JPS59193358A - ラツト抗ｈＣＧ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本玉」Ｊ勿１１− 木光割勿完１ 本発明はヒｌ−絨毛膜性生殖Ｂｊ１目ｉｌｌ　１９ｊＩ
ホルモン（ｈＣ（２）にグ・１゛４゛る高度に特聞二性
ノ：Ｃｉ；Ｌ：体の製造に関」−る。ラソ１により生体
で生産されノこ、また（・、１、ラノＩ・リンパＪ、ド
ハイゾリドーマＧこよって試験管内でイ）−産されノこ
これら抗体は、妊娠の指示薬としての個人の血中ホルモ
ン；農度の定量るこ有用である。

先４１技術−Ｑ説−ツ１ 絨し軟性ｌす１−１−ロピンは血清中に非常に低Ｉ／・
＼ル゛（通當存在するホルモンである。妊娠初期には１
１　Ｃに　０）ｆｉｌｌ　ｌｉ’ｆレヘルは急’ｔ’ｌ
ｔ、１．．．″−１胃−３−る。この１１（−〕に　Ｌ
−ベル０片七昇は、妊娠テス１−のもつとも著通の形で
あるイムノアッセイ燥作によって測定することができる
。

商業的に入手ル得るｈ　ＣＧのイムノア７−ｔ　＜　Ｌ
；４、ウーリギからの抗血清か、またはマウス）ｚ４ブ
１月・−マれ１胞から（Ｍられる七ツクＩコナール抗体
（Ｋｏｈｌ（・■・ａｎｄ　ＭｉｌｓＬｅｉｎ、　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　２５６＋　４９５−７＋　１．
９７５　）を使用する。ｈ　ＣＧを正確にθ、１１定す
るこれらのアッセイのためには、それに使用される抗体
は、黄体形成ホルモン（ｊｕｌ）、甲状腺刺激ホルモン
（′Ｉ″ＳＨ）、または卵胞制激ホルモン（ＦＳＨ）の
よ・うな他の関連あるホルモンと交差反応してはならな
い。４種のホルモンのすべては同じα−ザブユニットと
、類似したβ−ザブユニ・７トとを有する。ごの類似性
の結果、天然の修飾していない１１ＣＧ分子て免疫化し
たウサギまたはマウスは、前述の他のホルモンに対し許
容できない程高い交差反応性を有する抗血’／？ｔ　（
またはマウスハイブリドーマの場合はモノクロづ−−ル
抗体′）をしばしば生産する。Ｄｏｍｉｎｉの米国特許
第３．９９２．５１４号またはＴｓｏｎｇｅｔ　ａｌ　
の米国特許第４．２７１，０６９号におりるように、ｌ
しｔｚ　ｈ　ＣＧのβ−ザフユニソトを免疫化に用いる
ときにも、動物はなお著しい交差反応性を持った抗体を
生産するであろう。

Ｔａｔｖａｒ　　ｅｔ　　ａｊ’、＋　　ＰＮＡ’Ｓ、
　　Ｕ、Ｓ、八、、　　Ｖｏｌ、　　７２．　２１８−
２２２　　（１９７６）　　ｉ　　Ｂａｈｌ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、旧ｏｐｈｙｓ。

Ｒｃｓ、　Ｃｏｍｎ、、　Ｖｏｌ、　７０．５２５−５
３２　　（１９７６）　　；Ｐａｐｐｅｎ＋＋ａｇｃｎ
　ｅｔ　ａｔ、米国特許第３，９０３，２６２号；また
ばＢａｂｌ　　米国特許第４，２３４，５６１号によっ
て提案されたように、他の分子への複合化または化学約
手１々に、］、るｈＣＧ分子の改変は、低い免疫活性を
持った分子をしばしばイ］：じ、低りイクー低親和（！
１抗体をｉ、：ＪＩる。加えて、ｈ　ＣＧ　（１’＆飾
のこれらおよび他の方法は、免疫化のための改変したｈ
ｃｃ分子をＭ造するため著しい技術的努力と費用を必要
とずに〕。

