JPS62138193A - 酵素又は微生物菌体の粒状固定化成形物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素又は微生物菌体の固定化に関し、さらに詳
しくは酵素又は微生物菌体を粒状成形物として固定化す
る方法に関する。

酵素又は微生物の固定化法としては、従来から包括法、
物理的吸着法、共有結合法等多くの方法が知られている
。これらの方法によって得られる塊状あるいはシート状
の固定化物は微生物反応や酵素反応に使用する場合には
、細かく切断したり粉砕したりした後方ラムに充填する
のが普通である。しかしその場合固定化物は面同志で密
着することが多く、微生物反応や、酵素反応の効率が悪
くなり、またたびたびチャネリング現象を起こしてカラ
ムを閉塞する等の欠点もある。

本発明者らは酵素又は微生物菌体を粒状成形物として固
定化することができれば、流動しゃすぐカラムへの充填
作業が容易で、粒子同志の接触面積も少なく微生物反応
や酵素反応の効率をアップすることができると考え先に
光硬化性樹脂と水溶性高分子多糖類を用いて酵素又は微
生物菌体の粒状ゲルを調製する方法を提案した（特開昭
５９−１１１８２号公報参照）。

しかしながら、光硬化性樹脂は高価であり、且つ粒状物
に均一に活性光線を照射することが必要なためその適当
な照射装置がなかなか得られないなどの問題がありその
改善が要望されていた。そこで本発明者らは酵素又は微
生物菌体を容易に珪つ低コストで粒状成形物として固定
化する方法について鋭意研究を行なったところ、固定化
担体として安価なポリビニルアルコールを用いこのもの
と多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力のある
水溶性高分子多糖類との組合わせを使用して、硼酸と多
価金属イオンを含む水性媒体から極めて簡単に、酵素又
は微生物菌体のロスもなく、機械的強度の大きい粒状固
定化物を製造することができることを見い出し本発明を
完成するに至った。しかして、本発明によれば、 （ａ）　　ポリビニルアルコール、 （ｂ）　　多価金属イオンとの接触によりゲル化する能
力のある水溶性高分子多糖類、及び（ｃ）　　酵素、又
は微生物菌体 を含んでなる液状組成物を、多価金属イオンと硼酸を含
有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化さ
せることを特徴とする酵素又は微生物菌体の粒状固定化
成形物の製造方法が提供される。以下本発明の方法につ
いてさらに訂しく説明する。

（ａ）　　ポリビニルアルコール ポリビニルアルコールは安価で毒性も少なく、かつ機械
的強度にも優れたものである。該ポリビニルアルコール
としては、ケン化度は一般にｉｏｏ〜７５、重合度は３
００〜３，０００のものが使用されるが、取り扱い粘度
、機械的強度を考慮すると、好ましくはケン化度９０〜
８０、重合度５００〜２．５００のものである。

（ｂ）　　水溶性高分子多糖類 本発明の方法は、酵素又微生物菌体の固定化担体の水性
媒体中でのゲル化及び粒状を達成するために、固定化担
体として、前（ａ）項に述べたポリビニルアルコールと
組合わせて水溶性高分子多糖類を使用することに１つの
大きな特徴がある。

本発明において使用する水溶性高分子多糖類は、水溶性
であり、水性媒体中で多価金属イオンと接触したときに
水に不溶性又は難溶性のゲルに変化する能力のある高分
子多糖類で、−・般に約３．０００〜約２，０００，０
００の分子量を有し、また、多価金属イオンと接触させ
る前の水溶性の状態で通常少なくとも約ｌｏｇ／、ｕ（
２ｓ℃）の溶解度を示すものが好適に使用される。

かかる特性をもつ水溶性高分子多糖類の具体例としては
、アルギン酸のアルカリ金属塩、カラギーナン、マンナ
ン、キトサン等が包含される。

これら水溶性高分子多糖類の１種であるアルギン酸の金
属塩は水性媒体中に溶解した状態で、多価金属イオン、
例えばマグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロ
ンチウムイオン、バリウムイオン等のアルカリ土類金属
イオン或いはアルミニウムイオン、セリウムイオン、ニ
ッケルイオン等の他の多価金属イオンのうちの少なくと
も１種の多価金属イオンと接触するとゲル化しうる。な
お、本発明において使用しうる水溶性高分子多糖類は、
すべての多価金属イオンの接触に対してゲル化能を有し
ている必要はなく、少なくとも１種の多価金属イオン、
好ましくはアルカリ土類金属イオンと接触した時にゲル
化する能力を有していれば充分である。ゲル化が起る多
価金属イオンの濃度は水溶性高分子多糖類の種類等によ
り異なるが、一般には少なくとも０．０１ｍｏ文／！ｌ
である。

