JPS59208462A - キモパパインの分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はキモパパインに対するアレルギー性過敏症の確
定に関するものである。更に詳しくは、本発明は患者の
血清中のキモパパイン特異性Ｔ。

Ｅ抗体の存在と相対濃度を確定するための方法及び試薬
に関するものである。

椎間板ヘルニアの非外科的治療のための蛋白分解酵素キ
モパパインの商業的な流通及び注射は、最近規制的な認
可が得られ、従来の椎間板手術に代るこの方法の使用が
急速に増大しつつある。しかしながら、キモパパインを
注射した多くの患者が軽度の輯麻疹から循環の内税及び
死亡にわたる、アナフィラキシ−の過敏症を示している
。椎間板中への高濃度の酵素の注射は、アレネギ−反応
を著るしく強めて致命的な反応を生じさせるおそれがあ
る。キモパパインに対するアレルギー性過敏症は、今日
、恐らくはたとえばパパイヤ、パイナツプルのような食
品、及び特に熱帯地方の果物ジュース中のキモパパイン
の頻繁な摂取のために、全人口の１パーセントに達する
ほど多く存在するものと思われる。それ故、過敏性ショ
ックは、この新しい治療法に付随する主要な重大な危険
である。

患者の血清中のアレルゲン特異性［Ｅ１１度を確認し且
つ測定するための放射測定及び螢光光度的方法は、商業
的に行なわれており、たとえばＲＡＳＴ試験として公知
である。米国特許第ＲＥ−２９４７４号：３５５５１４
３＠；３６８４３４６号；３７２０７６０号及び３９６
６８９８号は、これらの方法及びそのための試薬に関す
るものである。液体中の抗原と抗体を確認し且つ定量す
るための酵素免疫学的方法は広く用いられており、たと
えばＥＬＩＳＡ及びＥｒＡ試験として公知である。酵素
検定及びそのための試薬に対しての基礎的な技術は、た
とえば米国特許ＲＥ−２９１６９号及び３８３９１５３
号に開示されている。

５− 溶液中の蛋白質の検出のための免疫学的検定に関する技
術の現状についての総説は、Ｒ，ローズ（Ｒｏｓｅ）ら
、臨床免疫学便賢、第２版、米国微生物学会、ワシント
ン、３２７〜４２９頁、７７５〜８４９頁（１９８０）
及びＡ、ボラ−（Ｖｏｌｌｅｒ　）ら、”　８０年代の
免疫検定法′°、ユニバージティー　パーク　プレス、
ボルチモア（１９８１）、並びにそれらの中の引用文献
によって提供されるが、両出版物の全内容を参考のため
にここに編入せしめる。その中のＴ、Ａ、Ｅ。

ブラッツーミルス（Ｐ　Ｉａｔｔｓ−Ｍ　１ｌｌｓ）ら
による章、“′アレルギーにおける放射線免疫検定”、
２８９〜３１１頁及びその中の引用文献は、本発明の分
野の包括的な総説を提供する。

蛋白質を不溶性担体に結合させるための手順が、主とし
て記されている。抗体の不溶性担体への共有結合は米国
特許第３５５１５５５号、３５５３３１０号、４０４８
２９８号及びＲＥ−２９４７４号中に記されている。吸
着によるポリスチレン６− への抗体の結合は、たとえば、米国特許第３６４６３４
６号及び４０９２４０８号中に記されている。アレルゲ
ンは米国特許第３７２０７６０号に記すように、梗々の
不溶性担体に共有結合されている。

ポリエチレングリコールはＡ、ボールソン（Ｐｏ１ｓｏ
ｎ　）ら、３　ｉｏｃｈｉｍ、３１ｏｐｈｙｓ、　Ａｃ
ｔａ。

第８２巻、４６３〜４７５頁（１９６４）及びＡ。

ボールソンら、ＶＯＸ　　５ａｎ（］　、第２３巻、１
０７〜１１８頁（１９７２）に記されているように、蛋
白質分画工程において用いられている。

ＲＡＳＴ試験に類似する固相放射線免疫検定は、キモパ
パインを注射すべき患者におけるアナフィラキシ−反応
を予知するための試みにおいて開発されたものであって
、この試験の評価はＡ、カブ＋ｊ−’）ス（Ｋａｐｓａ
ｌｉｓ　）ら、ＣＩｉｎ、　　Ｅ　ＸＩ）、　　Ｉ　ｍ
ｍ　−ｕｎｏｌ、　３３．１５０〜１５８　（１９７８
）によって記されている。１２６３人の患者の血清から
集めたデータが報告された。それらの中、１２大の患者
がキモパパインの注射に反応した。１２人中７人（５８
，３パーセント）が、血清０．２１当り０．９ｎｇの基
準を用いて、放射線免疫検定により検査陽性であること
が認められた。この低い割合は、信頼性のある感度の水
準ではなかった。陽性の結果に対する基準の０．２１当
り０．８ｎｏへの低下は、陽性の検査を６７パーセント
に増大させるが、疑似陽性の結果を８．４パーセントに
増大させた。さらに１人の患者が公的に除外されたが、
４９人の追加の患者が、疑似陽性の結果のために、不必
要に除外された。アナフィラキシ−ショックに伴なうき
わめて重大な危険のために、感度の低いＲＡＳＴ試験法
は、実用のための最低必要条件に合致しない。

本発明は面清試料中のキモパパイン特異性ｌ１ｌＥの確
認及びその相対濃度の定量のための方法に関するもので
ある。本発明は、アレルゲン的に活性なキモパパインが
付着させである不溶性担体を、血清中に存在するキモパ
パイン特異性１ｏＥ抗体との不溶性担体上のキモパパイ
ンの結合を生じさせるために充分な時間にわたって、患
者の血清と接触させるという第一の段階を包含する。結
合後に、血清を不溶性担体から取り除く。

次いで不溶性担体を、不溶性担体上のキモパパインに結
合したＩＯＥ抗体との抗１（ＩＥ抗体の結合を生じさせ
るために充分な時間にわたって、標識付けした抗ＩＯＥ
抗体の溶液と接触させる。この溶液を取り除き、不溶性
担体に結合した、又はそれから取り除いた標識付は抗１
（ＩＥ抗体溶液中の、標識付は抗１１ＪＥ抗体の量を測
定する。

標識付けした抗［Ｅ抗体をフルオロゲン性酵素と抱合さ
せるときは、不溶性担体に結合した酵素標識付けした抗
１ｏＥ抗体の量は、不溶性担体を、フルオロゲン性酵素
の存在において螢光性の化合物を放出する基質と接触さ
せることによって、測定することができる。次いで溶液
中の螢光の量を測定する。キモパパインの酵素活性を、
アレルゲン性の顕著な低下なしに、低下又は封鎖するこ
９− とが好ましい。不溶性担体に対して付着させるキモパパ
インの量は、不溶性担体の表面積Ｃｌｌ１！当り１０ミ
クログラムを超えないことが好ましく、且つ抗ＩＧＥ抗
体は単クローン性抗体であることが好ましい。

本発明の方法は、アレルゲン性キモパパインが付着させ
である不溶性担体を、患者の血清中のキモパパイン特異
性ＩＣＥ抗体とのキモパパインの抱合を生じさせるため
に充分な時間にわたって、患者の血清と接触させ、次い
で担体から患者の血清を取り除くという第一の段階を包
含している。

この手順において、患者の血清は、相持したアレルゲン
との接触の前に、希釈しないことが好ましい。保温時間
は実質的な抱合を生じさせるために充分な時間でなけれ
ばならないが、その時間は温度に依存する。適当な保温
時間は１８〜４０℃の範囲内の温度において３０〜１８
０分であり、好適接触時間は２０〜２６℃の範囲内の温
度において６０〜１２０分である。

１０− 不溶性担体は、アレルゲン性の実質的にすべてを保持し
ているキモパパインがそれに付着していることが肝要で
ある。患者の血清中のキモパパイン特異性Ｉ（ＩＥ抗体
が選択的に結合すべき結合部位は、本質的に不変でなけ
ればならない。キモパパインの酵素活性の抑制はＭ、エ
バタら、Ｂｔｏ−ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ
、　Ｃｏｍｍ、　　９．１７３　（１９６２）；Ｍ、　
エバタら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　３１ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ１１８．２０１　（１９６６）：及びＡ、ホワ
イトら、生化学の原理、マツフグローヒル、ニューヨー
ク、２４０頁（１９７３）に記されている。

