NL8401221A

NL8401221A - Analytische toepassing van fagocyt-cellijnen.

Info

Publication number: NL8401221A
Application number: NL8401221A
Authority: NL
Original assignee: Innovi Nv
Priority date: 1984-04-16
Filing date: 1984-04-16
Publication date: 1985-11-18
Also published as: IL74904A0; IL74904A; EP0159653B1; US4737455A; ATE56750T1; EP0159653A1; JPS60256377A; DE3579731D1

Description

Br/lh

Analytische toepassing van fagocyt-cellijnen.

_________________t___________________________________________

De uitvinding heeft betrekking op het analyseren van biologische vloeistoffen, in het bijzonder voor biotechnisch, klinisch en farmacologisch onderzoek, onder toepassing van fagocyt-cellen, afkomstig uit een continue fagocyt-cellijn.

5 Fagocyten zijn in het menselijk en dierlijk organisme voorkomende cellen, die in staat zijn microscopische partikels in zich op te nemen en te verteren. Onder hen zijn vooral enkele typen witte bloedcellen van belang, zoals macrofagen, neutrofiele leukocyten en monocyten, die een rol spelen bij 10 de afweer tegen bacteriële infekties.

Het is bekend, dat fagocyten in celsuspensie door chemische of immunologische agentia kunnen worden geactiveerd, waarbij chemiluminescentie optreedt. De chemiluminescentie houdt waarschijnlijk verband met de vorming van onstabiele 15 zuurstofverbindingen, zoals superoxide-anionen, atomaire zuurstof en waterstofperoxide, die onder emissie van licht in een meer stabiele vorm overgaan. De lichtemissie kan door toevoeging van luminescerende substraten zoals luminol en lucigenine worden versterkt en met behulp van geschikte 20 apparatuur worden gemeten. Vervolgens kan de meting worden gebruikt om de activiteit van de fagocyten in een biologische vloeistof te bepalen, teneinde zodoende eventuele immunologische gebreken in die vloeistof op te sporen.

In overeenstemming met de uitvinding wordt de 25 chemiluminescentie van geactiveerde fagocyten nu echter gebruikt voor een ander doel, namelijk om de aanwezigheid en het gehalte van diverse agentia in biologische vloeistoffen te onderzoeken. Daarbij kan het gaan om immunologische faktoren die een rol spelen in het afweermechanisme tegen 30 antigenen, maar ook om chemische agentia, zoals ongewenste gifstoffen die opgespoord moeten worden, of farmaceutica waarvan men de toxiciteit wil weten. Steeds maakt men daarbij gebruik van het feit dat de bedoelde agentia een stimulerende of een modulerende invloed op de activering van de fagocyt- 8401221 ï r -2- cellen hebben.

Voorwaarde voor de analytische toepassing van fagocyt-cellen is wel, dat de fagocyt-cellen uniforme eigenschappen hebben, in voldoende mate voor analytische 5 toepassing ter beschikking staan en zich goed laten doseren.

De normale fagocyten die uit een menselijk of dierlijk organisme worden geïsoleerd voldoen niet aan deze voorwaarde omdat zij uitermate heterogeen zijn, vele stadia van differentiatie vertonen en ook het vermogen missen om in 10 celculturen te worden voortgekweekt. Daarom dient de uitvinding eerst te voorzien in een fagocyt-cellijn van gestandaardiseerde eigenschappen, die continu kan worden voortgekweekt en goed voor de chemiluminescentieproeven bruikbaar is.

15 De uitvinding beoogt'derhalve continue fagocyt- cellijnen met gestandaardiseerde eigenschappen te verschaffen, alsmede een werkwijze voor het bereiden daarvan.

Daarnaast beoogt zij een werkwijze voor het analyseren van biologische vloeistoffen zoals bloed, bloed-20 serum en dergelijke te verschaffen, waarmee talrijke immunologische en chemische faktoren kunnen worden aangetoond, zowel op kwalitatieve als kwantitatieve wijze.

Verder beoogt zij op grond van het voorgaande te komen tot nieuwe methoden voor biotechnisch, klinisch en 25 farmacologisch (in het bijzonder toxicologisch) onderzoek.

Andere doeleinden van de uitvinding zullen uit de volgende beschrijving duidelijk worden.

Continue fagocyt-cellijnen.

30 De uitvinding verschaft in de eerste plaats continue fagocyt-cellijnen, die gekenmerkt zijn door funktionele fagocyt-eigenschappen en door het vermogen tot continue groei. Dergelijke cellijnen hebben gestandaardiseerde eigenschappen, laten zich continue voortkweken, zijn daardoor steeds voor 35 analytische toepassing beschikbaar en kunnen bij die toepassing goed worden gedoseerd.

Onder funktionele fagocyt-eigenschappen kunnen diverse eigenschappen worden verstaan, zoals fagocytose, 8401221

1 T

-3- chemiluminescentie, secretie van lymfokinen en enzymen, tumordodende werking en dergelijke. Het is niet nodig, dat de continue fagocyt-cellijnen al deze eigenschappen tegelijk, of alle eigenschappen in gelijke mate zullen vertonen, 5 al is het voor een latere analytische toepassing wel gewenst, dat de chemiluminescentie-eigenschap in zekere mate aanwezig is.

In overeenstemming met de uitvinding kunnen de continue fagocyt-cellijnen worden bereid door een hybridi-10 seringstechniek, omvattende een celfusie van fagocyten met geschikte tumorcellen, gevolgd door kloneren en selecteren van de verkregen hybriden. De geselecteerde en verder gekweekte hybride-cellen zullen dan zowel funktionele eigenschappen van de tumorcellen (namelijk continue groei in 15 vivo en in vitro) alsook funktionele eigenschappen van de fagocyt-cellen, bijvoorbeeld fagocytose, chemiluminescentie en dergelijke vertonen. Door een geschikte selectie is het mogelijk tot cellijnen te komen die bepaalde funktionele eigenschappen in meerdere of mindere mate bezitten en ook 20 tot cellijnen die naar keuze specifiek of minder specifiek op bepaalde agentia reageren.

De voor deze hybridiseringstechniek gebruikte fagocyt-cellen kunnen bestaan uit macrofagen, neutrofiele leukocyten of monocyten, waarbij macrofagen de voorkeur 25 genieten. Zij kunnen uit diverse organen van het menselijk of dierlijk organisme worden geïsoleerd, al dan niet na voorafgaande stimulering van het organisme met daartoe geschikte agentia. Zo kan de aanwezigheid van macrofagen in het buikvlies vaak worden geïnduceerd door vooraf 30 inspuiten van lectine, endotoxinen, thioglycolaat en dergelijke. De gewonnen fagocyt-cellen dienen van verontreinigingen (bijvoorbeeld lymfoide cellen) te worden gescheiden, hetgeen met voordeel kan geschieden door gebruik te maken van de eigenschap dat fagocyt-cellen in tegenstelling tot andere 35 cellen goed aan glas en kunststof hechten. Na een dergelijke zuivering kunnen de fagocyt-cellen direkt voor celfusie worden gebruikt.

8401221 1 , -4-

Als andere component voor de celfusie worden tumorcellen gebruikt. Voor het verkrijgen van goede resultaten dienen deze tumorcellen fenotypisch op de fagocyt-cellen te gelijken, zodat men voor hybridisering met mense-5 lijke macrofagen, bij voorkeur macrofaagachtige menselijke tumorcellen gebruikt en voor hybridisering met muizen-macrofagen bij voorkeur macrofaagachtige tumorcellen uit muizen. Verder dienen de tumorcellen fusogeen te zijn, dat wil zeggen het vermogen te hebben om gemakkelijk een cel-10 fusie aan te gaan. Bij voorkeur zijn de tumorcellen afkomstig uit een continue cellijn, zodat de eigenschappen ervan goed bekend zijn.

Het kan voordelig zijn om vooraf uit een dergelijke tumor-cellijn een variant of mutant te kweken, die gevoelig 15 is voor bepaalde chemicaliën, zoals bepaalde purinebasen. Indien men bijvoorbeeld een mutant kweekt, die bestand is tegen 8-azaguanine, maar gevoelig is voor HAT-medium (een medium dat hypoxanthine, aminopterine en thymidine bevat) kan men later na de celfusie dit HAT-medium gebruiken 20 om ongefuseerde cellen te vernietigen.

