JPS5918988B2 - 生体触媒の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は生体触媒に係り、特に、重合体に内蔵された
パール状生体触媒の製造方法に関する。

生体触媒は一次および二次物質代謝生成物の直接回収に
とって大きな意義がある。

技術的興味の寄せられている実例として以下のものが挙
げられる。

グルコースイソメシーゼによる、グルコースからのフル
クトースの回収。

ペニシリンアシラーゼによる、ペニシリンＧからの６−
ＡＰＳの製造。

Ｅ、コリによる、フマル酸アンモニウムからのＬ−アス
パラギン酸の製造。

ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｋｔｅｒｉｕｍ
）アンモニアゲン細胞を有するアシラーゼからのＬ−り
んご酸の製造。

「生体触媒」という語は工業微生物学および微生物工業
において肉眼でみえる（ ｍａｋｒｏｓｋｏｐｉｓｃｈ
）担体によって固定された、全細胞微生物または酵素
よりなる生物系と理解されている。

従来、製造コストの理由および製造方法に柔軟性がある
という理由、特に酵素反応が多種類であるという観点か
ら固定された微生物が生体触媒としてひんばんに利用さ
れていた。

生体触媒の製造は、基本的には、重合体マトリックス中
に微生物を物理的に内蔵させることでおこなわれる。

従来のマトリックスを製造するために、個々の方法に従
って以下の物質が用いられていた。

ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、コラーゲ
ン、セルローストリアセデート、カルボキシメチルセル
ロース、寒天、マレイン酸−スチレン共重合体′、およ
びカラゲーンである。

技術的観点からすると、上記物質を用いて生体触媒を製
造するための従来の方法はその技術的方法によって困難
性を持ち、またこの方法に従って得た生体触媒の性質に
欠点があった。

多価イオンによるゲル生成によって簡単に得られるアル
ギナート系、ＣＭＣ系および共重合体系触媒は特に、多
くの反応が実際におこなわれるリン酸塩罎衝液に対して
耐性がないという欠点がある。

天然の電解質を用いることによって微生物攻撃とこれと
組み合わさったマ） ＩＪラックス破壊が始まる。

その上、上記タイプの触媒にあってはそれ程高（ない機
械的耐荷重性のために固定床反応器に殆んど使用できな
い。

湿式紡糸方によるセルローストリアセテート触媒の製造
は毒性の強い溶媒例えばトルエンやメチレンクロリドの
利用の下に、極（わずかの微生物にのみ論ぜやれる固定
方法に意味がある。

その繊維形状によって、固定床反応器に触媒をあらかじ
め部分的に添加してお（。

コラーゲン系触媒の製造は非常に浪費的である。

＼ 。

その添加は膜形状によってスパイラル反応器に制限され
る。

また、毒性のあるグルタルしアルデヒドによる硬化工程
を避けることができな℃゛・。

ポリアクリルアミド系触媒はブロック重合の生成物と同
様に鋭角の不規則な粒子である。

攪拌反応器に投入する際、これらは高い摩擦性を示し、
微生物の仕込みが制限される。

これらは以下の西独国特許公開公報によって証明されて
いる。

ＤＥ−Ｏ８２２５２８１５： ４．８ ｆＥ、コリー１
２０ｍｌ触媒／４容量％ ＤＥ−Ｏ８２４２０１０２： Ｉｎ’細胞−１７０ｒＩ
ｌｌ触媒／１０容量％ ＤＥ−０８２４１４１２８： １；ｌ細胞＝１２０ｍｌ
触媒／１０容量％ しかしながら、多くの研究にもかかわらずほんのわずか
の方法が実用化されているに過ぎない。

それは次の欠点による。

これらをより大規模の反応器に加えるためには多くの担
体の機械的強度が低すぎる。

その固定化方法が浪費的すぎるので生体触媒の投入が経
済的でない。

得られる配合量が低すぎるので、不都合な空間一時間収
率しか得られない。

公知の方法の一つは重合体ネットワーク中に物理的に閉
じ込める方法を利用している。

その例を挙げると、ポリアクリルアミド、ポリメタクリ
ルアミド、コラーゲン、セルローストリアセテート、イ
オノトロピー性ゲルである。

この固定化方法を用いると、酵素、細胞片、全細胞の比
較的わずかな不活性化が生ずる。

ポリアクリルアミドゲルまたはポリメタクリルアミドゲ
ルとは異なり、例えばアルギン酸Ｃａ２＋塩を実質的に
無毒性の化合物で処理する、イオノドローピー性ゲル中
へ内包させることが知られている。

Ｍ、キールシュタインおよびＣ，ブーケはＢｉｏｔｅｃ
ｈｎ、 ＆Ｂｉｏｅｎｇ、 １９ （１９７７）、３
８７にアルギン酸Ｃａゲル中に酵素、細胞片および全細
胞を内包させる方法について述べている。

彼らはアルギン酸Ｎａ溶液をＣａ２＋凝固浴中に射出す
ることによって繊維を製造することを提案している。

しかしながら、この繊維は報告によると中程度の安定性
しか示さない。

もう一つの欠点は、上記繊維は生体触媒としては固定床
反応器にのみ投入することしかできないということであ
る。

ＩＪ、ハラケルはその論文（Ｔ ｅｃｈ 、ウニベルシ
テート・ブラウンシュバイン１９フ６ｒポリメールアイ
ンシユルス・フォノ・ミクロロガニズメンーツー・ア゛
ウフバウ・ラント・レアクテイビテート・フォノ・ビオ
カタリザトーレン （Ｐｏｌｙｍｅｒｅｉｎｓｃｈｌｕｓｓ ｖｏｎＭｉ
ｋｒｏｏｇｎａｎｉｓｍｅｎｚｕ Ａｕｆｂａｕ ｕ
ｎｄＲｅａｋｔｉｖｉｔｉｔ ｖｏｎ Ｂｉｏｋａ
ｔａｌｙｓａｔｏｒｅｎ ） Ｊ ）に、高分子電解質
を架橋浴中に射出することに゛よってイオノトロピー性
球状ゲルを生体触媒として製造することを記載している
。

