JPS59192961A - 血液凝固第「じ」因子測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発Ｆ３Ａは、ヒト血液凝固第■因子測定用試薬に関す
る。

ヒト血液凝固第■因子（以下、単に第■因子と称する）
に、血液凝固機構の最終段階である安定性フィブリノポ
リマーの生成に関与するものであり、フィブリノ安定化
因子とも呼ばれ、平常は不活性状態で血液中に存在して
いるが、出血などで血欣凝向が起りトロンビンの生成が
みられると、このトロ／ピンと力Ｉレシウムイオンとの
作用によって活性化され、フィブリノの安定化を図る。

したがって、第■因子の減少若しくは欠損している血液
では、凝固時間に正常閾値を示すが、形成されたフィブ
リン塊が胞弱であり、後出血などの特有の現象を呈する
。そのため第ＸＩ因子の血液中濃度は第Ｍ因子欠損もし
くに欠乏患者の指標になり得るものとして注目され、現
在中和抗体法、モノクロル酢酸溶解試験法の試薬キット
が市販されている。

ところが、第■因子の免疫学的定量法に関する上記の方
法では検出感度がきわめて低く、正常人第■因子量の１
〜３１％レベルまでの希釈値しか測定できず、臨床試験
を行う場合など第■因子製剤の補正効果や第■因子欠損
もしくは欠乏患者のスクリーニングテストが精度よく行
われない。従つって、多数の被検体について迅速かつ正
確に第Ｊ因子を測定できる定量法を確立することは当面
の課題であり、本発明の目的はかかる課題全解決した第
■因子測定試薬を提供することである。

本発明は、特異抗ヒト兜■因子仇体を動物赤血球に感作
して得た抗ヒト第■因子抗俸感作赤皿球を含む逆受身抗
体赤血球凝集反応用ヒトｉｘｉ因子測定試薬に関する。

本発明に係る測定試薬は、各試薬をキット化しておくこ
とが便宜的であるので、以下キット化されたものを例と
して本発明を説明する。

本発明試薬をキット化した場合、次のごとき各試薬にて
構成される。即ち、（イ）特異抗ヒト第■因子抗体を動
物赤血球に感作して得た抗ヒト第」因子感作赤血球（以
下、感作赤血球という。）、（コノ測定用緩衝液、（ハ
）標準ヒト血漿陽性コントロール（以下、陽性フットロ
ールという）及びに）標準ヒト血漿陰性コントロール（
以下、陰性コントロールという。）の組合せにて当該キ
ットは構成される。

感作赤血球は、特異抗ヒト第Ｘ鳳因子抗体を動物赤血球
に感作させに感作赤血球がその本体をなす。

特異抗ヒト第Ｘ１因子抗体は、高度に精製されｆｃ免疫
用の第■因−１′−（参考側参照）を動物に免疫し、得
られる仇皿清より精製することによって製造される。当
該仇血消の製造は公知の方法にて行、ｔはよく、たとえ
ば高度精製ヒト第■因子とフロイ／ドの完全アジュバン
トの混合孔８！Ｌを作り、動物の皮内に５〜６回注射し
、数週後採血を行い室温で凝固せしめた後、４°Ｃで一
夜放前後、３０００ｒｐｍ２０分間の遠心分離により当
該抗血清か得られる。

免疫に用いる動物によって、ヒト第■因子に対する抗体
産生能力が異ることから、感受性の高い動物群、例えば
、モｌレモット、ウサギ、ニワトリ、ウマ等を選ぶこと
が経済的に何回である。

当該抗血清から感作用抗体の精製は、ノヒとえば、次の
ようにして行われる。第Ｘ１ｌｌ因子（ｌ百物とＤ１血
清（ウサギ）を混合して抗原・抗体コンブノックス（抜
合体）を調製する。生理食塩水で十分洗浄して、他の血
清成分、ならびに余剰の抗原もしくは抗体を除去した後
、尿素（又は塩酸グアニジ／）でこのコンプレックスを
溶解させる。これにより、抗原である第■因子は失活・
可溶化する。ケルｐ過操作等の脱塩操作により尿素を除
去した後、親和基に仇・ウサギＩｇＧを使ったアフイニ
ティ・クロマトクラフィー（解離剤として塩酸グアニジ
ノ、尿素、チオシア／酸カリウム等を使用。）を行って
愚作用抗第几因子抗体の精製品を得る。

