには前記力プリンサルフエートを過酸化水素の３％
溶液に置き換えることができ、この方法が好ましい。
それにもかかわらず、銅による汚染がない状態で、アス
コルビン酸およびカプリンサルフェートの存在下にヘパ
リンの脱型台化を行なうと平均分子量が非常に高い、通
常９２００ダルトンより高いオリゴ糖分画かえられるこ
とが実験的にわかっている。
コルビン酸およびカプリンサルフェートの存在下にヘパ
リンの脱型台化を行なうと平均分子量が非常に高い、通
常９２００ダルトンより高いオリゴ糖分画かえられるこ
とが実験的にわかっている。
かくしてえられるオリゴ糖の混合物から最も有益な分画
、すなわち平均分子量が４０００〜５０００の分画を単
離するには、溶媒、とくにエタノールによる分画を行な
うことが必要なのは明らかであり、ラスカーの記載によ
れば有用生成物の収量が結果的にかなり低下する。
、すなわち平均分子量が４０００〜５０００の分画を単
離するには、溶媒、とくにエタノールによる分画を行な
うことが必要なのは明らかであり、ラスカーの記載によ
れば有用生成物の収量が結果的にかなり低下する。
またアスコルビン酸と過酸化水素の３％溶液（後者はカ
プリンサルフェートと置換したもの）の存在下に行なう
ヘパリンの脱型台化によっても約１１５００ダルトンの
高い平均分子量を有するオリゴ糖分画がえられるが、目
的とする平均分子量を有するオリゴ糖分画をうるための
分画化法にはほとんど利用されえない。
プリンサルフェートと置換したもの）の存在下に行なう
ヘパリンの脱型台化によっても約１１５００ダルトンの
高い平均分子量を有するオリゴ糖分画がえられるが、目
的とする平均分子量を有するオリゴ糖分画をうるための
分画化法にはほとんど利用されえない。
また前記の方法を組合せた脱型台化、ずなわちアスコル
ビン酸、カプリンサルフェートおよび３％の過酸化水素
溶液の存在下に行なう脱型台化によっても平均分子量が
９０００より高い分画がえられる。かかる操作の組合せ
（カプリンサルフェートと過酸化水素の組合せ）に関す
る記載はなく、ラスカーによる前記の仕事においても示
されていない。にもかかわらず、かかる組合せの条件下
での脱型台化はラスカーによる単一反応を改善すること
が可能であると考えられてきた。
ビン酸、カプリンサルフェートおよび３％の過酸化水素
溶液の存在下に行なう脱型台化によっても平均分子量が
９０００より高い分画がえられる。かかる操作の組合せ
（カプリンサルフェートと過酸化水素の組合せ）に関す
る記載はなく、ラスカーによる前記の仕事においても示
されていない。にもかかわらず、かかる組合せの条件下
での脱型台化はラスカーによる単一反応を改善すること
が可能であると考えられてきた。
銅を用いる方法を実験的に繰り返したところ、オリゴ糖
分画が非可逆的（ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌ”ｅ）にカプ
リンイオンにより汚染されることがわかった。
分画が非可逆的（ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌ”ｅ）にカプ
リンイオンにより汚染されることがわかった。
驚くべきことに、本発明の目的であるヘパリンの分解法
を用いることにより目的とする平均分子量に非常に近い
平均分子量を有するオリゴ糖分画を直接的に取得しうる
が見出された。すなわち、本発明は１ｌあたり５〜２０
ｔＪのへパリンを含むヘパリン水溶液を４〜５０ミリモ
ル、／ ｄのアスコルビン酸、０．４〜２．５ミリモル
／１２のカプリンアセテートおよび５０〜３００ミリモ
ル／ｌの過酸化水素の存在下に４０〜５０℃で２０〜２
４時間酢酸ナトリウムでｐＨを７．５〜８の範囲に保持
しながらインキュベーションすることからなる。
を用いることにより目的とする平均分子量に非常に近い
平均分子量を有するオリゴ糖分画を直接的に取得しうる
が見出された。すなわち、本発明は１ｌあたり５〜２０
ｔＪのへパリンを含むヘパリン水溶液を４〜５０ミリモ