（ｄ）　　酵素又は微生物菌体 本発明の方法により固定化しうる酵素又は微生物菌体の
種類には特に制約はなく、本発明の方法によれば、どの
ような種類の酵素又は微生物菌体でも、その酵素活性を
実質的に失活させることなく固定化することができる。

しかして、本発明の方法によって固定化しうる酵素及び
微生物菌体の代表例を示せば次のとおりである。

（イ）　酵素の例 ラクテートデヒドロゲナーゼ（１、１、２、３）ラクテ
ートオキシダーゼ（１，１，３，２）グルコースオキシ
ダーゼ（１，１，３，４）ホルメートデヒドロゲナーゼ
（１、２、１、２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（１，
２，１，３）アルデヒドオキシダーゼ（１，２，３，１
）キサンチンオキシダーゼ（１，２，３，２）ピルビン
酸オキシダーゼ（１，２，３，３）ピルビン酸リダクタ
ーゼ（１，２，４，１）コルチゾン−α−リダクターゼ （１，３，１，４） アシルＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ （１３，９９，３） ３−ケトステロイドΔｌ−デヒドロゲナーゼ（１，３，
９９，４） ３−ケトステロイドΔ４−デヒドロゲナーゼ（１，３，
９９，５） Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ （１，４，１，１） Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ （１，４，１，３） Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（１，４，３，２）Ｄ−アミ
ノ酸オキシダーゼ（１，４，３，３）カタラーゼ（１，
１１，１，６） カテコールメチルトランスフェラーゼ （２、１、１、ｅ） カルニチンアセチルトランスフェラーゼ（２，３，１，
７） アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（２，３，
１，９） アスベルテートアミノトランスフェラーゼ（２，６，１
，１） アラニンアミノトランスフェラーゼ （２，６，１，２） ピリドキサミンピルベートトランスフェラーゼ（２，６
，１） へキソキナーゼ（２，７，１１） グルコキナーゼ（２，７，１，２） フルクトキナーゼ（２，７，１，４） ホスホグルコキナーゼ（２，７，１，１０）ホスホフル
クトキナーゼ（２，７，１，１１）ピルベートキナーゼ
（２，７，１，４０）カルボキシエステラーゼ（３、１
、１、１）アリールエステラーゼ（３、１、１、２）リ
パーゼ（３、１、１、３） ホスホリパーゼＡ（３，１，１，４） アセチルエステラーゼ（３，１，１，６）コレステロー
ルエステラーゼ （３，１，１，１３） グルコアミラーゼ（３，２，１，３） セルラーゼ（３、２、１、４） イヌラーゼ（３、２、１、７） α−グルコシダーゼ（３，２，１，２０）β−グルコシ
ダーゼ（３，２，１，２１）α−ガラクトシダーゼ（３
，２，１，２２）β−ガラクトシダーゼ（３，２，１，
２３）インベルターゼ（３，２，１，２６） ペプシン（３，４，４，１） トリプシン（３、４、４、４） キモトリプシンＡ（３，４，４，５） カテプシンＡ　（３、４） パパイン（３，４，４，１０） トロンビン（３，４，，４，１３） アミダーゼ（３，５，１，４） ウレアーゼ（３，５，１，５） ペニシリンアシグーゼ（３，５，１，１１）アミノアシ
ラーゼ（３，５，１，１４）アデニンデアミナーゼ（３
、５、４、２）Ａ、Ｔ、Ｐ、アーゼ（３、６、１、３）
ピルベーｉ・デカルボキシラーゼ （４，１，１，１） アルドラーゼ（４，１，２，１３） マレートシュターゼ（４，１，３，２）トリプトファン
シンターゼ（４，２，１，２０）アルドラ−ゼ（４，３
，１１，） リジンラセマーゼ（５、１、１、５） グルコース−６−リン酸インメラーゼ （５、３、１、９） ステロイドΔ−インメラーゼ（５，３，３，１）マクシ
ニルＣｏＡシンセターゼ （６，２，１，５） など （註）カッコ内の数字は酵素番号を表わす。