そこには、種々のタイプの高分子電解質の利用性につい
ても述べられており、それにはスチレン−マレイン酸共
重合体のような完全合成生成物も含まれている。

しかしながら、これらの提案によっては充分な強度と湿
潤生体塊（ＢＦ”Ｍ）の高い含有率を持った生体触媒は
得られない。

生体触媒中の重合体含有率を増すことによって強度を高
めることは、高粘度溶液が操作しにくいということによ
り成功しない。

この発明の目的は、機械的強度が高く、酵素物質の含有
率カー高（、かつ多孔性を有する生体触媒の製造方法を
提供することである。

また、この発明の目的は高い耐圧性（Ｐ／パール）およ
び高い含有率（２酵素活性物質／グパール状触媒）を有
しかつ注意深い乾燥後４１５部ないし１１５部の相対収
縮率を示す生体触媒を提供することである。

この発明に従う上記生体触媒は好ましくはこの発明の方
法によって製造される。

しかしながら、この生体触媒はこの発明の方法で制限さ
れるものではない。

このような生体触媒は当該技術分野で知られているので
、その他の製造方法を開発する可能性がある。

この発明の目的を達成するために、この発明によれば、
酵素活性物質（Ａ１）を高分子電解質の水溶液中に０．
５ないし１５重量％の濃度範囲で懸濁または溶解してな
る混合物（Ａ）を、前記高分子電解質に対して反対極性
の多価イオンを含有する化合物を水中に０．５ないし３
５重量％の濃度で溶解してなる凝固浴としての混合物（
Ｂ）中に射出することによって粒径約０５ないし５ｍｍ
のパール状物に転化し、攪拌下にこれらパール状物を約
５分間ないし４時間放置することによってその表面を固
化し、（ロ）こうして得られた酵素活性物質内蔵パール
状触媒をろ過し、生理塩溶液で洗浄し、かつ（／−）８
０℃までの温度で空気を約４８時間までの時間にわたっ
て通じることによって乾燥して前記パール状触媒を収縮
および固化させ、（→このパール状触媒を後硬化のため
に前記凝固浴（Ｂ）に投入して再膨潤させ後架橋もしく
は再架橋によって固化を生じさせ、（力このパール状触
媒を洗浄工程に供し、湿潤状態で取り出すことを特徴と
するパール状生体触媒の製造方法が提供される。

この発明の方法には以下の各態様が含まれる。

（１）濃度０．５ないし１５重量％の高分子電解質の水
溶液中に０．５？／ＴＬｌまでの含有率で酵素を懸濁さ
せることによって混合物（’Ａ ）を製造し、これを工
程（イ）において濃度０．５ないし３５重量％の多価電
解質の水溶液よりなる混合物（Ｂ）に射出して大きさ０
．５ないし５ｍｍのパール状物を得、これを０．２５な
いし５時間均一に攪拌することによって固化し、こうし
て得たパール状触媒を工程（ロ）において生理塩液で洗
浄し、工程（）→において８０°までの温度で空気を通
じることによって乾燥し、このパール状触媒を工程に）
において後硬化させるために凝固浴（Ｂ）または濃度０
．５ないし５重量％の多価電解質の溶液よりなる凝固液
に投入し、しかる後工程（力においてこのパール状触媒
を洗浄工程に供し、湿潤状態で回収することを特徴とす
る方法。

（２）酵素活性物質が増殖性全細胞、非増殖性全細胞、
細胞片、単離酵素または酵素複合体からなり、これを懸
濁液または溶液として仕込むことを特徴とする方法。

（３）混合物（Ａ）において高分子電解質として、天然
高分子電解質、化学変性天然重合体、または分子量２０
０００ないし２０００００のアルギン酸塩もしくはペク
チン酸塩を０．５ないし約１５重量％の濃度で、あるい
は化学変性天然重合体としてカルボキシメチルセルロー
スを０．５ないし約１５重量％の濃度で仕込むことを特
徴とする方法。

（４）混合物（、Ｂ ）においてイオン性化合物として
、高分子電解質に対して反対極性の多価イオンを有する
低分子量塩、またはＣａＣｌ２、 Ａ１２ （ＳＯ４）３、Ｆ ｅ （Ｎ０３） ３ もし
くはこれらの混合物を０．０５ないし１モル／ｌの濃度
で混合物（Ａ）中に仕込むことを特徴とする方法。

（５）全細胞または細胞片をアルギン酸ナトリウムの２
ないし１０重量％水溶液中に懸濁することによって混合
物（Ａ）を調製し、工程（イ）において凝固浴（Ｂ）と
して０．０５ないし１モル濃度のＣａＣｌ２溶液を用い
、工程（ロ）および（／→の後に、工程（→において凝
固浴（Ｃ）として０．０５ないし１モル濃度のＡＩ２
（ＳＯ４） ｓ溶液を用いること、あるいは２ないし１
０重量％アルギン酸ナトリウム溶液中に単離酵素もしく
は酵素複合体を懸濁もしくは溶解させることによって混
合物（Ａ）を調製し、■楯（４）において凝固浴（Ｂ）
として０．０５ないし１モル濃度のＦｅ （Ｎｏ３）３
溶液を用い、工程（ロ）および（′）の後に、工程に）
において凝固浴（Ｂ）として０．０５ないし１モル濃度
のＦｅ （ＮＯ３） ｓ溶液を用いることを特徴とする
方法。