不発！！ＩＪ−の一概−要 本発明の特徴の一つば、高度に感受性で、そして商１店
に特異性のｈＣＧに刻する抗体の製造であろ、。

他の舶徴は、全体の修飾しないｈＣＧで免疫化したラッ
トの血清または腹水からのこれら抗体を１？るごとであ
る。

なおイＩｊ　Ｏ）特徴は、全体の修飾しないｈＣＧから
、高いｑ：ｉ、　５ｉ；ｊ性および感受性のモノクロナ
ール抗体の製造である。

全体の未修飾ｈＣＧ（α−およびβ−サブユニ２１０両
１イ）またばβ−−リ”フユニソト単独で免疫化したラ
ットは、それらはヒトＩ−Ｈとの交差反応性を全くまた
は少ししか有せＪ、そしてイムノアッセイに用いるのに
適当な親和性（感受性）特性を有する抗血清を生産する
点において、マウスおよびウサギと異なることが発見さ
れた。商業的に入手し得る通交形または異系交配ラット
系統を使用しｉＭるが、しかしルイス通交系統のラット
が好ましい。

所望により、これら免疫動物に腹水を誘発させることが
でき、この腹水ｌ＆ば血清抗体に１似の特徴を持つ抗体
を含有している。このようにして得られた抗体は、マウ
スおよびウサギのような哺乳動物を全体の未修飾ｈ　Ｃ
Ｇで免疫化する普通の手法によって得られたものよりも
驚くほとずぐれている。その代わりに、リンパ球、例え
は免疫化した動物からの肝細胞を慣用の１榮作により骨
髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞系統をつくるこ
とができる。これらハイブリドーマ細胞のクローンは、
最適の感受性および低交差反応性のために選定すること
ができ、そして全ｈＣＧで免疫化したマウスまたはウサ
ギからつくったモノクロナール抗体よりも著しく良好な
モノクロナール抗体を生産するであろう。

ｊ洋−イ町欠ヤ変朋 本発明の実施において、市販のヒト絨毛膜外生１／＋ｌ
’ｉ腺刺激ポルモンか第一次免疫注射に、そしてず・＼
ての（茨の増強に使用できる。最良の成績のためにｌｊ
：　、該抗原は比較的高純度の４）のでなげればならな
い。β−ザブユニソｌ−も他の動物で得られるものより
もずくたれ結果をもって使用することができる。

適当な全数のう・７１・か、生理食塩中のｈ　ＣＧとフ
１１インＩ・アジュバントとの等計を混合することによ
ってｉｌＭ　１ｌｉｊＪした抗原エマルションで免疫化
される。該エマルジョンは免疫抗体応答を誘発するよつ
ｃ、：腹腔内・＼注射される。注射のスケシ・ニールは
変えることができるが、典型的なプロトコールは、第　
ペル、！Ｉ４と、２週後の最初の増強とを含むであろう
。追加の増強は１月間隔で与え得る。

動物ＧＪ−・般に最後の増強後マないし１０日後で採血
される。尾の血管を切断することによってラットから血
液が除去される。一般に、ラットが重人な副作用を経験
することなく５淑までの血液がいつでも除去される。血
液は２工程方法で回収される。全血が室温で凝固するこ
とを許容され、そして血清が領しゃされる。次に他の血
液成分の除去が遠心および領しやによって実施される。

前述の慣用の抗血清生産の代替法として、ラットに多量
の腹水液を生成させることかできる。適当な方法は、例
えばＤｏｕにＩａｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｖｏｌ、　２６．６．９−７４　　
（１９７９）に記載のように、免疫化したラットの腹腔
をフロインドアジュバントエマルジョンで刺激し、血清
のそれに極めて近似の抗体活性を有する腹水液の生成を
誘発することを含む。

免疫動物はまた、商業的に入手しくηるマウス骨髄腫細
胞との細胞融合のための活性化したリンパ球を提供し得
る。融合操作前に、動物は一般に、５ｔａｈｌｉ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｖｏｌ
、　３２＋　２９７−３００、　（１９８０）によって
記載されたように、抗原製剤で阻害される。この処理は
リンパ球組織電の芽および罪細胞含量を増加する傾向を
有する。細胞醐１合およびハイブリドーマ選択はＫｏｈ
ｌｅｒ　ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ、　　　Ｎａしｕｒｅ
、　　　〜Ｉｏ１．　　２５６．　　４９５−７　　　
　（１，９７５）　　　の方ｒノ（によって実施される
。組織培養培地上清か、山販の拭清を使って予信°１ス
クリーンとして酵素リンクイムノソーヘントアソセイに
よって抗体活性についてテス］・される。