De celfusie kan op gebruikelijke wijze geschieden, bijvoorbeeld door de fagocyt-cellen en de tumorcellen in een polyethyleenglycol-houdend medium van geschikte temperatuur (bijvoorbeeld 37°C) samen te brengen. Door roeren kan de 25 mogelijkheid van kontakt tussen de beide soorten cellen en daarmee de kans op celfusie worden vergroot. De tijdsduur van deze bewerking is min of meer kritisch en zal doorgaans ongeveer 2 minuten zijn, want bij kortere kontaktduur wordt de kans op celfusie kleiner en bij langere kontaktduur werkt 30 het polyethyleenglycol giftig op de cellen in. Na beëindiging van de celfusie worden de cellen uit het fusiemedium naar een ander medium overgebracht en worden ongefuseerde cellen door toevoeging van geschikte chemicaliën, bijvoorbeeld een HAT-medium vernietigd. Er blijven dan alleen gefuseerde 35 cellen (hybride cellen) over. Daarna volgen de gebruikelijke bewerkingen van kloneren (met inbegrip van subkloneren) en selecteren van de hybride cellen.

8401221 -5-

Het kloneren en subkloneren kan geschieden op microtiterplaten of op agar in een Petrischaal. Voor het opkweken van de hybride cellen kan elk geschikt kweekmedium voor celkweek of weefselkweek worden gebruikt. De voorkeur 5 wordt gegeven aan het medium RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, N.Y., USA), waaraan 10% foetaal kalverserum (Gibco), 2 nM glutamine, 100 E/ml penicilline en 100 pg/ml streptomycine is toegevoegd. Het medium RPMI 1640 (ontwikkeld in het Roswell Park Memorial Institute) bevat anorganische zouten 10 (NaCl, NaHCO^, Na2HP0^, etc.), glucose, diverse aminozuren en diverse vitaminen. Wanneer hierna over een "kweekmedium" wordt gesproken, wordt daarmee steeds RPMI 1640 met de genoemde toevoegsels bedoeld, tenzij anders aangegeven.

Het selecteren van de hybride cellen geschiedt 15 aan de hand van hun funktionele eigenschappen, welke door tests kunnen worden bepaald. In het algemeen kunnen tal van eigenschappen worden bepaald, waaronder fagocyt-eigenschappen ' en tumoreigenschappen. Typische voorbeelden van fagocyt-eigenschappen zijn: fagocytose (van rode bloedcellen, bacte-20 riën, gistcellen, parasieten,etc·)> chemiluminescentie (na stimulering door gistextract, bacteriën, parasieten, phorbol-esters, tumorcellen etc.), secretie van lymfokinen (zoals T-cel mitogenen en Interleukine-1), secretie van enzymen (zoals lysozyme), tumoricide werking en modulering 25 van deze eigenschappen door immunologische en niet-immuno-logische faktoren zoals opsoniserende antilichamen, complement, lymfokinen, endotoxinen, phorbol-esters etc. Een voorbeeld van de specifieke tumoreigenschappen is de continue groei van de cellen in vitro en in vivo.

30 Als kriterium voor de selectie van de hybride cellen kunnen diverse eigenschappen dienen, afhankelijk van de latere toepassing die men op het oog heeft. Zo kunnen bijvoorbeeld hybride cellen worden gekozen die een sterke chemiluminescentie onder invloed van bepaalde stimulatoren 35 vertonen, indien men dergelijke stimulatoren later in biologische vloeistoffen wil aantonen. Ook is het denkbaar dat men hybride cellen kiest, die onder invloed van een 8401221 -6- stimulator alleen slechts een geringe chemiluminescentie, maar onder invloed van een stimulator plus een modulator juist een versterkte chemiluminescentie vertonen. In dat geval kunnen de hybride cellen later dienen om een modulator 5 in biologische vloeistoffen aan te tonen. Daarnaast zijn nog talrijke andere selectiekriteria mogelijk.

De geselecteerde hybride cellen worden verder opgekweekt in een geschikt kweekmedium, bijvoorbeeld het » genoemde RPMI-medium met toevoegsels, en vormen dan een 10 continue cellijn, waaraan te allen tijde cellen voor analytische toepassing kunnen worden onttrokken.

Bij voorkeur worden de cellijnen voorafgaand aan de toepassing, en nadat aan het kweekmedium 10 vol.% dimethylsulfoxide is toegevoegd, in vloeibare stikstof ingevroren.

15 De bereiding van de continue fagocyt-cellijnen wordt door het volgende, niet-beperkende voorbeeld geïllustreerd. Hoewel daarin uitsluitend over macrofagen en tumorcellen uit muizen wordt gesproken zal het duidelijk zijn dat fagocyt-cellijnen van menselijke oorsprong zich op dezelfde 20 wijze laten bereiden.

8401221 -7-

Voorbeeld I

Bereiding van continue fagocyt-cellijnen

Een aantal continue fagocyt-cellijnen werd bereid door celfusie van muize-macrofagen met geschikte murine 5 tumorcellen, gevolgd door kloneren, subkloneren en selecteren van de verkregen hybride cellen.

Isolering van macrofagen

Macrofagen werden geïsoleerd uit de milt of het buikvlies van muizen, waarbij de muizen in het laatste geval 10 drie dagen tevoren met lectine (Concanavaline A, Sigma

Corporation) waren geënt. De macrofagen werden van verontreinigende lymfoide cellen bevrijd door ze in een Petrischaal met kweekmedium te brengen, waar zij zich aan de bodem hechtten. Na verwijdering van het kweekmedium, gevolgd door 15 spoelen, werden de aanhechtende macrofagen voorzichtig van de Petrischaal afgeschraapt en waren zij gereed voor celfusie .

Tumor-cellijn

De gebruikte tumor-cellijn was afkomstig van muizen-20 lymfosarcoom J774. Deze tumor J774 ontstond in een vrouwelijke muis van de stam BALB/c in het National Institute of Health, USA, in 1968 tijdens een plasmacytoom-industrie-programma (vergelijk J. Immunol. 107, 927, 1971). Uit een celkweek van tumor J774 is door kloneren een cellijn J774.2 25 afgeleid, die verkrijgbaar is bij het Albert Einstein College of Medicine, Bronx, N.Y. USA.

De cellijn J774.2 werd verder gekweekt in een medium dat 25 nM 8-azaguanine bevatte, teneinde een variant te vinden die tegen azaguanine bestand was. Na diverse 30 overentingen in hetzelfde medium werd een mutant . met de aanduiding C2E2-HAT verkregen, die bestand tegen azaguanine en gevoelig voor HAT-medium was. Deze cellijn C2E2-HAT werd als fusiepartner voor de muizen-macrofagen gebruikt.

Vorming van hybride cellen 35 In een proefbuis die 1 ml polyethyleenglycol (mol.

gewicht 1500, 50% in PBS, waarbij PBS een met fosfaat gebuf- 7 ferde fysiologische zoutoplossing is) werden 10 macrofaag- g cellen bij 37°C vermengd met 10 tumorcellen en gedurende 8401221 -8- 2 minuten dooreengemengd. De celsuspensie werd vervolgens langzaam verdund met kweekmedium (RPMI 1640 met toevoegsels) tot een eindvolume van 8 ml en daarna gecentrifugeerd bij 1800 rpm, De gewonnen cellen werden gesuspendeerd in een 5 HAT-medium en verdeeld over de holten van een microtiter-plaat met 96 holtes. De plaat werd bij 37°C geincubeerd in een vochtige atmosfeer met 5% CC^· Vanaf de dag 10 werden de holtes in de plaat zorgvuldig met een fasencontrastmicros-coop waargenomen. Hybride koloniën werden na 20-30 dagen 10 zichtbaar, waarna enkele cellen daarvan naar Petrischalen, gevuld met kweekmedium, werden overgebracht en op funktionele eigenschappen werden getest. Hybride cellen uit de koloniën die duidelijke macrofaag-eigenschappen vertoonden, werden ter subklonering verdeeld over agarplaten (0,33% agar van 15 Difco in kweekmedium) en daarop voortgekweekt. Na 10 tot 20 dagen verschenen zichtbare koloniën, die werden overgebracht naar platen met kweekmedium en daarop verder gekweekt, steeds bij 37°C en in een vochtige atmosfeer met 5% CC^.

Zodra zich voldoende cellen hadden gevormd, werden zij op 20 funktionele eigenschappen getest. Aan de hand van deze tests werd een aantal koloniën voor latere toepassing geselecteerd. Zij werden door regelmatig overenten in kweekmedium verder gekweekt als continue cellijn en soms door invriezen bij -70°C bewaard.

25 Tests op funktionele eigenschappen

Ter bepaling van de eigenschappen van de gevormde hybriden werden monsters daarvan, voor of na het kloneren in agar, aan de volgende tests onderworpen.

Bepaling Fc-receptorplaatsen.