キモパパインの酵素活性を取り除くか又は低下させるた
めに適する封鎖剤は、銀、水銀、ヒ素及び鉛の重金属陽
イオン、たとえば、ｐ−メルクリ安息香酸塩及びその他
の水銀剤、ヒ素剤、Ｎ−エチルマレイミド及びリンフッ
素酸ジイソプロピル（ＯＦＦ＞などである。ヨード酢酸
及びブロム酢酸、それらの塩及びエステル、並びにそれ
に相当するアミドが特に有用である。アレルゲン性を変
えることなしに完全な酵素活性の抑制を達成するための
抑制剤の選択及び酵素の処理の特定的な条件は、きわめ
て精密な条件を必要とする。

この反応は適当な極性溶剤中で行なわれるが、好適な溶
剤は水、特にリン酸塩で緩衝した食塩水溶液である。溶
液中のキモパパインに対するヨード酢酸のモル比は１０
〜２００１好ましくは２０〜１００の範囲内である。反
応混合物中の試薬濃度は同様に重要であり、キモパパイ
ン濃度は１当り０．１〜５０＋１１（ｌの範囲内、好ま
しくは１当り０゜５〜５ｗ１ｇの範囲内である。反応混
合物中のヨード酢酸（化合物）１１度は１当り５〜９ミ
クログラムの範囲内であり、１当り１０〜５０ミクログ
ラムの範囲内であることが好ましい。

最適の反応のためには、反応混合物における多くのその
他のパラメータが重要である。ｐＨは４〜９の範囲内で
なければならず、６〜８の範囲内が好ましい。反応は４
〜４０℃、好ましはく４〜２２℃の温度で行なうことが
有利である。反応時間は反応温度に依存し、比較的高い
温度では比較的短かい時間を要する。４〜２２℃の範囲
内の反応に対しては、１〜１６時間の反応時間が好まし
い。しかしながら、究極的な基準は、アレルゲン活性の
維持を伴なう酵素活性の望ましい低下である。

反応に続くキモパパイン誘導体の精製は、たとえば透析
、ゲルｒ過クロマトグラフィー、限外ｒ過及びイオン交
換クロマトグラフィーのような通常の精製方法によって
達成される。これ以上の詳細は本発明と同時に出願した
、キモパパインアレルゲン及び方法（ＡＸ−２６＞と題
する、共願中の特許願第　　　　　号、　　　　　中に
記されているが、この出願の内容をここに参考として編
入せしめる。

キモパパインが付着させである不溶性担体は本発明の重
要な局面である。診断用の担体は固体の水不溶性表面を
有していることが好ましい。表面１３− は広く変えることができる。表面は異なる形態をとるこ
とができ、異なる物理的性質を有することができ、異な
る化学的組成のものとすることができ、且つ組成物、被
覆又は積層物あるいはそれらの組合わせとして、１種以
上の組成から成るものとすることができる。表面は媒体
から識別可能であり且つ通常は媒体から分離可能である
ために、検定溶液中で分離した存在を保持する基部又は
基質として働らく。表面は、キモパパインが表面に無関
係に溶液中を拡散することができないように、表面に結
合したキモパパインを保持するために働ら（。加つるに
、表面はそれに結合させたキモパパインと抱合させる化
合物のための担体として働らく。表面は、それを浸漬す
る液体媒体から識別可能であり、且つ化合物類を担持す
るための別個の基部すなわち土台を提供するという点で
、効果的に非流動性で不連続である。表面は静電的に荷
電し、又は荷電してない状態で存在することができ、当
該１１！識系の操作に対して電荷が多少の利点１４− を提供するような場合には荷電させる。担体の物理的形
態は、フィルム、ビード、容器、管、単−及び多数の壁
を有する板及び帯状物などを含む、使用に便利な如何な
る形態をとることもできる。

固体担体としては広く異なる化合物を使用することがで
きるが、考慮すべき主な点は、キモパパインの表面への
結合及び結合と使用に係わる反応への妨害の欠如という
ことである。天然及び合成の両方の、広い種類の有機及
び無機重合体を固体担体のための材料として使用するこ
とができる。

それらの重合体の例を挙げると、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリブチレン、ポリ〈４−メチル−ブチレン
）、ブチルゴム及びその他の合成ゴム、シリコーンゴム
及びシリコーン樹脂、ポリエステル、ポリアミド、セル
ロース及びセルロース誘導体くたとえば酢酸セルロース
、ニトロセルロースなど）、アクリル酸エステル、メタ
クリル酸エステル、ビニル重合体（たとえばポリ酢酸ビ
ニル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ
化ビニルなど）、ポリスチレン及びスチレングラフト共
重合体、レーヨン、ナイロン、ポリビニルブチレート、
ポリホルムアルデヒドなどがある。不溶性担体として使
用することができるその他の材料はシリカゲル、珪素ウ
ェファ、ガラス、紙、不溶性蛋白質、金属、半金属、金
属酸化物、磁性材料、半導体材料、セルメットなどを包
含する。そのほか、たとえばリボ多糖類のような、ゲル
を形成する物質、珪酸塩、アガロース、ポリアクリルア
ミド、又はデキストラン、ポリアルキレングリコール（
２〜３炭素原子を有するアルキレン）又は界面活性剤、
たとえばリン脂質のような両親媒性化合物、長鎖（１２
〜２４炭素原子）アルキルアンモニウム塩などが含まれ
る。たとえばゼラチンのような蛋白質は、キモパパイン
が酵素的に不活性である限りは使用することができる。

表面は、試薬と表面の間の共有結合が可能であるために
通常は多官能性であるか又は多官能性化することができ
る。表面に存在して結合のために使用することができる
官能基はカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基
、エチレン性不飽和基、水酸基又はメルカプト基などを
包含することができる。種々の表面に広く異なる化合物
を結合するための方法は公知であって、文献、たとえば
、゛固定化酵素″、チバタ　イチロー、ハルステッドプ
レス、ニューヨーク、１９７８及びコートレカザス（Ｃ
ａｕｔｒｅｃａｓａｓ）　、Ｊ　、　Ｂ　ｔｏ、Ｃｈｅ
ｍ、、　２４５．３０５９　（１９７０）中に広く説明
されている。

結合基の長さは結合させる化合物の種類、結合した化合
物と表面の間の距離が結合した化合物の性質に与える影
響、結合した化合物の架橋に対する潜在能力などに依存
して広く変えることができる。結合基は単結合であって
もよいし、あるいは連鎖中に約１２に至るまで、通常は
１０以内の原子を有していてもよい。結合基は脂肪族、
脂環族、芳香族、複素環式、又はそれらの組合わせとす
ることができる。結合基中の原子の総数は水素以外１７
− に約２０以内、通常は約１６以内の原子数であって、そ
の原子は炭素、オキシ又はオキソ、オキソ−カルボニル
及び非オキソ−カルボニルの両方、としての酸素、アミ
ノ又はアミドとしての窒素、あるいはチオ又はチオノと
しての硫黄である。例として挙げることができる基はメ
チレンカルボニル、スクシンイミジル、アルファーハロ
アセチル。

チオメチレン、グリシル又はポリグリシル、スクシンジ
オイル、マレジオイル、グルタルジアルキリデン、メチ
レンフェニルジアゾ及びウレイドを包含する。

本発明の好適な診断用担体は、吸収、吸着、イオン結合
、ファンデルワールス吸着、静電結合、又はその他の非
共有結合、あるいは共有結合によってキモパパインが結
合させである、不透明（好ましくは黒色）ポリスチレン
又はスヂレンー（ビニルモノマー）共重合体である。本
発明の方法に対して特に有利な担体は多数の井戸を有す
るミクロ井戸板又はストリップから成る。井戸表面又は
−１８＝ その中のプラスチックカップ挿入物がキモパパイン担体
を構成することができる。ミクロ井戸板又は井戸挿入物
は、一つの井戸に当てる励起光又はそれに応答して発生
する螢光が、取り巻いている井戸の内容物に達するか又
は影響を及ぼすことがないように、光に対して不透明で
あることが、もっとも有利である。このような系を用い
れば、各井戸を他の井戸には無関係の検査系として使用
することができる。