抗ヒト第■因子抗体を感作さぞる赤血球は、特に動物を
選ぶ必要はないが、安定でしかも感度の高い試薬を作る
之めには、ヒツジ、ニワトリ、ヒトの０型赤血球などが
望ましい。赤血球は生理食塩水で十／）ｆ抗争した後、
グ１１／クー−レ・アルデヒド、ホルマリンなどの処理
で安定化させる。

このような赤血球は５〜１５μｍ程度のものが良い。精
裂抗坏でこれらの赤血球を感作するのは公知（医学のあ
ゆみひ７５９（１９７０））の方法で実施することが出
来る。

それには、赤血球と抗体とを緩衝液中で感作させるのか
よく、一般には赤血球浮遊液と抗体合釘液を混合するこ
とにより行う。

本操作に、ｐ　）ｉ　５．０〜８．５、温度２０〜６０
℃で行うのがよい、感作赤血球は凍結乾燥して、たとえ
ばバイア！し中に、好ましくはナトリウムアジドなどの
如き区存剤を添加して、封入しておくことが好ましい。

本発明に関する陽性コントローｒしな、標準検量線を作
成するために用いられるものであり、通常はヒト第■因
子含有の凍結乾燥品よりなるものである。

ヒ）！■因子は緩衝液に溶解して使用され、この際例え
ば５〜５０ｎ？／−となるように４〜６濃度段階まで小
分けして標準検量線の作成に使用される。

陽性コントロールは、たとえばバイアーし中に、好まし
くはナトリウムアジドなどの医存剤を添加して封入して
おく。

陰性コノトロールは、ヒト抗第■因子抗体及びヒト第■
因子が共に陰性の液体（たとえば人血清、生理食塩液な
ど）よりなり、＾とえば、バイアル中に、好ましくはナ
トリウムアジドなどの医存剤を添加して、封入しておく
ことが好ましい。

測定用緩衝液は、感作赤血球、陽性コントロール、陰性
コントロールを希釈するために用いられるものであり、
たとえばリン酸緩価敵よりなり、非特異的反応の生じる
のを防止するために、たとえはストローマ、動物血清な
どを添加してもよい。

寸た、たとえばナトリウムアジドなどの保存剤を添加し
ておくことが好ましい。

以下に実施例、実験例及び参考例を示す。

なお、第■因子の活性は、新鮮な正常人血漿ｌｄ中に含
まれている第１因子活性量を１単位〔希釈テスト法、ス
ロンプス　エト　ティアセシスへモルハギ力（１’ｈｒ
ｏｍｂｏｓｉｓ　ｅｔ　ｌＪｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍ
ｏｒｒｈａｇｉｃａ　）　、　２３　、４５５（１９７
０）　）として計算した。

実施例１ 約２〜蛋白の精製ヒト第■因子をウサギに免疫して仇ヒ
ト第Ｘ厘因子血清を得Ａ０この抗血清３−と精ｇ！第■
因子８単位を混合し、３７°ｃ２時間でイノキュベーシ
ョノし、遠心分離により上清を除去した後、抗原・抗体
結合物の沈殿を冷生理′ｓ、塩水（４°Ｃ）で充分に洗
浄し足。洗浄後の沈殿を少量の尿素で溶解踵　５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ　−２５カラムで脱塩し皮。脱塩後、抗つ
サキＩｇＧ（ブタ）−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　カラムに
よるアフィニティークロマトグラフィーにかけた。次い
で、解離剤として５Ｍ塩酸グアニジンによって溶出させ
、溶出画分はリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で透析・脱塩
し、感作用精製抗体３．３■を得た。