（６）工程（／→の乾燥によってパール状触媒を乾燥前
の４１５ないし１１５に収縮させることを特徴とする方
法。

（力 湿潤状態の酵素活性物質塊（Ａ１）を実質的に純
粋な多官能性エポキシプレポリマー成分よりなる樹脂成
分（Ａ２）と、（Ａ２）と（Ａ１）との重量比０．５：
１ないし５：１で混合し、しかる後、工程（イ）におい
て多官能性硬化成分（Ｂ１）を混合物（Ａ２）＋（ＡＩ
）と、（Ｂ１）と（（Ａ２ ） ＋ （Ａｔ ） ）と
の重量比０．２：１ないし０．８：１で混合して、重縮
合を生じさせるために攪拌によって実質的に均質に分散
させ、この系を高分子電解質（Ｄ）の水溶液と１：０．
６ないし１：２．８の重量比で混合し、この混合物を、
多価イオンを有する低分子電解質（Ｅ）の過剰に存在す
る水溶液中に射出して大きさ０．５ないし約５ｍｍのパ
ール状物を生成し、これを約５ないし５０分間攪拌して
外側の固化したパール状物へと硬化させ、工程（ロ）に
おいて洗浄工程に供し、工程ツにおいて８０℃までの温
度の空気と約３０時間まで接触させることによって注意
深（乾燥し、工程に）において硬化させ、工程（ホ）に
おいて、濃度０．０５ないし５Ｍ／ｌの前記（Ｅ）と競
合するイオン溶液で洗浄することによってパール状物か
ら高分子電解質を溶出させ、湿潤状態で分離回収するこ
とを特徴とする。

（８）樹脂成分（Ａ２）として、乳濁性低粘度エポキシ
樹脂または変性ビスフェノールＡ／エピクロルヒドリン
−エポキシ化合物を用いることを特徴とする方法。

（９）硬化成分（Ｂ１）として粘稠ポリアミノアミドを
約２０ないし５０重量％水溶液の形態で用いることを特
徴とする方法。

００）高分子電解質溶液（Ｄ）として天然高分子電解質
または化学変性天然高分子電解質を用いること、あるい
はアルギン酸ナトリウムを５ないし１０重量％の濃度で
用いることを特徴とする方法。

ａυ 低分子電解質（Ｅ）として、高分子電解質（Ｅ）
に対して反対極性の多価イオンを有する塩を用いること
、または混合物（Ａ）においてアニオン性高分子電解質
（Ｄ）を用いる際０．０５ないし１モル濃度のＣａＣｌ
２溶液を用いることを特徴とする特許請求の範囲第８項
ないし第１１項のいずれかに記載の製造方法。

（１２）樹脂成分（Ａ２）、硬化成分（Ｂ１）、生体塊
（Ａ１）および高分子電解質（Ｄ）を混合し、この混合
物をＣａＣｌ２水溶液よりなる低分子電解質の水溶液中
に周期的に射出することを特徴とする方法。

（１３） 工程→において濃度比（Ｄ）：（Ａ２）＋
（Ｂｌ）＋（ＡＩ）を変えることによってパール状触媒
の気孔率を調節することを特徴とする方法。

Ｉ 工程（イ）において、混合物（Ａ）または（Ａ２＋
Ａ１）を周期的に混合物（Ｂ）または（Ｂ１）に射出す
ることを特徴とする方法。

この発明では、注意深い乾燥によってパール状触媒は所
定の収縮を受け、これによってより高い強度、酵素活性
物質のより高い含有率がより高い気孔率において達成さ
れるという効果を利用している。

その際、凝固浴（Ｂ）または（Ｃ）との新たな平衡化に
よって制限された再膨潤 （Ｒｉｉｃｋｑｕｅｌｌｕｎｇ ） Ｌか生じないとい
うことは驚（べき効果である。

この効果はこの発明の課題・目的を解（ことにつながる
。

このような効果は従来知られておらず、また、この発明
の有用性もそこにある。

この発明の生体触媒は全細胞、細胞片または酵素から選
ばれた酵素活性物質を重合体中にパール状に内包させて
なるもので、８００ないし１０００の耐圧性（Ｐ／パー
ル）および０．９までの酵素活性物質含有率（グ酵素活
性物質／グパール状触媒）を持つ。

この発明の方法はこのような生体触媒を製造するもので
ある。

この発明の方法の効果は次の実験から明らかである。

８％アルギン酸塩溶液の２％ＣａＣｌ２溶液で常法によ
り架橋することによってゲルパールを製造した。

室温で空気を５時間通じることからなる注意深い乾燥に
よってパールは３．５ｍｍから１．５１１Ｌ１１Ｌにそ
の直径が収縮した。

これは初期直径の約２１５に相当する。

２％ＣａＣｌ２溶液との新たな平衡化によって直径２ｍ
ｒｎまでのわずかな再膨張が生じた。

これを３０％グルコース溶液中に６５℃で６週間放置し
てもそれ以上の膨潤は生じなかった。

触媒パールの収縮とその結果の生体触媒中の重合体固形
分との関係を添付の図に示す。

この図では、生体触媒パールの直径（ｗ）と固形分含有
率（％）とを乾燥時間との関連においてグラフ的に示し
ている。

この例、によると、生体触媒パールの直径ハ２１ｉ間ま
での乾燥では急激に減少し、それ以後５時間までは平坦
な曲線にそってゆるやかに減少する（実線）。

一方、固形分含有率の増大は１時間後および４時間後に
転換点を示し、その間は一様な勾配で素早（進行する（
点線）、固形分含有率の増大はかなり規則的なものと考
えることができる。

以下この発明を実施例に基いて詳しく述べる。

実施例 １ まず、圧縮酵母１５０グを水で１５０ｍ１までとした状
態（酵素活性物質）でアルギン酸Ｎａの８重量％溶液（
高分子電解質の水溶液） ４５ ｏｍｉ中に懸濁させる
ことによって混合物（Ａ）を調製した。