」二記のように調製した血清または腹水液、およびハイ
シリトーマ細胞からの抗体製剤は、タイター、感受性、
および二ｍ抗体ラジオイムノアッセイ　（Ｒ１Δ）にお
いてヒＩ−黄体形成ホルモン（ＬＩＩ＞に対する交差反
応性パーセントについて特徴づ（１られる。

夕・イタ−は、全１２５１標識ｈ　ＣＧ　トレーサーの
３０％を結合するづンプルの希釈度と定義される。

抗体は２％（Ｖ／Ｖ）正常シソ１〜血漿および食塩ｋ　
ｆ・ｒｉ　ｌｌｉξ中に希釈される。希釈した抗体の１
００μβ部分標本か等容積の１２５．　　、レーサー（
約２５００Ｃｉ　／　ｍｍｏ　ｌ活性）と反応すること
を許容される。ブランク：１ン］・ロールとして、不活
性子ウシ血清部分標品がシステムへ含められる。沈銀は
適当な抗ラット免疫グロブリン試薬の添加によって達成
される。反応沈澱物が遠心および上滑の領しやによって
回収される。

抗体の感受性は、遊離の非ヨード化ｈｃｃがシステムへ
含められた時、ｈＣＧ）レーサー結合を競合的に阻止す
るその能力によって決定される。

抗体製剤は一般に標２Ｆ！濃度曲線の中間点か、または
子ウシ血清ブランク値の５０％を阻止する遊離ｈＣＧの
量をもって記載される。

ＬＨに対する抗体の交差反応性パーセントは、サンプル
感受性と同時に決定される。ＬＨの標４（′＝液がｈ　
ＣＧ標準液と同じ方法で調製される。サンプルの交差反
応性％は以下の式を用いて計算される。

本発明のラソ］・抗体は典型的きには１５％以下、好ま
しくは１％以下のＬ　Ｈとの交差反応性を示すが、同時
に中間点ｈ　ＣＧ　１３０　ｍＩＩＩ／ｙｆｆ以下、好
土しくは］、　００　ｍｌＵ／蔵以下を持ったｈ　ＣＧ
に対する高い感受性を示す。

実り色別１ 等４７１のフロインドアシュハンＩ〜と、商業的に入Ｅ
Ｊシ１７る仝ｈＣＧを含有する生理食塩水とを混合する
ことによって抗原エマルシ３ン組成物を調製した。約５
０μＡのｈＣＧを各自含有するエマルジョンの等量を腹
腔内〆１躬によって多数のラットおよび・マウスへ投与
し、その後３回の続いての腹腔内および４本のすべての
足裏白増強注射を実施しノこ。最初の増強は最初の注射
後２週目で、残りはその後１月間隔で行った。動物は最
後の増強後マないしＩＯ日目に採血し、血清をｔ凝固、
仲じゃ、および遠心によって回収した。

次に抗［［１［清を前記のタイター、感受性（標準濃度
曲線の中間点）およびＬ　Ｈに対する交差反応性パーセ
ントについて評価した。ツ下の成績が得られた。

（以下余白） 実施例 １ヶ月後４回目の増強を追加し、マないし１゜１−１後
採血したことを除いて、実施例１の操作を繰り返し、以
下の結果をｆＷた。

（以下余白） 実施例３ めいめいの増強注射のため全ｈＣＧに代えてβ−ザブユ
ニｙ　ｌ−ｈ　ＣＧを用いたことを除いて、実施例２と
同し操作を繰り返し、以下の結果をｉ！７た。

（以下余白） 実施例４ 一シ、トのめを用い、そして最後の増強注射後各動物に
１ｌｏｕｌＨＩａｓ　ｅｔ　ａｌ、、　、１．１ｍｍｏ
ｎ、　Ｍ’ｅｔｌ＋ｏｄｓ、　Ｖｏｌ。

２６、６９−７４　　（１９７９）の方法に従って１２
日間にねたリソ１−１イドアシ：Ｉ−ハントをもって腹
腔を刺激することにより腹水の生成を誘発したことを除
き、実施例２０打ｉ・１作を繰り返した。各動物はその
後腹水０月、Ｉｆｌ＆と同ＩＩ、１に尾静脈から採血し
た。