30 Dit geschiedde door binding van met IgG beladen erythrocyten aan het membraan van de hybride macrofaag-cellen.

5

Circa 5x10 cellen werden aangebracht op een microscoop-glaasje en bedekt met een suspensie van met IgG beladen erythrocyten. Na 30 minuten bij 37°C werd het glaasje 35 gespoeld met kweekmedium en werd het aantal cellen, dat rosetten had gevormd, waargenomen. Een cel werd als positief beschouwd indien drie of meer erythrocyten daarop werden gevonden.

8401221 -9-

Fagocytose

Hiervoor werd dezelfde methode gebruikt als bij het bepalen van de Fc-receptorplaatsen. Na 30 minuten inwerking van de met IgG beladen erythrocyten werden de aan de 5 buitenzijde geadsorbeerde rode bloedcellen opgelost door 10 seconden dompelen in gedestilleerd water. Na spoelen met kweekmedium werden de hybride macrofaag-cellen onder een microscoop waargenomen en werd het aantal erythrocyten, dat door elke cel was opgenomen, vastgesteld.

10 De fagocytische werking werd ook bepaald door het opnemen van andere deeltjes zoals fluorescente bacteriën, fluorescente plasmodien en gistcellen.

Lysozyme-afscheiding

Cultuurvloeistoffen van de hybride cellen werden 15 toegevoegd aan holtes in een agarplaat, welke 1% agar en 1% deeltjes van Micrococcus luteus bevatte. De vorming van een kring rondom een holte werd als aanduiding beschouwd voor een actieve lysozyme-afscheiding.

Afscheiding van interleukine-1 20 Deze eigenschap werd getest door microscopisch na te gaan of een cultuurvloeistof van de hybride cellen het vermogen bezat om de vermeerdering van muizen-thymocyten in aanwezigheid van een stimulerende stof, namelijk fytohaemagglu-tine (PHA, een plant-lectine van Difco) te induceren.

25 Chemiluminescentie

Het uitzenden van licht door chemiluminescentie werd getest op de wijze van de latere voorbeelden. Als stimulerend middel werd een geopsoniseerd gistextract (Zymosan, Difco) of werden geopsoniseerde micrococcen 30 gebruikt. Als modulerend middel diende een lymfokinen-houdende cultuurvloeistof of een endotoxine-preparaat (Lipopoly-saccharide, Difco).

Resultaten

In tabel A zijn een aantal van de verkregen cel-35 lijnen met hun eigenschappen samengevat. De cellijnen waren afkomstig van een drietal fusie-experimenten, waarbij steeds tumorcellen van de cellijn C2E2-HAT werden gebruikt. In de experimenten 1 en 2 waren de macrofagen afkomstig uit de 8401221 -10- miltcellen van een BALB/c muis, terwijl de macrofagen bij experiment 3 afkomstig waren uit het buikvlies van een CBA muis na voorafgaande inductie met lectine.

De geteste eigenschappen waren de volgende: 5 Fc Fc-receptorplaatsen

Phago Fagocytose

Lys secretie van lysozyme IL-1 secretie van interleukine-1 CL chemiluminescentie met stimulator 10 CL+MO chemiluminescentie met stimulator en modulator

Voor de evaluatie van de diverse eigenschappen is de volgende schaal gebruikt: + sterk matig 15 - zwak

Bij de chemiluminescentie-eigenschappen komt dit ongeveer overeen met een maximale lichtintensiteit per 4 2.10 cellen van + >100.000 fotonen/min 20 + ca. 40.000 fotonen/min <1000 fotonen/min 8401221 9 -11-

TABEL A

Fusie Exp. Code No. Eigenschappen

Fc Phago Lys IL-1 CL CL+MO

1 Kloon 2C11 + ++++^ + subklonen 2C11-12 + + + + _+ + 2C11-D3 + - +- -+ 2C11-11 + ++-++ 2C11-3 + ++++ + 2 kloon LA5 + + ++^ + subkloon LA5-9 + +++++ 3 kloon C4 + + + - - + subklonen C4-2 + + +- -+ C4-5 + ++-- + C4-10 + ++-- +

Uit de tabel blijkt, dat alle geselecteerde cellijnen een duidelijk contrast in chemiluminescentie-eigen-schappen (CL en CL+MO) vertoonden. De cellijnen uit de groepen 2C11 en LA5 zijn voor latere analytische experimenten gebruikt (zie de voorbeelden II-X).

8401221 -12-

Analytische toepassingen

Volgens de uitvinding kunnen de hierboven beschreven fagocyt-cellijnen worden gebruikt voor diverse analytische toepassingen, in het bijzonder bij biologische vloeistoffen.

5 De uitvinding verschaft dan ook een werkwijze voor het analyseren van biologische vloeistoffen, welke gekenmerkt is doordat men een te analyseren vloeistof laat inwerken op hybride fagocyt-cellen, afkomstig van een continue fagocyt-cellijn, en daarna de chemiluminescentie van de zo 10 behandelde cellen meet, ter bepaling van fagocyt-stimu-lerende en/of modulerende faktoren in de geanalyseerde vloeistof.

De analyse berust op het reeds genoemde verschijnsel , dat fagocyt-cellen door bepaalde agentia kunnen worden 15 geactiveerd en tot uitzending van licht (chemiluminescentie) kunnen worden gebracht. Dit verschijnsel zal zich eveneens bij de cellen van een continue fagocyt-cellijn voordoen, mits men bij het selecteren van de hybride cellen voor de continue cellijn heeft zorggedragen dat de chemiluminescentie-eigenschap nog steeds 20 aanwezig is. De sterkte van het uitgezonden licht kan met geschikte apparatuur worden gemeten en vormt dan een aanduiding voor de aanwezigheid van stimulerende en/of modulerende faktoren in de te onderzoeken vloeistof.

Bij deze analyse is het nuttig, over een vergelij-25 kingsbasis te beschikken. Daarom voert men bij voorkeur ook een vergelijkingsproef uit, waarbij men de chemiluminescentie meet van fagocyt-cellen waarop de te analyseren vloeistof niet heeft ingewerkt, en vergelijkt men de meetresultaten van beide proeven met elkaar ter bepaling van de genoemde 30 stimulerende en/of modulerende faktoren.

Het verdient aanbeveling, de vergelijkingsproef gelijktijdig met de eigenlijke proef uit te voeren. Verder is het van belang, bij de vergelijkingsproef en de eigenlijke proef hetzelfde aantal hybride fagocyt-cellen, afkomstig van 35 dezelfde fagocyt-cellijn, te gebruiken. Op deze wijze worden verschillen in kwaliteit, aantal en capaciteit van de fagocyt-cellen uitgeschakeld, zodat het verschil in meetresultaat tussen de beide proeven alleen afkomstig kan zijn 8401221 -13- van faktoren in de te analyseren vloeistof.

Ter versterking van de chemiluminescentie wordt bij voorkeur tevens een chemiluminescerend substraat, zoals luminol of lucigenine aan de hybride fagocyt-cellen toege-5 voegd. Hierdoor worden de meetresultaten aan daardoor ook verschillen tussen de eigenlijke proef en de vergelijkings-proef duidelijker.

De optredende verschijnselen kunnen op eenvoudige wijze door reaktievergelijkingen worden verduidelijkt. Indien 10 men bijvoorbeeld aanneemt dat in de te analyseren vloeistof een stimulerende faktor of stimulator aanwezig is, kan de activering en lichtemissie als volgt worden weergegeven:

M(Zi + stimulator —> Μφ* + CLP —> CL

waarbij Μφ en M0* de fagocyt-cellen in ongeactiveerde resp.

15 geactiveerde toestand aangeven, CLP het chemiluminescerende substraat en CL de lichtemissie voorstelt. Indien de hoeveelheid en de capaciteit van de fagocyt-cellen, evenals de hoeveelheid chemiluminescerend substraat bij de eigenlijke proef en de vergelijkingsproef gelijk is, valt gemakkelijk 20 in te zien dat de mate van chemiluminescentie afhankelijk is van de aanwezigheid van de stimulator en ook van de hoeveelheid daarvan.

Neemt men aan dat de chemiluminescentie van de hybride fagocyt-cellen niet alleen wordt beïnvloed door een 25 stimulator maar ook door een modulerend agens (modulator) dat rechtstreeks op de fagocyt-cellen of op de stimulator inwerkt, dan krijgt men de vergelijking:

Μφ + stimulator + modulator —> M0* + CLP —^ CL

waarin de symbolen de eerdergenoemde betekenis hebben. Gemak-30 kelijk valt hier in te zien dat als de hoeveelheid en de capaciteit van de fagocyt-cellen alsmede de hoeveelheid stimulator en de hoeveelheid chemiluminescerend substraat in de eigenlijke proef en de vergelijkingsproef gelijk zijn, de mate van chemiluminescentie direkt afhankelijk is van 35 de aanwezigheid van een modulator in de te analyseren vloeistof en ook van de hoeveelheid daarvan.

