JPS5821165A - 血液凝固異常因子の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液試料中の血液凝固異常因子、殊にビメミン
に欠乏に起因する血液凝固異常因子の免疫学的測定方法
及び該方法に使用する新規な免疫学的測定試薬に関する
。

血液の凝固という現象は酵素の連鎖反応であり、血液が
陰性荷電を持つ異物面と接触することにより凝固系の活
性化が開始される。

まず、非活性型の酵素源が活性化されると、その活性化
酵素はつぎの酵素源に働いてこれを活性型の酵素とし、
下記に示す如き一連の反応を経て、やがてプロトロンビ
ン（凝固筒■因子）がトロンビンに活性化され、これが
最終基質であるフィブリノゲン（第ｉ因子）に作用して
線維素として析出するに至る。

異物面 ↓ 第Ｘ因子　活性第Ｘ因子 グロトロンピン　トロンビン 血液凝固に関与する因子には第１から第Ｘ［因子迄あり
（第Ｖ因子は欠番）、この他番号は付されていな□いが
プレカリクレイン、高分子キニノゲンなどのように明ら
かに凝固に関与する因子も知られている。これらの凝固
因子のうちの一部には階累では々く、カルシウム（第１
Ｖ因子）、第Ｖ因子、高分子キニノゲンのように凝固促
進の補助因子として作用するものもあるが、第■因子を
除く他の因子はすべてタンパク性のものである。

このうち第■、■、■およびＸ因子は、そのタンパク構
造中にγ−カルボキシグルタミン酸残基金持ち、この部
位へのカルシウムイオンの結合とリン脂質の存在下で活
性化機転がおこる。これらタンパク質の肝臓における正
常な生成には、ビタミンＫが必須であること〃）ら、第
■、■、■およびＸ因子はとくにビタミンに依存性凝固
因子と呼ばれている。

従って、ビタミンに欠乏状愈またはビタミンに拮抗物質
投与中の患者の肝臓ではこれらビタミンに依存性凝固因
子が正常に生成されず、異常構造のビタミンに依存因子
が生成される。これら異常構造のビタミンに依存因子は
通常″ＰＩＶＫＡ″（ｐｒｏｔｅｉｒｒ　　１ｎｄｒｂ
ｃｅｄ　　ｂｙ　　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｋａｂｓｅｎｃｅ
　　ｏｒ　　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　）と総称され、そ
れぞれの起源（凝固系■、■、■及びＸ因子）に応じて
ＰＩＶＫＡ−Ｔｉ、■、■及びＸと称されてお）、本明
細書に誉いても同様に称する。

Ｐ７ＶＫＡはそのタンパク分子構造中にｒ−力゛ルホキ
シグルタミン酸残基を持たないため、カルシウムイオン
とは結合せず、従って血液凝固が阻讐される。・例えば
、ＰＩＶＫＡ−Ｒからは、カル聾因子）が生成せず、従
って、血液凝固系に重大　５− な影響が生ずる。

正常な血管内では血液は凝固しない。しかし血管が破綻
して出血をおこした場合には、凝固系がＩＦ常に作動し
なければ止血がおこらない。他方、血管内で何らかの原
因によって凝固系の活性化がおこると血栓を生じ、いわ
ゆる播種住血管内凝固症候群（以下”ＤＩＣ”と略称す
る）のような重大な結果となることも今る。生体が正常
であれば、−たん凝固した血液は生体の防御機構として
の線Ｍｖ率溶解現象（線溶）によって溶けるが、異常に
強力な線溶がおこると出血を生じる。このように、凝固
−線溶系は多くの因子−酵素とその阻市物質など〜の複
雑な平衡状態の上で正常な機能を保っているのであるつ
。従ってその一部が破綻すれば血栓あるいは出血という
重大な状態が発生する。特に、ヒトの凝固系に関与する
因子は多く、きわめて複雑で、どの部位に異常が起った
かを適　６− 確に、しかも迅速に把握しないと、適切な予防、治療ま
たは措置ができないことになる。