ル、／ ｄのアスコルビン酸、０．４〜２．５ミリモル
／１２のカプリンアセテートおよび５０〜３００ミリモ
ル／ｌの過酸化水素の存在下に４０〜５０℃で２０〜２
４時間酢酸ナトリウムでｐＨを７．５〜８の範囲に保持
しながらインキュベーションすることからなる。
１１あたり１０ｇのヘパリンを含むヘパリン水溶液を２
０ミリモル／１２のアスコルビン酸、２．２５ミリモル
／ｌのカプリンアセテートおよび１８０ミリモル／ｌの
過酸化水素の存在下に５０℃で２４時間、ｐＨ７，８で
インキュベーションすることにより最もよい結果かえら
れる。
０ミリモル／１２のアスコルビン酸、２．２５ミリモル
／ｌのカプリンアセテートおよび１８０ミリモル／ｌの
過酸化水素の存在下に５０℃で２４時間、ｐＨ７，８で
インキュベーションすることにより最もよい結果かえら
れる。
公知の方法と比較して、本発明の方法によればそれ以上
分画操作を必要としない平均分子量を有するオリゴ糖分
画がえられる。さらに、えられる生成物はカプリンイオ
ン残渣により非可逆的に汚染されることがない。
分画操作を必要としない平均分子量を有するオリゴ糖分
画がえられる。さらに、えられる生成物はカプリンイオ
ン残渣により非可逆的に汚染されることがない。
しばしば生じるこん跡程度のカプリン化合物は水に溶解
し、キレート試薬、ｋとえばＥＤＴＡなどを加え、さら
に適当な溶媒から沈澱させることによって容易に除去さ
れうる≧ もし必要であるなら、本発明の方法によりえられるオリ
ゴ糖を当該技術分野において公知である精製および（ま
たは）分画操作に供することもできる。ゆえに、生物活
性がさらに増強した生成物をうろことが可能である。
し、キレート試薬、ｋとえばＥＤＴＡなどを加え、さら
に適当な溶媒から沈澱させることによって容易に除去さ
れうる≧ もし必要であるなら、本発明の方法によりえられるオリ
ゴ糖を当該技術分野において公知である精製および（ま
たは）分画操作に供することもできる。ゆえに、生物活
性がさらに増強した生成物をうろことが可能である。
本発明の方法はかなり幅広い濃度範囲で行ないうるが、
えられるオリゴ糖分画の平均分子量およびその生物学的
性質の両者に関しては、水溶液１１２あたり５〜１０ｇ
の濃度で、ヘパリンに対する種々の試、薬のモル比を実
質的に一定に保つことにより最もよい結果がえられる。
えられるオリゴ糖分画の平均分子量およびその生物学的
性質の両者に関しては、水溶液１１２あたり５〜１０ｇ
の濃度で、ヘパリンに対する種々の試、薬のモル比を実
質的に一定に保つことにより最もよい結果がえられる。
脱型合化反応を行なうのに適したｐＨを保持するには、
種々の緩衝剤を使用しうるが、なかでも酢酸ナトリウム
を用いると最も満足のいく結果がえられる。事実、酢酸
ナトリウムは溶液中に存在するカプリンイオンとともに
結果的に生成物を汚染するほぼ非可逆的でかつほとんど
溶解しないコンプレックスを形成しない。
種々の緩衝剤を使用しうるが、なかでも酢酸ナトリウム
を用いると最も満足のいく結果がえられる。事実、酢酸
ナトリウムは溶液中に存在するカプリンイオンとともに
結果的に生成物を汚染するほぼ非可逆的でかつほとんど
溶解しないコンプレックスを形成しない。
本発明の方法によりえられるオリゴ糖の混合物は抗凝血
活性が非常に低く、それは出発物質のヘパリンに比して
より一層低い。本発明の方法によりえられるオリゴ糖分
画の抗凝血活性は米国薬局方に記載の方法（後記「生物
学的特性」の項に記載）で調べたところ、出発物質のヘ
パリンの抗凝血活性のわずか２０〜３０％である。
活性が非常に低く、それは出発物質のヘパリンに比して
より一層低い。本発明の方法によりえられるオリゴ糖分
画の抗凝血活性は米国薬局方に記載の方法（後記「生物
学的特性」の項に記載）で調べたところ、出発物質のヘ
パリンの抗凝血活性のわずか２０〜３０％である。
後記「生物学的特性の項」に記載の部分的に活性化され
たトロンボプラスチンタイム（ｐａｒｔｉａｌ ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎｅ ｔｉ