（ロ）　微生物菌体の例 ラクトバチルス争ブルガリクス （Ｌａｃｔｏｂａｅｉｔｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
）アエロバクタ−争アエロゲネス （Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）バチル
ス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
）アゾトバクタ−崇ビネランディ （Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）プ
ロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ）アースロバフタ一番シンプレックス （八ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｓｉｍｐｌｅｘ）エツ
ジユリシア争コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　ｐｕｔｉｄａ）アクロモバクタ−・リクイダム （Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｌｉｑｕｉｄｕｍ）ク
ルブラリア・ルナータ（ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　１ｕｎ
ａｔａ）コリネバクテリウムψグルタミカム （ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）ノカルディア争ロドクラス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　
ｒｈｏｄｃｒｏｕｓ）メサノサルシナ会パーケリイ （Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｂｅｒｋｅｒｉｉ）
メサノバクテリウム・フォルミシカム （ＭｅｔｈａｎｂａｃｔｅｒｉｕＩＩｌｆｏｒｍｉｃｉ
ｃｕｍ）など。

゛　１゛　のラ　： 以」二に述べた（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各成分は
、水性媒体中で相Ｑ二に充分に混合することにより液状
組成物にすることができる。使用しうる水性媒体として
は、水又は緩衝水溶液が好適であるが、場合によっては
水溶性アルコール類と水又は緩衝水溶液との混合液、水
溶性ケトン類と水】　１ 又は緩衝水溶液との混合液、水や緩衝水溶液と均一に混
合しうるエステル系溶剤溶液などを使用することもでき
る。

上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の各成分の相互の使用割
合は厳密に制限されるものではなく、各成分の種類等に
応じて広範にわたって変えることができるが、−・般に
は、（ａ）成分のポリビニルアルコール１００重量部に
対し、）記の割合で使用するのが適当である（カッコ内
は好適範囲である）。

（ｂ）水溶性高分子多糖類二０．５〜１５重敬部（１〜
８１柵 （ｃ）酵素又は微生物菌体：Ｏ，ＯＯ１〜５０帖啼ｃｏ
　、　ｏ　ｉ〜２０重店萄 また、水性媒体は上記（ａ）〜（ｃ）の合３１に対して
ｌＯ〜１，５００重量部（５０〜９ｏｏ重琶部）の範囲
で使用することができる。

ゲル化： 上記の如くして調製された液状組成物は次いで多価金属
イオン及び硼酸を含イｌする水性媒体中に滴下すること
により粒状にゲル化される。

」−記の液状組成物を粒状にゲル化させるには、多価金
属イオンと硼酸の両者が必須成分であり、どちらが欠け
ても、達成できない。すなわち、多価金属イオンが欠け
ると、−に記の液状組成物は、ゲル化はするが、粒状に
はならない。一方硼酸が欠けると上記の液状組成物は、
粒状らしきものにはなるが、このゲル化したものは、機
械的強度がほとんどなく実用に酎えない。１−記の液状
組成物は、多価金属イオンと硼酸の両者の相乗作用によ
って、きわめて容易に粒状にゲル化されるのである。

又硼酸によるゲル化は仮に粒状にできたとしても時間が
かかるため粒状固定化成形物を連続的に製造することは
困難である。一方多価金属イオンと硼酸を同時に使用す
れば、瞬時に粒状固定化成形物が生成ししかも互いに吸
着したり、粒状状態が変化したりすることもないので連
続的に製造することが可能となる。これによって製造コ
ストの大幅な削減がはかれる。

上記水性媒体中に含ませうる多価金属イオンとしては、
該液状組成物中の水溶性高分子多糖類をゲル化させる能
力のあるものが選ばれる。

選ばれた多価金属イオンと硼酸を含有する水性媒体の調
製は、水性媒体中に、該多価金属の水溶性化合物、例え
ば該多価金属のハロゲン化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫
酸塩、硝酸塩等を溶解した後、硼酸を溶解することによ
り行なうことができる。その際の水性媒体中の多価金属
イオンの濃度は、一般に０　、０１〜５ｍｏ、ｕ／！；
１．好ましくは０．１〜２ｍｏｕ／ｕの範囲内とするこ
とができる。一方硼酸の濃度は、一般に０．０１〜１０
ｍｏｎ／ｌ、好ましくは０　、１〜４．１１Ｏ，Ｑ、　
／、ｉｌの範囲内とすることができる′。

又選ばれた多価金属イオンと硼酸を含有する水性媒体の
ＰＨは酸性域にある。これを中性域あるいはアルカリ域
側にしたいときには、１価のアルカリ金属を使用して、
多価金属イオン、硼酸系と共存させてもかまわない。こ
のアルカリ金属の濃度は設定するＰＨに応じて、任意に
定めることができる。