従来から出血の予防と治療には、凝固系に作用するもの
として、全血或は血漿分画製剤の輸注、ビタミンにの投
与などが臨床的に用いられ、この他線箔糸あるいは血小
板系に作用するものなども、その患者の状ゆに応じて使
用されている。逆に、血栓の予防には凝固系あるいは血
小板機能を抑制する薬剤が用いられている。この中で経
口的抗凝血薬として広く用いられているビタミンに拮抗
剤は凝固第■、■、■およびＸ因子、いわゆるビタミン
に依存因子を低下せしめることによって抗凝血効果を現
わすものである。

しかしながら、実際の臨床にあたってのビタミンに拮抗
剤の使用は、ビタミンに依存因子の異常表元進があるが
ために、特に凝固系のこの部位を抑制するために用いる
という確たる診断の上に立つてのものではなく、単に血
栓に対する対照療法的に用いられているに過ぎない。ま
た、ビタミンに拮抗剤は多くの患者に対して著明な効果
はあるにしてもその使用方法はむずかしく、例えば、ビ
タミンに拮抗剤を過剰に投与すると、ビタミンに依存因
子のγ−カルボキシル化が阻害されて異常構造をもった
ＰＩＶＫＡが生成されるため、血液の凝固性が低下して
出血を生じ、反対に投与量が不敏すると、血栓に対する
効果が乏しい。このような場合、血中にＰＩＶＫＡが存
在するか否か、しかもその量を知ることができれば臨床
上の意義は極めて大きい。しかしながらこれを簡便迅速
に定量する方法は従来なかったのである。そのため、ビ
タミンに拮抗剤を長期にわたって連続投与する場合のそ
の投与量の決定は、ヘパプラスチンテスト（以下”ＨＰ
Ｔ“と略称する）、トロンボテスト（以下”ＴＴ“と略
称する）などにより凝血能を測定しながら、いわゆる試
行錯誤に頼っているのが現状である。

すなわち、ＴＴはＰＩＶＫＡによシ影響を受け、ＨＰＴ
は影響を受は難いとされていることから、次式によ、す
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　　Ｉｎｄｅｇｃ（７，１，）を
求め、この値が０．３〜１．０の場合ＰＩＶＫＡ陽性と
して、間接的にＰＩＶＫＡの存在を求めてきたのである
。

Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　　Ｉｎｄｅｘ　（１，１，）＝
ＨＰＴ（勢、）−，１１Ｔ（％）／ｌ１ＰＴ（％）しか
し、この方法で用いられる組織トロンボプラスチンはそ
の種類、力価等によって標準曲線が異なるという問題が
ある上、測定手技が繁雑で時＠接的に証明する方法と、
しては二盗元免疫電気泳動法があり、とくにＰ　ＩＶＫ
Ａ　−Ｉｌ、　（グ５μトビン　９− ビンのＰ　Ｉ　ＶＫＡ　）の存在を証明することが可能
である。しかし、この方法は定性的なものでしかなく１
．しかも測定手技が繁雑で時間を要し、日常検査には不
適当である。

そこで、本発明者らは、ビタミンに欠乏状態またはビタ
ミンに拮抗剤投与中の患者の血液中のＰＩＶＫＡを簡便
に、短時間で目つ精確に測定しくはＸ因子又はその抗体
で感作した免投学的に不活性な　　　　　　　　　　　
　−担体粒子よシなる免疫学的測定試薬を用いる免疫学
的反応に供すれば、血液試料中の血液凝固異常因子、す
なわちＰ　ＩＶＫＡを簡便且つ迅速に、しかも極めて高
感度で検出することができ、さらに例えばＤＩＣのよう
に複数の原因によって起る凝固−線溶系の疾患において
、それがビタミンに依存性であ−ｌ　〇　− るか否かの診断も適確になしうろことを見出し、本発明
を完成するに至った。

しかして、本発明に従えば、硫酸バリウム、炭酸バリウ
ム又は水和酸化アルミニウムで予備処理した血液試料を
、血液凝固第■、■、■もしくはＸ因子又はその抗体で
感作した免疫学的に不活性な担体粒子よりなる免疫学的
測定試薬を用いる免疫学的反応に付し、その反応の結果
から該血液試料中の血液凝固異常因子を定性的又は定量
的に決定することを特徴とする血液試料中の血液凝固異
常因子の測定方法が提供される。

