JPS59219236A - 遅行性アルフア及びベ−タ糖たん白質を得る方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願人に係るベルギー国特許第７５０．６４１号には
、予め溶菌を受けた微生物菌株の培養物の抽出により遅
行性（ｓｌｏｗ　）α−糖たん白質とβ−糖たん白質と
の混合物を得る方法が記載されている。

この方法によって得られた糖たん白質は、非常に興味あ
る治療学的性質を有する。それらは、相当な抗炎症性と
迅速でしかも非特異的な免疫性とを付与されている。さ
らに、それらは、アレルギーも高熱も発生させない利点
、そして注射時における不都合な現象を何ら起こさせな
い利点を持っている。

これらの遅行性α−及びβ−糖たん白質の構造は、既知
の参照物質の糖たん白質に関して、特に血漿糖たん白質
に関して示される密度勾配下での電気泳動の挙動によっ
て示される。本発明の遅行性α−及びβ−糖たん白質と
は、一定の電気泳動条件下に既知の参照糖たん白質（オ
ロソムコイド）と比較したときにその電気泳動が非常に
遅い糖たん白質であって、血漿のα−及びβ−糖たん白
質と同じ電気泳動の挙動を示すものをいう。なお、血漿
の糖たん白質は、α、α２、β及びγの４種が分離され
ており、電気泳動の挙動も知られている（　Ａｎａｌ、
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５０　（１９５Ｂ　）、ｐ１２
６−１２７を参照）。

これらの物質の化学的性質は、そのヘキソース及びペン
トース含有量のような化学的反応によって；変性セルロ
ース、セファデックスゲル又はモレキュラーシーブのよ
うな選択的クロマトグラフィー試剤を使用する分子量の
近似的同定によって；標準血清アルブミンに関して計算
されたビウレット形成能により評価されるたん白質（Ｐ
ｒｏｔｉｄｉｃ　）画分含有量によって；ヘキソサミン
含有量によって；そしてシアリン酸含有量によって立証
される。

前記の方法で得られる遅行性α−及びβ−糖たん白質の
混合物は、酸に可溶であり且り硫酸アンモニウム溶液に
可溶である遅行性の熱安定性α−及びβ−糖たん白質か
らなるものと定義することができる。

また、この方法によって得られた遅行性α−及びβ−糖
たん白質は、５０〜６０％の間の結合ヘキソース含有量
・を有する。

本発明は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ　）の既知の菌株の培養物より既知の方法
で製造された遅行性α−及びβ−糖たん白質の既知混合
物から遅行性α−及びβ−糖たん白質を精製された形で
得るにあたり、前記の遅行性α−及びβ−糖たん白質の
既知混合物を分子篩の役割をはだす１種又は数種類の１
枚又は数枚の開口規定した膜により水溶液で透析濾過す
ることによって精製し、不活性の又は僅かに活性の両分
を分離し、透析濾過セル内で膜により保持された非常に
純粋な両分を集め、この両分を親水性の重合ゲル上でク
ロマトグラフィーし、固定されなかった両分を集めるこ
とを特徴とする精製された遅行性α−及びβ−糖たん白
質を得る方法を目的とする。

本発明の方法は、遅行性α−及びβ−糖たん白質を非常
に純粋な、したがって非常に活性な形で取得することを
可能にする。また、混合物中で残存し得たたん白質分解
生成物の大部分を除去することを可能にし、その結果最
終生成物を極めて精製された形で取得することを可能に
する。

本発明の方法は、特に次の点によって特徴づけられる。

（１）透析濾過に用いられる膜は網状化された選択的透
過膜であって、好ましくは、商標″Ａｍ　ｉ　ｃ　ｏｎ
ＸＭ　！＋００　”　（米国７ミコンコ一ポレーシヨン
社）として市販されているものである。

（２）　　また、選択的透過膜は、好ましくは、商標”
　ＡＪｎｉｃｏｎ　ＸＭ　５０、ＰＭ３０及びＵＭ　２
　”として市販されているものである。

（３１親水性の重合ゲルは、セファロースゲル６Ｂであ
る。

（４）　　また、親水性の重合ゲルは、セファデックス
ゲルｑ２００である。

本発明の方法によって得られる精製された遅行性α−及
びβ−糖たん白質は、その分子量、結合結合″＋７７２
の比によって ヘキソース含有量及び−え、伯。ｒ 定義される。

本発明の方法に従って得られる非常に純粋な画分は、１
０’　ｄａｌｔｏｎに等しいか又はそれ以上の分子量を
有する糖たん白質からなり、６０〜６５％ヘキソース の間の結合ヘキソースを含有し、７に近い一α白輔の比
を与える。一般に、それは約６２％の結合ヘキソースを
含有する。それにもかかわらず、糖類の割合を標準化す
ることの困難のために、この含及量は、その両分の純度
について結論を導き出すことができないので、６０〜６
５％の間で変化し得る。

