JPS59196100A - グリセロ−ルの測定法および測定組成物 - Google Patents

グリセロ−ルの測定法および測定組成物

Info

Publication number
JPS59196100A
JPS59196100A JP58070730A JP7073083A JPS59196100A JP S59196100 A JPS59196100 A JP S59196100A JP 58070730 A JP58070730 A JP 58070730A JP 7073083 A JP7073083 A JP 7073083A JP S59196100 A JPS59196100 A JP S59196100A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
glycerol
dihydroxyacetone
enzyme
glyceraldehyde
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP58070730A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0422560B2 (ja
Inventor
Shinya Ito
伸哉 伊藤
Kuniyoshi Matsunaga
松永　國義
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amano Enzyme Inc
Original Assignee
Amano Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amano Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Amano Pharmaceutical Co Ltd
Priority to JP58070730A priority Critical patent/JPS59196100A/ja
Priority to US06/601,252 priority patent/US4636465A/en
Priority to DE8484302642T priority patent/DE3468124D1/de
Priority to EP84302642A priority patent/EP0123511B1/en
Publication of JPS59196100A publication Critical patent/JPS59196100A/ja
Publication of JPH0422560B2 publication Critical patent/JPH0422560B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグリセロールの測定法ならびにその測定組成物
に関する。さらに詳しくはグリセロールデヒドロゲナー
ゼを用いたグリセロールの測定において、ジヒドロキシ
アセトンまたはＤ−グリセルアルデヒドをリン酸化する
酵素を用い、グリセロールデヒドロゲナーゼが触媒する
反応を促進することを特徴とする測定法である。本発明
は特に生体液中のグリセロールまたはトリグリセライド
の測定に有用である。生体液中のグリセロールおよびト
リグリセライドの測定は、高脂血症の検査の一つとして
臨床上極めて重要な位置を占めている。特に高トリグリ
セライド血症は動脈硬化、冠状機能不全、心筋梗塞など
の早期診断、治療の目安として用いられるため、上記の
迅速かつ正確な測定方法が望まれている。
トリグリセライド測定の一方法であるリパーゼおよびグ
リセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法は次の反応式
で示されるように、まずトリグリセライドがリパーゼの
作用でグリセロールと脂肪酸に加水分解され、次いでグ
リセロールはＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下グリセロールデヒ
ドロゲナーゼの作用でジヒドロキシアセトン（またはＤ
−グリセルアルデヒド）とＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを生成し、
このときＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの紫外部における吸収または
螢光を測定することによりグリセロール、延いてはトリ
グリセライドが測定される。
リパーゼ トリグリセライド□グリセロール＋脂肪酸ここでＮＡＤ
　（Ｐ）＋はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
リン酸）を表し、ＧＤＨはグリセロールデヒドロゲナー
ゼを表す。
上記グリセロールデヒドロゲナーゼの触媒する反応は平
衡がＮＡＤ　（Ｐ）＋生成の方向に傾いているため正方
向に反応が充分進まず、従って反応時間が長くかかると
ともに測定精度および感度が低くまた測定できるグリセ
ロールの濃度範囲も狭いという欠点を有している。
この問題を克服するため従来はＮＡＤ　（Ｐ、）＋を過
剰量添加する、またはｐｔｕｏ〜１１の高いｐＨで反応
を行うといった酵素反応には不利な条件が強いられてき
た。上記グリセロールデヒドロゲナーゼの反応を進める
ためには、生成物であるジヒドロキシアセトンまたはＤ
−グリセルアルデヒドを反応系外に除去することが考え
られ、このような例としてヒドラジンを添加しジヒドロ
キシアセトンをヒドラゾンに変えることにより脱水素反
応を進める方法が試みられている（臨床病理、第２４巻
、８５５頁、　１９７６年）。しかしながらこの方法は