たとえば、以下の手順によってキモパパインをポリスチ
レンミクロ井戸又はミクロ井戸に対するポリスチレン挿
入カップに、非共有結合によって付着させることができ
る。不溶性担体上のキモパパインの濃度は検査の感度に
対して重要であって、０１当り０．０１〜１０ミクログ
ラムの濃度が適当であり、Ｃｌｌ１ｉ当り０．０５〜０
．５ミクＯグラムの濃度が好適である。

ポリスチレン表面をたとえばメタノールのような洗浄液
で洗浄する。水性の緩衝溶液中のキモパパインを井戸又
は挿入カップ中に入れ、１８〜４０℃で２〜２４１間保
温したのち、取り除く。緩衝溶液の特性は重要であって
、７〜９．４の範囲内のｐＨ１特に７．５〜８．５のＩ
ＩＨを有するリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）が好適である
。溶液中のキモパパイン濃度は１当り０．０００５〜０
゜５１１１ｇ、好ましくはｍｌ当り０．００５〜０．　
１ｍａである。次いで井戸又は挿入カップを乾燥し、ス
クロース又はソルビトール水溶液で洗浄したのち、真空
乾燥する。

キモパパインの酵素活性は、そのアレルゲン性を完全に
保持しながら不活性化することが好ましい。酵素活性の
低下のための工程は、キモパパイン中のアレルゲンのス
ペクトル又はアレルゲンの相対的な割合（アレルゲンプ
ロフィル）を変化させるものであってはならない。これ
らが変化した場合には、注射したキモパパイン処方物に
対するアレルゲン性過敏症を正確に予知し且つ測定する
ための製品の有用性が著るしく害なねれる。アレルギー
反応の危険を完全に見積もるためには、全アレルゲン成
分に関して過敏症を測定することが肝要であって、キモ
パパイン中に存在する複数の成分の中の一つのみに対す
る過敏症を測る検査は、患者の危険を正しく見積もるこ
とができない。

ポリエチレン又はポリスチレン表面をキモパパインで被
覆するための一手順にあては、たとえば、アジドを含有
する緩衝した溶液中でキモパパインを表面に付着させる
。ｍ１当り約０．０００５乃至約０．５１１１１１１の
蛋白質の濃度を有する酵素の溶液は、約０．００５乃至
約０，０１モル濃度のリン酸ナトリウムと約０．０１乃
至約０．１重量％のナトリウムアジドの溶液中の濃厚抽
出物から調製する。

リン酸ナトリウムは溶液を約７．１乃至約９．５のｐＨ
に緩衝する。次いでこの溶液を重合体表面上に塗布して
、室温で６〜７２ＦＲ間、好ましくは１２〜４８時間保
温する。次いでこれらの被覆した表面を、６．９〜８．
４のｐＨを有し且つ約０．０１乃至約０．１重量％のナ
トリウムアジド２１− を含有する約０．００５乃至約０．１モル濃度のリン酸
ナトリウム溶液によって洗浄する。８のｐＨに緩衝した
０、１モルｍ度のトリス−）ＩＣＩ　と０．０２重邑％
のナトリウムアジドの溶液が、保温及び洗浄媒体の両方
に対して好適である。

蛋白質を管又はその伯の装置に対して付加させることに
ついての更に詳細な記述はＣ，Ｍ、リング（Ｌｉｎｇ＞
及びＣ，Ｒ，オバーバイ（Ｏｖｅｒｂｙ　）１１ｚｃ による文献、　　　■で標識付けした抗体による直接的
放射線免疫検定によって解明されるＢ型肝炎抗原の流行
”　、Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｏ
Ｖ、　１０９、Ｎｏ４．１９７２年１０月、中に与えら
れている。

被覆方法を被覆した管に関して説明したけれども、この
被覆方法は、被覆した挿入物、ビーズ、又は井戸と共に
使用するための何らかの装置などの調製に対しても、挿
入物を酵素溶液中に浸漬したのち、残りの手順に従かう
ことによって、利用することができる。

別法として、酵素的に不活性化したキモバパイ２２− ンを、不溶性基質に対して親和性を有する水溶性蛋白質
又は蛋白質類似重合体に対して共有結合させることがで
きる。次いで酵素−重合体生成物を、たとえば吸着又は
吸収のような非共有結合によって、不溶性基質に付着さ
せる。この手順は共通に譲渡された共願中の特許願第４
４４６２２号、１９８２年１１月２６日出願中に記され
ており、その全内容を参考としてここに編入せしめる。

適当な水溶性蛋白質はウシ（ＢＳＡ）　、ヒト（Ｈ８Ａ
）、ウサギ（Ｒ８Ａ）　、ヤギ（ＧＳＡ）、ヒツジ（Ｓ
ＳＡ）、ウマ（ＨＯ８Ａ）などの内情アルブミン：上記
の動物の内情ガンマグロブリン；及び、たとえばオヴア
ルブミン、フィブリノゲン、トロンビン、トランスフェ
リン、糖蛋白質などのような、その他の動物蛋白質を包
含する。適当な水溶性アミノ酸重合体はポリリシン、ポ
リグルタミン酸、ポリアラニン、ポリヒスチジン、ポリ
メチオニン、ポリプロリンなどを包含する。酵素は、通
常のカップリング剤を使用する公知の方法によって、水
溶性蛋白質又はアミノ酸重合体に共有結合させることが
できる。

カップリング剤は、たとえば１−エチル−３−（３−Ｎ
、Ｎ−ジメチルアミノプロピル〉カルボジイミド塩酸塩
及び１−シクロへキシル−３（２−モルホリノエチル ｐ−トルエンスルホナート ミドであることが好ましい。その他の適当なカップリン
グ剤は、たとえばアクロレイン、メタクロレイン、又は
２−ブチナールのようにエチレン性不飽和を有するか、
あるいはたとえばグルタルアルデヒド、プロパンジアー
ル又はブタンジアールのような複数のアルデヒド基を有
するアルデヒドカップリング剤を包含する。その他のカ
ップリング剤は、たとえばスペリン酸ジスクシンイミジ
ル、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス−［２−（スクシ
ンイミドキシカルボニロキシ）エチルコスルホン、ジス
クシンイミジル（Ｎ．Ｎ＝−ジセチルホモシスチン、ジ
チオビス（スクシンイミジル　プロピオナート）、エチ
レングリコールビス（スクシンイミジル　スクシナート
）のような２官能性ＮＨＳ−エステル；たとえばＮ−５
−アジド−２−ニトロベンゾイロキシスクシンイミド、
臭化ｐ−アジドフェナシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジル−４−アジドベンゾエート、ｍ−マレイミドベン
ゾイル　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、メチ
ル−４−アジドベンゾイミデート・ＨＣＩ、ｐ−二トロ
フェニル　２−ジアゾ−３。

３、３−トリノルオロプロビナート、Ｎ−スクシンイミ
ジル−６（４′−アジド−２′−二トロフェニルアミノ
）ヘキサノエート、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイ
ミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−アジド−フェニ
ルジチオ）プロピオナート、Ｎ−スクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、Ｎ−（４−
アジドフェニルチオ）フタルアミドのようなへ２５− テロ２官能性試薬；たとえば１．５−ジフルオロ−２．
４ージニトロベンゼン、４，４′−ジフルオＯ−３．３
”−ジニトロジフェニルスルホン、４、４−−ジイソチ
オシアノ−２．２′−ジスルホン酸スチルベン、ｐ−フ
ェニレンジイソチオシアナート、カルボニルごス（Ｌ−
メチオニン　ｐ−ニトロフェニルエステル）、’１．４
”−ジチオビスフェニルアジド、■リトリトールビスカ
ルボナートのようなホモ２官能性試薬；及びたとえばジ
メチルアシビミデート・２ＨＣＩ　、ジメチルスベリミ
デート、ジメチル３．３′−ジチオビスプロピオンイミ
デート・２ＨＣｌ　、２−イミノチオラン・ＨＣＩのよ
うな２官能性イミドエステルを包含する。キモパパイン
の不溶性蛋白質への共有結合は、上記の試薬を用いて、
通常の公知の反応によって、たとえば中性１）Ｈの水溶
液中で、１０℃未満の温度で１８時間又は終夜にわたっ
て行なうことができる。

もう一つの方法においては、先ず担体表面を不２６− 活性蛋白質によって被覆する。この方法をポリスチレン
又はポリエチレン管について説明するが、井戸、ビーズ
などに対しても同様に適している。