混合物（Ａ）の高分子電解質と反対極性の多価イオンを
有する化合物を含有する凝固浴（Ｂ）として０．２モル
ＣａＣｌ２溶液を用いた。

次に、工程（イ）において、直径０．４ ｍｒｕのキャ
ピラリーから混合物（Ａ）を、攪拌下で、凝固浴（Ｂ）
中に滴下した。

こうして、直径４ｍｗのパールを得た。

これらを攪拌下に１５分間放置することによって固化さ
せた。

ついで、工程（ロ）において、得られたパール状触媒（
酵素活性物質を内包）をろ過し、生理ＮａＣ１液で洗浄
した。

ついで、工程（／つにおいて、乾燥室中で３０℃の空気
を２０時間通じる注意深い乾燥でパール状触媒を乾燥し
た。

これらの処理によってパール状触媒の収縮と固化が生じ
た。

この乾燥前の状態に対する収縮率は約２１５であった。

次に、工程（に）において、濃度０．１モル／ｌのＡ１
２ （ＳＯ４） ｓ溶液からなる凝固浴（Ｃ）中に３０
分間浸漬することによってパール状触媒の後硬化をおこ
なった。

ついで、工程（（ホ）において、パール状触媒を生理Ｎ
ａＣ１液による洗浄工程に供し、湿潤状態で回収した。

この実施例のパール状触媒は次に示す高い機械的強度と
酵素活性物質含有率とを示した。

混合物（Ａ）の容量が製造過程で６００ｍ１から最終的
に１７０ゴに減少したこと、およびこの触媒容量には最
初に加えた１５０７の圧縮酵母が湿潤生体塊として含ま
れていることから、０．８８ ｆ圧縮酵母／グ生体触媒
の含有率となる。

この発明の方法に従って耐圧性は破壊時の荷重において
７５０ｐ／パールであった。

実施例 ２ まず、遠心湿潤塊の形態のＥ、コＩＪ（ＡＴＣＣ１１１
０５）１００ｆを水で１５０７７１１にした状態でアル
ギン酸Ｎａ （高分子電解質）の８重量％水溶液４５０
ｍ１中に懸濁させることによって混合物（Ａ）を調製し
た。

その他は実施例１と同様に処理した。

混合物（Ａ）から合計１６５ＴＬｌのパール状生体触媒
が得られた。

また、含有率は０．６ＰＢＦｗ包生体触媒であった。

既述の方法に従う耐圧性は８００ ｐ／パールであった
。

実施例 ３ まず、アミログルコシ−ダーゼ１００ヤをアルギン酸の
８％水溶液１０ｒｕｌ中に懸濁させることによって混合
物（Ａ）を調製した。

凝固浴（Ｂ）として０．５−Ｅ、ルーＣａＣ１ｚ溶液を
用いた。

工程（イ）で直径０．４ ｍｒｎのキャピラリから攪拌
下で混合物（Ａ）を凝固浴（Ｂ）中に滴下し、直径４龍
のパールが生成した。

これらをさらに攪拌下に１５分間放置することによって
固化させた。

ついで、工程（ロ）で、得られたパール状触媒（酵素活
性物質を内包）をろ過し、生理ＮａＣ１液で洗浄した。

ついで、パール状触媒を工程０→で、３０℃で空気を２
０時間通じることによって乾燥した。

この処理によりパール状触媒の収縮と固化が生じた。

■、５朋の直径で相対収縮率は約２１５であった。

ついで、工程に）で、０．１モルＡ１２ （ＳＯ４）
３溶液よりなる凝固浴（Ｃ）中に３０分間浸漬すること
によってパール状触媒の後硬化をおこなった。

次に、工程（ホ）でパール状触媒を生理ＮａＣ１液によ
る洗浄工程に供し、湿潤状態で回収した。

このパール状触媒は最終状態で１．８ｍｍの直径を持ち
、これから量収支の比により３２〜酵素／ｍｌ生体触媒
の含有率を得た。

この発明に従った耐圧性によると７８０ ｐ／パールの
強度が得られた。

この発明の方法に従って製造された生体触媒は従来法に
従うものに比べて耐圧性（ｐ／パール）および酵素活性
物質の含有率（グ酵素活性物質／グパール状触媒）が著
しく増大する。

例えば、硬化していないアルギン酸塩パールの耐圧性が
この発明に従う生体触媒パールと匹敵する。

以下、耐圧性を決定するための測定方法を記載する。

試験装置の機械部品は固定試験台と、その上に配置され
、成力装置（ホツテインガー・ボールドウィン・メステ
クニック社製吸引装置Ｕｌ／ＩＫポンド）で固定接続さ
れたスタンプと、モータおよび歯車よりなる駆動装置で
ある。