酵素が失活し易いという問題があり、本質的な解決法に
は至っていない。そこで本発明者らは酵素反応に好まし
い条件下でジヒドロキシアセトンまたはｌ１ｌｌ−グリ
セルアルデヒドを反応系外に除去する方法を鋭意検討し
たところ、ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルア
ルデヒドをリン酸化する酵素を使用する方法を見いだし
本発明を完成したものである。
本発明法において用いるジヒドロキシアセトンまたはＤ
−グリセルアルデヒドをリン酸化する酵素の具体的な例
はトリオキナーゼまたはジヒドロキシアセトンキナーゼ
である。トリオキナーゼ（Ｔｒｉｏｋｉｎａｓｅ、系統
名　ＡＴＰ：Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスホトラン
スフェラーゼ、ＥＣ２，７，１，２８）は次式に示すよ
うに、アデノシン５′−三リン酸（以下ｒＡＴＰｊとい
う）などのリン酸化合物を供与体としてそのリン酸基を
Ｄ−グリセルアルデヒドに転移する反応を触媒する酵素
であり、ジヒドロキシアセトンもＤ−グリセルアルデヒ
ドとほぼ等速度でリン酸化することが知られている。
Ｄ−グリセルアルデヒド＋ＡＴＰ→ Ｄ−グリセルアルデヒド−３リン酸＋ＡＤＰ一方ジヒド
ロキシアセトンキナーゼ（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ａｃｅ
ｔｏｎｅ　ｋｉｎａｓｅ）はＡＴＰなどのリン酸供与体
のリン酸基をジヒドロキシアセトンに転移する反応を触
媒する酵素であるが、Ｄ−グリセルアルデヒドに対する
反応性は弱くトリオキナーゼとは異なる酵素であると考
えられている。。反応式を以下に示す。
ジヒドロキシアセトン＋ＡＴＰ− ジヒドロキシアセトンリン酸＋ＡＤＰ トリオキナーゼの例としてはモルモット肝、ラット肝、
バチルス・ズブチリス（ｆｊａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ　）などに存在することが知られている〔メソッ
ド　イノ　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ、）第５巻、３６２頁（１９６２）　、
ユーロピアンジャーナル　オブ　バイオケミストリー（
Ｅｕｒ。
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第３１巻、５９頁（’１９７
２）およびジエンザイム（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　）
第２版、第６巻、７５頁（１９６２）　）。またジヒド
ロキシアセトンキナーゼの例としてはキャンシダ・メチ
リカ（Ｃａｎｄ　＋ｄａｍｅｔｈｙｌｉｃａ　）　　（
ツァイトシュリフト　アルゲマイネ　ミクロビオロジエ
（Ｚ、　Ａｌ１ｇ、　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、　）第２０
巻、３８９頁（１９８０）および同第２１巻、２１９頁
（１９８１）　）　、グルコノバクタ−・サブオキシダ
ンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　５ｕｂｏｘｙｄａ
ｎｓ）　　Ｃ日本農芸化学会、中部支部・関西支部合同
大会（昭和５６年１０月９日）講演要旨集、３頁〕、ア
セトバクター・キシリナム（八ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　
ｘｙｌｉｎｕｍ　）　　（ジャーナルオブ　バクテリオ
ロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）第１２７巻、
７４７頁（１９７６）　）　、緑藻類の一種であるデユ
ナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）　　（プラント　フ
イジオロジ−（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）第５９
巻、　１５頁（１９７７）およびバイオキミカ　バイオ
フィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、八ｃｔａ）第　６１５％、１頁（１９８０）　）およ
び本発明者らが新たにスクリーニングしてシゾサツカロ
ミセス属菌に見いだした酵素があげられる。
本発明には上記トリオキナーゼまたはジヒドロキシアセ
トンキナーゼはいずれも用いることができるが、特に好
ましいのは酵素の生産性および性質などから、本発明者
らが新しく見いだしたシダサツカロミセス属に属する菌
株の産生ずるジヒドロキシアセトンキナーゼである。上
記以外にもジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルア
ルデヒドをリン酸化する酵素であればいずれも本発明に
用いることができるのは言うまでもない。
シダサツカロミセス属に属するジヒドロキシアセトンキ
ナーゼ生産菌は、具体的にはシダサツカロミセス°ポン
ベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂ
ｅ）ＩＦＯｏａ４ｏ、同ＩＦＯＣｌ３５４、シダ”ｊ−
ｙヵロミセス・マリデポランス（Ｓ、　ｍａｌｉｄｅｖ
ｏｒａｎｓ　）　ＩＦｏ　１６０８、シゾサツカロミセ
ス・ヤボニヵス（Ｓ、　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＩＦＯ１
６０９、シゾサツカロミセス・オフトスポラス（Ｓ、　
ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ　）　ＩＡＭ　１２２５７などが
あげられる。
このうち特に好ましいのはシゾサツカロミセス・ボンベ
ＩＦ（１０３５４である。
シゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯ０３５４が産生する
ジヒドロキシアセトンキナーゼは二種類のアイソザイム
（Ｄ　ＨＡ　Ｋ　Ｑ）およびＤ　ＨＡ　Ｋ　（１）とい
う〕からなり、その性質を以下に示す。
（１１旬月：　　ＡＴＰなどリン酸供与体のリン酸基を
基質ジヒドロキシアセトンに転移する反応を触媒する。
（２）基質特異性：　本酵素はジヒドロキシアセトンを
基質としてこれによく作用するが、ＤＬ〜グリセルアル
デヒドに対する作用は弱くまたグリセロール、１，２−
プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、アセト
ール、アセトイン、グリセロール３−リン酸、ＤＬ−グ
リセリン酸には作用しない。
（３）リン酸供与体の特異性二　本酵素はＡＴＰを最も
よいリン酸供与体として利用する。ウリジン５゛−三リ
ン酸は若干利用するがイノシン５゛−三リン酸、シチジ
ン５′−三リン酸、グアノシン５′−三リン酸は利用し
ない。
（４）二価金属イオンの特異性二　本酵素はＭ　ｇ　２
＋、Ｃａ２＋、Ｃ０２＋、Ｍｎ２＋などの二価金属イオ
ンが存在しないと酵素活性を示さない。ＤＨＡＫ（Ｉ）
はＣａ２＋イオンで、ＤＨＡＫＧＤはＭｇ２＋イオンで
最大の活性を示す。
（５）至適ｐＨ：　　約７．３ （６）安定ｐＨ範囲：　　Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（Ｉ）はｐＨ
約５〜１１．ＤＨＡＫα）はｐＨ約６〜１１の範囲で安
定である。
（７）至適温度：　　Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（Ｉ）は６０°Ｃ
付近、ＤＨＡＫ■は５５°Ｃ付近が至適である。
（８）温度安定性：　　Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（Ｉ）は約５０
°Ｃ以下、ＤＨＡＫ（Ｉ［）は約４０℃以下で安定であ
る。
（９）基質親和性：　　ｐＨ７，５，２５°Ｃの反応条
件におりるジヒドロキシアセトン、Ｉ）Ｌ−グリセルア
ルデヒド、ＡＴＰに対するミバエリス定数（Ｋｍ値）は
Ｄ　ＨＡ　Ｋ（１）の場合それぞれ８．４Ｘ　１０−６
　Ｍ、２．１ｘｌＯ−５Ｍ、　２．２ｘ　１０−４Ｍ、
　Ｄ　ＨＡ　Ｋ（ＩＤの場合はそれぞれ２．ＯＸ　１０
−５　Ｍ、３．２Ｘ　１０−５　Ｍ、９、ｌＸ１０−４
Ｍであった。またＭｇ２＋イオンは反応系において４ｍ
Ｍ以上の濃度であれば十分な酵素活性が得られた。
００）分子量：　セファデックスＧ−２００（ファルマ
シア社！Ａ）を用いたゲルろ過性により測定したところ
Ｄ　Ｈ，Ａ　Ｋ　（Ｉ）、Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（１０ともに
約１４５，０００と算出された。
次ぎに本発明法によるグリセロールの測定法について具
体的に説明すると、まずグリセロールはピリジンヌクレ
オチド補酵素の存在下グリセロールデヒドロゲナーゼの
作用で脱水素されジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリ
セルアルデヒドとなる。このときリン酸供与体の存在下
トリオキナーゼまたはジヒドロキシアセトンキナーゼを
作用せしめることにより、ジヒドロキシアセトン、Ｄ−
グリセルアルデヒドはそれぞれジヒドロキシアセトンリ
ン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸となって系外
に除去される結果グリセロールデヒドロゲナーゼの触媒
する反応がすみやかに進行する。
ピリジンヌクレオチド補酵素の例としてはＮＡＤ”また
はＮＡＤＰ＋が用いられる。ｄＰＪえばエセエリヒア・
コーリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、ク
レブシェラ・ニュウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　
ｐｎｅｕｍｏｎ−１ａｅ）、アセトバクター・サブオキ
シダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　５ｕｂｏｘｙｄａ
ｎｓ）およびゲオトリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒ
ｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　）のグリセロールデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，６）　　（ジャーナル
　オブ　バイオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、）第　２０３巻、１５３頁（１９５３）
　、同第２３５巻、　１１３２０頁（１９６０）および
アグリカルチュラル　アンド　バイオロジカル　ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）第４
６巻、　３Ｑ２９頁（１９８２）　）はＮＡＤ＋を補酵
素としてジヒドロキシアセトンを生成し、ウサギ骨格筋
のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，ｔ、ｉ、７
２＞　　（バイオキミカ　バイ矛′フィジカ　アクタ　