Binnen het kader van de analysemethode volgens de uitvinding zijn een groot aantal praktische uitvoerings 8401221 -14- vormen denkbaar. Enkele daarvan zullen in het navolgende worden behandeld.

a) Bepaling van opsoniserende antilichamen of van de 5 corresponderende antigenen.

Indien men fagocyt-cellen samenbrengt met een stimulator en met een speficieke antilichamen tegen die stimulator, dan wordt vaak een veel sterkere chemiluminescen-tie verkregen dan bij gebruik van de stimulator alleen.

10 Het verschijnsel doet zich voor bij diverse stimu latoren, waaronder bacteriën (zoals micrococcen) en parasieten (zoals plasmodien en trypanosomen) en kan als volgt worden weergegeven:

+ stimulator + IgG-antilichaam -> M$* + CLP -> CL

15 waarin de symbolen de eerder aangegeven betekenis hebben.

Waarschijnlijk berust het verschijnsel op "opsoni-sering" van de stimulator door de antilichamen ter voorbereiding van fagocytose. De stimulatordeeltjes geraken met antilichamen beladen en zodra zij in de nabijheid van een 20 fagocyt-cel komen, hechten de antilichamen zich tevens aan het membraan van die fagocyt-cel (op de Fc-receptorplaatsen daarvan). Zodoende wordt een verbinding tussen de fagocyt-cel en de stimulatordeeltjes tot stand gebracht, die tot activering van de fagocyt-cel en tenslotte tot fagocytose I / ^ 25 leidt. Het gevolg is een sterke lichtemissie dan bij gebruik van de stimulator alleen.

Dit biedt de mogelijkheid om met behulp van bepaalde stimulatoren (zoals bacteriën of parasieten) de aanwezigheid van specifieke antilichamen daartegen en ook het gehalte 30 daarvan in een biologische vloeistof aan te tonen. Omgekeerd biedt dit verschijnsel ook de mogelijkheid om met behulp van specifieke antilichamen de aanwezigheid van bepaalde stimulatoren (zoals bacteriën of parasieten) en het gehalte daarvan in biologische vloeistoffen te bepalen.

. 35 Aangezien een sterke chemiluminescentie uitblijft bij gebruik van niet-opsoniserende antilichamen, kan het verschijnsel ook worden gebruikt om een onderscheid tussen opsoniserende en niet-opsoniserende antilichamen tegen de- 8401221 -15- zelfde stimulator, die als antigeen dient, aan te tonen.

b) Bepaling van complement.

Indien men fagocyt-cellen uit een continue cellijn 5 samenbrengt met een stimulator en met complement (een bepaalde immunologische faktor) dan wordt vaak een veel sterkere chemiluminescentie verkregen dan bij gebruik van de stimulator alleen. Dit verschijnsel doet zich vooral voor bij gebruik van een gistextract uit Saccharomyces cerevisiae en 10 van bepaalde gisten (Candida's) als stimulator. Het laat zich als volgt weergeven:

M0 + stimulator + complement —> M^* + CLP -> CL

waarin de symbolen de eerder aangegeven betekenis hebben.

In andere gevallen treedt een versterkte chemi-15 luminescentie pas op indien tevens antilichamen tegen de betreffende stimulator worden toegevoegd. Dit doet zich vooral voor bij gebruik van bepaalde bacteriën (bijvoorbeeld Streptococcen) als stimulator. Het kan als volgt worden weergegeven:

20 M(z5 + stimul. + IgG-antilichaam + complem. —> M$* + CLP —^ CL

waarin de symbolen de eerder aangegeven betekenis hebben.

Beide verschijnselen berusten waarschijnlijk op opsonisering van de stimulator door het aanwezige complement, zonder of met tussenkomst van de genoemde antilichamen, 25 ter voorbereiding van fagocytose. De stimulatordeeltjes geraken met complement beladen en zodra in de nabijheid van een fagocyt-cel komen, zal het complement zich tevens aan het membraan van die fagocyt-cel (op de C3b-receptorplaatsen daarvan) hechten. Zodoende wordt een verbinding tussen de 30 fagocyt-cel en de stimulatordeeltjes tot stand gebracht, die tot fagocytose, activering van het zuurstof-redoxmetabo-lisme en tenslotte tot chemiluminescentie leidt. Het gevolg is een sterkere lichtemissie dan bij gebruik van de stimulator alleen.

35 Dit biedt de mogelijkheid om met behulp van bepaal de stimulatoren (zoals gistextract of streptococcen) en zonodig antilichamen daartegen de aanwezigheid en ook het gehalte van complement in een biologische vloeistof te 8401221 -16- bepalen.

Het omgekeerde, namelijk de bepaling van een stimulator in biologische vloeistoffen met behulp van complement, laat zich minder eenvoudig verwezenlijken. Bepaling 5 van een stimulator zoals gistextract met behulp van complement alleen is niet goed mogelijk, omdat complement met diverse stimulatoren reageert; wel kan de chemiluminescentie-test dan worden gebruikt om met behulp van complement een "screening" van diverse stimulatoren uit te voeren. Een 10 kwalitatieve of kwantitatieve bepaling van stimulatoren zoals streptococcen met behulp van complement en antilichamen is wel goed mogelijk, omdat de antilichamen dan specifiek voor de betreffende stimulator zijn.

15 c) Bepaling van inhibitoren.

Gebleken is, dat de werking van stimulatoren op de chemiluminescentie van fagocyt-cellen soms door bepaalde faktoren in de biologische vloeistoffen wordt afgeremd. Voorbeelden van dergelijke faktoren of inhibitoren zijn: 20 Fc-fragmenten, C3-fragmenten, opsoniserende immuuncomplexen, natuurlijke of synthetische Fc-peptiden, anti-Fc-antilichamen en anti-C3-antilichamen.

Terwijl bijvoorbeeld de lichtemissie door samenbrengen van fagocyt-cellen met een bacterie en specifieke 25 antilichamen daartegen kan worden versterkt, kan de lichtemissie door samenbrenging van fagocyt-cellen met bacteriën en losse Fc-fragmenten (fragmenten van antilichamen) worden verzwakt.

Dit biedt een mogelijkheid om de aanwezigheid en 30 het gehalte van dergelijke inhibitoren in biologische vloeistoffen te bepalen. Er zal dan meer dan één vergelijkingsproef nodig zijn, bijvoorbeeld een proef met de stimulator alleen, een proef met de stimulator en antilichamen, een proef met de stimulator en complement etc. maar dit behoeft geen 35 bezwaar te zijn.

8401221 -17- d) Bepaling van membraan-specifieke antilichamen.

Indien men fagocyt-cellen uit een continue cellijn samenbrengt met ^antilichamen die specifiek op het membraan van dergelijke fagocyt-cellen reageren (membraan-specifieke 5 antilichamen) dan werken dergelijke antilichamen vaak stimulerend op de chemiluminescentie.

Dit verschijnsel kan als volgt worden weergegeven:

Μφ + anti-M^-antilichamen —^ M?5* + CLP > CL

waarin de symbolen de eerder aangegeven betekenis hebben.

10 Daarnaast blijken dezelfde antilichamen vaak remmend te werken op gebruikelijke stimulatoren voor de chemiluminescentie, hetgeen tot uiting komt als men de fagocyt-cellen met dergelijke stimulatoren en dergelijke antilichamen samenbrengt.

15 Deze verschijnselen te zamen bieden een mogelijkheid om anti-membraan-antilichamen kwalitatief en kwantitatief in biologische vloeistoffen te bepalen. Uiteraard zijn dan tenminste twee proeven (met en zonder stimulator) nodig.

Verder blijken de uitkomsten afhankelijk van het type fagocyt-20 cellijn te zijn, zodat parallele proeven met tenminste twee verschillende cellijnen gewenst zijn.

e) Bepaling van membraan-specifieke lectinen.

Ook bepaalde lectinen, die specifiek op het membraan 25 van de fagocyt-cellen kunnen inwerken (membraan-specifieke lectinen) werken stimulerend op de chemiluminescentie daarvan. Het verschijnsel kan als volgt worden weergegeven: Μφ + antimembraan-lectine —^ Μφ* + CLP —> CL waarin de symbolen, de aangegeven betekenis hebben.

30 De stimulerende werking van dergelijke lectinen kan worden geinhibeerd door bepaalde stoffen zoals mono-sacchariden.

Dit biedt een mogelijkheid om dergelijke lectinen en ook dergelijke monosacchariden in biologische vloeistoffen 35 kwalitatief en kwantitatief te bepalen.