本発明の方法により得られた遅行性α−及びβ−糖たん
白質は、生体の非特異的防衛のための抗炎症剤及び刺激
剤として有用である。それらは、特に骨関節感染症、気
管支炎及び細菌感染症の処置に有用である。

それらは、非経口的に、経舌的に、経口的に、直腸経路
で、粘膜経路で又は局所経路で投与するよ５に適合され
た製薬組成物の活性成分として使用することができる。

例えばアンプル又は多回分用薬びん中ＶＣ調剤された注
射可能溶液又は懸濁液、舌下錠、腸溶皮を有する圧縮錠
剤、エーロゾル、噴霧剤、クリーム、軟膏、ローション
、生薬又は丸薬を列挙できる。

有効薬量は、治療指示及び投与方法に大いに依存して変
化する。

下記の例は本発明を例示するものであって、それを制限
するものではない。

ベルギー国特許第７５０．６４１号に記載の方法に従っ
て、選ばれた菌株、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＮＣＴＣ５０５５（又はパスツー
ル研究所寄託４５２１４５号））を適当な培地により発
酵器で培養する。培養が止ったときに、微生物を細菌懸
濁液が安定となるまで８日間溶解（ｌｙｓｉｓ）させる
。

次いで溶解物を濃縮し、そしてこれからメチラールーメ
タノール混合物（４−１）により脂質を除去する。遠心
分離残留物をメタノールで洗浄し、水で溶解し、ホルモ
ールと混合する。この細菌抽出物は、その水溶液のメチ
ラールーメタノール混合物による沈殿及びその沈殿のメ
タノールによる洗浄により最終的に処理される。

（２）細菌抽出物の性質 得られた抽出物は透明であり、水性媒質に可溶である。

それは０．６Ｎ過塩素酸中０１０％（ｐ／ｖ）トリクロ
ル酢酸媒質中で又はｐ）ｉ　＝　７．０及び１５℃で５
．６Ｍ硫酸アンモニウム中で沈殿しない。部分的な沈殿
は、硫酸マンガン又は塩化セチルピリジニウム（Ｃ，Ｐ
、Ｃ，）の溶液を加えることによって得られる。

この細菌抽出物の主要成分を評価したが、それは特にバ
ッチ法によって２６〜３２％の結合中性ヘキソース含有
量及び６．２　、Ｘのα−アミノ窒素を示した。

前記の調製法に従って肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｅｌｌｉａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｎ　ｃ’ｒｃ　５０５５　）の
培養物から出発して得られた２ｇの連行性α−及びβ−
抛たん白質の混合物を４００ｃｃの水に溶解する。この
溶液を、ＡＸＴＩｉｃｏｎ　ＸＭ　　”ｓ　ＯＯで作っ
た膜で閉じた透析セルに入れる。その溶液を僅かな圧力
（０，７バニル）の下に絶えず攪拌しつづける。濾過さ
れた容積を補なうことによって透析のバランスを絶えず
移動させて透析を続ける。このために等容積の蒸留水を
加える。この操作は連続的に行い、そして透析濾過され
た全体の容積が初期の容積の１０倍に等しいか又はそれ
以上となったときに透析濾過操作は終了したものとみな
す。透析Ｅ過セルの残留物を集めてセファロースゲル６
Ｂ上でり四マドグラフィーし、そしてそのセファロース
ゲル６Ｂ上に固定されなかった両分を集めて凍結乾燥さ
せる。

また、透析濾過は、まずＡｒ１１ｉｃｏｎ　ＰＭ　３０
　　で作った膜を入れた透析セル中で、次いでＡｒＦｌ
ｉｃｏｎ　Ｘ５０で作った膜を入れた第二の透析セル中
で、そして最後にＡｌｎ１ｃｏｎ　ＸＭ　　で作った膜
を入れた第三の透析濾過セル中で数回で実施することが
でき、茨いでセファロースゲル６Ｂ上でクロマトグラフ
ィーし、そして排除された両分を凍結乾燥した後、膜に
よる一度の透析濾過により得られた両分と同一の両分を
得る。

このようにして得られた（　Ａｍ１ｃｏｎ　ＸＭ　３０
０の膜に保持され、そしてセファロースゲル６Ｂから量
のものである。これらの巨大分子物質は、前記のベルギ
ー国特許の方法で得られた物質、即ちそれはと純粋でな
い両分よりも高いヘキソース組成を有する。それは一般
に６２９６に近い。他方、α−アミノ窄素含有量は小さ
く（１，６Ｘ）、先に得られた物置の両分の場合よりも
低い。

このようにして得られた運行性α−及びβ−糖たん白質
は、８Ｍ尿素溶液によって又は還元剤溶透析濾過中に分
離された低分子量の分子は、解離剤が除去されると自然
に再会合できる。それにもかかわらず、このようにして
新たに得られた巨大分子は、Ａｒｎ１　ｃｏｎ　Ｘｈｌ
　５００の膜上に保持された遅行性α−及びβ−糖たん
白質と異なり、したがってその遅行性α−及びβ−糖た
ん白質にいくつかの酵素（プロナーゼ、トリプシン、パ
ンクレアチン、ヒアルロニダーゼ）を作用させ、続いて
膜で分別するならば、その巨大分子のごく小部分がこれ
らの酵素に対して感応性であり、またその薬理学的活性
は感知するほどには変わらな℃・ことが決定される。