本発明の方法の特徴の１つは、検出すべきＰＩＶＫＡ−
ｎ、■、Ｋ又はＸとそれに対応する血液凝固第■、■、
■又はＸ因子とが共通の抗原性を有していることに着目
し、ＰｒｖｘＡ検出のための抗原−抗体反応用の抗原と
してＰＩＶＫＡではなく、それに対応する血液凝固因子
を使用する点にある。

下特にことわらない限り・［凝固因子ＪというＪは、ヒ
トの血漿からそれ自体公知の方法により、例えばゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー等の方法を単独で又は組み合せ用いて
分離精製することにより取得することができる［分離精
判法の詳細（ｌこついては必要あれば、青水、岩永編「
凝固、線溶、キニン」中外医学社、１９７９参照］。

一方面液凝固第■、■、区又はＸ因子の抗体（以上時１
／こことわらない限り「抗凝固因子抗体」という）もま
たそれ自体公知の方法によりｄ脚襲することができ、セ
！えは上記の如くして得た凝固因子Ｋ　７’　ｒ：ｙイ
ンドのアジュバントその他の補助剤を加えたもので、ウ
サギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、などの人間以外の呻
乳動物を免疫し、その抗血清を回収し、該抗血清から通
常の方法に従い、例えば硫安沈殿法による分画によって
抗凝固因子抗体を分離することによシ取得することがで
きる。

またこれらのヒト凝固因子の抗血清は市販されており、
その製品を使用することもできる。

本発明に従い感作すべき凝固因子及び抗凝固因子抗体は
、検出することを希望する試料血液中のＰＩＶＫＡに対
応するものであり、その純度は厳密に制約されるもので
はないが、一般に凝固因子はディスク電気泳動法により
実質的に単一の像を示す程度の純度のものが好ましく、
また抗凝固因子抗体は一血秦量半抗妻社血漿中の対応す
る凝固因子との抗原−抗体反応において免疫電気泳動法
により実質的に単一の像を示す程度の純度のものが適し
ている。

また、かかる凝固因子又は抗凝固因子抗体の感−１３− 作のために用いられる免疫学的に不活性な担体粒子とし
ては、例えば、ホルマリンなどで固定化した赤血球、高
分子ラテックス、ベントナイト、゛コロジオン、シリカ
、カオリン等４ｔ・従来免疫化学的測定試薬の担体とし
て通常使用されているものはいずれも使用できる。かか
る担体粒子は一般に約００１〜約２０ミクロン、好まし
くは約０．０５〜約１０ミクロンの平均粒径を有するこ
とができる。

本発明において「感作」なる語は、凝固因子又は抗凝固
因子抗体を上記した如き担体粒子上に物理的に吸着せし
める場合及び在学的に結合させる場合の両方を包含する
意味で用いるものである。

かくして、感作は通常の方法によって行なうことができ
、例えば、上記した如き担体粒子に凝固因子又は抗凝固
因子抗体を物理的に吸着させる場合には、感作すべき凝
固因子又は抗凝固因子抗体を最終濃度０．００１〜０．
５％（Ｗ／Ｖ）、好まし−１４− くは０，０１〜０２％（Ｗ／Ｖ）になるよ゛うに緩衝液
（例えばグリシンＮａＯＨ緩衝液）中に溶解し、攪拌し
なから担体（例えばポリスチレンラテックス）を加え、
通常約４〜約６０℃、好ましくは約１５〜約４０℃の温
度で約３０〜約１８０分間さらに攪拌をつづけることに
より、感作を行なうことができる。この場合、検出すべ
き凝固因子及び抗凝固因子抗体に対して免疫学的に不活
性なタンパク質し例えばヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジなど
の動物の血清のアルブミンやグロブリンなど〕の緩衝溶
液［通常０．０１−０．５％（Ｗ／Ｖ）一度のものが使
用される］で感作前又は感作後の担体粒子を処理するこ
とができ、これによって非特異的反子抗体と化学的に結
合しうる官能基を表面にもつ担体粒子と感作すべき凝固
因子又は抗凝固因子抗体とを適当な結合剤例えばカルボ
ジイミド、ビスジアゾベンジジン、ゲルタールアルデヒ
ドなどの存在下に反応させる方法が挙げられる。この場
合においでも、上記と同様に不活性なタンパク質を感作
前又は感作後の担体粒子で処理する（化学的に結合せし
める）ことにより非特異的反応を除き高感度の試薬を得
るようにすることができる。