ｍｅ）（以下、ＡＰＴＴという）としてｉｎ ｖｉｔｒ
ｏｒ調べた抗凝血活性はヘパリンの１０〜１５％に減少
する。
たトロンボプラスチンタイム（ｐａｒｔｉａｌ ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎｅ ｔｉ
ｍｅ）（以下、ＡＰＴＴという）としてｉｎ ｖｉｔｒ
ｏｒ調べた抗凝血活性はヘパリンの１０〜１５％に減少
する。
それに対し、Ｘａ因子の阻害活性を、凝固針による方法
（ｃｏａｇｕｌｏｍｃｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ） （後
記「生物学的特性の項」に記載）で調べたところ、その
値はヘパリンの２５〜３５％に減少しており、一方りロ
モシエニツク（ＣｒＯｍＯｇｅｒｌｉＣ）法（後記「生
物学的特性」の項に記載）により調べると該活性はヘパ
リンの５５〜６０％に減少していた。
（ｃｏａｇｕｌｏｍｃｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ） （後
記「生物学的特性の項」に記載）で調べたところ、その
値はヘパリンの２５〜３５％に減少しており、一方りロ
モシエニツク（ＣｒＯｍＯｇｅｒｌｉＣ）法（後記「生
物学的特性」の項に記載）により調べると該活性はヘパ
リンの５５〜６０％に減少していた。
り０モジエニツク法で調べた抗Ｘａ活性とＡＰＴＴ活性
との比（抗ＸａＣｒ／＾ＰＴＴ）ａよび凝固針で調べた
抗Ｘａ活性とＡＰＴＴ活性との比（抗ＸａＣｏ／ＡＰＴ
Ｔ）を考えると、ヘパリンに関してはＸａＣｒ／ＡＰ、
ＴＴは約０．６、またＸａＣｏ／ＡＰＴＴは約０．８テ
あるのに対し、本発明の方法によりえられる化合物に関
してはＸａＣｒ／ＡＰＴＴは約４、またＸａＣｏ／ＡＰ
ＴＴは約２であり、抗Ｘａ活性とＡＰＴＴ活性との比が
それぞれ約６００％および約２５０％増加している。
との比（抗ＸａＣｒ／＾ＰＴＴ）ａよび凝固針で調べた
抗Ｘａ活性とＡＰＴＴ活性との比（抗ＸａＣｏ／ＡＰＴ
Ｔ）を考えると、ヘパリンに関してはＸａＣｒ／ＡＰ、
ＴＴは約０．６、またＸａＣｏ／ＡＰＴＴは約０．８テ
あるのに対し、本発明の方法によりえられる化合物に関
してはＸａＣｒ／ＡＰＴＴは約４、またＸａＣｏ／ＡＰ
ＴＴは約２であり、抗Ｘａ活性とＡＰＴＴ活性との比が
それぞれ約６００％および約２５０％増加している。
本発明の方法によりえられる化合物は前記のこと＜Ｘａ
因子をかなり阻害し、同時に抗凝血活性が非常に低い。
因子をかなり阻害し、同時に抗凝血活性が非常に低い。
したがって、本発明の化合物は出血の危険性を実際的に
有さないため、血栓治療薬として用いることが可能であ
り、非常に有益である。
有さないため、血栓治療薬として用いることが可能であ
り、非常に有益である。
つぎに実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない
。
、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない
。
実施例１
平均分子量１３５００ダルトンおよび第１表に示す生物
学的性質を有する市販のヘパリンを本発明の方法にした
がって脱型合化反応に供した。
学的性質を有する市販のヘパリンを本発明の方法にした
がって脱型合化反応に供した。
ヘパリン１０ｇを塩化ナトリウム３０（１（５００ミリ
モル）および酢酸ナトリウム３水和物 （ＣＨ３ＣＯＯＮａ ・３）１２０）３０ｙ （２００
ミリＴニル）を含む水溶液７００ｍに溶か”した。２Ｈ
のＮａ叶でｐＨを７．８に調整し、えられた反応溶液に
まず最初にアスコルビン酸３．５Ｇ （２０ミリモル
）を含む水溶液２００ｍ１！を撹拌下に加え、ＮａＯＨ
でｐＨ７〜７．５に調整し、ついでカプリンアセテート
１水和物（（ＣＨ３ＣＯＯ）２ Ｃ０−８２０）０．４
５ｇを含む水溶液１００献を加えた。
モル）および酢酸ナトリウム３水和物 （ＣＨ３ＣＯＯＮａ ・３）１２０）３０ｙ （２００