前記の製造法に従う精製収率は約３０〜３５％である。

このようにして得られた緩性α−及びβ−糖たん白質は
、約６２％の結合ヘキンース含有量、９％に近いたん白
質物質含有量を有し、そして＊、、ｉＺ：、’４；、、
２　の比は１１ぼ７である。ただし、この正確な解明は
難しいであろう。なぜならば、オルシノール染色による
標準化が遅行性α〜及びβ−糖たん白質中に実際に含ま
れているが任官にガラクトース及びマンノースの形にあ
る８！類についてなされないからである。

構造の研究 真空下での酸加水分解は、セルロースプレート上で分離
後、異なった分子成分を示す。したがって、非常に多種
類のアミノ酸を示すことができ、このことは運行性（χ
−及びβ−糖たん白質をペプチドグリカンやオサミンか
ら識別するものである。

糖類の中ではグルコース、ガラクトース及びマンノース
の存在が立証される。

リボースの存在は示されなかった。

０−オシジル結合の解裂を伴なうアルカリ加水分解をし
た後、形成されたフラグメントの研究は長いグリカン（
ｇｌｙｃａｎｉｃ　）　　鎖がたん白質の小さい鎖の輪
にグラフトしていることを示す。

それ故に、それらは、巨大分子性、たん白溶解酵素に対
する抵抗性、脂肪分解酵素（リパーゼ、バンクレアチン
）に対する抵抗性によって証明される糖たん白質のＶ＝
類の分子を有する。さらに、塩化セチルピリジニウムに
よって沈殿できないのでムコ多種類の凝いはない。

ナトリウムバルビタール緩衝剤の存在下、ｐＨ＝８．２
で、密度勾配下での電気泳動はとりわけα−β易動度の
ピークを示す。

薬理学的研究 ３）抗炎症活性 ラットの足にカラゲニンを局部注射して足底部炎症性水
腫を形成させた。被検化合物は、刺−激剤注射の１時間
前に腹腔内投与した。次いで刺激剤注射の前後で足の容
積を測定した。足の容積の増大は炎症の度合の尺度であ
るので、ｒ）Ａ４ｏ薬量（即ち、対照動物と比較して処
理動物の４０％を保蝕する薬量）を決定した。

比較は、前記した［（■）出発紬菌抽出物の調製例」に
記載したようにして製造した・物質（糖たん白質穴）と
本発明の方法で製造された精製遅行性ａ−及びβ−糖た
ん白質（糖たん白質Ｂン′と、最も普通に用いられてい
る抗炎症剤とについて行った。

結果は次の通り。

本発明の糖たん白質Ｂは被検化合物の中で最も効力のあ
る抗炎症剤であることがわかる。なお、糖たん白質Ａ及
びＢは、他の化合物と比較して潰瘍発現性はなかった。

ｂ）非特異的防衛の刺激 この刺激は、Ｈａ１ｐｅｒｎ氏により発展された方法に
よるマウスでの「炭素浄化試験」により研究した。この
方法は、動物の眼側にコロイド状炭素の懸濁液を注射し
、血中への炭素の消失量を光学密度の測定により時間の
関数として評価することからなる。

被検化合物は、試験の２４時間及び４８時間前に腹腔内
投与した。結果は、コロイド状炭素のみを注射し且つ炭
素粒子数の１００Ｘに相当する対照例と比較して、炭素
粒子の除去率として表わす。

Ｃ）抗細菌活性 糖たん白質Ｂをマウスに投与してから微生物を注射した
。１μＥｌ１ｋｇの薬量では糖たん白質Ｂはル１１炎桿
菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）
　Ｋ対して、処置マウスの９０Ｘを死亡から保護した。

また、ぶどう球菌に対しては２０μＥｌ１ｋｇの薬量で
マウスの７７Ｘを死亡から保護した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　Ｐｎｅｕｍｏ
   ｎｉａｅ　）の既知の菌株の培養物より既知の方法で製
   造された遅行性α−及びβ−糖たん白質の既知混合物か
   ら遅行性α−及びβ−糖たん白質を精製された形で得る
   にあたり、前記の運行性α−及びβ−糖たん白質′の既
   知混合物を分子篩の役割をはだす１種又は数種類の１枚
   又は数枚の開口規定した膜により水溶液で透析Ｆ遇する
   ことによって精製し、不活性の又は僅かに活性の両分を
   分離し、透析濾過セル内で膜により保持された非常に純
   粋な両分を集め、この両分を親水性の重合ゲル上でりｄ
   マドグラフィーし、固定さ、れなかった両分を集めるこ
   とを特徴とする精製された遅行性α−及びβ−糖たん白
   質を得る方法。