（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）第
２５８巻、４０頁（１９７２）　）はＮＡＤＰ＋を補酵
素としてＤ−グリセルアルデヒドを生成し、また緑藻デ
ユナリエラ・パルプｙ　　（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ　ｐ
ａｒｖａ）のグリセロール２−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１，１，１゜１５６）（フェブス　レター（ＦＥＢＳ　
Ｌｅｔｔ、）第２９巻、１５３頁（１９７３）　〕ばＮ
ＡＤＰ＋を補酵素としてジヒドロキシアセトンを生成す
る。本発明には上記グリセロールデヒドロゲナーゼはい
ずれも使用することができるが、好ましくはグリセロー
ルに対するミバエリス定数（Ｋｍ値）の小さいゲオトリ
カム・カンディダムの産生ずるグリセロールデヒドロゲ
ナーゼがよい。
リン酸供与体の例としては、ＡＴＰ、ウリジン５゛−三
リン酸（ＵＴＰ）　、イノシン５゛−三リン酸（ＩＴＰ
）、シチジン５′−三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン５
゛−三リン酸＜ＧＴＰ）などがあげられる。シゾサツカ
ロミセス・ボンベＩＦＯ０３５４のジヒドロキシアセト
ンキナーゼはＡＴＰを最もよいリン酸供与体とする。
上記反応においてグリセロールを測定するには、グリセ
ロールデヒドロゲナーゼの触媒する反応におけるＮＡＤ
　（Ｐ）＋の変化、好ましくは生成するＮＡＤ　（Ｐ）
Ｈを３４０ｎｍ付近における紫外部吸収により測定する
のが最も簡便である。その他螢光強度を測定する方法、
フェナジンメトサルフェートとニトロテトラゾリウムブ
ルーなどのテトラゾリウム塩を使用して比色する方法〔
クリニカキミカ　アクタ（Ｃ１ｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉ
ｃａ　Ａｃｔａ）第８１巻、１２５頁（１９７７）　）
　、ジアホラーゼとテトラゾリウム塩を使用して比色す
る方法〔特公昭５６−３８１９９号公報〕などもの方法
も利用できる。
＼ 本発明のグリセロール測定組成物はジヒドロキシアセト
ンまたはＤ−グリセルアルデヒドをリン酸化する酵素、
グリセロールデヒドロゲナーゼ、ピリジンヌクレオチド
補酵素およびリン酸供与体を必須として含んで成り、各
成分の具体例は前述のとおりである。各成分の使用量は
幅広く変えて用いることが可能である。例えばグリセロ
ールデヒドロゲナーゼの使用量は、反応の初速度からグ
リセロールを求める場合には０．０１〜０．５ｕ／ｍＥ
、グリセロールを完全に生成物に変化させることにより
求める場合には０．５ｕ／、ｍ以上用いることが好まし
い。トリオキナーゼまたはジヒドロキシアセトンキナー
ゼの使用量は０．１ｕ／＋＋＋ｆｆ以上が好ましい。
反応の条件は、ｐＨ７〜９、温度２５〜４０℃が特に有
効であるが、この範囲を越えて行うことも可能である。
また反応液のｐＨを一定に保持するために緩衝液を含む
のが好ましい。緩衝液は上記ｐＨ範囲を示すものであれ
ばいずれでもよいが、より好ましくはトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０〜８．５）である。
以下に実施例をもって本発明を具体的に説明するが、使
用した酵素の調製法および各酵素の活性の表示は次のと
おりである。
（１）　　ジヒドロキシアセトンキナーゼの調製麦芽エ
キス１％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．１％、リ
ン酸二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水塩　０
．０５％、塩化カリウム　０．０５％および硫酸第一鉄
７水塩ｏ、ｏｏｉ％から成る組成の培地（ｐＨｅ、２：
＋にシゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯＯ３５４を接種
し、３０℃で４８時間培養した。
培養液１０βを遠心分離して菌体を集め、２０ｍＭ　）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁後、ダイノミルに
て菌体破砕を行い酵素を抽出した。抽出液を遠心分離し
て固型物を除去し、得られた上清液にポリエチレンイミ
ン溶液を最終濃度０．０２％になるように添加し、沈澱
物を再度遠心分淵により除去した。次に得られた上清液
を硫安塩析し、４０−７０％飽和画分の酵素沈澱を取得
した。沈澱を上記同緩衝液に熔解したのちセファデック
スＣ，−ＺＳ＜ファルマシア社製）を使用したゲルろ過
法により脱塩したのち、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−セファロース（ファルマシア社製）カラムに吸着させ
、カラムを洗浄後Ｏ〜０．３Ｍの食塩濃度勾配により酵
素を溶出した。酵素活性は二つのピークに分れ、約０．
１２Ｍ食塩で溶出される画分をＤ　ＨＡ　Ｋ　（’Ｉ）
、約０．１６Ｍ食塩で溶出される画分をＤＨＡＫ（Ｉ［
）としてそれぞれ別に集めた。
Ｄ　ＨＡ　Ｋ　（１）、ＤＨＡＫ（１）画分はそれぞれ
硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加えて酵素
を沈澱させたのち、遠心分離により集め、上記同緩衝液
に溶解してセファデックスＧ−２５により脱塩した。次
に得られた酵素溶液を４（ｉｍＭのトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化したブルーセファロース（ファル
マシア社製）カラムに通し、吸着されずに溶出してきた