かかる多価金属イオン及び硼酸を含有する水性媒体中へ
の前記液状組成物の滴下は、例えば注射針のような先の
細い管の先端から該液状組成物を滴下する方法、遠心力
を利用して該液状組成物を粒状に飛散させる方法、スプ
レーノズ゛ル先端から、該液状組成物を霧化して粒状と
し滴下する方法などの方法により行なうことができる。

滴下する液滴の大きさは最終の粒状固定化物に望まれる
粒径に応じて自由に変えることができるが、通常は直径
が約０．１〜約５ｍｍ、好ましくは約０．５〜約３１１
１ｖａの液滴として滴下させるのが好都合である。

滴下した液状Ｍ＋成物の水性媒体中でのゲル化は水溶性
高分子多糖類と多価金属イオンによるものと、ポリビニ
ルアルコールと硼酸によるものとの２つが考えられる。

水溶性高分子多糖類と多価金属イオンとのゲル化は直ち
におこり、その際のゲル化の機構はｉＩ三確にはわから
ないが、水溶性高分子多糖類がハロゲン化物又は塩溶液
により凝集し、ついで水溶性高分子多糖類に含まれるア
ニオン基が多価金属イオンを介して、イオン結合するこ
とにより三次元的に架橋してゲル化するものとイ１゜定
される。一方ポリビニルアルコールと硼酸によるゲル化
は、ポリビニルアルコールの水酸基ど硼酸の硼素とがモ
ノディオール型に化学結合することによってゲル化する
と推定される。このゲル化は粒状成形物の表面から内部
へとおこり粒径の大きさによって異なるが１〜２４時間
で完全に内部までゲル化すると考えられる。又ポリビニ
ルアルコールの残存酢酸基が多いほど、はぼ直線的にゲ
ル化に要する硼酸の濃度は低くなり、ゲル化しやすくな
る。

上記ゲル化の温ｉは通常室温で充分であるが、必要によ
り、酵素又は微生物菌体が失活しない程度の加温下にゲ
ル化を行なってもよく、或いは冷却下に行なってもよい
。

このようにしてできた粒状ゲルは水あるいは、緩衝水溶
液で洗浄し、そのまま保存に供したりあるいは粒状ゲル
を凍結乾燥して保存することができる。

かくして本発明により粒径が約０．５〜約５ｍｍの酵素
又は微生物菌体の粒状固定化物が、極めて簡単な操作で
製造することができ、連続的生産も可能である。

本発明の方法によれば合成担体による酵素又は微生物菌
体の粒状固定化が容易になったこと、水溶性高分子多糖
類を使用することによる酵素や微生物菌体の活性の保護
効果が得られたこと、又固定化担体として安価なポリビ
ニルアルコールを使用することによって、コストの面か
ら、用途範囲が広がるなどの利点が得られる。

これらの粒状固定化物は、特に反応装置規模の余り大き
くないリアクター、流動床型のリアクターなどに簡便に
用いることができる。

次に実施例により本発明をさらに説明する。

実施何重 重合度１５００．けん化度８７．０〜８９．０のポリビ
ニルアルコール２０重量部に蒸留水８０重量部を加え約
５０°Ｃに加温しよく混合して均一な水溶液にする。こ
の混合液に３％アルギン酸ナトリウム水溶液２０重量部
、蒸留水６０重憂：部および酵素インベルターゼ（０，
１％濃度）２０重量部を加えてよく混合し、得られるポ
リビニルアルコール−酵素混合液を、３％硼酸及び０．
１Ｍ塩化カルシウムを含む水溶液（ＮａＯＨでＰＩ（−
６に調製した）中に、注射器先端の注射器から液面高さ
１０ｃ＋ｏより滴下したところ、粒径的２ＩＩ１１の粒
状物が得られた。この粒状物をこのままの状態で１０時
間浸漬したところ機械的強度良好な粒状固定化酵素が得
られた。

この粒子のインベルターゼ活性をショ糖を基質として測
定したところ、固定化しないインベルターゼに対する比
活性が６０％であった。

実施例？ 重合度１５００．けん化度１００のポリビニルアルコー
ル１０重量部に蒸留水９０重Ｖ一部を加え、約５０℃に
加温し、よく混合して均一な水溶液にする。この混合液
に３％に一力うギーナン水溶液ｌＯ重量部、及び２％グ
ルコースイソメラーゼ菌体酵素液（重炭酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ＝８）３重品部を加えて均一な混合液を調製し
た。この均一な混合液を注射針先端から３％硼酸及び５
％塩化カリウムを含む水溶液（ＮａＯＨでｐＨ＝６に調
製）中に液面から１５ｃｍの位置から滴下したところ粒
径２．５ｍｍの粒状物が得られた。この粒状物をこのま
まの状態で１５時間浸漬したところ機械的強度良好な粒
状固定化酵素が得られた。