8401221 -18- f) Bepaling van lymfokinen

De fagocyt-cellen van sommige cellijnen vertonen onder invloed van de gebruikelijke stimulatoren slechts een geringe chemiluminescentie. Indien men zulke fagocyt-cellen 5 echter vooraf incubeert met een zogenaamde modulator, laten zij zich vervolgens door een gebruikelijke stimulator vaak wel tot aanmerkelijke luminescentie stimuleren. Blijkbaar wordt door de modulator een verandering in de fagocyt-cel teweeggebracht, die maakt dat de fagocyt-cel beter op de 10 stimulator reageert.

Het verschijnsel kan als volgt worden weergegeven: M0 + modulator —> M0(r)

M0(r) + stimulator —> M0* + CLP —^ CL

waarin M$(r) de reaktieve fagocyt-cel weergeeft en de andere 15 symbolen de eerder aangegeven betekenis hebben.

Als stimulator zijn alle gebruikelijke stimulatoren mogelijk. Als modulator dienen vooral lymfokinen, dat wil zeggen oplosbare immunologische faktoren die door geactiveerde lymfocyten maar ook door gamma-interferon worden geleverd.

20 Het verschijnsel biedt de mogelijkheid om lymfo kinen en interferon kwalitatief en kwantitatief in biologische vloeistoffen te bepalen. Verder biedt het de mogelijkheid om de diverse stappen bij de zuivering van lymfokinen-prepa-raten of interferon-preparaten analytisch te volgen.

25 g) Bepaling van endotoxinen.

Als modulator zijn ook endotoxinen, bijvoorbeeld lipopolysacchariden mogelijk. Incubeert men derhalve fagocyt-cellen (die met een Stimulator alleen slechts een geringe 30 chemiluminescentie geven) vooraf met endotoxinen en brengt men ze vervolgens samen met een gebruikelijke stimulator, dan wordt een aanmerkelijke chemiluminescentie verkregen.

Het verschijnsel kan dienen om endotoxinen in biologische vloeistoffen kwalitatief en kwantitatief te 35 bepalen.

Verder blijken de endotoxinen soms een synergistische en soms een antagonistische werking op lymfokinen te hebben.

Met andere woorden: indien men fagocyt-cellen (die met een stimulator alleen slechts een geringe chemiluminescentie 8401221

< I

-19- leveren) vooraf incubeert met een mengsel van lymfokinen en endotoxinen, en dan samenbrengt met een stimulator, wordt afhankelijk van de gebruikte fagocyt-cellijn, soms een versterkte en soms een verzwakte chemiluminescentie ver-5 kregen.

Het verschijnsel van synergisme of antagonisme biedt de mogelijkheid om lymfokinen en endotoxinen van elkaar te onderscheiden, en ze afzonderlijk in biologische vloeistoffen te bepalen. Uiteraard zal men dan proeven met meer 10 dan 1 cellijn moeten nemen.

h) Bepaling toxische stoffen.

Gebleken is, dat diverse toxische stoffen invloed hebben op de modulerende werking van lymfokinen. Indien men 15 derhalve fagocyt-cellen uit een fagocyt-cellijn eerst incubeert met een combinatie van lymfokinen (of een andere modulator) en een toxische stof, en vervolgens samenbrengt met een gebruikelijke stimulator, dan blijkt de chemiluminescentie vaak zwakker te zijn dan bij gebruik van de modu-20 lator en de stimulator alleen.

Het verschijnsel doet zich voor met een groot aantal chemische stoffen van toxische aard. Dit biedt derhalve de mogelijkheid om toxische stoffen kwalitatief en kwantitatief in biologische vloeistoffen aan te tonen. Verder biedt 25 het de mogelijkheid tot toxicologische screening van farmaceutische preparaten, zonder gebruik van proefdieren.

Het zal duidelijk zijn, dat de gegeven lijst van bijzondere gevallen nog met vele andere kan worden aange-30 vuld, zonder buiten het kader van de uitvinding te treden.

Verder zal het duidelijk zijn dat de analysemethode volgens de uitvinding toepassing kan vinden op het gebied van biotechnisch, klinisch en farmacologisch onderzoek. Met name de toxicologische screening van farmaceutica lijkt een 35 uitermate belangrijke toepassing te zijn. Bij klinisch onderzoek kan de analysemethode (bijvoorbeeld bij de detectie van lymfokinen of interferon) tot een zekere indicatie over de aard van het ziektebeeld leiden zodat de diagnose wordt 8401221 -20- vergemakkelijkt. Op biotechnisch gebied kan men met de analysemethode volgens de uitvinding tot een goede onderzoeksstrategie voor het opsporen van bacteriën, gisten en parasieten komen. Andere mogelijkheden zullen de deskundige 5 duidelijk zijn.

De analysemethode volgens de uitvinding wordt geïllustreerd door de volgende, niet beperkende voorbeelden, waarin tevens mogelijkheden voor verdergaande toepassing zijn 10 aangegeven.

Voorbeeld II

Bepaling van opsoniserende antilichamen in een serum.

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie gemeten van hybride macrofaag-cellen na stimulering door micrococcen 15 met of zonder toevoeging van een micrococcen-antiserum.

De macrofaag-cellen waren afkomstig van de cellijn 2C11-12 uit tabel A. De micrococcen bestonden uit Micrococcus luteus (afkomstig van Worthington Biochem. Corp., New Jersey). Zij werden voor het gebruik driemaal gewassen met een fysio-20 logische zoutoplossing, gehersuspendeerd in fysiologische zoutoplossing tot een concentratie van 4 mg/ml en bij -70°C bewaard.

Het antiserum was bereid door konijnen intraveneus in te spuiten met 2 mg aan micrococcen (12 inspuitingen, 25 verspreid over 4 weken), daarna bloed af te tappen en serum uit het bloed te winnen.

Voor het uitvoeren van de proeven werden de macrofaag-cellen vanuit Petrischalen overgebracht naar kunststof-cuvetten (PCT-cuvetten, Lumac 4960) enwel zodanig dat zich 4 30 in elke cuvet 1 ml celsuspensie met 2x10 cellen bevond. Vervolgens werden de cuvetten 2-3 dagen geincubeerd. Na de incubatie werd het kweekmedium verv/ijderd en vervangen door een gelijke hoeveelheid met Veronal gebufferde fysiologische zoutoplossing, die per liter 8,3 g natriumchloride, 1,02 g 35 Na-5,5-diethylbarbituraat, 102 mg MgCl2, 22 mg CaCl2, 200 mg runderserumalbumine, 200 mg glucose en 3,5 ml 1N zoutzuur bevatte. Verder werd per cuvet 100 μΐ 0,2 mM Luminol-oplos-sing (Sigma Chemical Corp., St. Louis, Mo) toegevoegd, als 8401221 -21- ook 200 /ug micrococcen en (in sommige proeven) 10 pl micro-coccen-antiserum. Het verkregen mengsel werd op chemilumi-nescentie getest in een toestel van het type Biolumat 9505 (Laboratorium Prof. Dr. Berthold, Wildbad, Bondsrepubliek 5 Duitsland). De kinetica van de lichtemissie werden opgetekend in parallele experimenten over een tijdsduur van een half uur.

In de grafiek van fig. 1 is de maximale lichtintensiteit van de macrofaag-cellen bij de proeven weerge-10 geven, uitgedrukt in CPM, dat wil zeggen getelde fotonen per minuut. Duidelijk blijkt dat de door de micrococcen gestimuleerde lichtemissie door het micrococcen-antiserum wordt versterkt, hetgeen een mogelijkheid biedt om de aanwezigheid van opsoniserende antilichamen tegen micrococcen in het anti-15 serum aan te tonen en het gehalte daarvan te bepalen.

Verder biedt de proef ook een mogelijkheid om de aanwezigheid van micrococcen in een serum en het gehalte daarvan aan te tonen, aangezien het micrococcen-antiserum op zichzelf geen activerende werking op macrofaag-cellen 20 heeft en derhalve zonder aanwezigheid van micrococcen geen chemiluminescentie veroorzaakt.

Voorbeeld III

Bepaling van complement in een serum.

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie gemeten 25 van hybride macrofaag-cellen na stimulering door gistextract, met of zonder toevoeging van een complement-preparaat.

De macrofaag-cellen waren afkomstig van de cellijn 2C11-12 uit tabel A. Het gistextract (Zymosan van Sigma Chem. Corp.) was een extract van Saccharomyces cerevisiae.