活性画分を限外ろ過法により濃縮したところ、１２　ｕ
／　７の活性を有するＤ　ＨＡ　Ｋ（Ｉ）溶液１０ｍＥ
ならびに２０　、　ｕ／　ｍＩ２の活性を有するＤＨＡ
　Ｋ　（ｎ）溶液１８ｍｆを得た。なお本Ｄ　ＨＡ　Ｋ
　（１）とＤＨＡ　Ｋ　（ｎ）は混合状態でも有効であ
り、以下に示す実施例では混合物を使用した。
活性測定法：　２．５ｍ門ＡＴＰ、４ｍＭ硫酸マグネシ
ウム、Ｏ，，２ｍＭ　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈｌｌ、０ｍＭジヒ
ドロキシアセトンおよび２．５ｕ／ｍＲグリセロールー
３−リン酸デヒドロゲナーセ（ベーリンガー・マンハイ
ム社製）を含む０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）　１．０　ｍｌと酵素溶液０．０ｆｉ’を混合し２５
°Ｃで反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測
定する。酵素活性の表示は、上記条件で１分間に１Ｍモ
ルのＮＡＤＨを減少させる酵素量を１単位とした。以上
の反応式を示せば次の通りである。
ジヒドロキシアセトン＋Ａ　Ｔ　、Ｐ　−ジヒドロキシ
アセトンリン酸＋ＡＤＰ ジヒドロキシアセトンリン酸＋ＮＡＤＨ−グリセロール
３−リン酸＋ＮＡＤ＋ （２）トリオキナーゼの調製 メソッド　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ　、）第５巻、３６２頁（１９６２）記
載の方法に準じてブタ肝臓より調製した。活性の測定は
、上記ジヒドロキシアセトンキナーゼ活性の測定法にお
ける基質ジヒドロキシアセトンの代わりにＤ−グリセル
アルデヒドを用いて同様に操作した。
（３）　　グリセロールデヒドロゲナーゼの調製ゲオト
リカム・カンディダムのグリセロールデヒドロゲナーゼ
は　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　第４６
巻、　３０２９頁（・−１９８２＞に準じ、またウサギ
骨格筋のグリセロールデヒドロゲナーゼは　Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　　第２５８巻、４０頁（
１９７２）に準じそれぞれ一製した。酵素活性は、グリ
セロールとＮＡＤ　（Ｐ）＋を基質として、ｐＨ８，０
，２５℃の反応条件で１分間に１μモルのＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈを生成する酵素量を１単位とした。
（４）　　リパーゼ活性の表示 オリーブ油乳化液と牛血清アルブミンとの混合液を基質
として、ＰＨ７，０，３７℃の反応条件で１分間に１μ
モルの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。
実施例１ 硫酸マグネジうム・７水塩　１　、０４ｍｇ／　ｍｌ！
、ＮＡＤ　２．Ｏｍｇ／ｍｆおよびＡ　Ｔ　Ｐ　　１．
５ｍｇ／　＋−を含む０．１５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）　０．９６ｍｆと試料としてトリオレイン換
算７５〜１０５０ｍｇ／　ｄｉの既知濃度のグリセロー
ル溶液０．０’２ｒｎｆ！を１ｉ容のキュベツトに入れ
て混合し、３７℃で３分間保持した。その後ゲオトリカ
ム・カンディダムのグリセロールデヒドロゲナーゼ８．
７５ｕ／−およびジヒドロキシアセトンキナーゼ２５ｕ
／ｎｆを含む０．０２Ｍ　ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５＞　０．０２ｉｆを添加して反応させ、３４０ｎｍ
における吸光度の１分間当りの増加を測定した。
なお比較のためジヒドロキシアセトンキナーゼを除いた
系についても同様に操作した。
反応時間と吸光度の関係を第１図（本発明法）および第
２図（比較例）に、また本発明法の検量線を第３図に示
す。本発明法では１０００ｍｇ／ｄ１以上の試料に対し
ても反応速度は一定であり、高感度で定量的な測定が可
能であるが、比較例では反応速度が遅く、また時間とと
もに低下することがわかる。
実施例２ 実施例１におけるジヒドロキシアセトンキナーゼ、ゲオ
トリカム・カンディダムのグリセロールデヒドロゲナー
ゼおよびＮＡＤに代えてそれぞれトリオキナーゼ、ウサ
ギ骨格筋のグリセロールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤ
Ｐを用いて同様に操作したところ、実施例１と同様の結
果を得た。
実施例３ 実施例１における硫酸マグネシウム代えて塩化カルシウ
ム、塩化コバルトまたは塩化マンガンを用いて同様に操
作したところ、いずれも実施例１と同様の結果であった
。
実施例４ 硫酸マグネシウム・７水塩　１　、０４ｍｇ／　ｍ、ｆ
！、ＮＡＤ　２．Ｏｍｇ／ｍｅおよびＡ　Ｔ　Ｐ　　１
．５ｍｇ／　ｒｎＥを含む０．１５Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐｌ！　８．５）　１．９軸ｐとゲオトリカム・カン
ディダムのグリセロールデヒドロゲナーゼ７５ｕ／ｍｃ
およびジヒドロキシアセトンキナーゼ２５ｕ／フｎ！を
含む０．０２Ｍ　＋−リス塩酸緩衝液（ｐｔ＋　７．５
）　０．０２＋＋＋ｎを試験管に入れて混合し、３７℃
で３分間保持した。その後試料としてトリオレイン換算
７５〜９００ｍｇ／ａの既知濃度のグリセロール溶液０
．０２７を添加して２０分間反応させ、３４０ｎｍにお
ける吸光度の増加を測定した。なお比較のためジヒドロ
キシアセ１〜ンキナーゼを除いた系についても同様に操
作した。
結果は、第４図に示すように本発明法ではグリセロール