上記の感作操作において、担体粒子への凝固因子又は抗
凝固因子抗体の感作量及び／又は該不活性タンパク質に
よる処理の程度を適宜調節することにより、常に一定の
感度の免疫学的測定試薬を調製することができる。

上記の如く調典された本発明の測定試薬は、患者から・
採取した血液試料、例えば全面、血漿（クエン酸血暗、
シュウ酸血漿］などの中のＰＩＶＫＡの免疫学的測定の
ために使用することができ、その測定はそれ自体公知の
抗原−抗体反応、すなわち免疫学的凝集反応又は免疫学
的凝集阻止反応を利用して行なうことができる。

本発明の方法のもう１つの特徴は、血液試料を予め＋！
Ａ酸バリウム、炭酸バリウム又は水利酸化アルミニウム
で吸着処理する点にある。この吸着処理によシ、血液試
料中に存在しうる正常な凝固因子による偽反応を未然に
阻止することができる。

硫酸バリウム、炭酸バリウム又は水和酸（ヒアルミニラ
ムによる血液試料の処理は、一般に、硫酸清アルブミン
の如き不活性タンパク質を含をことができる）中に分散
した懸濁液を血液試料に一定量加え、連続的又は間欠的
に一定時間、例えば５〜６０分間好ましくは約１５分間
振盪した後、該−１７− 微粉末を通常の方法例えば遠心分離によって除去するこ
とによって実施することができる。該処理の際の温度は
該血液試料中のタンパク質が著るしく変質することがな
い限り、特に制限されないが、一般には２０〜４０゛Ｃ
の範囲内、殊に３７℃前後が好適である。

上記微粉末の添加量は厳密に制限されるものではなく、
血液試料１良び／又は該微粉末の種類等に応じて広範に
変えることができるが、硫酸バリウムおよび炭酸バリウ
ムを用いる場合は一般には血液試料１ａ当り＋Ｂθ〜１
０００〜、好ましくは−８−′５０〜６００１９の量で
また、水酸化アルミニラかくの如く予備処理された血液
試料は、該予備処理に用いた緩衝溶液で希釈された形で
、そのまま本発明に従う免疫学的凝集又は凝集１１１１
止反応に−１８− 供することができる。

例えば、免疫学的凝集反応においては、スライ作した担
体粒子よりなる測定試薬とを相互に接触せしめる。もし
血液試料中にＰＩＶＫＡが存在すれば凝集反応が起り、
肉眼的に観察することができる。血液試料の希釈倍率を
増やし、凝集反応が確認できる双最大希釈倍率を求める
ことにより、血液試料中のＰＩＶＫＡ＃度を決定するこ
とができる。

また、免疫学的凝集阻止反応においては、上記と同様、
スライドガラス板上又は小試験管中に、一定の希釈倍率
に希釈した血液試料と検出すべきＰＩＶＫＡに対応する
抗凝固因子抗体とを直下し、混和した後、本発明による
該抗凝固因子に対応する凝固因子を感作した担体粒子よ
り成る測定試薬を加えて接触せしめ、その際に凝集像が
現われるか否かを判定する（核布釈血液試料中にある一
定濃度以一ヒでＰＩＶＫＡが存在すれば凝集１（目市像
が観察される）ことにより上記と同様にして血液試料中
のＰＩＶＫＡ＃度を決定することができる。

上記のように本発明の方法によれば、血液試料の希釈液
と試薬と金力口え、スライドガラス板上又は小試験管中
の凝集像を肉眼的に観察するという極めて簡便な操作だ
けで、迅速に血液試料中のＰＩＶＫ’、Ａを測定するこ
とができ、臨床学的には患者のベッドサイドで極めて手
軽に数分間でＰＩＶＫＡの定量を行なうことが可能とな
る。本発明におけるかかる効果は前述した従来の測定法
からは全く予想外のことであり、ＰＩＶＫＡ測定分野に
画期的な発展を□、もたらすものである。