30 Het werd voor het gebruik eerst 1 uur in een fysiologische zoutoplossing gekookt, dan in een verse fysiologische zoutoplossing gesuspendeerd tot een concentratie van 25 mg/ml en bewaard bij -70°C. Het complementpreparaat was een complement-houdend cavia-serum (Behringwerke, Marburg, 35 Bondsrepubliek Duitsland).

De chemiluminescentieproeven werden op dezelfde wijze uitgevoerd als in voorbeeld II, waarbij per cuvet 50 Jig gistextract en (in sommige proeven) 0,1 jil complementpreparaat werd gebruikt. De resultaten, uitgedrukt in de 8401221 -22- maxima le lichtintensiteit, zijn weergegeven in fig. 2.

Uit de resultaten blijkt dat de door het gist-extract gestimuleerde luchtemissie van de macrofaag-cellen door complementpreparaat wordt versterkt. Dit biedt een 5 mogelijkheid om de aanwezigheid van complement in een bloed-serum aan te tonen en het gehalte daarvan te bepalen.

Omgekeerd biedt de proef een mogelijkheid om diverse stimulatoren te screenen op hun reaktie met complement.

10 Voorbeeld IV

Bepaling van lymfokinen in biologische vloeistoffen.

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie gemeten van macrofaag-cellen na stimulering door een gist-extract, met of zonder voorafgaande modulering door een lymfokinen-15 preparaat.

De macrofaag-cellen waren afkomstig van de cellijnen 2C11-D3 en 2C11-12 uit tabel A. Het als stimulator dienende gistextract (Zymosan) was gelijk aan dat van voorbeeld III.

Het lymfokinen-preparaat (LK-SN) was bereid door miltcellen 20 van ratten in een concentratie van 5 x 10/ml te kweken in een medium dat Concanavaline A (Con A, Sigma) in een eind-concentratie van 1 pg/ml bevatte. Na 48 uren werd de kweek-vloeistof gewonnen, 10 minuten gecentrifugeerd bij 1500 rpm, en gefiltreerd door een 0,2 pa filter.

25 Voor het uitvoeren van de proeven werden de micro- faag-cellen vanuit Petrischalen overgebracht naar cuvetten (PST-cuvetten, Lumac 4960) enwel zodanig dat elke cuvet 1 ml 4 celsuspensie met 2 x 10 macrofaag-cellen bevatte. Tevens werd 0 μΐ op 50 μΐ of 100 μΐ lymfokinen-preparaat toegevoegd, 30 waarna de cuvetten 2-3 dagen werden geincubeerd. Na de incubatie werd het kweekmedium verwijderd en vervangen door een gelijke hoeveelheid met Veronal gebufferde fysiologische zoutoplossing (dezelfde als in voorbeeld II). Verder werd per cuvet 100 μΐ 0,2 mM luminol-oplossing en 50 pg gist-35 extract toegevoegd. De verkregen mengsels werden op chemiluminescentie getest in een toestel van het type Biolumat 9505. De kinetica van de lichtemissie werden opgetekend in parallele experimenten over een tijdsduur van een half uur.

8401221 -23-

In de grafiek van fig. 3 is de maximale lichtintensiteit van de macrofaag-cellen bij de proeven weergegeven. Uit deze grafiek blijkt dat de macrofaag-cellen die door het gistextract alleen slechts in geringe mate worden 5 gestimuleerd, na voorafgaande incubatie met het lymfokinen-preparaat wel een duidelijke stimulering door gistextract vertonen, en tevens dat de lichtemissie afhankelijk is van de gebruikte dosis van het lymfokinen-preparaat. Dit wijst op een modulerende werking van het lymfokinen-preparaat en 10 biedt een goede mogelijkheid om lymfokinen in biologische vloeistoffen kwalitatief en kwantitatief te bepalen.

Voorbeeld V

Bepaling van interferon in biologische vloeistoffen.

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie 15 gemeten van macrofaag-cellen na stimulering door bacteriën of een gistextract, met of zonder voorafgaande incubatie van de cellen met een interferon-preparaat.

De macrofaag-cellen waren afkomstig van de cellijn 2C11-D3 uit tabel A. Voor de stimulering werd eenzelfde 20 gistextract (Zymosan) als in voorbeeld III en werden dezelfde micrococcen als in voorbeeld II gebruikt. Het modulerende interf eron-preparaat (een met γ^-interferon verrijkt serum, aangeduid als IFN~yj was bereid door muizen eerst intraveneus in te spuiten met tuberkel bacillen (BCG-stam GL2) in een g 25 dosis van 5 x 10 bacillen per mg per 0,2 ml per muis, en ze twee weken later intraveneus in te spuiten met tuberculine (PPD, Instituut Pasteur van Brabant) in een dosis van 1 mg per 0,2 ml per muis. Vanaf 4 uren na het inspuiten van het tuberculine werden bloedmonsters genomen en werd serum 30 daaruit gewonnen. De interferontiter van het serum werd bepaald met een virusplekken-verkleiningstest onder gebruikmaking van muizecellen van het type L-929 en van vesiculair stomatitis-virus (VSV).

De proeven werden uitgevoerd op dezelfde wijze als 35 in voorbeeld IV, waarbij de pre-incubatie geschiedde zonder enige toevoeging of met toevoeging van 10 eenheden of 1 eenheid interferon-preparaat. De stimulering geschiedde met 50 pg gistextract of 200 pg micrococcen. De resultaten zijn weer- 8401221 -24- gegeven in fig. 4.

Uit de resultaten blijkt dat de door micrococcen of gistextract gestimuleerd lichtemissie van de macrofaag-cellen door voorafgaande incubatie met een interferon-5 preparaat wordt versterkt en ook dat de mate van versterking duidelijk afhankelijk van de dosis van het interferon-preparaat. Dit biedt een goede mogelijkheid om de aanwezigheid van interferon in biologische stoffen aan te tonen en ook het gehalte daarvan te bepalen.

10 Voorbeeld VI

Bepaling van lymfokinen of interferon in biologische vloeistoffen .

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie gemeten van macrofaag-cellen na stimulering door gistextract, met 15 of zonder voorafgaande incubatie met een lymfokinen-preparaat of een interferon-preparaat.

De macrofaag-cellen waren afkomstig van de cellijnen 2C11-12 en LA5-9 uit tabel A. Het gistextract (Zymosan) was gelijk aan dat van voorbeeld III. Het lymfokinen-preparaat 20 (LK-SN) was gelijk aan dat van voorbeeld IV en het interferon-preparaat (IFN-^) was gelijk aan dat van voorbeeld V. De chemiluminescentieproeven werden op dezelfde wijze als in voorbeeld IV en V uitgevoerd, waarbij de voorafgaande incubatie geschiedde zonder enige toevoeging of met toevoe-25 ging van 50 μΐ lymfokinen-preparaat of van 10 eenheden interferon-preparaat. Het stimulerende gistextract werd gebruikt in eën hoeveelheid van 50 pg per cuvet. De resultaten zijn weergegeven in fig. 5.

Uit de resultaten blijkt dat de door het gistextract 30 (Zymosan) gestimuleerde lichtemissie van beide typen macrofaag-cellen door voorafgaande incubatie met het lymfokinen-preparaat of het interferon-preparaat wordt versterkt. De macrofaag-cellen uit de cellijn 2C11—12 reageren sterker op het interferon-preparaat, terwijl de macrofaag-cellen uit 35 de cellijn LA5-9 sterker reageren op het lymfokinen-preparaat uit geactiveerde lymfocyten. Dit maakt het mogelijk, niet alleen de aanwezigheid van lymfokinen en interferon in biologische vloeistoffen aan te tonen en het gehalte daarvan 8401221 -25- te bepalen, maar ook om een onderscheid tussen lymfokinen en interferon (oftewel een onderscheid tussen lymfokinen van verschillende oorsprong) te maken.

Voorbeeld VII

5 Bepaling van opsoniserende antilichamen in een serum.

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie gemeten van hybride macrofaag-cellen na stimulering door parasieten (pathogene protozoën), met of zonder toevoeging van specifieke antilichamen tegen deze parasieten.

10 a) In een eerste reeks proeven werd de parasiet

Plasmodium chabaudi (verwekker van malaria) gebruikt, die in rode bloedcellen (erythrocyten) leeft. Er werden drie soorten stimulatoren gebruikt, namelijk een normaal erythro-cyten-preparaat, een geïnfecteerd erythrocyten-preparaat en 15 een anti-plasmodium-antiserum. Het normale erythrocyten- preparaat (aangeduid als ERY(N)) was verkregen uit het bloed g van gezonde muizen en bevatte 10 rode bloedcellen per 10 μΐ.