デヒドロゲナーゼの反応が終点まで達することにより少
なくとも９００ｍｇ／　ｄｌまでは検量線は直線であり
、感度良く測定できることがわかる。
一方比較例では反応性が低くて、感度が悪く、検量線は
直線性を示さない。
実施例５　　トリグリセライドの測定 試料にリパーゼ（リポプロティンリパーゼ）を作用させ
て含有するトリグリセライドを加水分解し、住じたグリ
セロールを測定することによりトリグリセライドの測定
を行った。即ち、リポプロティンリパーゼ（大野製薬社
製）　５００ｕ／＋＋＋ｅ、硫酸マグネシウム・７水塩
　１．０４ｍｇ／ｍ、ＮＡＤ２．Ｏｍｇ／ｍｅ、　ＡＴ
Ｐ　　１’、５ｍｇ／ｎ＋ＥおよびトリトンＸ−１００
０，１％を含む０．１５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）０．９６ｍｎと血清試料０．０２ｍＪ！を混合し３
７°Ｃで５分間保持したのち、ゲオトリカム・カンディ
ダムのグリセロールデヒドロゲナーゼ８．７５ｕ／ｍｆ
およびジヒドロキシアセトンキナーゼ２５ｕ／ｍｅを含
む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　０．０
２ｍｆｆを添加して反応させ、３４０ｎｍにおける吸光
度の１分間当りの増加を測定した。別に、既知濃度のト
リグリセライドを含む標準血清を試料として上記と同様
に操作して得た検量線と上記測定値を対比して前記血清
試料中のトリグリセライドを求めた。検量線を第５図に
示す。
なお、公知のトリグリセライドの測定試薬であるＴＧキ
ット−Ｋ（日本商事社製、リボプロテインリバーセ、グ
リセロールキナーゼ、グリセロール３−リン酸オキシダ
ーゼを含む）を用いた方法と本発明法との血清試料測定
結果の関係をみたところ、第６図に示すように極めて有
意な相関が認められた。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明によるグリセロールの測定における反応
時間と吸光度の関係を表す図であり、第２図はその比較
例を表す図である。第３図および第４図は本発明による
グリセロールの測定の検量線を表す図である。第５図は
本発明を利用したトリグリセライドの測定の検量線を表
す図であり、第６図はそれによる血清試料中のトリグリ
セライドの測定値と公知法による測定値との相関を表す
図である。 特許出願人　天野製薬株式会社 第１図 ０　　　　　　１’　　　　　２　　　　　３　　　　
　４反応時間（分） 第　２　図 ０　　　　　　　１　　　　　　２　　　　　　３　　
　　　　　４反応時間（分） 第３図 ０　　　　　　　　　　５００　　　　　　　　１００
０クリセロール（トリオレイン換ａ、ｍｇ／ｄｉ）第　
４　図 ０　　　　２００　　　　４００、　　５００　　　８
００クリセロール（トリオレイン換算＋　ｍ　ｇ　／（
１’　ｉ　）第５図 ■ ０　　　　　２００−ゝ　　　４００　　　６００　　
　８００１−リグリセライド（トリオレイン換算１ｍｇ
／ｄｌ）０　　　　　２００　　　　４００　　　　６
００　　　　８００公知法（ｍｇ／ｄｉ’） 手　続　禎　正　＠（自発） 昭和５９年５月９日 特許庁長官　　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第７０７３０列・ ２、発明の名称 グリセロールの測定法および測定組成物３、補正をする
壱 事件との関係　　特許用１頭人 住所　愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号５、補正の
対象 明細書の発明の’ａｌｌ′：Ｉｌｌな説明の柵６６ネｉ
ｌｉ正の内容 （１）明細書第３頁第８行目の「測定法」の後に「およ
び測定組成物」を挿入します。 （２）同第４頁下から第３行目に「従って」とあるを「
また」と補正します。 （３）同第４頁下から第２行目に「長くかかると、とも
に」とあるを「長くかかり、従って」と補正＼します。 （４）同第７頁第１行目に「考えられている。。」とあ
るを１考えられている。」と補正します。 （５）同第８頁第１５行目の「見いだした」を削除しま
す。 （６）同第８頁第１６行目に「菌株の産生ずる」とある
を「保存菌株の中に見いだした」と補正しまず。 （７）同第１３頁第１行目の「補酵素として」の後に「
グリセロールより」を挿入し、ます。 （８）−同第１４頁第１５行目に１なともの方法」とあ
るを「などの方法」と補正しまず。 （９）同第１５頁第４行目の「場合には」の後に［反応
液中の濃度が」を挿入します。 （１０）同第１５頁第６行目にｒ　Ｏ，５ｕ／１正以上
」とあるを「０．５〜５０ｕ／ｍβ」と補正します。 （１１）同第１５頁第８行目に「０．１　’ｕ／ｍβ以
上」とあるを「０．１〜１００ｕ／ｍｅＪと補正しまず
。 （■２）同第１９頁第１２〜１３行目、第２０頁第１５
行目、第２１頁第５〜６行目、および第２２頁第１０行
目に「ＮΔＤ」とあるをｒＮＡＤ”Ｊと袖正します。 り１３）同第２０頁第１７行目にｒＮＡＤＰＪとあるを
ｒＮＡＤＰ＋Ｊと禎正しまず。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １　グリセロールデヒドロゲナーゼを用いたグリセロー
    ルの測定において、ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グ
    リセルアルデヒドをリン酸化する酵素を用いることを特
    徴とするグリセロールの測定法。 ２　ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルアルデヒ
    ドをリン酸化する酵素がトリオキナーゼまたはジヒドロ