上記成力装置の信号は測定増幅器タイプＫＷＳ３０７２
（ＨＢＭ社製）で増幅されて、記録計に入力される。

触媒粒子の耐荷重性を測定するために、各粒子を上記試
験台に載せる。

ついで、上から上記スタンプを１．４５ｍｍ／分の送り
速度で触媒粒子上に押圧する。

触媒粒子上に作用する力はスタンプ、成力装置および増
幅器を通って直接測定量として記録計によってカ一時間
図に記録される。

上記カ一時間図中における歯状不連続によって破壊操作
がはっきりと示されているので耐破壊性についての結果
は上記図から明らかである。

力測定の許容誤差は１％以下であり、１回の仕込みで得
られる多数のパールを測定することによって当然変動す
るが、±５％を超えることはない。

上記測定方法によって、ディメンジョンｐ／パールの耐
圧性が各パールの形状に拘束された太きさとして定義さ
れる。

上記測定方法は力を単に力の単位、より厳密にいうとポ
ンド／パールで表現している。

「ｐ／パール」とはこの定義のことである。

力の単位「ポンド」はＳＩ−力の単位「ニュートン」で
は次のように換算される。

１０００ポンド＝９．８０６ニユートンキ１０ニユート
ン。

上記方法に従うと、従来の未硬化の直径３−５ｍｍのア
ルギン酸Ｃａパールは１０ないし１５０ｐの圧力で破壊
する。

これに対し、この発明の方法で得たパール状生体触媒は
直径２ｍｗのもので６００ないし１０００ｐ／パールの
圧力で初めて破壊する。

この発明の方法で製造されたパール状生体触媒はファク
ター３〜５での容量減少に関連した生体（酵素）塊の濃
縮によって従来では達成できなかった含有率を示す。

前述のＭ、キールシュタインおよびＣ，ブーケは０、２
５８ Ｆ Ｍ／ｉ触媒を達成している。

西独国特許公開公報２２５２８１５号、 ２４２０１０２号および２４１４１２８号ではポリアク
リルアミドゲル中に固定することによって０．０４ない
し、０．１１ＢＦＭ／ｆｆｌ触媒の含有率しか得られて
いない。

これに対して、この発明の方法で得た生体触媒パールは
０．８８？ＢＦＭ／？パール状触媒の含有率を示す。

この発明の方法で得た生体触媒パールはさらに、ラスタ
ー電子顕微鏡（ＲＥＭ）による写真から観察されるよう
に多孔性を示す。

酵素活性物質の含有率が高いことは、例えば、相対活性
度６１％および絶対活性度４４００Ｕ（単位）／ｌ触媒
でペニシリンＧを固定化Ｅ、コリ細胞と反応させること
によって証明される（パール状生体触媒：直径２．５ｍ
−含有率０．５１ＢＦＭ／ｃｒｉｔ：温度：３７℃；Ｃ
８−５％；ペニシリンＧＮａ塩）。

実施例 ４ 遠心した流動性ＢＦＭの形態のＥ−コリ細胞（ＡＴＣＣ
１１１ｏｓ）３ｏＰ（成分（Ａ１）として）をエポキシ
樹脂「エピ−コートＤＸ２５５」（ドイツ・シェル社製
）１１’（樹脂成分（Ａ２）として）と混合した。

ゑ次に、ポリアミンアミ
ド系硬化剤成分（Ｂ１）として［カサミドＣＡ３６０Ｊ
（アクゾ・ヒーミー社製）の２５％水溶液２０１を攪拌
によって充分に分散させ、エポキシ樹脂の重縮合をおこ
なった。

（Ａ２）＋（Ｂ１）＋（Ａ１） の系を溶液（Ｄ）とし
ての、アルギン酸Ｎａ（マヌコールＬＤ、アルピナーテ
・インド社製）の８重量％水溶液２０ｍ１とよく混合し
、ついで、これを工程（イ）において直径０．４ ｍｍ
のキャピラリから加圧下に凝固浴としての２重量％Ｃａ
Ｃ１２溶液中に射出した。

こうして直径３ないし４ｍｖｔパールを得た。

２０分間の攪拌後、上記ＣａＣｌ２溶液からパールを安
定な粒子として回収し、工程（ロ）で洗浄した。

ついで、工程（′→において２４時間２８℃で空気を通
じることによって注意深い（５ｃｈｏｎｅｎｄｅ ）乾
燥をおこなった。

これによって初期直径の約２１５までパールの収縮がお
こった。

この乾燥した、成分（Ａ２）および（Ｂ１）に関して硬
化したパールを工程（→において０．１モルリン酸塩緩
衝液中で攪拌下に４０分間洗浄し、その際高分子電解質
成分（Ｄ）としてのアルギン酸塩が粒子から溶出し、パ
ールは直径３關凍で収縮した。

こうして得られた多孔性生体触媒は次の表に示されるよ
うに、高い細胞塊含有率と良好な機械的安定性を示す。

相対活性度２８％（固定化細胞／同一数の自由細胞）で
絶対活性度（ペニシリンＧ−アシラーゼ、３７℃、ｐＨ
＝７．８）は３８μ触媒／ｌ触媒である。

この発明の方法による耐圧性は６５１ ｐ／パールであ
った。

実施例 ５ 成分（Ａ１）としての圧縮酵母３５グを樹脂成分（Ａ２
）としてのエポキシ樹脂（エピコートＤＸ−２５５）１
０ｖ中に攪拌混入した。

この混合物に、成分（Ｂ１）として「カサミドＣＡ３６
０Ｊの２５重量％水溶液を攪拌によって良く分散させた
。

（Ａ２）＋（Ｂｌ）＋（ＡＩ） の系をマヌコールＬ
Ｄの８重量％水溶液３５ｍ１とよ（混合し、直径０、４
ｍｍのキャピラリから加圧によって成分（Ｅ）として
の１重量％ＣａＣ■２溶液中に射出した。

こうして直径３〜４ｍｍのパールを得た。

以後、実施例４と同様の操作をおこなった。

パール状生体触媒は最終的に３ｍｍの直径を持っていた
。

含有率は１．１８８ Ｆ’Ｍ／Ｐ生体触媒であり、グル
コースのへタノールへの分解時に測定した絶対活性度は
０．１８ ｆグルコース／ｍｌ触媒・時であった。

この発明に従う耐圧性は６５０１）／パールであった。

このパール状生体触媒は実質的に同一形状を示すので、
耐圧性にとって一定の物質量が得られる。

この発明の第２の方法によれば、生体触媒の重合体マ）
ＩＪラックス実質的な合成は多官能性、水中乳濁性エ
ポキシプレポリマー成分（Ａ２）をポリアミノアミドの
ような硬化成分（Ｂ１）で重縮合することによって達成
される。

