JPS592276B2 - ウイルス抗体の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗体の培養そして特にインビトロ−での生き
ている細胞による抗体の製造に関する。

ウィルスの抗原のデターミナントに特異的な抗体の製造
は、逸疫治療および免疫研究の両方のために重要である
。

ウィルスの抗原デターミナントに対するモノクローン性
抗体が、ウィルスの感染したひ臓細胞中でインビトロ−
で製造されて来た。

現在まで、しかし、ひ臓病巣による抗体の生産は３０か
ら４０日後に減少し９０日後には完全に停止してしまう
６我々は、ここに、抗体を製造する新規技術を開発した
のであって、本発明によれば、特に、遺伝的に安定な新
規セルラインの増殖物は、無限に、培養そして継代培養
されそしてウィルスおよび抗原性デターミナントに対し
て大量の抗体を生産することができる。

この新規セルラインは、（ａ）ミエローマ（ｍｙｅｌｏ
ｍａ ）細胞、つまり骨髄の１次腫瘍よりの悪性細胞と
、（ｂ）ウィルス抗体生産細胞なるべくはウィルスでプ
ライムされたひ臓または淋巴節から採取したウィルス抗
体生産性細胞とよりの、融合細胞バイブリドである。

特に有用なセルラインは、ウィルスでプライムされたマ
ウスひ臓細胞とマウスミエローマ細胞とのあいだの融合
細胞バイブリドである。

これらのセルラインは、ヒポキサンチン−アミノプテリ
ン−チミジン選択培地のような培地中に実質的に無限に
維持することができウィルスの抗原デターミナントに特
異的な抗体の生産を続けるのである。

これらの細胞は、組織的に許容されつる動物中にインビ
ボ−で発育さすことができ、動物の血清および腹水中に
著量の抗体を蓄積する。

本明細書において使用する「抗体生産性細胞」（ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ）なる用
語は身体全体を通して循環し、ひ臓およびリンパ節のよ
うな特定の臓器に濃縮蓄積する傾向を有せる唯一つのタ
イプの細胞を意味する。

従って、これは身体のどこにあっても同じ細胞タイプな
のである。

ミエローマ細胞は、抗体の特異性はなお知られていない
けれども、細胞が抗体を生産しうる点でそれ自体独特で
ある。

ミエローマ細胞およびひ臓細胞の由来する動物の特定の
種は、ひとつの種の細胞を別の種の細胞に融合させうる
限り、たとえばマウス対ラット、ラット対ヒトの細胞を
融合さすことが可能な限り、不可欠な条件とはならない
。

しかし、我々はミエローマ細胞およびウィルス抗体生産
細胞の両方の原料として同じ動物の種を使用するのを有
利とする。

あらかじめ免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスのウィルス抗
体生産性ひ臓細胞とＢＡＬＢ／ｃマウスのミエローマ細
胞との体細胞バイブリドを用いてすぐれた結果かえられ
る。

特に有利なミエローマ細胞は、クローン（Ｐ３×６３Ａ
ｇ８）と称せられるＭＯＰＣ−２１ラインで、Ｋｏｈｌ
ｅｒ等がＮａｔｕｒｅ 、 ２５６巻、４９５−４９７
頁（１９７５）に記載している。

ＢＡＬＢ／ｃひ臓細胞とＢＡＬＢ／ｃミエローマ細胞の
融合細胞バイブリドは、すでに、Ｋｏｈｌｅｒ等がＮａ
ｔｕｒｅ 、 ２５６巻、４９５−４９７頁（１９７５
）およびＥｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 ６巻、
５１１−５１９頁（１９７６）に記載している。

これらのバイブリドは、しかし、ウィルスで免疫された
マウスに由来するのでなく、むしろ羊赤血球細胞で免疫
されたマウスに由来している。

羊赤血球抗体生産性細胞とミエローマ細胞とのあいだの
バイブリドは容易に形成されるが、Ｋｏｈｌｅｒ等のバ
イブリドで生産される抗体は羊赤血球細胞に特異的でウ
ィルスには効果を有しない。

本発明以前には、ウィルス抗体生産性細胞とミエローマ
細胞とのあいだにバイブリドが生成されうるかどうかは
知られていなかった。

つぎに示すのは、インフルエンザウィルスであらかじめ
免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスのひ臓細胞とＢＡＬＢ／
ｃマウスのミニローア細胞との融合で、バイブリド細胞
のセルラインを調製する方法である。