この手順に従って、反応性の底部に不活性蛋白質を付着
させる。゛不活性蛋白質″という用語は、免疫化学的反
応に関与することがなく且つ生物学的物質に悪影響を与
えることがない蛋白質を意味する。使用することができ
る蛋白質は、この技術分野の熟達者には公知である。そ
れらは、たとえば種々の動物種から取得される自消アル
ブミン又はグロブリンのような蛋白質材料を包含し又は
その他の均一な材料とすることができる。特に好適なも
のは入手が容易であるという理由でウシのガンマグロブ
リン及びゼラチンでる。使用する蛋白質材料は、その使
用によって本質的に連続的な表面を取得することができ
るために充分に均質でなければならない。このような表
面は上記の蛋白質を用いて容易に取得することができる
。次いで酵素的に不活性なキモパパインを不活性蛋白質
に結合させる。

さらに詳細には、プラスチック表面（ａ）吸着によって
表面を吸着条件下に不活性な蛋白質で被覆し、（１））
酵素抽出物を不活性蛋白質被覆に付着させ、（Ｃ）結合
した部分を安定剤によって処理して酵素抽出物を変性に
対して安定化し、且つ（ｄ　）酵素のアレルゲン活性を
実質的に低下させない乾燥条件下に反応性部分を乾燥す
ることから成る方法によって処理する。

最高の結果を与えるために必要な不活性蛋白質の吊は、
その不活性蛋白質及び表面の本質に依存する。この量は
この分野の熟練者によって容易に決定することができる
。一般には、蛋白質の薄いフィルム（たとえば、少なく
とも１層の分子の厚さ）を表面に付加する。一般に、こ
れは生物学的に活性な物質を付加させることができる均
一な被覆を達成するために充分な量である。

このようにして増大した電気的な吸引力と増大した吸着
を提供する陰電荷をそれらに与える。塩基は表面を清浄
にするためにも役立つ。別の局面においては、表面上の
電荷の分布を、付着させるべき不活性蛋白質のものとほ
ぼ等しくすることが有利である。これは、被覆以前に、
不活性蛋白質を含有する被覆溶液とほぼ同一のｐＨを有
する干渉剤水溶液で表面を洗浄することによって行なわ
れる。

酵素的に不活性なキモパパインは、任意の適当な手段に
よって付加させることができる。公知のこのような適当
な手段は、吸着、共有結合、イオン結合及び閉じ込めを
包含する。酵素を不活性蛋白質に共有結合させるための
方法は、米国特許第３５５３３１０号及び３６３９５５
８号中に開示されており、参考のためにそれらをここに
編入せしめる。不活性蛋白質に対して共有結合させるた
めの好適方法は、先ず蛋白質をアルデヒドカップリング
剤によって処理し、次いでアルデヒドを不活性蛋白質と
酵素の両方に共有結合させることができる条件下に、酵
素を加えることから成る。適２９− 当なアルデヒドカップリング剤は、エチレン性不飽和又
は複数のアルデヒド基のどちらか又は両者を有するもの
、たとえばアクロレイン、メタクロレイン及び２−ブタ
ノールである。たとえばグルタルアルデヒド、プロパン
ジアール及びブタンジアールのようなジアルデヒドを用
いる・こともできる。

これらのアルデヒドの一つを不活性蛋白質の表面と接触
させるときは、蛋白質は安定化し且つ架橋によって重合
すると共に、アルデヒド活性部分が表面に固定する。こ
れらの部分はカルボニル基となるものと考えられ、それ
らは酵素のアミン基に対して高度に反応性であるために
、それらは蛋白質粒子と酵素の間に共有結合を形成する
。

アルデヒド又はエチレン性不飽和カップリング手法もま
た、酵素を第一アミノ基を有する他の表面に共有結合さ
せるために用いることができる。

たとえば、ポリリシン被覆したポリスチレンはグルタル
アルデヒドによって酵素に結合させること３０− ができる。

アルデセドの代りに、たとえば２以上の下記の反応性基
を有する化合物のようなその他のカップリング部分を用
いることもできる：アゾ、スルホン酸又はニトロ基によ
って活性化したフルオロ基、アジド、イミン又は適当な
共鳴構造を有する環に結合させた反応性クロロ基。これ
らの反応性の基は不活性蛋白質及びそれに結合させた酵
素を構成する物質中の第一アミノ、スルフィルヒドリル
、カルボキシル、ヒドロキシル及びフェノール基と反応
することができる。

このようなカップリング剤の代表的な例はビスジアゾベ
ンザジン、ジスルホン酸、テトラアゾ−ｐ−フェニレン
ジアミン、ジフルオロジニトロベンゼン、ジフルオロジ
ニトロフェニルスルホン、カルボジイミド、トルエンジ
イソシアナート、塩化シアヌル、ジクロロトリアジン、
過塩素！！！　Ｎ　−１−ブチル−５−メチルイソオキ
サゾリウムである。使用することができるカルボジイミ
ドはＮ。

Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド ル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩、及び１−シクロへキシル−３（２−モルホリニ
ル（４）−エチルカルボイミドチル−ｐ−トルエンスル
ホナートである。

あるいは、キモパパインを米国特許第３５５１５５５号
に記す手順に従って、吸着によって、付加することがで
きる。たとえばポリエーテルイソシアナート被Ｎ（ハイ
ポ−ルー２０００１Ｗ．Ｒ。

ブレース　エンド　カンパニー、レキシントン、マサチ
ューセッツ）によって提供されるもののようなイソシア
ナート結合によって酵素に対して結合する材料で固体担
体表面を被覆することもできる。

ガラス表面に試薬を結合させるための手順は公知であっ
て、たとえば米国特許第４２８０９９２号に記されてい
る。酵素をガラスに結合させるために用いる方法は限定
的ではない。つや消しのガラスが好適である。酵素的に
不活性化したキモパパインは物理的又は化学的な方法に
よってガラス表面に結合させることができる。多量の酵
素をガラスに強固に且つ永久的結合させることを望む場
合には後者が好適である。

物理的方法による結合は主として物理的な吸着（ファン
デルワールス吸着）によって達成することができる。す
なわち、ガラスを不活性化した酵素の溶液中に浸漬し、
且つ物理的な結合を形成させるために適切な時間にねた
つで、保温又は放置すればよい。溶液は一般にリットル
当り０．０１〜４００１３，好ましくはリットル当り０
．１〜１。

０ｇの濃度を有することができる。浸漬処理は、たとえ
ば、０〜４５℃の温度で１〜４８時間にわたって行なえ
ばよい。

適当な化学的方法としては、シランカップリング剤及び
、必要ならば、架橋剤の助けをかりて、ガラス表面、好
ましくはつや消しガラスの表面に結合させることができ
る。分子中にガラスと反応する官能基及び酵素及び／又
は架橋剤と反応する３３− 官能基の両者を有しているシランカップリング剤を用い
ればよい。ガラスと反応する適当な官能基の例は、ガラ
スのシラノール基と反応するものを包含し、たとえば、
アルコキシシリル基（たとえばメトキシ又はエトキシ置
換したシリル基）などを包含する。酵素及び／又は架橋
剤と反応する適当な官能基の例は、アミノ、カつレボキ
シル及び／又はチオール基と反応するものであり、たと
えば、カルボキシル、エポキシ、ハロアルキル（たとえ
ばクロロエチル及びクロロプロピル）、アルデヒド、第
一アミノ及び第ニアミノ、チオール、イソシアナート、
カルボキシレート、イミノ及びニトリル（又はシアノ基
）などを包含する。さらに特定的には、アミノ基と反応
する適当な官能基の例は、カルボキシル、エポキシ、ハ
ロアルキル及びアルデヒド基である。カルボキシル基と
反応する適当な官能基は、たとえば、第−及び第ニアミ
ノ、並びにエポキシを包含する。チオール基と反応する
適当な官能基はチオール、エポキシ、ハロアル３４− キル及びアルデヒド基などを包含する。