次に実施例により本発明をさらに説明する。

実施列１ （α）プロトロンビンの製造 ヒトクエン酸血漿から、ＢｔｔｎαｒＯｕＢらの方法（
Ｔｈｒｏｍｂｏａ、　　Ｄｉａｔｈｅｓ、　　ｈ、ａｅ
ｍｏｒｒん、　３０　。

４２５１１９７３））、即ちクエン酸ノくリウムへの吸
着、浴出、Ｄｏｗｅｗ　５　ｏＷ−Ｘ−８によるバリウ
ムの除去、ｒｓｇｐｈａｄｅｚ　Ｇ　１００ゲルｐ過、
ハイドロオキシアパタイト、′ＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｄ
ｅｘＡ　５０カラムクロマトグラフイーによって精製分
離した。

（ｂ）　　抗プロトロンビン抗体の製造上記（α）テ得
たプロトロンビンｌ−を生理食塩液１ｍ１．に溶解し１
．同量のコンプリ＝ｌ・・フロイント・アジュバントで
乳化し、家兎の定論および皮下に注射した。この注射を
３週間間隔で行ない、抗体価の上昇を確認拶全採抑を行
なった。

得られた血液を・室温で４０分間放置したのち。

−２１− 室温、３．００　Ｏｒｐｍ　　で３０分間遠心分離して
血清を分離した。この抗血清４０＋ｄに同相゛の０．９
チＮαＣ’ｌ會有１／２０ＯＡ／リン酸緩衝液（ｐＨ？
、２）を加え徴拌したのち、飽和Ｍ’ｔ　Ｎ？アンモニ
ウムによる塩析で抗プロトロンビン抗体を製（造した。

（Ｃ）　　抗プロトロンビン抗体感作ポリスチレンラテ
ックスの製造 上４ｉ−（ｂ）で製造した抗グロトロンビン抗体１０智
を５　’ｍｅの０．２４　ＡＩグリシン緩衝液（ｐ−Ｈ
９，６１に溶解し、これに２％ＩＷ／Ｖ）ポリスチレン
ラテックス懸濁液（平均粒径：０．１０９μ）５ゴを加
えて混合し、室温で２時間攪拌した。この後、遠心分離
して？８だ沈殿を０．３　ｑ６ウシ而清アルブミンＩＢ
８．４）を含むグリシン緩衝液１Ｏｒｎｅに懸濁させ、
抗プｐトロンビン抗体感作ポリスチレンラテックスを得
た。

（ｄ）　　凝與反応 −２２− 健常者の血漿を０．２４　Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，
６）で１００，２００，４００および８００倍に希釈し
、各希釈血漿を２滴（約１００μｔ）反応スライド板上
に滴下し、、？：ｔ１に上言１（Ｃ）で製造した抗グロ
トロンビ゛ン抗体感作ポリスチレンラテックスを１滴ず
つ滴下する。両者全混合し、スライド板をゆるやかに揺
動し、２分後に肉眼で凝集像の有ｐ、Ｊ：を観察し、た
とこる４００倍希釈血漿迄明瞭な凝＋ｊＬ像を１めた。

プロトロンビンの健常者血漿中の漉変は約８０〜／ｌで
あること、およびプロトロンビンの純品にｉＪする猾卵
反応から、抗プロトロンビン抗体感作うテックス試％Ｍ
の感電はプロトロンビンに対して０．２μ？　／ｍｅで
あった。

挾施例２ （α）プロトロンビン感作ラテツクスのｌＦｉ＆造実か
ζ例１　（（１）で製造したプロトロンビン４■を０、
２４　Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，６）５ゴに溶解し、
２％ポリスチレンラテックス１ｔｆｆｌ径０．５００μ
）５ゴを加えて室温で１時間攪拌した。攪拌後４Ｃ，１
０，００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分ｌ１ｍを行い得られ
た沈殿物を上記緩衝液１０−で洗浄した。