感作のための動物赤血球は、ヒツジ赤血球をリン酸緩衝
液で充分に洗浄後、グルクー・レアルデヒドを終濃度０
．５％ｗ／ｖに添加して杓１時同室温処理し、上記緩衝
液でゲルタールアルデヒド分際いて固定化赤血球を得た
。

５％ｗ／ｖ固定化赤血球の懸濁液と等量の上記の精製ヒ
ト第■因子抗体（Ｅ２８０ＨＨ１で０．０１程度）を混
合し、ｐ　Ｈ７，２でタンニノ酸５−５−３Ｏ０／ａｔ
ｆｃ添加・攪拌後、４°Ｃで１夜放置して感作し抗ヒト
第ＸＩ因子抗体感作赤血球を得た。そして充分に同上リ
ン酸緩衝液で洗浄した。この感作血球を分注してから凍
結乾燥して試薬を得た。

凍結乾燥後の抗ヒト兜ＸＩＭ因子抗体感作赤血球を動物
血清を含有する塩化す）　ＩＪウム含角等張化リす酸緩
衝液（ｐ）１７．２）に２条以上のヒツジ赤血球ストロ
ーマを含むリン酸Ｍ衝敵で０．５％に晶“、ｌ幣〆解し
、ヒト第■因子に対する凝集反応をマイクロプレート法
で測定した。検体中に含有−ぎるヒト第ＸＩ因子搦の１
〜２　ｎｊ／ゴまでの測定は可能であった。

実施例２　キットの構成 零発ツ１のキットに含まれている試薬類は、次の５種で
ある。

■　抗ヒト第ＸＩ因子感作ヒツジ赤血球。

ｌバイアルの内容物は、乾燥感作ヒツジ赤血球および床
存剤で後記■のり／酸緩衝＠：（ＰＢＳ）の５　ｍｌを
これに加えて懸濁させるとき、０５％（猶７’ｖ）赤血
球浮遊溌が得られる。保存剤としてす）　ＩＪウムアジ
ドＩＩｎｇが添加されている。

■　ヒト第Ｘ１因子陽性コントロール：■バイアル中、
除菌濾過し友ヒト兜■因子１ｒｎｌ。

を＠にする。本溶液のＲＰＨＡ法によるヒト第朋因子量
はｌ：６４以上である。保存剤としてナトリウムアジド
１１ｎ９（０，１％）か添加されている。

■　陰性コントローｌし： １ノくイアＩし中、除菌濾過し、を抗ヒト第■因子抗体
ならびにヒト第■因子抗原が共に陰性のヒト血清又は生
理食塩赦１ｄを含角する。保存剤としでナトリウムアジ
ドｌ　ｍ？　（０，１％）が＃、殊加されている。

■　リン酸緩衝ｇ： ｌバイアＩし中、除菌濾過しｒｃ　ｊｘ化ナトリウム加
等張リン酸緩衝液、ｐＨ７，２（ＰＢＳ）ｉゴを合釘す
る。ＰＢＳＫは、試験に際して９１三特異反応の生じる
のを防止するため、可溶化ストローマ２よび動物血清を
配合している。

組成（５０ｍｌ中） リン酸ニナトリウム（無水）　　　３９５７１７リン酸
−カリウム　　　　　　　　ｌ　５５　ｍｙ塩化ナトリ
ウム　　　　　　　　２２５　ｎｔｙストローマ　　　
　　　　　　　　３　条動物皿消　　　　　　　　　　
　　　ｌ　差ナトリウムアジド　　　　　　　　５０ｔ
ｈｇｐ　Ｈ７，２ リン酸緩両液の１Ｏｎｒ８ｆｌ五ヒト第」因子抗体Ｂ作
ヒツン赤血球の懸濁用に用いられ、伐りは波し【液の希
釈に用いる。呆存剤としてナトリウムアジドｌη（０，
１％）を加えておくことが好ましい。