キモパパインをガラスに結合する際には、架橋剤を用い
又は用いずに、シランカップリング剤を使用すればよい
。架橋剤はシランカップリング剤の稜類に従って選べば
よい。シランカップリング剤と酵素を架橋することがで
きる任意の架橋剤を用いることができる。そのような架
橋剤としては、シランカップリング剤のアミノ、カルボ
キシル又はチオール基を免疫学的に活性な物質のアミノ
、カルボキシル又はチオール基と架橋することができる
化合物、たとえばチオール基同志の間、又はアミノ基と
チオール基の間の架橋を生じさせることができる化合物
を挙げることができる。アミノ基同士を架橋することが
できる適当な化合物の例は脂肪族ジアルデヒド（たとえ
ばグリオキサール、マロンアルデヒド、スクシンアルデ
ヒド、グルタルアルデヒド）及びジクロロトリアジン（
たとえば２−アミノ−４，６−ジクロロ−ｓ−トリアジ
ン）などである。チオール基同士の間の適当な架橋剤は
、たとえば、シマレイミド化合物〈たとえばＮ、Ｎ′−
０−フェニレンジマレイミド、Ｎ。

Ｎ′−ｍ−フェニレンジマレ１゛ミド）である。アミノ
基とチオール基の間の適当な架橋剤は、たとえばマレイ
ミドカルボキシル− クシンイミドエステル（たとえばｍ−マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、及び４
−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキ
シル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）である
。

キモパパインに対する固体担体として本発明の方法にお
いて有用な吸着剤を以下に示す：吸着剤及び吸収剤 非イオン性セルロース たとえば、ウオットマン（クリ７トン、ニュージャージ
、米国）品種− ＣＩ−１■、長繊維粉末 ＣＦ−１１■、中繊維粉末 ＣＣ−４１■、微粒状粉末 たとえば、ビオ−ラッド（リッチモンド、カリホルニア
、米国）品種− セレックス■Ｎ−１、粉末 セレックス■４１０１粉末 シリカゲル たとえば、ウォットマン品種−ＳＧ８　１　、充填紙；
又はビオ−ラッド 品種−ビオー２，、■Ａ又，よ．オー、、、■ＨＡヒド
ロロキシルアバタイト（ビオ−ラッド）アルミナ；酸性
、塩基性又は中性品種（どオーラッド） アルミナＣ−ガンマ　ゲル（ビオ−ラッド）リン酸カル
シウム ヒドロキシプロピル　デキストラン たとえば、フーーマシア（ピスカタウエー、ニューシャ
ーシー、米国） 品種−セファデックス　ＬＨ２０ デキストラン（ファーマシア） ３７− 硫酸デキストラン（ファーマシア） アルキルアガロース たとえば、ファーマシア品種ーオクチルーセファロース
■Ｃ１−４Ｂ又は フェニル−セフアローズ■Ｃ１−４Ｂ たとえば、マイルス　リサーチ　プロダクツ〈エルカー
ルト、インジアナ、米国〉 品種−オメガ−アルキル　アガロース レクチン−アガロース（マイルス　リサーチ　プロダク
ツ） ポリ−しーリシン　アガロース〈マイルス　リサーチ　
プロダクツ） プラスチックス、たとえばポリスチレン、ポリエチレン
及びポリプロピレン 陰イオン交換物質 ジエチルアミノエチル（ＣＥＡＥ）セルロースたとえば
、ウオットマン　品種− ＤＥ−１■、フロック ３８− ＤＥ−２２０、繊維質 ＤＥ−２３０、繊維質 ＤＥ−３２■、乾燥、微粒状 ＤＥ５２９湿潤、微粒状 ＤＥ−８″Ｐ、紙 たとえば、ビオ−ラッド品種−セレックス■Ｄ、繊維質 ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）アガロースたとえば
、ビオ−ラッド品種−ＤＥＡＥビオゲル■Ａ ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランたとえ
ば、ファーマシア品種−ＤＥＡＥセファデックス■、ビ
ード アミノヘキシル−セファロ−ａ　４　Ｂ　＜ファーマシ
ア） エクテオラセルロース たとえば、ウォットマン品種− ＥＴ−１１■、粉末 ＥＴ−４１■、粉末（高純度） ＥＴ−８１■、紙 たとえば、ビオ−ラッド品種−セレックス■Ｅ、繊維質 トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）セルロースたとえ
ば、ビオ−ラッド品種−セレックス■Ｔ、繊維質 ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）−アミノ（ＱＡ
Ｅ）セルロース えよえ。よ、１オー５ツ、品種−ｔ？Ｌ／ッ、、、０６
ＡＥ、繊維質 ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）−アミノ（ＱＡ
Ｅ）−デキストラン たとえば、ファーマシア品種−〇ＡＥ−セファデック迎 ベンゾイル化ジエチルアミンエチルセルロースたとえば
、ビオ−ラッド品種−セレックス■ＢＤ、繊維質 陽イオン交換物質 リン酸セルロース たとえば、ウオットマン品種− ■ Ｐ−１、フロック Ｐ−１１■、粉末 Ｐ−４１■、粉末（高純度） Ｐ−８１０、紙 カルボキシメチルセルロース たとえば、ウオットマン品種− ＣＭ−１■、フロック ＣＭ−１１０、粉末 ＣＭ−２２■、ｍ紺質 ＣＭ−２３０、繊維質 ＣＭ−３２■、乾燥、微粒状 ＣＭ−５２０、湿潤、微粒状 ＣＭ−８２■、紙 たとえば、ビオ−ラッド品種−セレックス■ＣＭ１繊維
質 カルボキシメチルデキストラン たとば、ファーマシア品種−ＣＭ−セファデックス■ ホスホリルセルロース たとえば、ビオ−ラッド品種−セレックス■Ｐ、ｍｕ質 カルボキシルメチルアガロース △ たとえば、ファーマシア品種−〇Ｈ−セファロース■　
４　Ｂ スルホプロピルデキストラン たとえば、ファーマシア品種−ＳＰ−セファデックス■ キモパパインを種々の粒径の重合体担体粒子に化学的に
カップリングすなわち結合させることによって形成せし
めた試薬は、公知である：たとえば米国特許第３８８２
２２５号：３９５７９３１号：３８２５５２５＠：３６
２９５５８号；３５６５９８７号、３５５３３１０号：
３４０７０７４２− ６号：３２３６７３２号：　３０９６２５０号；４０９
２１１４号：４１４０６６２号：４２１０７２３号；４
２２６７４７号：４２５９３１３号；３０８８８７５号
；３７６６０１３号：３６１９３７１号：３Ｂ０９６１
３号；３８５３９８７号、３９６３４４１号：３５５１
５５５号；及び３６４９３４６号；オランダ特許７２０
１３０８号；及び英国特許第１２５７２６３号。

キモパパインの重合体ビードへの共有結合を所望する場
合は、ビードに対して結合させるべき酵素上のアミノ、
アミド又はスルホンアミド基と反応することができる基
、たとえば、クロロベンジル、クロロアセチル、りＯロ
エチルカルボニル、クロロエチルスルホニル、アクリロ
イル又はビニル−スルホニル基、をビードの生成後にも
維持しているモノマーをビードに対して使用することが
好ましい。

反応性のビード表面基とキモパパインの両者と反応する
２官能性結合基によって、表面基を酵素に結合させるこ
ともできる。

ビーズは通常は、標準的な手順によって１挿以上のビニ
ルモノマーを重合させることにより製造する。重合させ
月つ／又は何らかの割合で相互に及び／又は他の七ツマ
−と共重合させて、望ましいビーズを与えることができ
る適当なビニルモノマーは、モノビニリチン炭素環式モ
ノマー、たとえば、スチレン、アルファーメチルスチレ
ン、ａｒ−（１−ブチル）スチレン、ａｒ−メチルスチ
レン、ａｒ、　ａｒ−ジメチルスチレン、旧゛−クロロ
スチレン、ａｒ−（ｔ−アミル）スチレン、ａｒ−ブロ
モスチレン、ａｒ−フルオロスチレン、ａｒ−シアノス
チレン、ａｒ−メトキシスチレン、ａｒ−エチルスチレ
ン、ａｒ−ヒドロキシメチルスチレン、ａｒ−■トキシ
スチレン、ａｒ−クロロ−ａｒ−メチルスチレン、ａｒ
、　ａｒ−ジクロロスチレン、ａｒ、　ａｒ−ジフルオ
ロスチレン、ビニルナフタレン及び２６以下の炭素原子
を有するその他のかかる乳化重合しうるモノマー：重合
して非成膜性重合体を生じるアルファー、ベーターエチ
レン性不飽和カルボン醸のエステル、たとえば、メタク
リル酸メチル、メタクリル酸クロロメチル、メタクリル
酸ｎ−ブチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸イソ
ブチル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸フェ
ニル、クロロアクリル酸ブチル、クロロアクリル酸シク
ロヘキシル、クロロアクリル酸エチル、クロロアクリル
酸メチル、クロロアクリル酸イソプロピル及び重合させ
て硬質の重合体とすることができるその他のかかるエス
テル；非重合性カルボン酸のアルファ、ベーターエチレ
ン性不飽和エステル、たとえば、安息香酸ビニル、ａｒ
−エチル安息香酸ビニルトルエート、ａｒ−エチル安息
香酸アリル、トリメチル酢酸ビニル、ピバリン酸ビニル
、８９９０口酢酸ビニル及び不飽和部分が２〜１４炭素
原子を有し且つ酸部分が２〜１２炭素原子を有している
その他のかかるモノマー；アルファ、ベーターエチレン
性不飽和ニトリル、たとえば１２以下の炭素原子を有す
るニトリル；塩化ビニル、臭化ビ４５− ニルなどのようなその他の重合性ビニルモノマーを包含
する。