再度遠心分離後、沈殿物をＯ，ｆｌｑｌ、ＢＳＡ含有グ
リシン緩衝液ｌロゴに懸濁させ、プルトロンビン感作ポ
リスチレンラテックスを製造した。

（６）　　凝集阻止反応 健常者の血漿を０．２４　Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，
６）で１００．２００．４００および８００倍に希釈し
、各希釈液の１滴（約５０μｔ）　ｆ反応スライド板上
に滴下し、これに実施例１　（ｂ）で製造した抗プロト
ロンビン抗体を４００倍に希釈した液ｆｔ１滴ずつ滴下
し；′□混会合後上記口））で製造したプロトロンビン
感作ポリスチレンラテックス懸濁液ずつ滴下した。この
三者を均一に混合し、スライド板をゆるやかに揺動し、
２分後肉眼で凝集１オ、凝集阻止像を観察したところ、
４００倍希釈血漿迄明瞭な凝集阻止反応示した。本ラテ
ックス試薬の測定感電はプロ）ｏンビンに対して６２μ
ｆ／ｌｄであった。

実施例３ 抗■因子抗体感作ポリスチレンラテックスの製造ヘキス
ト社製抗■因子抗血清から硫酸アンモニウム塩析によっ
て製造した抗■因子抗体１０■を、５−の０．２４　Ｍ
グリシン緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解し、これに２％（
Ｗ／Ｖ　）ポリスチレンラテックス懸濁液（平均粒径：
　０．３４０μ）５ｍｌを加えて混合し、室温で３時間
攪拌した。この後遠心分離して得た沈殿をαａｉＥｓＡ
含有グリシン緩衝液１０ｍに懸濁させ、抗■因子抗体感
作ボリスチレンラテックスケ得た。測定感度は０．１μ
ｂ〜であった。

−２５一 実施例４ 抗■因子抗体感作ポリスチレンラテックスの製造ヘキス
ト社製抗■因子抗血清から硫−９アンモニウム塩析によ
って製造した抗■因子抗体ｌＯ〜を、５　ｍｌの０．２
４Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，６３に鹸解し、こねに２
％ｔｗ／ｖ＋ポリスチレンラテックス懸濁液（平均粒径
：　０．２２０μ）５ゴを加えて混合し、室温で２時間
攪拌した。この後、遠心分離して得た沈殿を０．３４Ｂ
ＳＡを含むグリシン緩衝液１０ｓｌｊに懸濁させ、抗■
因子抗体感作ポリスチレンラテックス分得た。測定感度
は０．４μ′ｔ／　ｍｌであった。

失施例５ 抗Ｘ因子抗体感作ｙｈ　ｕスチレンラテックスの製造Ｄ
ｉａｅｉｐｉ６らの方法（Ｂｉｏｏｈｅｍｔｓｔｒｌｌ
　　Ｌ　６．６９ｇ＋１９７７１３によってヒト血漿か
らｎ製した第Ｘ因子を実施例１　（ｂ）の方法に従って
家兎に−２６− 免疫して得た抗Ｘ因子抗体５■を、５ｄの０．２４Ｍグ
リシン緩衝液ｉｐ＆９．６３に溶解し、これに２％（Ｗ
／Ｖ　）ポリスチレンラテックス懸濁液（平均粒径：　
０．１０９μ３５ｍ１を加えて混合し、３７Ｃで６０分
攪攪した。この後、遠心分離して得た沈殿ｆＯ１３％Ｂ
ＳＡ含有グリシン緩衝液１〇−に懸濁させ、抗Ｘ因子抗
体感作ポリスチレンラテックス号得た。測定感度は０．
２μｆ／ａｔであった。

実施例６ （α）抗プロトロンビン抗体感作面球の製造常法により
ホルマリン固定したヒツジ赤血球４％ａｆ８液（リン＃
緩衝液、ｐＨ７，４）に等量の０、０１　％タンニン＃
溶液を加えて５６Ｃで３０分反応させ１次いでリン酸緩
衝液で赤血球を洗浄後。