    キシアセトンキナーゼである特許請求の範囲第１項記載
    のグリセロールの測定法。 ３　グリセロールがトリグリセライドの加水分解に由来
    するものである特許請求の範囲第１項記載のグリセロー
    ルの測定法。 ４　ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルアルデヒ
    ドをリン酸化する酵素、グリセロールデヒドロゲナーゼ
    、ピリジンヌクレオチド補酵素およびリン酸供与体を含
    んで成るグリセロール測定組成物。 ５　ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセルアルデヒ
    ドをリン酸化する酵素がトリオキナーゼまたはジヒドロ
    キシアセトンキナーゼである特許請求の範囲第４項記載
    のグリセロール測定組成物。 ６　ピリジンヌクレオチド補酵素がニコチンアミドアデ
    ニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチドリン酸である特許請求の範囲第４項記載のグ
    リセロール測定組成物。 ７　リン酸供与体がアデノシン５′−三リン酸である特
    許請求の範囲第４項記載のグリセロール測定組成物。 ８　前記組成物がさらに二価金属イオンを含む特許請求
    の範囲第４項記載のグリセロール測定組成物。 ９　二価金属イオンがマグネシウム、カルシウム、コバ
    ルトまたはマンガンである特許請求の範囲第８項記載の
    グリセロール測定組成物。 １０　　前記組成物がさらに緩衝液を含む特許請求の範
    囲第４項記載のグリセロール測定組成物。
JP58070730A 1983-04-21 1983-04-21 グリセロ−ルの測定法および測定組成物 Granted JPS59196100A (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP58070730A JPS59196100A (ja) 1983-04-21 1983-04-21 グリセロ−ルの測定法および測定組成物
US06/601,252 US4636465A (en) 1983-04-21 1984-04-17 Method and composition for determination of glycerol
DE8484302642T DE3468124D1 (en) 1983-04-21 1984-04-18 Method and composition for determination of glycerol
EP84302642A EP0123511B1 (en) 1983-04-21 1984-04-18 Method and composition for determination of glycerol

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP58070730A JPS59196100A (ja) 1983-04-21 1983-04-21 グリセロ−ルの測定法および測定組成物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS59196100A true JPS59196100A (ja) 1984-11-07
JPH0422560B2 JPH0422560B2 (ja) 1992-04-17

Family

ID=13439940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP58070730A Granted JPS59196100A (ja) 1983-04-21 1983-04-21 グリセロ−ルの測定法および測定組成物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US4636465A (ja)
EP (1) EP0123511B1 (ja)
JP (1) JPS59196100A (ja)
DE (1) DE3468124D1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3041840B2 (ja) * 1992-02-24 2000-05-15 東洋紡績株式会社 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途
US6743579B1 (en) * 1999-10-22 2004-06-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Glycerol as a predictor of glucose tolerance
AU1220401A (en) * 1999-10-22 2001-05-08 Complexe Hospitalier De La Sagamie Glycerol as a predictor of glucose tolerance
WO2002086230A1 (en) * 2001-04-20 2002-10-31 Enzymatic Deinking Technologies, Llc Rapid triglyceride assay for use in pulp pitch control

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3703591A (en) * 1970-12-16 1972-11-21 Calbiochem Triglyceride hydrolysis and assay
GB2021594B (en) * 1978-05-22 1982-10-20 Atkinson A Glycerol dehydrogenase