キモパパイン特異性ＩｇＥ抗体の不溶性担体に付着して
いるキモパパインとの抱合後に、それから溶液を取り除
く。過剰の液体を除き、次いで固体表面を、たとえば６
〜８．５のｐＨを有するリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）の
ような適当な洗浄溶液で洗浄する。

本発明の方法の第二の段階は不溶性担体を標識付けした
抗１（ＩＥ抗体と接触させることから成る１不溶性担体
上のキモパパインと抱合した自消ＩｇＥ（存在するなら
ば）が抗１（ＩＥ抗体と抱合を生じるために充分な時間
にわたって保温を続ける。

保温後に、過剰の液体を除いたのち、抱合しない抗体を
除くために第一段階において先に記したような弱溶液で
不溶性担体の表面を洗浄する。

抗■ｇｅ抗体は多くの源泉から入手することができ、そ
れらをＩＮ造するための方法は公知であって先に引用し
たいくつかの特許及び出版物中に記さ４６一 れている。好適な抗体は単クローン性抗体である。

単クローン性抗体を製造するための方法は充分に開発さ
れており、単りローン性抗ＩＤＥ抗体の製造のために適
する手順はり、カッティー（Ｃａｔｔｙ）らによる“ヒ
トの免疫グロブリンに対する単クローン性抗体に特に関
係する免疫検定における抗内情″、煎」巳８０二生Ｊ！
！シ免」え上し定−１１３３〜１５３頁及びその中の引
用文献中に記されており、その全内容をここに参考のた
めに編入せしめる。

抗ＩｏＥ抗体は種々の方法によって標識付けすることが
できる。適当な標識付は部分は、放射性標識、酵素標識
、化学発光標識、螢光性標識、金属及び金属酸化物、電
子スピン標識、などである。

標識部分の測定における感度は、それが発生する信号の
種類、その信号を検出するべき能力、及び単位量の４Ｆ
Ｎ識分子当りに用いうる信号の強度、すなわち、その特
異的活性に依存する。

放射性標識においては、信号は崩壊放射線である。生じ
る放射線の透過性のために、放射性崩壊は容易に検出す
ることができる。新式の計数装置は、きわめて効率的に
ｔｌｉ劃能側測定する。更に、今日標識付けのために用
いられる同位元素によって提供される特定の放射能につ
いて一定の範囲が存在する。

放飼性標識付けした化合物の特定の放射能は、いくつか
の要因に依存する：すなわち、標識付けに用いた同位元
素の半減期、標識の同位元素としての純度及びどの程度
の船の標識を化合物中に導入したかに依存する。多くの
元素の放射性同位元素が抗体試薬の標識付けのために使
用可能である。

各同位元素は、それぞれ独自の半減期を有している。か
くして、単に最適の放射性同位元素を選ぶことによって
、標識付けのための広く異なる固有放射能を用いること
ができる。Ａ表は、いくつかの一般に用いられる同位元
素、その固有放射能及び半減期を示す。

匿−エ袈−」虹 放射性同位元素の性質 純同位元素の 同位元素　　　固有放射能　　　　　半減期ユ１−　モ
ル １４Ｃ６，２５Ｘ　１０工５７２０年 ’Ｈ２，９１ｘ１０今　　　　　　　１２．５年’Ｓ　
　　　　　　１，５　　ｘ１０６　　　　　　　８７日
１′：Ｌ’Ｉ　　　　　　　２．１８　　ｘｌｏＧ　　
　　　　　　６０日３２Ｐ　　　　　　　３，１６　Ｘ
１０６１４，３日１３１１　　　　　　１．６２　ｘ１
０’　　　　　　　８．１口筒Ａ表中に挙げた放射性同
位元素による有機化合物の標識付けに対して使用するこ
とができる方法は公知である。トリチウム標識材は方法
はたとえば米国特許第４３０２４３８号に記されている
。

放射性ヨードによる標識付け、ハンター（ＨＬｌｎｔ−
ｅｒ）ら、Ｎ　ａｔｕｒｅ、　１９４．４９５６　（１
９６２）によって記されたクロラミン−Ｔを用いる方法
によって、直接に達成することができる。

４９− 広く異なる酵素性標識剤を用いることができる３適当な
系の例、カップリング方法及びそれにともなう基質反応
は、たとえば米国特許第４２１４０４８号、４３１２９
４３号及び４３０２４３８号に記されており、それらの
全内容を参考としてここに編入せしめる。

フルオロゲン酵素（その存在で基質が螢光性の生成物を
生じる酵素〉は好適なＩＩ付は物質である。抗原と選択
的に抱合する抗体の能力を害なうことなく抗体に対して
酵素を結合させるための方法は公知である。適当な酵素
及びそれを抗体にカップリングするための方法は、たと
えば米国特許第４１９０４９６号に記されており、その
内容を参考のためにここに編入せしめる。好適なフルオ
ロゲン性酵素及びそれに対応する適当な基質は、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ及びそれに対して適する基質とし
てホモヴアニリン酸又は４−ヒドロキシ−３−メトキシ
−フェニル酢酸、ベーターガラクトシダーゼ及びそれに
適する基質として４−５０− メチルウンベリフェリル−ベーターローガラクトシド、
アルカリ性ホスファターゼ及びそれに適する基質として
リン酸４−メチルウンベリフェリル並びにたとえばリン
酸４−カルボキシウンベリフェリル及びリン酸ウンベリ
フェリル４−カルボキシアルキルエステルなどのような
その他のリン酸ウンベリフェリルである。

抗ＩｏＥ抗体の酵素標識付けのための適当な方法の例は
カルボジイミド、ジアルデヒド及び酵素的に不活性化し
たキモパパインを、たとえば、ＢＳＡのような水溶性蛋
白質に共有結合させるために先に記したような２官能性
カツプリング剤の使用を包含する。

螢光性化合物は抗ＴａＥ抗体は公知の標準的な螢光性物
質から調製することができる。抗体及びその他の蛋白質
は約３１０ｎｍに至るまでの光を吸収するから、螢光部
分は３１０ｎｍよりも高く、通常は３５０ｎｍよりも高
く、好ましくは約４００　ｎｍよりも高い波長で実質的
な吸収を有している。多くの異なる螢光体がストライヤ
ー（Ｓ　ｔｒｕｅｒ　）、３ｃｉｅｎｃｅ、　１６２．
５２６　（１９６８）及びり。

ブランド（１’３　ｒａｎｄ）ら、“構造のための螢光
性プローブ（ＦＩｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　　ｐ　ｒｏｂｅ
　ｆｏｒ　　Ｓ　ｔｒｕｃｔ−ｕｒｅ　）　、Ａｎｎｕ
ａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、４１．８４３〜８６８　（１９７２）によって記
されている。

前記の望ましい性質の多くを有している螢光体の一グル
ープはキサンチン染料であり、それらは３．６−シヒド
ロキシー９−フェニル−キサントヒトロールから誘導さ
れるフルオレセイン並びに３．６−ジアミツー９−フェ
ニルキサントヒトロールから誘導されるレザミツ及びロ
ーダミン類を包含する。ローダミン及びフルオレセイン
は９−〇−カルボキシフェニル基を有しており、９−〇
−カルボキシフェニルキサントヒトロールの誘導体であ
る。これらの化合物は、結合のための部位として又は結
合官能基として用いることができるフェニル基上の置換
基を有するものが市販されている。たとえば、アミノ及
びインチオシアナ−１〜置換したフルオレセイン化合物
を入手しうる。