８チ懸濁液とした。ついで前記実施例１（ｂ）で製造し
た抗プロトロンビン抗体の０．１チ溶液を加え、５６Ｃ
で２時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液にて血
球を遠心洗浄し、０．２ｆｒＢＳＡ’ｌｔ含むリンａＭ
衝液にて３チ血球ａ度の懸濁液とした。

（６）　　血球凝集反応 健常省の血漿を０．２４　Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，
６）で５０．１００，２００，３００．４００および５
００倍に希釈し、各希釈液３００μノずつを小試験管に
入れ、上記（ａ）で製造した抗プロトロンビン抗体感作
血球の懸濁液５０μｔを加え混和したのち強く振盪し、
ミラー付スタンドに２時間静置し、管底像ＫＪ−１凝集
像を判定したところ。

４００倍希釈崩漿迄凝集像を示し、測定感度は０、２μ
ｔ／−であった。

実施例７ 血漿中のＰＩＶＫＡの測定（臨床的応用）（ａ）　　試
験方法 ０．２％ウシ血清了ルプミン（ＢＳＡ）を含む生理食塩
液に懸濁した硫酸バリウム（１００η／−）。

炭酸バリウム＋　１００ｎｑ／ｍｅ）又は水酸化アルミ
ニウムゲル＋　０．１　％　）のＭ濁液１００μｔにク
エン酸又はシュウ酸添加被検血漿２５μｔを加え、３７
Ｃで２分毎に１５分間混和し、次いで０．２％ＢＳＡ含
有生理食塩液３７５μｔを加えて混和した後、３０００
　ｒｐｍ　で５分間遠心分離した。この上清は原血漿が
２０倍に希釈されたものである。

さらに必要に応じてこれをｏ２％ＢｓＡ含有生理食塩液
で希釈した検液を２滴（約ｉｏｏμｔ）反応スライド板
上に滴下し、これに抗プロトロンビン抗体感作ポリスチ
レンラテックスを１滴ずつ滴下し、スライド板をゆるや
かに揺動し、２分後に凝集の有無を観察した。０．２μ
ｔ／ｄ、以上のブｑトロンビンに相当するＰＩＶＫＡｘ
が存在すれば凝集が起るので、凝集が認められた最高希
釈倍数に０．２を乗じて被検血漿中のＰＩＶＫＡｕの蛍
を算出した。なお１表中本願発明方法によるＰＩＶＫ−
２９− Ａｎ測定値を０と表現しであるのけ、ＰＩＶＫＡＵの鼠
が本試薬による測定感度未満であったことを示すもので
ある。

（ｂ）が”験結果 （イ）新生児（生後８−７日） 衣Ｉ ＶＫＡｔ定 音信μｍ− １００，０６４７，０− ２０−０，１６４４，０− ３０−１，０４６，０− ４００３０，０− ５００，０９３５，０− ６００，３３５１，０− ７００，０４５１，０− ８００，０９３７，５− ９００，１６４９，２− １０００，３０３１０− １１０−０，０５４１０− １２４０，２８３２，０＋ １３４　　　　０．０６　　　３２０　　　　＋１４８
　　　　　　　　０．７６　　　　　　３５．０　　　
　　　＋−３０− Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ−ＨＰ７’（％）−
ＴＴ＠）／ＨＰＴ（（転） ＨＰＴ：ヘパプラステンテスト、ＴＴ；トロンボテスト
、ＤＤＩＥＰ二二次元電気泳動法によるＰＩＶＫＡｌ存
在の有無 １１ＰＴは健康成人を１００とした場合、新生児におい
ては表の如く低値を示し、凝固活性の低下が　められる
。Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ＩｎｄｅｘからはＪ１６６．
１０および１４の症例においてＰＩＶＫＡの存在が疑わ
れたが１本願方法により測定した結果、扁６および１０
にけ異常がな（、ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎＩｎｄｌｊＺ　
　では発見できなかったＪｉ１２．１３ケ含めて３し１
１が４〜８μ２／−のＰＩＶＫＡの存在を示し、この結
果けＤＤＩＥＰによる定性的所見と一致した。従って４
１２〜１４の３例はビタミンに依存因子の異常が疑われ
、ビタミンに療法の７ｊ象となった症例である。