この一般的な反応タイプの技術的な利点は重合体の合成
が反応成分を適当に選択することによって副生成物を生
成することなく室温でおこなえるということである。

この発明の方法に従って得た重合体ネットワークは機械
的および化学安定性が高い。

例えば、塩溶液や酸性およびアルカリ領域における極端
なｐＨ値で処理してもネットワークの物性は何の影響も
受けない。

この発明の方法に従って用いられるエポキシプレポリマ
ーは水系媒体中で、有毒な溶媒の排除下に実質的に無毒
性のパール状生体触媒を与える。

湿潤生体塊（Ａ１）を粘稠なエポキシ樹脂成分（Ａ２）
に直接投入することによって、細胞は成分（Ａ２）で被
覆され、その際この無毒性樹脂は固定死中保護コロイド
の作用をなす。

全細胞または細胞片の内包に対するエポキシドの特別の
適合は（Ａ２ ） ＋ （Ａ’ｌ ）の（Ｂ１）とのブ
ロック縮合によって生ずる。

樹脂および硬化成分（Ａ２）＋（Ｂｌ）の付加量に比例
して生体塊（Ａ１）の割合が高いことによって、ブロッ
ク重合によって合成したエポキシ重合体が、ＲＥＭで確
認されるように多孔性を持つことが達成される。

水の発生下でのブロック重合に伴なう、この発明の方法
に従って用いられる物質（Ａ２）および（Ｂ１）の担体
物質の収縮によってより高い酵素活性度を有する生体塊
（Ａ１）の含有率が高くなる。

さらに、技術的方法にとって必然的な約３ないし４ｍｍ
の核を用いた操作方法によって初期活性度の約１１５の
わずかな酵素活性度が得られる。

この結果は拡散阻止に帰着する。

生体塊（Ａ１）の含有率が高いことによって、基体分子
は全ての細胞を得ることはできない。

これらの確認は次の試験で証明できる。

細胞を含有するエポキシブロックを重合体ミル中で鋭角
の不規則な５０ないし１００ミクロンの粒子に破砕する
と、これら粒子は高い酵素活性度を示す。

これは比較的おだやかな固定化技術についてのものであ
る。

また、これによって物質の多孔性についてのＲＥＭ結果
も確認される。

しかしながら、この種の破砕触媒粒子の核の大きさが増
大すると活性度が減少する。

したがって、この種の製品は従来法での使用には適して
いない。

これに対して、この発明の方法で得たパール状触媒は技
術的に必然の核の大きさにおいて高い酵素活性度を示す
。

この発明に従って好ましくは室温で乾燥し、パール状触
媒を硬化させるために約３０時間までもの長時間（これ
は原料の可使時間が長いことを意味する）を要すること
は固化方法にとって望ましい時間の保留という利点を提
供する。

従来法では粉砕エネルギーの消費が犬である。

という欠点もある。

これに加えて、不規則な乾燥した、もろい粒子の摩擦が
かなり起り、また拡散の制限による反応の阻止という問
題が生じる。

これらの欠点はこの発明の方法およびこの発明に従うパ
ール状触媒によって解消される。

すなわち、この発明の方法によれば、重縮合（Ａ２）＋
（Ｂｌ）とイオノトロピー性ゲル生成（Ｄ）＋（Ａ１）
とを組み合せることによってパール状多孔性生体触
媒が得られ、これは従来の生体触媒に比較して高い機械
的および化学安定性並びに酵素活性物質の高い含有率を
示し、また技術的に重合な約２ないし５間の核の大きさ
において高い酵素活性度を示し、かつそのパール状形態
およびその強度によって公知の反応系に仕込むこともで
きるものである。

好ましい方法はアルギン酸Ｎａのような高分子電解質（
Ｄ）をエポキシ−硬化剤−生体塊（（Ａ２）＋（Ｂｌ
）＋（ＡＩ ） ）に混和させたものをＣａＣｌ２水溶
液よりなる凝固浴（Ｅ）中に周期的に射出するものであ
り、これによって、小滴外表面におけるアルギン酸塩の
イオン的架橋が直ぐに生じ、それによってパール状触媒
が生成する。

その際、アルギン酸Ｃａ皮膜の内部において樹脂−硬化
剤系（Ａ２）＋（Ｂｌ）の重縮合が同時に開始する。

短時間の後、小滴がパールへと固化すれば、それを回収
し、洗浄することができ、空気の導入による注意深い乾
燥に供することができる。

室温で約２０時間の乾燥工程が終了した後パール状触媒
中に均一に分布しているアルギン酸塩をリン酸塩緩衝液
で洗い出す。

この処置により貫通したキャピラリ路が生じ、エポキシ
ド（Ａ２）＋（Ｂｌ）および生体塊（Ａ１）よりなる多
孔性パール状生体触媒が得られる。

工程（イ）におけるアルギン酸塩の内包と工程（／→に
おける溶出によって得た多孔性は乾燥アルギン酸塩を含
むパールに対してアルギン酸塩の洗い出しによって得た
膨潤した触媒パールが３０％多いことがＲＥＭによって
光学的に証明できる。

この発明に従うパール状触媒の利点は同一の大きさにお
いて従来のパール状触媒に対して著しく高い酵素活性度
を有するということにもある。

高分子電解質マトリックス（Ｄ）＋（Ｅ）中で（Ａ２）
十（Ｂｌ）の重縮合をおこなうことによって得たエポキ
シネットワークの構造変化によって担体マ） ＩＪラッ
クス巨視的物質挙動はブロック縮合粒子におけるもろい
挙動からこの発明に従うパール状触媒における弾性的挙
動に移行する。