この方法はインフルエンザウィルスの特定の株を用いる
が、他のウィルスたとえば狂犬病ウイルス、おたふくか
ぜウィルス、ワクシナウィルスインフルエンザ株６−９
４シミアンウイルス４０ポリオウイルス等も使用しうる
。

（ａ） 融合のためのひ臓細胞の調製 融合のためのひ臓細胞を調製するために、２から３ケ月
前に、精製されたインフルエンザウィルス（Ａ、ＰＲ／
８／３４（ＨＯＮＩ ））の１２５０血球凝集単位を腹
腔注射してプライムしたＢＡＬＢ、／ｃマウスに、同系
統ウィルスの１００血球凝集単位の投与量を静脈注射し
たマウスは７日後に殺し、Ｇｅ ｒ ｈ ａ ｒ ｄ等
がＢｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 ５、７２０−７２５ （１９７５
）に記載した方法でひ臓細胞懸濁液を調製した。

ひ臓細胞中に存在する赤血球細胞は通常抗体非生産性融
合生成物を導くので、この赤血球細胞をＮＨ，Ｃ１（０
，８３係）中において４度Ｃでインキュベートすること
により融解させた。

これにより、抗体生産性であるリンパ球細胞のひ臓から
の精製が容易になり、抗体産生融合生成物へと導かれる
。

生ずる細胞懸濁液は、熱不活化牛血清を用いて一度遠心
（８００Ｘ！すして洗い、蛋白不含媒体中（ＲＰＭＩ
１６４０，７．５市ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，２で緩
衝〕で１度遠ノ印た。

（ｂ） 融合のためのミエローマ細胞の調製Ｃｅ５ａ
ｒ ＭｉｌｓｔｅｉｎがＮａｔｕｒｅ 、 ２５６巻、
４９５−４９７頁（１９７５）に記載し、かつ同氏から
入手した、ＭＯＰＣ−２１ラインに由来しそしてＨＰＲ
Ｔ（Ｅ、Ｃ，２，４，２，８）を欠如するＢＡＬＢ／ｃ
（Ｐ ３ Ｘ ６３Ａｇ ８ ）ミエローマ細胞を１
０チ牛脂児血清および１０係馬血清を含有すルイークル
（Ｅａｇｌｅ ）のミニマルエツセンシャル培地（ＭＥ
Ｍ）に継代した、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８のミエローマ細胞の
発育は、選択的ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミ
ジン培地中で阻害した。

（ｃ） バイブリドの生成 １ｏｏｏ万個のＢＡＬＢ／ｃ（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８）ミエ
ローマ細胞を、ウィルス感染ＢＡＬＢ／Ｃマウスより得
られた１０８個のひ臓細胞と混合してバイブリドを生成
させた。

細胞混合物は、８００ ｘｇで遠心し、融合のために、
血清不含のミニマムエツセンシャル培地（ＭＥＭ）中で
希釈した５ｏ ％ （重量／容量）ポリエチレングリコ
ール−１０００（ＰＥＧ）中に再懸垂させた。

Ｄａｖｉｄｓｏｎ等がＳｏｍａｔ 、 Ｃｅ１１ Ｇｅ
ｎｅｔ。２．１７５−１７６に記載した操作に準じて、
ポリエチレングリコールは、まず、血清不含のＭＥＭで
希釈し、ついで血清で希釈し、それから細胞を、ヒポキ
サンチン−アミンプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培
地を含有する７５Ｃ７ｒＬのｐｌａｃｏｎフラスコ５個
に接種した。

培養物は、９５％空気１５％ＣＯ２の気流中で３７度Ｃ
でインキュベートし、７から１０日毎に、培地は部分的
にＨＡＴ培地（３Ａから％）でおきかえていった。

ＰＨ１（これはインフルエンザウィルスであって、常法
により調製され、当業者周知のものである。

このウィルスはマウスに抗体を生産させるためマウスの
免疫にのみ使用されている）で免疫したマウスのひ臓細
胞をＰ ３ Ｘ ６３ Ａｇ８細胞と融合させて生じた
培養物を１０から１５日インキュベートすると、ひとつ
の細胞について細胞の発育を観察した。