ミリＴニル）を含む水溶液７００ｍに溶か”した。２Ｈ
のＮａ叶でｐＨを７．８に調整し、えられた反応溶液に
まず最初にアスコルビン酸３．５Ｇ （２０ミリモル
）を含む水溶液２００ｍ１！を撹拌下に加え、ＮａＯＨ
でｐＨ７〜７．５に調整し、ついでカプリンアセテート
１水和物（（ＣＨ３ＣＯＯ）２ Ｃ０−８２０）０．４
５ｇを含む水溶液１００献を加えた。
さらに常時撹拌しながら３６％の過酸化水素（１８０ミ
リモル）１５ｄを加えた。濃Ｈａ叶でｐＨ７，８に調整
し、反応混合物を５０℃で２０時間インキュベーション
した。
リモル）１５ｄを加えた。濃Ｈａ叶でｐＨ７，８に調整
し、反応混合物を５０℃で２０時間インキュベーション
した。
真空下で容量が半分になるまで濃縮したのち、反応混合
物に対して３重量％のＥＤＴＡナトリウム塩を加え、ｐ
Ｈを６．５〜７とし、２倍容量のメタノールを加えるこ
とによって生成物を沈澱せしめた。
物に対して３重量％のＥＤＴＡナトリウム塩を加え、ｐ
Ｈを６．５〜７とし、２倍容量のメタノールを加えるこ
とによって生成物を沈澱せしめた。
メタノールによる沈澱を２回くり返して生成物を精製し
た。
た。
平均分子量４５００ダルトンのオリゴ糖の収率（重量収
率、以下同様）は８７．５％であった。えられたオリゴ
糖の生物学的特性を第１表に示す。
率、以下同様）は８７．５％であった。えられたオリゴ
糖の生物学的特性を第１表に示す。
実施例２
インキュベーションの温度５０℃を４０℃におよび２０
時間を２４時間に代えたほかは実施例１と同様にしてオ
リゴ糖をえた。収率は８８％、平均分子量は３９４６で
あった。えられたオリゴ糖の生物学的特性を第１表に示
す。
時間を２４時間に代えたほかは実施例１と同様にしてオ
リゴ糖をえた。収率は８８％、平均分子量は３９４６で
あった。えられたオリゴ糖の生物学的特性を第１表に示
す。
実施例３
試薬の濃度を５分の１に減少し、ただし個々の反応試薬
の比は一定に保ち、実施例１と同様にしてオリゴ糖をえ
た。収率は９０％、平均分子量は５５９０であった。
の比は一定に保ち、実施例１と同様にしてオリゴ糖をえ
た。収率は９０％、平均分子量は５５９０であった。
実施例４
濃度を高くしたほかは実施例１と同様にして脱型台反応
を行なった。
を行なった。
ヘパリン２５ｇをアスコルビン酸５０ミリモル、カプリ
ンアセテート６．２５ミリモルおよび過酸化水素４５０
ミリモルで実施例１と同様に処理した。
ンアセテート６．２５ミリモルおよび過酸化水素４５０
ミリモルで実施例１と同様に処理した。
反応混合物の容積は１１２であり、１００ミリモルの塩
化ナトリウムを含んでいた。
化ナトリウムを含んでいた。
オリゴ糖分画の収率は７５％、平均分子量は５９８６で
あった。
あった。
実施例２〜４を比較すると驚くべきことに、使用した各
試薬間の比および各試薬とヘパリンの比が実質的に同じ
であったにもかかわらず、ヘパリンの濃度が１０（１／
／のばあいに最もよい結果かえられた。
試薬間の比および各試薬とヘパリンの比が実質的に同じ
であったにもかかわらず、ヘパリンの濃度が１０（１／
／のばあいに最もよい結果かえられた。
実施例５
本−発明の方法と文献記載の方法との差を明確にするた
めに、Ｓ、ラスカーの方法を追試した。
めに、Ｓ、ラスカーの方法を追試した。
（ωカプリンザルフェートの存在下における脱型台
２■／ｄのヘパリン水溶液を４ｍＨのアスコルビン酸、
０．５ｉ＋Ｈのカプリンアセテート、０．５Ｈの塩化ナ
トリウムおよび０，１Ｈのリン酸ナトリウムの存在下に
、ｐＨ７，８，４０℃で２４時間インキュベーションし
た。
０．５ｉ＋Ｈのカプリンアセテート、０．５Ｈの塩化ナ
トリウムおよび０，１Ｈのリン酸ナトリウムの存在下に
、ｐＨ７，８，４０℃で２４時間インキュベーションし
た。
オリゴ糖の収率は８４％、平均分子量は９２６０であっ
た。
た。
えられた生成物は実際に非可逆的な方法でカプリンイオ
ンによりかなり汚染されていた。
ンによりかなり汚染されていた。
山）過酸化水素の存在下における脱型台ラスカー自身が