（ロ）　ビタミンに欠乏症患者 表２ １３２　１．０　０　＋ ２８−０．１９　３４．８　＋ ３　　３２　　　　１．０　　　　０　　　＋４　　３
２　　　−０．１６　　１２．７　　＋ｓ　　　１６　
　　−０．３４　　３２３　　＋６　　１６　　　−０
．５５　　３５．５　　＋７３２　１．０　１　十 ８　３２　０．６５　１４．０　＋ ９　１６　０．４２　６ＬＯ＋ ９１りｄの症し０のうち、Ａ２．４．５．６の患者は、
凝固異常が認められるにもかかわらず、従来のＩｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ　ＩｎｄｅｘからけＰＩＶＫＡは隘駐と判
断されていたが、本願方法によシ全例高蒙度のＰＩＶＫ
Ａの存在がｉｉ＋ト明され、この結果けＤＤＩＥＰの結
果と一致し、治療方針が明確となった。

（ハ）ビタミンに拮抗剤投与中の患者 表３ μ？鷹 １１６　０．４０　４４．０　十 ２　　３２　　　　１．０　　　　０　　　　＋３　　
　　　　８　　　　　　　　０．２８　　　　　　　３
ＺＯ＋４　８　０．３７　８６．０　＋ ５　　　　　　２　　　　　　　　０．２４　　　　　
　　３８．０　　　　　　＋６　　Ｂ　　０．２７　６
３．０　＋ ７　　　０　　　　０．３７　　　５７．０　　−−３
３− Ａ、　７の症例けＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｉｎｔｔｅｘ
　　がらけＰ　Ｉ　ＶＫＡの看在が幾われたが１本願方
法及びＤ　ｌ）　Ｉ　ＥＰによってはＰＩＶＩ（Ａの存
在が証明されず、この結果から治療方針が明確になった
例である。

に）ＤＩＣ患者 表４ 扁　　本発明方法　　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　　ＩｉＰ
’ｌ’　　ＤＤＩによるＰＩ　　　Ｉｎｄｅｘ　　　　
　　４　　　ＥＰＶＫＡｙ定　　　　　　　　　　　ｊ
ＰＩｔ値　　　　　　　　　　　　　　　　　ＶＫＡ）
μｆ／ａｔ １　　　０　　　　０．４７　　　３５．８　−２　　
　０　　　−０．１１　　　３１．４　　−３　　　０
　　　　０．２８　　　３３．２　−４　　　０　　　
　０．１５　　　３９．１−５　　　０　　　　０．０
２　　　４５．１　　−６　　０　　−０、Ｏ？　　　
　３７．４　　−７　　　０　　　　０．１３　　　３
８．０　　−８　　　０　　　　０．３９　　　２６．
９　　−９　　　０　　　　０．０８　　　４４．２　
−１０　　０　　　　０．１６　　　４７．３　−１１
　　０　　　−０．１３　　　３０、〇　−１２００，
４５３４，１− １３００，０９２９，７− １４０−０，３０３１，４− １５０−０，２５３１，４− −３４− 全ド１」明らかな凝固異常を示し、Ｉｎｈｉ　／Ｊ　ｉ
　ｔ　１ｏｎＩｎｄｅｘ　　からＰＩＶＫＡの存在が疑
われた例もあるが、本１方法により金側ＰＩＶＫＡの存
在は否定され、ビタミンに依存８：凝固因子の異常以外
の原因で凝固異常が起ったことを示し、異なった治療が
行なわれた。

−３５−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　硫酸バリウム、炭酸バリウム又は水利酸化アルミ
   ニウムで予備処理した血液試料を、血液凝固筒■、■、
   ■％しくはＸ因子又はその抗体で感作した免疫学的に不
   活性な担体粒子よりなる免疫学的測定試薬を用いる免疫
   学的反応に付し、その反応の結果から該血液試料中の血
   液凝固異常因子を定性的又は定量的に決定することを特
   徴とする血液試料中の血液凝固異常因子の測定方法。 ２、　血液凝同第■、■、■もしくはＸ因子又はその抗
   体で感作した免疫学的に不活性な担体粒子よりなること
   を特徴とする血液凝固異常因子の免疫学的測定試薬。