このシ技術的利点はこの発明に従う触媒パールの汎用性
のある投入にとって重要な意義がある。

以下の差は、耐圧性（ｐ／パール）についてこの発明に
従うパール状触媒が従来のものよりも優れていることを
示している。

この発明に従う触媒パールの破壊はバッチ式攪拌釜操作
における極端な条件下でも確認できなかった。

次の表には、同様の測定法に従い市販のイオン交換樹脂
についての耐圧性（ｐ／パール）が比較して示されてい
る。

「レバテイット」はバイエルＡＧの製品。

材料：スチレン−ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）。

ＤＶＢ含有率は架橋度を示している。

上記比較はこの発明に従うパール状触媒の高い耐圧性を
証明している。

生体触媒の酵素安定性が長いということは工業的条件下
において仕込むことに関し重要な寄与をなす。

エポキシドパール中に固定されたＥ、コリ細胞を有する
、この発明に従って得たパール状触媒は０．９％ＮａＣ
１液中９℃で貯蔵する反、１２０日後でも初期活性度の
約２１％の活性度を持つ。

同様の条件下で貯蔵された自由細胞は３〜４日後日用使
用不能る。

反応速度論的長時間試験を、攪拌釜特性を有するスパイ
ラル床反応器中でおこなった。

これには、この発明の方法に従って新たに製造したパー
ル状触媒を用いた。

一連のバッチ反応操作を繰返しおこなった。

０．５％ペニシリンＧ溶液１１を、酵素活性物質として
Ｅ、コリ細胞を含有するパール状触媒を収容するスパイ
ラル床反応器中にポンプで連続的に循環させた。

温度は３７℃、ｐＨは７，８であった。反応溶液は２４
時間で完全に新たな０．５％ペニシリンＧ溶液と置換さ
れた。

上記生体触媒の酵素活性度は３０日間実質的に一定であ
った。

固定化Ｅ、コリ細胞を有するポリアクリルアミド系生体
触媒についておこなった比較試験では４０℃でほぼ半分
の１７日間の安定性しか示さなかった。

これに（良すトー、トサ、シバタによる［コンティニュ
アス・プロダクション・オブ・６−アミツペニシリンア
ニツク・アミド・クロム・ペニシリン・パイ・インモー
ビライズド・マイクロバイアル・セルズ」（ヨーロッハ
応用微生物学雑誌、２１５３１６０（１９７６））を参
照。