提唱した方法であり、カプリンサルフェートを３％の過
酸化水素溶液にかえた方法にしたがって試験を行なった
。
提唱した方法であり、カプリンサルフェートを３％の過
酸化水素溶液にかえた方法にしたがって試験を行なった
。
カプリンサルフェート ０５ミリモル／ａの溶液にかえ
て過酸化水素０．５ミリモル／１２の溶液を用いた。え
られたオリゴ糖の収率は９０％、平均分子量は１１７０
０であった。
て過酸化水素０．５ミリモル／１２の溶液を用いた。え
られたオリゴ糖の収率は９０％、平均分子量は１１７０
０であった。
（Ｃ）カプリンサルフェートおよび過酸化水素の存在下
における脱型台 カプリンサルフェートおよび過酸化水素を同時にそれぞ
れ０．５ミリモル／１２の濃度で用いて前記と同じ試験
を行なった。
における脱型台 カプリンサルフェートおよび過酸化水素を同時にそれぞ
れ０．５ミリモル／１２の濃度で用いて前記と同じ試験
を行なった。
えられたオリゴ糖の収率は９４％、平均分子量は９１５
０であった。
０であった。
（小実施例５（Ｃ）の５倍濃度のカプリンサルフェート
および過酸化水素の存在下における脱型台１０（＋／Ｉ
２のヘパリン溶液をアスコルビン酸２０ミリモル、カプ
リンサルフェート２．５ミリモルおよび過酸化水素２．
５ミリモルの存在下に４０℃で２０時間インキニーベー
トした。
および過酸化水素の存在下における脱型台１０（＋／Ｉ
２のヘパリン溶液をアスコルビン酸２０ミリモル、カプ
リンサルフェート２．５ミリモルおよび過酸化水素２．
５ミリモルの存在下に４０℃で２０時間インキニーベー
トした。
Ｎａ２ＨＰＯ，−２Ｈ２０の１００ミリモルを用いてｐ
Ｈを１．８に調整した。
Ｈを１．８に調整した。
かかる反応溶液はまた塩化ナトリウム５００ミリモルも
含んでいた。えられたオリゴ糖の収率は７６％、平均分
子量は１０９３６であった。
含んでいた。えられたオリゴ糖の収率は７６％、平均分
子量は１０９３６であった。
（ｅ＞実施例５（Ｃ）の５倍濃度のカプリンサルフェー
トおよび過酸化水素の存在下における脱型合えられたオ
リゴ糖の収率は７６％、平均分子量は１２４００であっ
た。
トおよび過酸化水素の存在下における脱型合えられたオ
リゴ糖の収率は７６％、平均分子量は１２４００であっ
た。
前記実施例でえられた結果を考慮すると、本発明の方法
においては目的とする平均分子量を有し、かつ抗血栓活
性／抗凝血活性の比が高いオリゴ糖をうるには反応液の
各種試薬の濃度が意外にも臨界要因（ｃｒｉｔｉｃａｌ
ｆａｃｔｏｒ）であることが明白である。
においては目的とする平均分子量を有し、かつ抗血栓活
性／抗凝血活性の比が高いオリゴ糖をうるには反応液の
各種試薬の濃度が意外にも臨界要因（ｃｒｉｔｉｃａｌ
ｆａｃｔｏｒ）であることが明白である。
一方、ラスカーによる方法において対応する濃度の増加
は、えられたオリゴ糖混合物の平均分子量に関してもそ
の生物学的性質に関しても、いかなる臨界条件も明白に
するものでない。
は、えられたオリゴ糖混合物の平均分子量に関してもそ
の生物学的性質に関しても、いかなる臨界条件も明白に
するものでない。
Ｊ、Ｃ，ヒルボーン（Ｊ、Ｃ１旧１ｂｏｒｎ）およびＰ
、Ａイナスタシアデイス（Ｐ、 Ａ、 Ｉｎａｓｔａｓ
ｓｉａｄ ｉｓ）らの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｌ
ｓｔｒｙ、 ３９．８０〜８２（１９７１））にしたが
って平均分子量を求めた。
、Ａイナスタシアデイス（Ｐ、 Ａ、 Ｉｎａｓｔａｓ
ｓｉａｄ ｉｓ）らの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｌ
ｓｔｒｙ、 ３９．８０〜８２（１９７１））にしたが
って平均分子量を求めた。
抗凝血活性は米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ） （以下、ＵＳＰとい
う）の２９８〜３００頁−ｕｓｐｘｘに記載の方法およ