この粒状グルコースイソメラーゼの活性をブドウ糖を基
質としてｐＨ８の重炭酸ナトリウム緩衝液中で６０℃に
て測定したところ固定化しないグルコースイソメラーゼ
に対する比活性が７０％であった。

実施例３ 重合度１１００．けん化度８７．Ｏ〜８９．０のポリビ
ニルアルコール２０重量部に蒸留水８０重量部を加え、
約５０℃に加温しよく混合して均一な水溶液にする。こ
の混合液に３％アルギン酸ナトリウム水溶液２０重昂・
部、蒸留水６０重量部およびアースロバフタ一台シンプ
レックス（ＡＴＣＣ６９４６）のアセトン処理菌体０．
２重量部を均一に混合分散した。Ｌかる後その分散液を
注射器先端から、３％硼酸及び０．２Ｍ塩化アルミニウ
ムを含む水溶液（ＮａＯＨでｐ）ｌ＝　６に調製）中へ
滴下したところ、球状にゲル化した。この粒状物をこの
ままの状態で１６詩間浸漬したところ、機械的強度良好
な直径２．８＋１ｍの球状固定化微生物が得られた。

実施例４ 重合度５００．けん化度８７．Ｏ〜８９．０のポリビニ
ルアルコール２５重量部に蒸留水７５重量部を加え、約
５０℃に加温しよく混合して均一な水溶液にする。この
混合物に３％アルギン酸ナトリウム水溶液２５重量部、
および０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）にとかした０
、５％グルコースオキシダーゼ水溶液２５重量部を均一
に混合し、得られるこの混合液を注射器の先端から、３
％硼酸及び０．１Ｍ塩化カルシウムを含む水溶液（Ｎａ
ＯＨでｐＨ＝６に調製）中へ滴下したところ、球状にゲ
ル化した。この粒状物をこのままの状態で１５時間浸漬
したところ機械的強度良好な、直径２．５■の球状固定
化微生物が得られた。

実施例５ 重合度１５００．けん化度８７．０〜８９．０のポリビ
ニルアルコール２０重量部に蒸留水８０重量部を加え約
５０’（１！に加温しよく混合して均一な水溶液にする
。この混合物に、３％に一力うギーナン水溶液２０重都
部、蒸留水６０重量部およびエラセリシア・コリー菌体
懸濁液１０重量部を均一に混合分散した。かくして得ら
れたポリビニルアルコール−菌体混合液を回転する円板
上に供給し、その遠心力で混合液を飛散させ、その飛散
した粒子を、３％硼酸及び０．３ＭＩｆｉ化カリウムを
含む水溶液（Ｎ′ａＯＨでｐＨ＝６に調製）中に落下さ
せ粒状にゲル化させた。この粒状物をこのままの状態で
１５時間浸漬したところ機械的強度良好な直径３．０ｍ
＋ｗの固定化菌体を作ることができた。

実施例６ アルゴンガス雰囲気中で重合度１５００．けん化度８７
．０〜８９．０のポリビニルアルコール２０重量部に蒸
留水８０重量部を加え約５０℃に加温しよく混合して均
一な水溶液とする。この混合物に３％アルギン酸ナトリ
ウム水溶液２０重量部、蒸留水７０重量部およびメサノ
サルシナｅバーケリイ菌体懸濁液１０重量部を均一に混
合分散した。得られるポリビニルアルコール−菌体混合
液を、３％硼酸及び０．１Ｍ塩化カルシウムを含む水溶
液（ＮａＯＨでｐＨ＝８に調製）中に、得られる混合液
を注射器の先端より滴下したところ粒状にゲル化した。

この粒状物をこのままの状態で１０時間浸漬したところ
、機械的強度良好な直径約２ｍｍの粒状固定化微生物が
得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ａ）ポリビニルアルコール （ｂ）少なくとも１種の多価金属イオンとの接触により
   ゲル化する能力のある水溶性 高分子多糖類、及び （ｃ）酵素、又は微生物菌体 を含んでなる液状組成物を、多価金属イオンと硼酸を含
   有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化さ
   せることを特徴とする酵素又は微生物菌体の粒状固定化
   成形物の製造方法。