DE2831580C2 (de) * 1978-07-18 1980-09-18 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin
US4242446A (en) * 1978-07-26 1980-12-30 Coulter Electronics, Inc. Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method

Also Published As

Publication number Publication date
EP0123511A3 (en) 1986-02-12
US4636465A (en) 1987-01-13
EP0123511A2 (en) 1984-10-31
DE3468124D1 (en) 1988-01-28
JPH0422560B2 (ja) 1992-04-17
EP0123511B1 (en) 1987-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0012446B1 (en) Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid
JPS61280272A (ja) ウリカ−ゼおよびその製造法
US5871949A (en) Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay
Carlsson et al. Characteristics of a hydrogen peroxide‐forming pyruvate oxidase from Streptococcus sanguis
Poels et al. NAD (P)+‐independent aldehyde dehydrogenase from Pseudomonas testosteroni: A novel type of molybdenum‐containing hydroxylase
US4341868A (en) Method and test composition for the determination of the substrate for xanthine oxidase
FR2508487A1 (fr) Procede de dosage pour composant apparente aux lipides, composition pour dosage et procede de production d'enzyme utilisee a cet effet
EP0016845B1 (en) Method and test composition for the determination of a substrate for xanthine-oxidase, including a novel xanthine-oxidase and method for the preparation thereof
JPS6122952B2 (ja)
FR2545504A1 (fr) Procede de titrage utilisant la nad-synthetase et procede de production de l'enzyme
Satomura et al. Dye-linked D-amino acid dehydrogenase from the thermophilic bacterium Rhodothermus marinus JCM9785: characteristics and role in trans-4-hydroxy-L-proline catabolism
JP2017158441A (ja) カタラーゼ
JPH0422560B2 (ja)
JPS63245672A (ja) 新規なモノグリセリドリパ−ゼ、その製法およびそれを用いる分析法
US5614374A (en) Glycerol dehydrogenase, process for its production and its use
JP7571418B2 (ja) カタラーゼ
JP2647684B2 (ja) トリグリセリドの分析用試薬および分析方法
JP5470906B2 (ja) カタラーゼ
JP7433238B2 (ja) 酵素的測定方法及び酵素的測定用試薬
Boontim et al. Purification and characterization of D-glucose dehydrogenase from Bacillus thuringiensis M15
Shimizu et al. Specific measurement of putrescine with putrescine oxidase and aminobutyraldehyde dehydrogenase
US5744342A (en) Protein having heat-resistant malate dehydrogenase activity
JP3852991B2 (ja) １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、その製造法および用途
Bryant Characterization of the fructose 1, 6-bisphosphate-activated, L (+)-lactate dehydrogenase from Thermoanaerobacter ethanolicus
JP3586485B2 (ja) ピルビン酸の定量方法およびその定量用試薬