螢光性化合物の別のグループは、アルファ又はベータ位
、通常はアルファ位にアミノ基を有するナフチルアミン
である。ナフチルアミノ化合物中に含まれるものは１−
ジメチルアミノナフチル−５−スルホナート、１−アニ
リノ−８−ナフタレンスルホナート及び２−１）−トル
インニル−６−ナフタレンスルホナートである。その他
の染料としては３−フェニル−７−イソシアナトクマリ
ン、アクリジン、たとえば９−イソチオシアナトアクリ
ジン及びアクリジンオレンジ；Ｎ−［ｐ−＜２−ベンゾ
オキサシリル）フェニルコマレイミド；ベンゾオキサジ
アゾール、たとえば４−クロロ＝７−ニトＯベンゾー２
−オキサ−１，３−ジアゾール及び７−（ｐ−メトキシ
ベンジルアミノ）−４−二トロベンゾ−２−オキサ−１
，３−ジアゾール：スチルベン類、たとえば４−ジメチ
ルアミノ−４′−イソチオシアナトスチルベン及び４−
５３− ジメチルアミノ−４′−マレイミドスチルベン；Ｎ、Ｎ
′−ジオクタデシクロオキサカルボキシアニンｐ−トル
エンスルホナート；ピレン類、たとえば８−ヒドロキシ
−１，３，６−ピレントリスルホン酸、及び１−ピレン
酪酸、メロシアニン５４０、ローズベンガル、２．４−
ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノン、並びにその他の容
易に入手できる螢光性分子を包含する。これらの染料は
、活性官能基を有しているか、又は容易にこのような官
能基を導入することができる。

結合基は通常は抗体と発色団の間の連鎖中に約１０以内
の原子を有し、さらに一般的には単結合又は連鎖中に約
１〜６原子を有している。抗体は発色団を抗体に共有結
合により抱合させるために用いることができる多くの活
性アミノ基を有している。発色団は、非才キンカルボニ
ル官能性（その窒素及び硫黄類似体をも含む）又は活性
アルファーハロカルボニル官能性を有することが便宜的
である。発色団を抗体に結合させるための官能基５４− は、アシルハライド、混合酸無水物、イミデートアルキ
ルエステル、イソチオシアナート、クロロブロモアセチ
ル又はヨードアセチルなどを包含する。

反応してこの種の適当な螢光性部分を形成する化合物の
例は、たとえば５−ヨードアセタミドフルオレセイン及
びピレンマレイミドのような、スルフヒドリル反応性化
合物；たとえばフルオレセインイソチオシアナート、テ
トラメチルローダミンイソチオシアナート、２−メトキ
シ−２，４−ジフェニル−３−フラノン及びエオシンイ
ソチオシアナート（リン光性生成物を形成する）のよう
な、アミン反応性化合物：たとえばアントロイル、トリ
フォロアセチル混合無水物のようなヒドロキシル反応性
化合物である。

抱合のための条件としては、適度のｐＨにおける水性の
媒体中で０〜４０℃の中庸温度を使用する。発色団の蛋
白質への抱合は、たとえば、ザ（Ｔｈｅ）ら、ｌ　ｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ　、　１８．８６５（１９７０）；セブ
ラ（Ｃｅｌ）ｒａ）ら、Ｊ、Ｉｗ＋ｍｕ−ｎｏｌｏｇｙ
、　９５〜２３０　（１９６５）：ゴールドマン（Ｇｏ
ｌｄＩｌｌａｎ）　、螢光性抗体方ＦＡ”　、７カ７’
ミツクブレス、ニューヨーク（１９６８）によって公知
である。

化学ルミネセンス体及び化学ルミネセンス体−消光体系
として標識付けした抗１（ＩＥ抗体は、たとえば米国特
許第４１０４０２９号；４２２０４５０号及び４２３８
１９５号に記すような公知の方法によって、標準的な標
識物質から製造することができる。

標識付けした抗１（ＩＥ抗体を水溶液中の不溶性担体に
対して加える。溶液は、反応物を保存し且つ抱合反応を
促進するために適当な塩と緩衝剤を含有することが好ま
しい。溶液は、水溶性蛋白質及びたとえばポリオキシエ
チレンソルビタンエステルのような穏和な界面活性剤を
含有する、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）であることが好
ましい。

本明細書中に記した洗浄液を使用することもてきる。

標識付けした抗１ｏＥ抗体溶液中の必須の成分は水溶性
蛋白質である。好適な蛋白質Ｉま動物蛋白質であり、且
つもつとも好適なものはウシの胎児の自消、ゼラチン及
びウシの血清アルブミンである。

本発明の好適溶液は、０．００００５〜０．１、好まし
くは０．０００１〜０．０５のリン酸塩モル濃度及び６
．０〜８．０、好ましく【ま７．２〜７．６のＥＩＨを
有する水性リン酸塩緩衝溶液中の１当り０．１〜５ミク
ログラム、好ましくＩよｍ１当り１〜２ミクログラムの
抗ＩｇＥ抗体から成っている。水溶性蛋白質濃度は０．
１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％である。抗１
０Ｅ溶液中の重要成分は１〜８重量％、好ましくは２〜
６重量％の濃度にある、１０００〜８０００．好ましく
は２０００〜４０００の分子量を有するボ１ノエチレン
グリコールである。ポリエチレング１ノコールは反応の
速度と感度を著るしく増大させる。も５７− う一つの重要な成分は０．００１〜０．５、好ましくは
０．０２〜０．１重量％の濃度にある非イオン界面活性
剤である。適当な非イオン界面活性剤は、たとえば、洗
浄液に関して先に記したものを包含する。好適な界面活
性剤はトリトンＸ−４０５である。界面活性剤は検定に
おいて非特異的な背景螢光信号を顕著に低下させる。

本発明の好適抗１ｏＥ溶液においては、不溶性担体と共
に溶液を保温する時間は、温度に依存する。１８〜４０
℃の温度においては、少なくとも３０〜１８０分の保温
時間を用いることができる。

好適な温度は２０〜２６℃の範囲内であり、このような
温度においては、６０〜１２０分の保温時間を用いるこ
とができる。本発明の何れの段階においても長い保温時
間は工程の効率を低下させる可能性があることは明らか
である。迅速な分析が本発明の目的であるから、なお望
ましい正確度を与える最低の時間が好適である。

次いで固体担体を洗浄して、残留する非抱合標５８− 識付は抗１９Ｅ抗体を除く。前記の洗浄液が適当である
。

本発明の方法の第三の段階は、不溶性担体に結合した又
はそれから除いた溶液中の、標識付けした抗１ｏＥ抗体
の量の測定である。

本発明の好適実施形態において、抗１（ＩＥ抗体をフル
オロゲン酵素によって標識付けし且つ残りの段階をそれ
との抱合により説明する。このような場合には、本発明
の方法の第三の段階は、螢光性化合物を生成させるため
に充分な時間にわたってフルオロゲン酵素の存在で化学
反応を受ける基質の溶液と固体担体とを接触させること
から成っている。適当な基質及びそれと反応させる酵素
は公知であり、たとえば米国特許第４１９０４９０号の
記されている。基質の例は相当するフルオロゲン酵素に
関して先に記したものである。

固体を、１０−１〜１０−カ、好ましくは１０−４〜１
０−５のモル濃度の基質を含有する基質の水溶液と接触
させる。基質溶液中の好適な付加的な試薬及び緩衝剤は
、たとえば、２−アミノ−２−メチル−１−プロパツー
ル緩衝剤及び塩化マグネシウムを包含する。

基質溶液を、螢光性反応生成物を生じさせるために充分
な時間にわたって、不溶性担体と共に保温する。１８〜
４０℃の温度においては、５〜２４０分の保温時間を用
いることができる。２０〜２６℃の範囲内の濃度と、３
０〜９０分の保温時間が好適である。