Het geïnfecteerde erythrocyten-preparaat (aangeduid als ERY(I)) was verkregen door muizen eerst te infekteren 20 met plasmodium, daarna bloed af te tappen en daaruit de rode bloedcellen te winnen. Onder een microscoop bleek 30-40% van de rode bloedcellen door plasmodium te zijn geinfekteerd. Het anti-plasmodium-antiserum (aangeduid als anti-Pc) was verkregen door bloed af te tappen van muizen, die een infektie 25 met Plasmodium chabaudi hadden overleefd, en daaruit een serum te winnen.

De macrofaag-cellen waren afkomstig uit de cellijn 2C11-12 van tabel A en werden vooraf geincubeerd met een modulator ter versterking van het contrast bij de licht-30 emissie. De modulator bestond uit een interferon-preparaat (IFN-γ) volgens voorbeeld V of een lymfokinen-preparaat (LK-SN) volgens voorbeeld IV.

De proeven werden uitgevoerd op de wijze van voorbeeld IV, waarbij de voorafgaande incubatie geschiedde met 35 toevoeging van 10 eenheden interferon-preparaat of 50 μΐ lymfokinen-preparaat. De stimulering geschiedde met 1 μΐ normaal erythrocyten-preparaat of 1 μΐ geinfekteerd erythro-cytenpreparaat, beide met of zonder 1 μΐ antiserum.

8401221 » · -26-

In de grafiek van fig. 6 is de maximale lichtintensiteit van de macrofaag-cellen bij de proeven weergegeven, uitgedrukt in CPM. Duidelijk blijkt dat alleen de combinatie van plasmodium (geinfekteerde erythrocyten) met anti-5 plasmodium-antiserum een sterke lichtemissie stimuleert, in duidelijk contrast tot plasmodium alleen of een combinatie van antiserum met normale erythrocyten. Het contrast is door de modulator versterkt.

Dit biedt een mogelijkheid om antilichamen tegen 10 plasmodium en eventueel ook de plasmodium zelf kwalitatief en kwantitatief in bloed te bepalen.

b) In een tweede reeks proeven werd gebruik gemaakt van de parasiet Trypanosoma brucei (verwekker van slaapziekte). Deze parasiet leeft extra cellulair zodat geen erythrocyten 15 nodig waren.

Als stimulator werden twee preparaten gebruikt, namelijk een trypanosomen-preparaat en een antiserum. Het 5 trypanosomen-preparaat (Tryp) bevatte 10 cellen per 1 μΐ en was verkregen door bloed af te tappen van geinfekteerde 20 muizen en dit bloed te centrifugeren (de trypanosomen blijven boven drijven). Het antiserum (Anti-Tryp) was verkregen door bloed af te tappen van geinfekteerde muizen die de infektie met trypanosomen hadden overleefd, en daaruit een IgG-houdend serum te winnen.

25 De macrofaag-cellen waren afkomstig van de cellijn LA5-9 uit tabel A en werden ter versterking*van het contrast vooraf geincubeerd met een modulator, bestaande uit een lymfokinen-preparaat (LK-SN), gelijk aan dat van voorbeeld IV.

30 De chemiluminescentieproeven werden uitgevoerd op de wijze van voorbeeld IV, waarbij de voorafgaande incubatie geschiedde met toevoeging van 50 pl lymfokinen-preparaat. De stimulering geschiedde met 1 pl trypanosomen-preparaat, met of zonder 1 pl antiserum.

35 In de grafiek van fig. 6 onderaan is de maximale lichtintensiteit van de macrofaag-cellen bij de proeven weergegeven, uitgedrukt in CPM. Duidelijk blijkt dat de door trypanosomen gestimuleerde lichtemissie door toevoeging van 8401221 -21- • »

Ben antiserum daartegen aanzienlijk wordt versterkt. Het contrast is groot, dankzij de vooraf gebruikte modulator.

De proef biedt een mogelijkheid om antilichamen tegen trypanosomen of omgekeerd de trypanosomen zelf kwali-5 tatief en kwantitatief in bloed aan te tonen.

Voorbeeld VIII

Bepaling van membraan-specifieke antilichamen.

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie gemeten van hybride macrofaag-cellen na stimulering door membraan-10 specifieke antilichamen, en ook de chemiluminescentie van hybride macrofaag-cellen na stimulering door bacteriën met of zonder membraan-specifieke antilichamen.

De macrofaag-cellen waren afkomstig van de cellijnen 2C11—12 en LA5-9 uit tabel A. De membraan-specifieke anti-15 lichamen waren bereid door macrofaag-cellen van de cellijnen 2C11—12 en LA5-9 bij muizen in te spuiten, daarna bloed af te tappen en uit het bloed een serum met de specifieke antilichamen (anti-2C11-12 en anti-LA5-9) in gezuiverde toestand te winnen. Verder werd nog een antiserum zonder 20 membraan-specifieke werking (aangeduid als IgG) ter kontrole gebruikt.

De chemiluminescentieproeven werden uitgevoerd op de wijze van voorbeeld II, waarbij de stimulatie aanvankelijk geschiedde met één der drie antilichaam-preparaten, 25 telkens in een hoeveelheid van 100 ug per cuvet.

Nadat de stimulering door de antilichaam-preparaten was gemeten, werden aan elke cuvet 200 ug micrococcen (dezelfde als in voorbeeld II) toegevoegd en werd de chemiluminescentie opnieuw gemeten.

30 In het rechter gedeelte van fig. 7 is de maximale lichtintensiteit van de chemiluminescentie tijdens het eerste gedeelte van de proeven weergegeven. Duidelijk blijkt dat de membraan-specifieke antilichamen bij één der cellijnen stimulerend op de chemiluminescentie werken, en bij 35 de andere cellijn nauwelijks invloed hebben.

In het linker gedeelte van fig. 7 is de vermindering van de maximale lichtintensiteit (ten opzichte van de door micrococcen alleen opgewekte lichtemissie) aangegeven.

8401221 * * -28-

Hieruit blijkt dat de membraan-specifieke antilichamen een remmende werking op een gebruikelijke stimulator (micro-coccen) uitoefenen.

Beide verschijnselen te zamen bieden de mogelijk-5 heid om membraan-specifieke antilichamen in biologische vloeistoffen kwalitatief en kwantitatief aan te tonen.

Voorbeeld IX

Bepaling van endotoxinen in biologische vloeistoffen.

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie gemeten 10 van hybride macrofaag-cellen na stimulering door micrococcen en met voorafgaande incubatie met lymfokinen, endotoxinen of combinaties daarvan.

De macrofaag-cellen waren afkomstig uit de cellijnen 2C11—12 en LA5-9 van tabel A. De stimulering geschiedde 15 met micrococcen (dezelfde als in voorbeeld II). Als modulator werd een lymfokinen-preparaat (LK-SN) volgens voorbeeld IV of een endotoxinen-preparaat (Lipopolysaccharide van Sigma Chemical Corp., aangeduid als LPS) gebruikt.

De chemiluminescentieproeven werden uitgevoerd op 20 de wijze van voorbeeld IV, waarbij de stimulatie geschiedde met 200 μg micrococcen. De voorafgaande incubatie geschiedde met 100 μΐ lymfokinen-preparaat of 10 pg lipopolysaccharide of met een combinatie van beide.

In de grafiek van fig. 8 is de maximale licht-25 intensiteit van de proeven weergegeven. Duidelijk blijkt dat zowel het lymfokinen-preparaat als het lipopolysaccharide de chemiluminescentie stimuleert. Verder blijkt dat bij combinatie van het lymfokinen-preparaat met het lipopolysaccharide een merkwaardig effekt optreedt: bij de cellijn 30 2C11-12 wordt de lichtemissie synergistisch versterkt en bij de cellijn LA5-9 wordt de lichtemissie antagonistisch verzwakt.

Deze resultaten bieden de mogelijkheid om lymfokinen en endotoxinen in biologische vloeistoffen te bepalen en ook goed van elkaar te onderscheiden.

35 Voorbeeld X

Bepaling van toxische stoffen.

In dit voorbeeld werd de chemiluminescentie gemeten van hybride macrofaag-cellen na stimulering met een gebruike 8401221 -29- lijke stimulator en voorafgaande incubering met lymfokinen, al dan niet in combinatie met een toxische stof.

De macrofaag-cellen waren afkomstig uit de cellijn 2C11-12 van tabel A. Als stimulator werd een gistextract 5 (Zymosan) volgens voorbeeld III of de stof Phorbol-myrystaat-acetaat (PMA van Sigma Chem. Corp.) gebruikt. Laatstgenoemde stof werd voor het gebruik opgelost in dimethylsulfoxide in een concentratie van 1 mg/ml en bij -70°C bewaard. Als modulator werd een lymfokinen-preparaat (LK-SN) volgens 10 voorbeeld IV en een interferon-preparaat (IFN-J') volgens voorbeeld V gebruikt, als ook de stof Lidocaine (Sigma Chem. Corp. L77-57), een bekend anestheticum.