びヘパリンの国際標準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
５ｔａｎｄａｒｄ） ＷＨＯＩＩ［との比較により求め
た。
Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ） （以下、ＵＳＰとい
う）の２９８〜３００頁−ｕｓｐｘｘに記載の方法およ
びヘパリンの国際標準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
５ｔａｎｄａｒｄ） ＷＨＯＩＩ［との比較により求め
た。
抗凝血活性に関しては、バス・Ｄ、（Ｂａｓｕ Ｄ、）
らの方法（Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｈｅｄ、２８７．３２４〜
２７（１９７２））の方法によりＡ Ｐ Ｔ ’ｒとし
て測定した。
らの方法（Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｈｅｄ、２８７．３２４〜
２７（１９７２））の方法によりＡ Ｐ Ｔ ’ｒとし
て測定した。
Ｘａ因子阻害活性はデンソン−Ｖ、Ｗ、Ｅ、（Ｄｅｎｓ
ｏｎＶ、Ｗ、Ｅ、） 、ボナーＪ、（Ｂｏｎｎａｒ Ｊ
、） （１）凝血計ニヨる方法（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄｉａ
ｔｈ、Ｈａｅｍｏｒｒｏ、３０．４７１（１９７３））
もしくはティエンＡ、Ｎ、（Ｔｅｉｅｎ Ａ、Ｎ、）ら
によるクロモジェニック法（Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｒｅｓ、
、８．４１３（１９７６））を用いて測定した。
ｏｎＶ、Ｗ、Ｅ、） 、ボナーＪ、（Ｂｏｎｎａｒ Ｊ
、） （１）凝血計ニヨる方法（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄｉａ
ｔｈ、Ｈａｅｍｏｒｒｏ、３０．４７１（１９７３））
もしくはティエンＡ、Ｎ、（Ｔｅｉｅｎ Ａ、Ｎ、）ら
によるクロモジェニック法（Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｒｅｓ、
、８．４１３（１９７６））を用いて測定した。
リポタンパク分解活性（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｏｌｉ
ｐａｓｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）はビアンチ一二・Ｐ３、
オオシマ・８（Ｏｓｉｍａ Ｂ、） 、カゼツタ−Ｒ，
（ｃａｓｅｔｔａ Ｒ，）の方法（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ
ｌ、Ｊｏｕｒｎ、、５．５９７（１９６７））、とアン
チ−ニー ｐ、、シュディー Ｇ、（Ｇｕｉｄｉ Ｇ、
）、オオシｖ −８，（Ｂｉｏｃｈｅｉ＋、Ｅｘｐ、Ｂ
ｉｏｌ、、基、２４３（１９７２））の方法によるハウ
ススタンダード（ＨｏｕｓｅＳｔａｎｄａｒｄ）と比較
して求めた。
ｐａｓｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）はビアンチ一二・Ｐ３、
オオシマ・８（Ｏｓｉｍａ Ｂ、） 、カゼツタ−Ｒ，
（ｃａｓｅｔｔａ Ｒ，）の方法（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ
ｌ、Ｊｏｕｒｎ、、５．５９７（１９６７））、とアン
チ−ニー ｐ、、シュディー Ｇ、（Ｇｕｉｄｉ Ｇ、
）、オオシｖ −８，（Ｂｉｏｃｈｅｉ＋、Ｅｘｐ、Ｂ
ｉｏｌ、、基、２４３（１９７２））の方法によるハウ
ススタンダード（ＨｏｕｓｅＳｔａｎｄａｒｄ）と比較
して求めた。
結果を第１表に示す。
（抗血栓活性）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＸａ因子阻害活性は抗血栓活性に