この発明に従う生体触媒の特徴はより高い機械的および
化学安定性並びに多孔性さらにはより高い細胞含有率に
よるより高い酵素活性度を持つということである。

この発明に従う生体触媒のパール形状によって非常に良
好な空間一時間収率および長期安定性を伴なって種々の
反応器のタイプに普通的に投入することができる。

このことによって従来のものに対するこの発明の生体触
媒の優位性が証明される。

また、この発明は従来のものよりも簡単に実施できるの
で、経済的に有利である。

このことはコスト的に有利な出発原料が用いられること
にもよる。

この発明の方法は重合体成分および架橋剤を広い範囲で
選択できるという利点も持っている。

これによって、イオノトロピー性ゲルは生体塊の生理学
的性質を最適に調節することができる。

選択の余地が広いということは生体塊として全細胞、細
胞片および酵素を内包させることが容易であるというこ
とである。

このことによって、この発明の生体触媒の可使時間が高
くなる。

例えば、アルギン酸Ｆｅ触媒パール中にアミノグルコシ
ダーゼを内容させることによって６日後の活性度残率は
９０％以上であった。

この発明のもう一つの利点はイオノトロピー性ゲルを生
成するための架橋反応が可逆的であるということである
。

これによって、生体触媒の重合体成分を使用後溶解する
ことによって回収できる。

【図面の簡単な説明】

添付図はこの発明の生体触媒パールの直径および固形分
含有率の乾燥時間に対する特性図。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ （イ）酵素活性物質（Ａ１）を高分子電解質の水溶
   液中に０．５ないし１５重量％の濃度範囲で懸濁または
   溶解してなる混合物（Ａ）を、前記高分子電解質に対し
   て反対極性の多価イオンを含有する化合物を水中に０．
   ５ないし３５重量％の濃度で溶解してなる凝固浴として
   の混合物（Ｂ）中に射出することによって粒径約０．５
   ないし５ｍｍのパール状物に転化し、攪拌下にこれらパ
   ール状物を約５分間ないし４時間放置することによって
   その表面を固化し、（ロ）こうして得られた酵素活性物
   質内蔵パール状触媒をろ過し、生理塩溶液で洗浄し、か
   つ０９８０℃までの温度で空気を約４８時間までの時間
   にわたって通じることによって乾燥して前記パール状触
   媒を収縮および固化させ、（→このパール状触媒を後硬
   化のために前記凝固浴（Ｂ）に投入して再膨潤させ後架
   橋もしくは再架橋によって固化を生じさせ、（イ）この
   パール状触媒を洗浄工程に供し、湿潤状態で取り出すこ
   とを特徴とするパール状生体触媒の製造方法。 ２ 濃度０．５ないし１５重量％の高分子電解質の水溶
   液中に０．５ ？／ｍｌまでの含有率で酵素を懸濁させ
   ることによって混合物（Ａ）を製造し、これを工程（イ
   ）において濃度０．５ないし３５重量％の多価電解質の
   水溶液よりなる混合物（Ｂ）に射出して大きさ０．５な
   いし５朋のパール状物を得、これを０．２５ないし５時
   間均一に攪拌することによって固化し、こうして得たパ
   ール状触媒を工程（ロ）において生理塩液で洗浄し、工
   程（／うにおいて８０℃までの温度で空気を通じること
   によって乾燥し、このパール状触媒を工程（→において
   後硬化させるために凝固浴（Ｂ）または濃度０．５ない
   し５重量％の多価電解質の溶液よりなる凝固浴に投入し
   、しかる後工程（（１）においてこのパール状触媒を洗
   浄工程に供し、湿潤状態で回収することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３ 酵素活性物質が増殖性全細胞、非増殖性全細胞、細
   胞片、単離酵素または酵素複合体からなり、これを懸濁
   液または溶液として仕込むことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の製造方法。 ４ 混合物（Ａ）において高分子電解質として、天然高
   分子電解質、化学変性天然重合体、または分子量２００
   ００ないし２０００００のアルギン酸塩もしくはペクチ
   ン酸塩を０．５ないし約１５重量％の濃度で、あるいは
   化学変性天然重合体としてカルボキシメチルセルロース
   を０．５ないし約１５重量％の濃度で仕込むことを特徴
   とする特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに
   記載の製造方法。 ５ 混合物（Ｂ）においてイオン性化合物として、高分
   子電解質に対して反対極性の多価イオンを有する低分子
   量塩、またはＣａＣｌ２、Ａ１２ （５Ｏ４）３、Ｆ
   ｅ （ＮＯｓ ） ｓ もしくはこれらの混合物を０
   ．０５ないし１モル／ｌの濃度で混合物（Ａ）中に仕込
   むことを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第４項
   のいずれかに記載の製造方法。 ６ 全細胞または細胞片をアルギン酸ナトリウムの２な
   いし１０重量％水溶液中に懸濁することによって混合物
   （Ａ）を調製し、工程→において凝固浴（Ｂ）として０
   ．０５ないし１モル濃度のＣａ Ｃ１２溶液を用い、工
   程（ロ）および（−→の後に、工程（に）において凝固
   浴（Ｃ）として０．０５ないし１モル濃度のＡｌ２（Ｓ
   Ｏ４）３溶液を用いること、あるいは２ないし１０重量
   ％アルギン酸ナトリウム溶液中に単離酵素もしくは酵素
   複合体を懸濁もしくは溶解させることによって混合物（
   Ａ）を調製し、工程（イ）において凝固浴（Ｂ）として
   ０．０５ないし１モル濃度のＦｅ （ＮＯ３） ｓ溶液
   を用い、工程（ロ）および（−→の後に、工程に）にお
   いて凝固浴（’ Ｂ ）として０．０５ないし１モル濃
   度のＦｅ （ＮＯｓ ） ｓ溶液を用いることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記
   載の製造方法。 ７ 工程（−表の乾燥によってパール状触媒を乾燥前の
   ４１５ないし１１５に収縮させることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の製造
   方法。 ８ 工程（イ）において、混合物（Ａ）を周期的に混合
   物（Ｂ）に射出することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項ないし第１項のいずれかに記載の製造方法。 ９ （イ）湿潤状態の酵素活性生体塊（Ａ１）を実質的
   に純粋な多官能性エポキシプレポリマー成分よりなる樹
   脂成分（Ａ２）と、（Ａ２）と（八〇）との重量比０．
   ５：１ないし５：１で混合し、しかる後、多官能性硬化
   成分（Ｂ１）を混合物（（Ａ２ ）＋（ＡＩ））と、（
   Ｂ１）と（（Ａ２＋（ＡＩ））との重量比０．２：１な
   いし０．８：１で混合して、重縮合を生じさせるために
   攪拌によって実質的に均質に分散させ、この系を高分子
   電解質（Ｄ）の水溶液と１：０．６ないし１：２．８の
   重量比で混合し、この混合物を、多価イオンを有する低
   分子電解質（Ｅ）の過剰に存在する水溶液中に射出して
   大きさ０．５ないし約５ｒ／Ｌｒ／Ｌのパール状物を生
   成し、これを約５ないし５０分間攪拌して外側の固化し
   たパール状物へと硬化させ、（ロ）これをろ過し、生理
   塩溶液で洗浄し、（′９８０℃までの温度の空気と約３
   ０時間までの時間接触させることによって乾燥し、に）
   これを濃度０．０５ないし５Ｍ／ｌの前記（Ｅ）と競合
   するイオン溶液で洗浄することによってパール状物から
   高分子電解質を溶出させ、湿潤状態で分離回収すること
   を特徴とするパール状生体触媒の製造方法。 １０ 樹脂成分（Ａ２）として、乳濁性低粘度エポキ
   シ樹脂または変性ビスフェノールＡ／エピクロルヒドリ
   ン−エポキシ化合物を用いることを特徴とする特許請求
   の範囲第９項記載の製造方法。 １１ 硬化成分（Ｂ１）として粘稠ポリアミノアミド
   を約２０ないし５０重量％水溶液の形態で用いることを
   特徴とする特許請求の範囲第９項または第１０項記載の
   製造方法。 １２ 高分子電解質溶液（Ｄ）として天然高分子電解
   質または化学変性天然高分子電解質を用いること、ある
   いはアルギン酸ナトリウムを５ないし１０重量％の濃度
   で用いることを特徴とする特許請求の範囲第９項ないし
   第１１項のいずれかに記載の製造方法。 １３ 低分子電解質（Ｅ）として、高分子電解質（Ｄ
   ）に対して反対極性の多価イオンを有する塩を用いるこ
   と、または混合物（Ａ）においてアニオン性高分子電解
   質（Ｄ）を用いる際、０．０５ないし１モル濃度のＣａ
   Ｃｌ２溶液を用いることを特徴とする特許請求の範囲第
   ９項ないし第１２項のいずれかに記載の製造方法。 １４ 樹脂成分（Ａ２）、硬化成分（Ｂ１）、生体塊
   （Ａ１）および高分子電解質（Ｄ）を混合し、この混合
   物をＣａＣｌ２水溶液よりなる低分子電解質の水溶液中
   に周期的に射出することを特徴とする特許請求の範囲第
   ９項ないし第１３項のいずれかに記載の製造方法。 １５ 工程（／→において濃度比 （Ｄ） ： （Ａ２）＋（Ｂｌ ）＋（ＡＩ ） を
   変えることによってパール状触媒の気孔率を調節するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第９項ないし第１３項の
   いずれかに記載の製造方法。 １６ 工程（イ）において、混合物（（Ａ２）＋（Ａ
   Ｉ））を周期的に混合物（Ｂ１）に射出することを特徴
   とする特許請求の範囲第９項ないし第１５項のいずれか
   に記載の製造方法。