ＨＡＴ培地中の発育はすべて、マウスひ臓とマウスミエ
ローマ細胞とのあいだのバイブリド生成がうまくいった
ことを示していた。

ＨＫ−ＰＥＧ−１と称するこれらの細胞は、ＨＡＴ培地
中で連続的に増し継代され限定された希釈度においてミ
クロプレート（Ｌｉｎｂｒｏ ）中でクローン化した。

他の４個のフラスコについては細胞の発育を示さなかっ
たので、融合後３週で廃棄した。

ＨＫ−ＰＥＧ−１と称されるセルライン培養物は、ｔｈ
ｅＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎに寄託され、番号ＡＴＣＯＣＬ１８９を
受けた。

ｄ）カリオロジー分析 表１に示すよう（へＰ３Ｘ６３Ａｇ８親細胞は、６３個
の染色体を含有しそしてＢＡＬＢ／ｃひ臓細胞は４０個
の染色体を含有する。

それでＨＫ−ＰＥＧ−１細胞中の９２個の染色体は２つ
の親細胞の染色体の大体の和を示す。

バイブリドクローンＨＫ−ＰＥＧ−１およびサブクロー
ンのカリオロジＨま、４ケ月後に調べてみたが、カリオ
タイプには、なんら有意の変緩はなかった。

（ｅ） バイブリド細胞で生産される免疫グロブリン
の分析 ＨＫ−ＰＥＧ−１およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞の培養液
について、ラジオイミュノアツセイ（ＲＩＡ）でＰＲ８
と反応する免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在について分析
した。

Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８は、ＩｇＧ１．に、 を分泌するこ
とが知られている。

表２に示すように、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８培養液は、抗ＰＲ
８反応を有するＩｇを含有しない。

対照的に、大量の抗ＰＲ８抗体がＨＫ−ＰＥＧ−１によ
り生産された。

表３のデータは、バイブリド細胞により生産されるウィ
ルス性抗体（抗−ＰＲ）は、ＰＲ８の抗原（赤血球凝集
原）に特異的であることを示している。

このことは、抗体（約４０μｇ／ｃＣ’。が赤血球凝集
原阻害（ＨＩ ）を示すが、なんらの検出されつるノイ
ラミニダーゼ阻害（ＮＩ ）を示さぬことが分る。

表３のデータは、バイブリド細胞により生産されるウィ
ルス性抗体（抗−ＰＲ）はＰＲ８の抗原（赤血球凝集原
）に特異的であることを示している。

このことは、抗体（約４０μ９／ ）が赤血球凝集原
阻害（ＨＩ）を示すが、なんらの検出されうるノイラミ
ニダーゼ阻害（ＮＴ）を示さぬことが分る。

（ｆ） バイブリド細胞のクローン化の出発細胞ＨＫ
−ＰＥＧ−１のクローン化の出発細胞を３個の別々の基
準により試験した。

（ｉ）ａ−ＰＥＧ−１培養塊より得られた濃縮Ｉｇ（表
３の説明をみよ）を、等霊的ホーカシング（ｆｏｃｕｓ
ｉｎｇ ）に処した。

ＩｇＧ１重鎮デターミナントを有する抗ＰＲ８抗体は、
限定されたｐＨ範囲に蓄積した。

（ｉｉ）ＰＨ１に対して抗原的に改変されることの知ら
れている種々のウエルスに対する交叉反応性について、
ＲＩＡにより抗体を試験した。

ＰＨ１の血球凝集原（ＨＡ）デターミナントに対して特
異的であることが分った。

しかしＰＲ８インフルエンザＡウィルスに対する抗体産
生させるためにプライムされたラットのひ臓からのＢ細
胞の２０％から２５係が、この株特異的抗ＨＡ（ＰＨ１
）反応性を示す。

それで抗体反応性のみでは、ＨＫ−ＰＥＧ−１１のモノ
クローン性を決定するにはむしろ弱い標準となる。

θＩＤ 抗ウイルス抗体を生産する細胞がバイブリド
細胞集団のほんの１部を占めるだけであるという可能性
を除くために、ＨＫ−ＰＥＧ−１バイブリドラインの１
２イ固のクローンに由来する培養液を、抗ＰＲ８抗体の
存在およびそれの特異性について検定した。