■　特異性判定のための確認試薬； ■バイアル中、除菌濾過した精製抗ヒト第■因子抗体（
Ｐｉ（Ａ価で１：５１２以上）を含む凍結乾燥品である
。これを生理食塩水の５ゴで酵解する。

実施例３　実施例２に示した試薬を用いて定量試験を次
の通り実施し之。

■　抗ヒト第■因子抗体感作ヒツジ赤皿琢を、ｌバイア
ル当たりりン飲緩１ｉ５ｒｎｌに懸濁する。

■　Ｕ−プレートの各穴に、ｄｒｏｐｐｅｒでリノ酸緩
衝ｔａをそれぞれ２５μＬｆつ入れる。

■　ｄｒｏｐｐｅｒ　　により、Ａ列の穴に被除液各２
５μｔｆつを入れる。Ａ列の混ｇ全ｄｉ　１ｕｔｅｒで
Ｂ列へ移し、吏ＫＢ列よりＣ列へ移し、次々と順次移し
て１列までこれを行う。これによりｅ験ぼは、） ２倍段階希釈されており、１列の希釈倍数は１０２４倍
となっている。

■　別に被験液の代わりに、陽性コントロールおよび陰
性コントロールについても、同様にして希釈系列をつく
る。

■　ｄｒｏｐｐｅｒを用い、すべての穴に抗ヒト第■因
子抗体感作ヒツジ赤血球のり／酸緩衝ｇ懸濁液を２５μ
ｔｆり加える。

■　プレートは、ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒで約１０秒間倣
盪後、呈温で２時間インキコーベートする。

■　コノドローＩしの観察 陽性コノドローＩしについては、通線６４倍希釈以上で
凝集を認める。陰性コントローＩしは、Ａ〜Ｊのすべて
において穴の底に赤血球の沈降物を認める（測定が良好
な場合、陰性稼は小さく明瞭である）。

■　試験結果 被験液につき、陰性コントローＩしと比較して凝集像を
認める最高希釈倍数をもってヒト第■因子とし＾。

夫験例 夫吸例１により得られた第■因子使出用Ｒ）’　ＨＡ試
楽金用いて以下の被瞼＋／′／ブＩしを検査するとさ高
感度で第■因子か検出されることが判った。

標準ヒト血漿及び第Ｘ厘因子（ｌ　ｕｎｉｔ／ｍ１．）
を用いて調製した標準希釈系列溶液に対して、０．Ｏ１
％レベｒしく　０．１）　００１　ｕｎｉｔ／ｄ　）　
（正常人のｌｈ分の１）まで測定できる。

すだ正材人・新鮮血漿（２９人）を用いて、非特異凝集
価を求めたところＸ１６〜Ｘ８２であった。

なお、いずれの測定でもプロゾーン現象はみらｈなかっ
た。

参考例 ヒトの胎盤を生理的食塩水をもって抽出した抽出ｇ８０
０　ｔ　（胎盤約８４０個、約５１０Ｋｓ＋）から特開
昭５５−６４５２２′ｐｊ′の開示の方法で得らｆ″し
た精製第■因子を含有する水だ欣（４０３単位／　ｍｌ
　）のｐＨ全７．０、温度をｌＯ℃Ｋｍ整した後、８０
９／を濃度の硫酸ナトリウム全添加し、分画を行ない沈
殿を回収した。得られた沈殿を水に溶解し、これを２．
２５％グリシ／を加えた０、５％塩化ナトリウム溶ＵＫ
対して透析し、次いで除菌濾過、分注、凍結乾燥した。

新鮮な正常人血漿１ｍ７！中に含まれる第ＸＩ因子活性
量を１単位とすれば得られた第１因子の活性量は４５０
万単位、り／バクとして７５２であった。

特許出願人　株式会社ミドリ十字

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 特異抗ヒト血液凝固第■因子抗体を動物赤血球に感作し
   て得た感作赤血球を含むことを特徴とする逆受身抗体赤
   血球凝集反応用ヒト血液凝固第■因子測定用試薬。