次にｆｆ＋−＋漬および腹水ｌ＋）ｔをアッセイし、以
下の結果ｊ：　Ｉ：Ｉだ（交差反応性はＬ　ｌ−（に対
するものである）。

（以下余白） 実施例５ ラット（ｌｎｉｓｔａｒ系統）と−、マウス（Ｂａｌｂ
／ｃ系統）とを免疫化するため、実施例１の操作を使用
しノこ。各動物は５Ｌａｈｌｉ　らの前出の操作によっ
て抗ｊ皇性エマルションで阻害し、最後の注射後約３［
１にと殺し、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
の前出の慣用操作によってラットリンパ結節細胞を一般
に入子しＩＮるマウス上詰腫細胞系統Ｐ３　Ｘ　６３八
ｇ８−６５３と融合し７ｋ。マウスは胛切除し、牌釧胞
を一般に入手しｉ−するマウス・Ｐ１髄腫細胞系統５Ｐ
２１０と副１合した。それぞれの場合にｉＨられるハイ
ブリト−マを培Ｎし、そして上清培養培地の酵素リンク
イムノソーヘン１〜アツセイによって抗１１ｃＧ抗体産
生についてスクリーンした。各動物から選択されたハイ
シリトーマのクローニングは組織培養系におりる霜釈を
制限することによって実行され、そし゛Ｃ各自からのモ
ノクロナール抗体は標（（Ｌ的うジオイムノアッセイに
よって特徴づりられた。以下に結果を示す（交差反応性
ば１．、　ｌ（に対するもの）。

見らｔｌ、るように、ラノ）−Ｘマウスモノクロナール
抗体は、ｆＨｊい感受性と低い交Ｘ：反応１（１との結
合を示　し　）こ　。

加えて、ラノＩ・×マウスハイフリト−マ細胞は無１１
ｊ４＋腺（免疫不全）マウス乙こ？、ｉｇ’ｌＪする時
、腹水を生成さ・けるのに作動である。この腹水液［Ｊ
その中ご１）：１記ハイシリドーマが生育された１−漬
組織培養１１η地のそ、）９．−＼類似のｂ　ＣＣｙ抗
体活性を示し、そし７′ご同しように有用−（ある。

実施例 ウリ十′（二Ｊ−シーラント白）を仝ｌ＋　ＣＧ総量５
０　ｐ　（ｙ、の４０部位の最初の放向注射と、全ｂ　
Ｃ（旨り１１回の皮下増強（各回１０〜２０部位）とに
、１１５１．て免疫し、次に採血した。ウサギ抗血漬を
実ｊｉｌ！例１の抗血？ｉ’Ｆと同し方法でアノセ・イ
し、ｊ以下の結果を＋１．冒こ。

（以下余白） ｆ１ツに、仝ｈＣ（、、を注射したウサギの１］０％か
１、、ｌＮこ苅１−る高い交差反応性を与えた。

本発明は、両方のザブユニットを含有する仝ホルに−ン
を所ゞ１！の抗体の産生に用いる、二とかでき（〕の（
、／ｉｑ、　ＩＩ　’　Ｃ（’；をα−およびβ−リ・
ブ〕７．ユノ；・に分１′ｉ、Ｉ［するごとを不必要と
する。：１：たそれ口高感受性Ａ、′、、ｌ、び１．１
１に対する低置ｊＣ−反応性の抗ｈ　Ｃ（Ｊ抗体を得る
ため、抗体をα−ザソユニノトｈ　ＣＧ　４：Ｚ吸収４
）シ＜は反応さセたり、Ｊ：たは別にそれを変化さ一已
る一切の必要をＩＪ＋除−４／′、　。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ラソＩ・へ全ｈ　ＣＨまたはそのβ−サブユ
   ニ・７１・を投与し、そして該ラットから抗ｈＣＧ抗体
   を採取することを特徴とする高感受性でＬ　Ｈに対する
   交差反応性の低いり、　ＣＧ抗体の生成方法。
2. （２）全ｈｃｃを投与する第１項の方法。
3. （３）　　ラソ］−がルイス系統近交系である第１項の
   方法。
4. （４）　　ラットがルイス系統近交系である第２項の方
   法。
5. （５）高い感受性を持ち、そしてＬ　Ｉ（に対し交差反
   応性が低いシソ１−抗ｈＣＧ抗体。
6. （６）抗血清の形の第５項のラット抗体。
7. （７）腹水液の形の第５項のラット抗体。
8. （８）　　モルクロナール抗体の形の第５項のシソ１〜
   抗体。