表４に示すように、１２個のクローンのうちの１１個が
抗ＰＲ８抗体を生産した、さらにこれらの抗体は、ＰＲ
８ウィルスのＨＡのデターミナントに対して特異的であ
る。

（ａ） ミクロリッタープレートをウィルスで被覆し
、このウィルスをグルタルアルデヒドによりプレートに
固定する： （ｂ） このプレートを次に凹部１個当り約２００マ
イクロリツターの牛胎児血清またはガンマグロブリンを
含有しない馬血清で被覆し、０．５時間インキュベート
し、その後、洗浄する： （ｃ） このプレートに細胞培養上澄液またはその他
の潜在性抗体源を入れ（約５０マイクロリツター）、約
２時間インキュベートし、その後プレートを蒸留水で洗
浄する： （ａ） 各凹部に放射性物質で標識した抗体、１２５
１Ｆ （ａ ｂ’）２を約５０，０００力ウント／凹部
の量で加れ、次に約２時間インキュベートする；（ｅ）
次いで、これらのミクロ凹部を洗浄し、切り取り、
ガンマシンチレーション計数器で分析する。

１分間当りのカウント（ｃｐｍ）は抗体の存在または不
存在を示す。

（ω バイブリド細胞の腫瘍原性 バイブリド細胞の腫瘍原性を測定するために、ＢＡＬＢ
Ａ成熟マウスの腹壁に、ＨＫ−ＰＥＧ−１細胞（１×１
０７個）またはＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞（１ｘｔｏ７）細
胞を皮下注射した。

表５に示すように、接種してから１０から１２日後に、
ＨＫ−ＰＥＧ−１細胞注射マウスでは５１５のマウスに
そしそ親のＰ３Ｘ６３Ａｇ８細胞注射マウスでは３１５
のマウスに接種部位に腫瘍を発生した。

第２の実験では、バイブリド細胞接種後の４１５のマウ
スに、そしてｐ ３ Ｘ６３Ａｇ８細胞接種後の３１５
のマウスに腫瘍を発生した。

細胞を腹腔注射（表５、実験３）すると、腹腔に塊状に
腫瘍を生じた。

腹水を生ずるためには、完全フロイントアジユバノドに
再懸濁させた腫瘍細胞をマウスに注射する必要があった
。

第４の実験で・は、プリステーン（ｐｒｉｓｔａｎｅ
） （サメ由来の（鉱油）を腹腔内投与してプライムさ
れたマウスが、ＨＫ−ＰＥＧ−１クローンの細胞を腹腔
接種したあとで、腹水を生じた。

これらの研究の結果は、マウスミエローマと正常ひ臓細
胞とのあいだのバイブリド細胞は、悪性腫瘍原性を抑え
ることなく、悪性の親と同様に振舞うことが分る。

注射後様々の間隔で腫瘍を有するマウスより得られた血
清および腹水について、ＲＩＡを用いて、抗ＰＲ抗体の
濃度を測定した。

結果を表６に示す。ＨＫ−ＰＥＧ−ＩＭ胞を皮下注射さ
れたマウスの血清（実験ｌおよび２）は、■から３１ｆ
１ｇ／ＣＣの濃度に抗体を含有した。

Ｐｉ、ＰＲ８抗体は、バイブリド細胞を腹腔注射したマ
ウスの腹水中にも見出だされた（実験４つｏ但し、抗体
の濃度は血清中における量に対しＸからにである。

ＨＫ−ＰＥＧ−１の腫瘍を有するマウスより得られた血
清の電気泳動は、３個の主要なＩｇ−集団を示した。

ひとつは親の（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８）ＩｇＧＩに相当しひ
とつは、ＩｇＧ３の特徴を有し、第３のものは２つのも
のの中間である。

免疫グロブリンのいずれの種類に抗ウイルス抗体が結合
しているかを測定するために、腹水をブリステンでプラ
イムされたマウス２０頭より集め、プールし、それより
免疫グロブリンを分離した。