関連したある範囲の中で考えるが、Ｘａ因子阻害活性は
必ずしも抗血栓活性を予測するものではない。
関連したある範囲の中で考えるが、Ｘａ因子阻害活性は
必ずしも抗血栓活性を予測するものではない。
それゆえラットにおける血栓の形成の阻害に関連させ、
ダビット−Ｊ、Ｌ、（Ｄａｖｉｄ Ｊ、Ｌ、）らの方法
（Ｃ，Ｒ，Ｓｏｃ、Ｂｉｏｌ、、１６２工、１７６３〜
６Ｇ（１９６８））にしたがって試験を行なった。かか
る方法は薬物の抗血栓活性を調べるのに適している。
ダビット−Ｊ、Ｌ、（Ｄａｖｉｄ Ｊ、Ｌ、）らの方法
（Ｃ，Ｒ，Ｓｏｃ、Ｂｉｏｌ、、１６２工、１７６３〜
６Ｇ（１９６８））にしたがって試験を行なった。かか
る方法は薬物の抗血栓活性を調べるのに適している。
実施例１でえられた化合物は経口投与でも静脈投与でも
有効であることがわかった。
有効であることがわかった。
（コラーゲン由来の静脈血栓症）
ウサギにＬＨＷ （低分子量、以下同様）ヘパリンを
静脈投与したばあいの抗血栓作用を調べた。
静脈投与したばあいの抗血栓作用を調べた。
結果を第２表に示す。
第 ２ 表
（コラーゲン由来の静脈血栓症）
ＬＨＷヘパリンおよび標準ヘパリンの抗血栓活性を静脈
投与により測定し、ＥＤ５０値を求めた。
投与により測定し、ＥＤ５０値を求めた。
結果を第３表に示す。
第 ３ 表
（コラーゲン由来の静脈血栓症）
ウサギにＬＨＷヘパリン２００Ｒｇ／Ｋｇを経口投与し
、抗血栓活性を調べた。結果を第４表に示す。
、抗血栓活性を調べた。結果を第４表に示す。
つぎに、本発明の出発物質であるヘパリンと実施例２〜
４でえられた１８１４オリゴ糖分画について化学分析を
行なった。結果を第５表に示す。
４でえられた１８１４オリゴ糖分画について化学分析を
行なった。結果を第５表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １１１２あたりヘパリン５〜２０ｇを含むヘパリン水溶
液を４〜５０ミリモル／ａのアスコルビン酸、０．４〜
２．５ミリモル／１２のカプリンアセテートおよび５０
〜３００ミリモル／ａの過酸化水素の存在下に４０〜５
０℃で２０〜２４時間、酢酸ナトリウムを用いてｐＨを
７．５〜８の範囲に保持しながらインキュベーションに
供することを特徴とするヘパリンの分解により製造され
る薬理活性を有するオリゴ糖分画。 ２ ｐＨ７，８で行なうことを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載のオリゴ糖分画。 ３１０Ｇ／ｆｆのヘパリン水溶液を２０ミリモル／ｌの
アスコルビン酸、２．２５ミリモル／ｌのカプリンアセ
テートおよび１８０ミリモル過酸化水素の存在下に５０
℃で２４時間、酢酸ナトリウムでｐＨ７，８に保持しな
がらインキュベーションすることにより製造される特許
請求の範囲第１項記載のオリゴ糖分画。 ４１１２あたりヘパリン５〜２０（ｌを含むヘパリン水
溶液を４〜５０ミリモル／（ｌのアスコルビン酸、０．
４〜２．５ミリモル／ａのカプリンアセテートおよび５
０〜３００ミリモル／１２の過酸化水素の存在下に４０
〜５０℃で２０〜２４時間、酢酸ナトリウムを用いてｐ
Ｈを７，５〜８の範囲に保持しながらインキュベーショ
ンに供することを特徴とするヘパリンの分解による薬理
活性を有するオリゴ糖分画の製造法。 ５ ｐＨ７，８で行なうことを特徴とする特許請求の
範囲第３項記載の方法。 ６１０！Ｊ／６のヘパリン水溶液を２０ミリモル／ｌの
アスコルビン酸、２．２５ミリモル／ｌのカプリンアセ
テートおよび１８０ミリモル／ｌの過酸化水素の存在下
に５０℃で２４時間、酢酸ナトリウムでｐＨ７，８に保
持しながらインキュベーションすることを特徴とする特
許請求の範囲第３項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT40021A/83 | 1983-03-08 | ||
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