De chemiluminescentieproeven werden uitgevoerd op de wijze van voorbeeld IV, waarbij de stimulatie geschiedde 15 met 50 Jig Zymosan of 10 μΐ PMA. De voorafgaande incubatie geschiedde met 100 pl lymfokinen-preparaat of 10 eenheden interferon-preparaat. Na 3 dagen incuberen werd bij sommige proeven 30 mmol Lidocaine toegevoegd, dat 10 min. mocht inwerken en vervolgens door decanteren werd verwijderd.

20 In de grafiek van fig. 9 is de maximale licht intensiteit bij de proeven uitgezet. Duidelijk blijkt dat de door voorafgaand incuberen met een modulator versterkte lichtemissie door de toevoeging van het Lidocaine vrijwel volledig is onderdrukt. Dit biedt een goede mogelijkheid om 25 Lidocaine en andere toxische stoffen in biologische vloeistoffen aan te tonen. Tevens biedt het een mogelijkheid tot toxicologische screening van farmaceutische stoffen.

Het zal duidelijk zijn dat binnen het kader van de uitvinding nog talrijke variaties op de beschreven uit-30 voeringsvormen mogelijk zijn.

8401221

Claims

1. Continue fagocyt-cellijnen, gekenmerkt door funktionele fagocyt-eigenschappen en het vermogen tot continue groei.

2. Werkwijze voor het bereiden van continue 5 fagocyt-cellijnen, gekenmerkt door een celfusie tussen fagocyten en geschikte tumorcellen, gevolgd door kloneren en selecteren van de verkregen hybriden.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de celfusie geschiedt door de fagocyten en tumorcellen 10 in een polyethyleenglycol-houdend medium samen te brengen en vervolgens ongefuseerde cellen door toevoeging van chemicaliën te vernietigen.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat het kontakt tussen fagocyten en tumorcellen 15 ongeveer 2 minuten duurt.

5. Werkwijze volgens conclusie 2-4, met het kenmerk, dat het vernietigen van de ongefuseerde cellen geschiedt met een medium dat hypoxanthine, aminopterine en thymidine bevat.

6. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de selectie van de hybride cellen geschiedt aan de hand van funktionele eigenschappen die door tests worden bepaald.

7. Werkwijze voor het analyseren van biologische vloeistoffen, met het kenmerk, dat men een te analyseren 25 vloeistof laat inwerken op hybride fagocyt-cellen, afkomstig van een continue fagocyt-cellijn, en daarna de chemilumines-centie van de zo behandelde fagocyt-cellen meet, ter aantoning van fagocyt-stimulerende en/of modulerende faktoren in de geanalyseerde vloeistof.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat men in een vergelijkingsproef de chemiluminescentie meet van fagocyt-cellen waarop de te analyseren vloeistof niet heeft ingewerkt, en dat men de meetresultaten van beide proeven met elkaar vergelijkt ter bepaling van fagocyt- 35 stimulerende en/of modulerende faktoren in de geanalyseerde vloeistof.

9. Werkwijze volgens conclusie 7 en 8, met het kenmerk, dat men de vergelijkingsproef gelijktijdig met de 8401221 -31- eigenlijke proef uitvoert.

10. Werkwijze volgens conclusie 7-9, met het kenmerk, dat men bij de vergelijkingsproef en de eigenlijke proef hetzelfde aantal hybride fagocyt-cellen, afkomstig van 5 dezelfde fagocyt-cellijn gebruikt.

11. Werkwijze volgens conclusie 7-10, met het kenmerk, dat men ter versterking van de chemiluminescentie tevens een chemiluminescerend substraat, zoals luminol of lucigenine aan de hybride fagocyt-cellen toevoegt.

12. Werkwijze volgens conclusie 7-11, met het kenmerk, dat men de hybride fagocyt-cellen samenbrengt met ; een gebruikelijke stimulator, met of zonder toevoeging van | i de te analyseren vloeistof, en dat men door meting van de ] chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarden de 15 aanwezigheid en het gehalte van specifieke antilichamen tegen de stimulator in de te analyseren vloeistof bepaalt.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de gebruikte stimulator bestaat uit bacteriën, zoals micrococcen, of uit parasieten, zoals plasmodien of trypa- 20 nosomen.

14. Werkwijze volgens conclusie 7-11, met het kenmerk, dat men de hybride fagocyt-cellen samenbrengt met antilichamen tegen een bepaalde stimulator, met of zonder toevoeging van de te analyseren vloeistof, en dat men door 25 meting van de chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarde de aanwezigheid en het gehalte van de bedoelde stimulator in de te analyseren vloeistof bepaalt.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de bedoelde stimulator bestaat uit bacteriën, zoals 30 micrococcen, of uit parasieten, zoals plasmodien of trypa-nosomen.

16. Werkwijze volgens conclusie 7-11, met het kenmerk, dat men de hybride fagocyt-cellen samenbrengt met een stimulator, met of zonder toevoeging van de te analyseren 35 vloeistof, en dat men door meting van de chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarden de aanwezigheid en het gehalte van complement in de te analyseren vloeistof bepaalt.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, 8401221 » -32- dat de stimulator bestaat uit gistextract of bepaalde gistsoörten. »

18. Werkwijze volgens conclusie 7-11, met het kenmerk, dat men de hybride fagocyt-cellen samenbrengt met 5 een gebruikelijke stimulator en met antilichamen daartegen, met of zonder toevoeging van de te analyseren vloeistof, en dat men door meting van de chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarden de aanwezigheid en het gehalte van complement in de te analyseren vloeistof bepaalt.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de stimulator bestaat uit streptococcen.

20. Werkwijze volgens conclusie 7-11. met het kenmerk, dat men de hybride fagocyt-cellen samenbrengt met een gebruikelijke stimulator en anderzijds met een stimulator 15 plus specifieke antilichamen daartegen, beide met of zonder toevoeging van de te analyseren vloeistof, en dat men door meting van de chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarden de aanwezigheid en het gehalte van remmende faktoren op de stimulator in de te analyseren vloeistof 20 bepaalt.

21. Werkwijze volgens conclusie 7-11, met het kenmerk, dat men de hybride fagocyt-cellen enerzijds alleen gebruikt en anderzijds samenbrengt met een gebruikelijke stimulator, beide met of zonder toevoeging van de te analy- 25 seren vloeistof, en dat men door meting van de chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarden de aanwezigheid en het gehalte van membraan-specifieke antilichamen in de te analyseren vloeistof bepaalt.

22. Werkwijze volgens conclusie 7-11, met het 30 kenmerk, dat men de hybride fagocyt-cellen samenbrengt met een gebruikelijke stimulator nadat de fagocyt-cellen vooraf al dan niet met de te analyseren vloeistof zijn geincubeerd, en dat men door meting van de chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarden de aanwezigheid en het gehalte 35 van een fagocyt-modulerende faktor in de te analyseren vloeistof bepaalt.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat de modulerende faktor bestaat uit lymfokinen of interferon. 8401221 HI * -33-

24. Werkwijze volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat de modulerende faktor bestaat uit endotoxinen.

25. Werkwijze volgens conclusie 7-11, met het kenmerk, dat men hybride fagocyt-cellen van een eerste 5 cellijn samenbrengt met een gebruikelijke stimulator, met of zonder voorafgaande incubatie met de te analyseren vloeistof, hybride fagocyt-cellen van een tweede cellijn eveneens samenbrengt met een gebruikelijke stimulator, met of zonder voorafgaande incubatie met de te analyseren vloeistof, en 10 dat men door meting van de chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarden de aanwezigheid en het gehalte van endotoxinen in de te analyseren vloeistof bepaalt.

26. Werkwijze volgens conclusie 7-11, met het kenmerk, dat men de hybride fagocyt-cellen samenbrengt met 15 een gebruikelijke stimulator na voorafgaande incubatie met een modulerend agens met of zonder toevoeging van te analyseren vloeistof, en dat men door meting van de chemiluminescentie en vergelijking van de meetwaarden de aanwezigheid en het gehalte van toxische stoffen in de te analyseren 20 vloeistof bepaalt.

27. Werkwijze volgens conclusie 26, met het kenmerk, dat het modulerende agens bestaat uit lymfokinen of interferon.

28. Werkwijze voor toxicologisch onderzoek van 25 farmaceutica, met het kenmerk, dat men daarbij de werkwijze van conclusie 26 of 27 toepast. 8401221