つぎのようにして分離を行なった。

マウスより集めた腹水をプールし、リン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で中和した。

等容量の飽和硫酸アンモニウムを４度Ｃで添加し、沈殿
蛋白質をＰＢＳに溶解し、ｐＨ８，０の０．ＯＩＭｌ−
リス緩衝液に対して透析した。

１夜透析したあとに生ずる沈殿をＰＢＳに再溶解し０．
ＯＩＭｌ−ＩＪス緩衝液（ｐＨ８，０）に対して透析し
て再沈殿させた。

透析物の上清は、ｐＨ８，０の０．０１Ｍトリス緩衝液
で平衡させたＤ Ｅ −５２（Ｗｈａ ｔｍａｎ ）カ
ラムに吸着させ、直線状ＮａＣ１のグラジェント（０，
０１Ｍトリス、ｐＨ８，０中０．５から０．１５Ｍまで
）を用いて溶出させた。

０、ＯＩＭ）ＩＪス緩衝液に対して透析して１ｇＧ３を
沈殿させてからの残留する上清は、電気泳動で、分画前
の腹水プール中に見られた成分のひとつを欠如した。

このものをＤＥ−５２でクロマトグラフィーしても、残
存する成分は完全には分離していない。

しかし、個々の分画を電気泳動すると、２個の主要な成
分の存在を示した。

ひとつは、親（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８）のＩｇＧ１に相当し
、他は、Ｉ ｇＧｌとＩｇＧ３との中間のバイブリドＩ
ｇを示した。

これは、ＨＫ−ＰＥＧ−１腫瘍を有するマウス（上記を
みよ）にも観察された。

抗ＰＲ８抗体の濃度を１２５１−抗Ｆ（ａｂ’）２Ｇ用
いるＲＩＡで測定した。

そして、抗ＰＲ８比活性は、抗Ｐ ｋ３．８ （ｒＩＵ
ｊ／ ｃｃつ２■ｇ（Ｉｒ１９／ＣＣ）の比として計算
した。

後者は、マウスＩｇの吸収値（１％。ｌ ｃｍ ）を１
４．０と仮定し０Ｄ２８０の測定で計算した。

低い塩濃度の沈殿で測定した抗ＰＲ８比活性は、ＤＥ−
５２クロマトグラフイーの抗ＰＲ８活性のピーク（０，
０６、分画２１）の約２倍の高さである。

１２５■−抗ＩｇＧ１を用いるＲＩＡでの試料の分析は
、低い塩濃度での沈殿中の抗ＰＲ８抗体の約１５係がＧ
ｌデクーミナントを表わすことを示した。

これと対照的に、ＤＥ−５２のクロトグラフィーの種々
の分画で、１２５Ｉ−抗Ｆ（ａｂ’）２は抗ＰＲ８抗体
の定量に同様に有効である。

別の一連の実験を狂犬病ウィルスを用いて実験した。

ＢＡＬＢ、／ｃマウスを不活化狂犬病ウィルス（ＥＲＡ
株）を含有するワクチンでプライムし、１ケ月後、同じ
ワクチン静注する。

それから３日後マウスを殺し、前記のようにひ臓細胞を
Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８ミエローマ細胞と融合させてバイブリ
ド細胞とした。

多数のこれらのバイブリド細胞が抗狂犬病ウィルス抗体
を生産した対照的に、静注後１０１ＥＩ？こ殺した場合
には、抗狂犬病抗体を生産するバイブリド細胞の数はき
わめて低かった。

この操作を用いて、表７，８および９に示す試験のため
のハイブリドーマを得た。

つぎの試験で用いられた狂犬病ウィルス株は、この方面
で知られている株である。

たとえばＥＲＡ株は、なかんずく、アメリカ合衆国特許 ３．４２３，５０５および３，５８５，２６６に記載さ
れている。

ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙはなかんずくアメリカ合衆国特許２
，７６８，１１４に、ＳＡＤはＣａｎ、Ｊ。

ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 ６ｔ ６０６（
１９６０）に記載されている。

同様に用いた分析法もこの方面の技術でよく知られてい
る。

放射免疫分析（ＲＩＡ）で測定された抗狂犬病ウィルス
抗体を産生ずる５２種のハイブリドーマを３種の狂犬病
ウィルス株、つまり、ＥＲＡ、ＣＶＳおよびＨＥＰ−Ｆ
ｌｕｒｙ株に対して試験した。