次いで溶液中の螢光強度を測定する。基質溶液中の螢光
の強度を測定するための装置と方法は、この分野で一般
的に用いられているものである。

螢光の強度は不溶性担体上の酵素濃度の関数であり、一
方、それは患者の血清中のキモパパイン特異性Ｉ（ＩＥ
抗体の量の関数である。螢光強度を既知濃度の各キモパ
パイン特異性１ａＥ抗体を含有する対照溶液を用いてこ
の手順を行なうことによって測定した強度と比較するこ
とにより、相当するキモパパイン特異性１（ＩＦ抗体の
存在と精密な濃度を決定する。適当な螢光光度計はパー
キン−エルマー、アメリカンインストルメントカンパニ
ー、及びターナーデザインスによる螢光光度計である。

゛アレルゲネテイソクス″螢光光度計（アレルゲネティ
ックス、インコーホレーテッド、マウンテンビュー、カ
リホルニア）が好適である。

現在の治療技術は、ヘルニアを起した椎間板を有する患
者の治療に対して、いくつもの選択を医者に提供する。

椎間板ヘルニアを直すために酵素的方法の開発以前に用
いられたもつとも一般的な方法は、外科手術を包含した
。背柱に対する外科的損傷の危険は高く、且つ手術はし
ばしば患者の苦痛の低減に成功しなかった。キモパパイ
ンを用いる酵素治療は椎間板ヘルニアの治療に対してよ
り帰れている。標準的なを髄造影図によってヘルニア状
態を確認した場合に、医者は治療に用いるキモパパイン
組成物に対して患者がアレルギー性過敏症を有している
かどうかを確認しなければならない。キモパパインアレ
ルギーはキモパパイン６１− を含有する食品の摂取に由来するものと考えられる。パ
パイヤ及びパイナツプル、それらから由来する果汁及び
柔らかくした肉は、もっとも疑わしい食物である。歯み
がき、化粧品及び消化を助ける酸類もまた、アレルギー
源であると思われる。

１つ以上のこれらのアレルギー源は大部分の飲食物の部
分であるから、この治療に対する全候補者をアレルギー
性過敏症について検査しなければならない。本発明の方
法は、既知の方法よりも遥かに高い正確度と信頼性のも
とて患者の血清中のキモパパイン特異性ＩｇＥ！１度を
決定することにより、過敏症を検知し且つ定量するため
に用いることができる。

本発明を以下の特定的ではあるが非利限的な実施例によ
って更に例証する。伯のことわりがない限りは、温度は
摂氏で示し、濃度は重量パーセントとして示す。

６２− ンを含有する水性の０．１Ｎリン酸塩緩衝溶液１゜０１
に、６のｐＨを有し且つ７．０重量％のヨード酢酸を含
有する０、０１ｍ１の０．１Ｎリン酸緩衝溶液を加える
。両溶液は共に４°の温度に保つ。

４°で終夜放置したのち、混合物を６から８．０まで段
階的に高めたｐＨを有する０、１Ｎリン酸塩緩衝溶液に
対して透析する。

１１九−１ 実施例１から得た溶液を、０．ＩＮリン酸塩緩衝溶液（
ｐｌ−４８，０）を用いて、０　、０１１１１（＋／１
１１１のキモパパインの最終濃度（０，００１重量％〉
まで１：１００に希釈する。各井戸に対して２゜Ｏミク
ロリットルの溶液を加える。これを終夜（１６時間）放
置したのち溶液を取り除いて、キモパパイン被覆したミ
クロ井戸を取得する。

実施例　３ 実施例２に従って調製した井戸を、０．１Ｎリン酸塩緩
衝溶液（ｐＨ８，０＞を用いて３回洗浄したのち、１０
０ミクロリツトルの血清を井戸に加える。２時間後に血
清を除き、井戸をリン酸塩緩衝溶液で３回洗浄する。

次いでミクロ井戸を、アルカリ性ホスファターゼ抱合し
た、Ｍ、オサリヴアン（Ｑ　′３ｕｌｌｉｖａｎ　）ら
、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　３　ｉｏｃｈｅｍ、　、第１
００巻、１００頁（１９７９）に従って調製した抗ヒト
Ｉ（ＩＥ単ツクローン性抗体１００ミクロリツトルの溶
液と接触させる。単クローン性抗体は、４重量％の４０
００の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ
４０００）、０．０５重量％のトリトンＸ−４０５，２
，５重量％のウシの胎児の血清（ＦＢＳ）及び０．１重
量％のナトリウムアジド防腐剤を含有する０、０１Ｍリ
ン酸塩緩衝食塩溶液（ｐＨ７，２＞中で使用する。アル
カリ性ホスファターゼ抱合抗ヒトＩｕＥ単クローン性抗
体溶液をミクロ井戸から除き、それを前記の緩衝した洗
浄液で３回洗浄する。

次いで０．１２５ｍＭの塩化マグネシウムと０゜１重量
％のナトリウムアジドを含有する脱イオン水中の１．２
５Ｍ２−アミノ−２−メチル−プロパツール（ｐＨ９，
５）中に１０−’Ｍのリン酸４−メチルウンベリフェリ
ルを含有する基質溶液１００ミクロリツトルを加える。

６０分後に、螢光強度を３６５ｎｍにおける励起と４５
０ｎｌｌｌにおける読みを用いて螢光光度計によって読
む。この読みを既知濃度のキモパパイン特異性Ｉ（ＩＥ
を有する対照溶液を用いてこの手順を繰返すことによっ
て測定した強度と比較することにより、患者の血清中の
血清キモパパイン特異性１ａ　Ｅ１度を特徴する 特許出願人　アクソニックス・インコーボレー６５− 第１頁の続き ０発　明　者　マイロン・エイ・ベイグラ−アメリカ合
衆国カリフォルニア 州９４０２２０スアルトスヒルズ。

マニュエラロード１４７８０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、連続する段階： ａ）アレルゲン的に活性なキモパパインが付着させであ
   る不溶性担体を、キモパパイン特異性ＩｇＥ抗体にキモ
   パパインを結合させるに充分な時間、患者の血清と接触
   させそして血清を不溶性担体から取り除き； ｂ）不溶性担体を、不溶性担体に結合させたＩ。 Ｅ抗体に抗１（ＩＥ抗体を結合させるに充分な時間、標
   識付けした抗Ｉ（ＩＥ抗体の溶液と接触させそして溶液
   を不溶性担体から取り除き二次いでＣ）不溶性担体に結
   合した又は不溶性担体から取り除いた溶液中の標識付け
   した抗１０Ｅ抗体を測定する ことから成る、血清試料中のキモパパイン特異性ＩｇＥ
   抗体を決定することによってキモパパイン過敏症を確定
   するための方法。 ２、標識付けした抗１ｑＥ抗体は単クローン性抗体であ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、標識付けした抗１ｏＥ抗体はフルオＯゲン性酵素標
   識と抱合した抗ｒｇＥ抗体である特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ４、標識付けした抗１（ＩＥ抗体は単クローン性抗体で
   ある特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、フルオロゲン性酵素はアルカリ性ホスファターゼで
   ある特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、不溶性担体はｃｍ’当り０．０１〜１０ミクログラ
   ムのキモパパインが付着させであるミクロ井戸表面であ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、標識付けした抗１（ＩＥ抗体の溶液は０．１〜１０
   重量％のウシの胎児の血清である特許請求の範囲第６項
   記載の方法。 ８．０１当り０．０１〜１０ミクログラムのキモパパイ
   ンが付着させである不溶性担体。 ９、不溶性表面はミクロ井戸の表面である特許請求の範
   囲第８項記載の不溶性担体。 １０．ミクロ井戸は不透明重合体から成る特許請求の範
   囲第９項記載の不溶性担体。 １１、不溶性担体はポリスチレン又はスチレン−（ビニ
   ルモノマー）共重合体である特許請求の範囲第８項記載
   の不溶性担体。 １２、キモパパインは不活性化したその酵素性部位を有
   している特許請求の範囲第８項記載の不溶性担体。 １３、キモパパインはヨード酢酸、その塩、１〜６個の
   炭素を有するアルコールから誘導されたそのエステル、
   又はそのアミドによって不活性化されたその酵素部位を
   有している特許請求の範囲第１２項記載の不溶性担体。 １４．０．００００５〜０．１のリン酸塩モル濃度、６
   〜８のｐＨ１０，１〜１０重量％のウシの胎児の血清、
   １〜８重量％のポリエチレングリコール及び０．ＯＯ’
   ｌ〜０．５重量％の非イオン界面活性座を有する水性の
   リン酸塩緩衝溶液中に、ｍ１当りＯ１１ミクログラムの
   単りローン性抗１ａＥ抗体を含有して成る試薬組成物。