さらに４種の異なる分析、ウィルス中和（ＶＮ）細胞毒
試験（ＣＴ）、膜螢光（Ｍ）、ニュクレオカプシド螢光
（ＮＣ）を用いた。

結果は表７に示す。表７は、ひとつの株と反応した抗体
は、狂犬病ウィルスの他の株とは反応しないことのある
ことを示している。

表７に示すように、狂犬病ウィルス抗体を分泌する５２
個のバイブリド細胞のうち、９個が、ウィルス中和、細
胞毒および膜免疫螢光の点で、ＥＲＡ、ＣＶＳおよびＨ
ＥＰ−Ｆｌｕｒｙの３株のすべてと反応した。

１５個はＥＲＡおよびＨＥＰ株と反応し、２個はＥＲＡ
およびＣＶＳと反応し、３個はＥＲＡのみと、１個はＨ
ＥＰウィルスのみと反応した。

２８個のバイブリド培養物が、３個のウィルス株すべて
のニュクレオカプシドと反応する抗体を生産した。

これらのうち２３個は、ニュクレオカプシドのみと反応
し、他のウィルス成分とは反応しなかった。

狂犬病ウィルスの野生株（街上株、５ｔｒｅｅｔｓｔｒ
ａｉｎ ）と固定法の抗原関係を、さらに追加して１０
種の地理的由来の異なる株で調べてみた。

ＥＲＡを用い上記のようにハイブリドーマを製造した。

表９に示す結果は、固定株Ｋｅ１６ｙウィルスは１個の
ハイブリドーマ（Ａｌ ２０ ）の分泌する抗体によっ
てのみ中和され、最近発見された南アフリカ野生株（Ｄ
ｕｖｅｎｈａｇｅ ）は２個のハイブリドーマにより生
産される抗体によってのみ中和された、これに対照的に
、Ａ １９３の抗体とは反応しなかったようにみえるＡ
Ｆ株を除いて、すべての野性ウィルス株はＶＮにおいて
交叉反応性を有するようである。

ハイブリドーマの抗体は、ウィルスの固定法を用いるＶ
Ｎ分析では、きわめて不均質であるようにみえた。

たとえば、ＰＭおよびＣＶＳ株は共にＰａ５ｔｅｕｒ株
に由来しているが、Ｐａ５ｔｅｕｒ株とも、また、相互
にも反応が異なっていた。

逆に、 ＳＡＤウィルスおよびそれに由来するＥＲＡは
、同じハイブリドーマにより分泌される抗体と同じ様式
で反応した。

最後に、非病原性のＨＥＰは、＊ １２０抗体を用いる
ＶＮで、ＫｅｌｅＶ株と交叉反応性であった。

しかし、さらに追加して、ＨＥＰは、３個の他のハイブ
リドーマの分泌する抗体により中和された。

１７１− 由来によらずすべてのウィルスは、固定しハイブリドー
マ１０４の生産する抗体にさらしたあとで細胞質内螢光
を示した（ＮＣ分析）、しかし７、それらウィルスのい
ずれも、ＶＮにおいては、同じパイブリドーマと反応し
なかった。

表７および８の結果は、抗狂犬病ウィルス抗体生産性の
バイブリド細胞は、研究および分析の目的に非常に有用
であることを示す。

狂犬病ウィルス中和抗体を分泌するバイブリド培養物は
狂犬病ウィルスの致死効果に対してマウスを保護した。

ハイブリドーマ大量培養物Ｃ−１およびＢ−１およびク
ローン１１０−５の細胞（表９をみよ）をＢＡＬＢ／ｃ
マウスの皮下に接種した、Ｃ−１および１１０．−５の
ハイブリドーマを接種してから２週間のうちに得られた
血清は、同じハイブリドーマの組織培養物よりの培地よ
りも１００倍高い狂犬病ウィルス抗体を示した。

パイブリドーマ接種後５田こ、マウスにＰＭ狂犬病ウィ
ルスの致死量を脳内接種した。

表９に示すように、ＶＮ抗体を分泌するハイブリドーマ
培養物を接種したマウスは、生存した。

しかし、ＶＮ抗体を分泌しないハイブリドーマを接種し
たマウスは防禦されえなかった。

本発明のセルラインは、正常のひ臓およびミエローマの
両方の親細胞の特徴を示すバイブリド培養物を表わし、
そして単一の融合現象に由来しているようにみえる。

細胞の性質は次の理由からバイブリドである。

（ａ） このセルラインは、親のＰ３Ｘ６３Ａｇ８ミ
エローマ細胞の発育を阻止するが正常のひ臓細胞の発育
は阻止しない選択的なＨＡＴ中に数ケ月発育した。

ところで、正常のひ臓の細胞はインビローで４から５週
以上は恐らくは生存しないはづなのである。

（ｂ） バイブリド細胞中の染色体の数は、正常のマ
ウスおよびミエローマの親細胞の和に近い。

（ｃ） ＨＫ−ＰＥＧ−１バイブリドは、Ｐ３Ｘ６３
Ａｇ８によっても分泌されるＩ ｇＧｌのみならずＩｇ
Ｇ３をも生成する。

そして恐らくはバイブリド分子である。

（ｄ） バイブリドは抗ウィルス活性のある抗体を生
成する。

ところでＰ３Ｘ６３Ａｇ８は生成しない。

抗体はバイブリドセルラインをインビトロ−で増殖させ
て生成さすのがもつとも良いが、バイブリドセルライン
を組織的に許容されうる動物に注射しそしてインビボ−
に抗体を生成されこともできる。

たとえば、比較的安価な動物であるマウスに、本発明に
よる、マウスに由来する抗体生産性細胞を注射して、血
清および腹水中に採取しつる抗体を生成させうる。

前記論理の表６は、このような条件で得られる抗体の量
を示す。

バイブリドにより生成される抗体は標準技術を用いて採
取しうる。

そして血液試料および培地中のウィルス性抗原の同定の
ために分析医学的研究に使用しうる。

インビトロ−で生成される抗体は、均質で、ウィルス性
抗原に対して高度に特異的である。

それぞれ特定の抗原に対して高度に特異的な種々な均質
の抗体の供給は、抗原の特異性をすみやかに測定しそし
て（または）ウィルス性抗原を特徴づけることを可能と
する。

さらに、抗体は、病気の克服を助けるために、罹病動物
に投与されうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ひ臓または淋巴節に見出されるタイプのウィルス抗
   体生産性細菌胞とミエローマ細胞との融合細胞バイブリ
   ドを調製し、該バイブリドを培養し、そしてウィルス抗
   体を採取することからなる、ウィルス抗体の製造方法。 ２ 該バイブリドをインビトロ−で培養する、特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 ３ 該バイブリドをクローン化し、ヒポキサンチン−ア
   ミノプテリン−チミジン含有培地中に培養する１、特許
   請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ 該バイブリドを組織的に許容される動物に注射しそ
   してインビボ−で培養する、特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ５ 該バイブリドがクローンである、特許請求の範囲第
   ４項に記載の方法。 ６ 該ウィルス抗体生産性細細胞がひ臓細胞および淋巴
   節細胞より成る群より選択した細胞である、特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 １ 該ウィルス抗体生産性細胞がひ臓細胞である、特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ８ 該ひ臓がマウスのひ臓で該ミニ−ローマがマウスミ
   エローマである、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ９ 該ミエローマがＭＯＰＣ−２１ラインに由来する（
   Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８）である、特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 １０該ウィルス抗体生産性細胞を、ウィルスで免疫した
   動物よりうる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １１ 該ウィルス抗体生産性細胞をウィルスで免疫した
   動物よりうる、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 １２該ウィルス抗体生産性細胞を、ウィルスで免疫した
   マウスよりうる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １３該ウイルスがインフルエンザウィルスである、特許
   請求の範囲第１１項に記載の方法。 １４該ウイルスが狂犬病ウィルスである、特許請求の範
   囲第１２項に記載の方法。 １５ＢＡＬＢ／ｃマウスにウィルスを注射して、該マウ
   スのひ臓細胞による抗体産生を誘導させ、該ウィルス抗
   体生産性ひ臓細胞とＭＯＰＣ−２１ラインに由来するＢ
   ＡＬＢ／ｃミエローマ セルクローン（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ
   ８）との融合細胞ハイブリドを形成させ、選択的ＨＡＴ
   培地中でインビトロ−で該バイブリドを培養し、生成抗
   体を採取することからなる特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 １６該ウイルスがインフルエンザウィルスである。 特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７該ウイルスがインフルエンザウィルス６−９９４株
   である、特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 １８該ウイルスがシミアン（５１ｍ１ａｎ ）ウィルス
   ４０である。 特許請求の範囲第１５項に記載の方法。１９該ウイルス
   が狂犬病ウィルスである、特許請求の範囲第１５項に記
   載の方法。