JPS5925699A - 酵素活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は 式（１） （Ｒ１はアミノ酸のカルボキシル基を介しエステル結合
した少くとも１つのアミノ酸基を示し、Ｒ２は水素また
はブロムを示す）で示される基ｊと、 酵素を反応させ、 酵素により（Ｉ）が水解されて生成すると、ＦＲ−ＩＴ
Ｒ塩と（Ｆｏｓｔ　Ｒｅｄ　ＩＴＲ塩、ＮＮ′−ジエチ
ル−４−メトキシメタニラミドジアゾニウム塩）とを反
応させることにより色素を生成させ その色素の月を測ることにより酵素活性を測定する方法 である。

ここでいう酵素とは化合物（１）を氷解することのでき
るＸ素である。つまりトリノ０シン、キモトす７０シン
、カリクレイン、プラスミン、スロンビン、アンチスロ
ンビン１１１、ウロキナービ、ｆａｃｔｏｒＸ町Ｃ１；
、Ｃ６等のセリングロテアービ、その他のプロプアーゼ
、ニスデラーゼおＪびその細化合物（１）を水房ずイこ
とのできる未知の酵素を包合する。

ずなわらここでいう酵素占件の測定とけ、上記Ｆ素の測
定はもちろん化合物（１）を用いた未知の酵素の測屋も
包Ωする。

未知の７素の測定としＣはたとえば血液、尿等の■気泳
１こ、るＡ台パターンの測定や、（胞染色におりる本発
明の使用を、その例としてあげることができる。

これら％−の中でトリプシン、ギモトリプシン、カリフ
レイン、プラスミン、スロンビン、アンチスロンビ／川
、ウロキナービ、ｆａｃｔｏｒＸａ　ＣＩｉ。

Ｃ」ｒ、の測５にｄける本発明の便用は特に潰れた方法
であＺ。

また、これ１の酵素ど基ｙの反応に、酵素のｆンヒビタ
ーがＴＥする時と、存在しない時の酵素占生の差を用足
することにＪリインヒビターを用足４２こともｅきる。

式（１）でＲｌノーミノ酸のカルボキシル基を介しエス
テル結自した少くども１つのアミノ酸基を示ず。

ここＣい９少しくとも１つのアミノ酸基とは、それぞれ
３独のアミノ酸！または同一もしくは異なる２〜４稍の
アミノ＝基からなるペプチド基で、そのＮ木端はツリー
またはアノル基な有している。

アミ夕の１どして＋、（１ｙ、八１ａ、Ｖｌ．。

ＬｅｌＩＩＪｅ、Ａｅし、Ｐｒｏ、Ｊ）＋、Ｆ目＋、（
ｌｕ。

ＰｙｒｏＱｉｕ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（ムイ”＋Ａｒ４、ワ
ｙｒのＬ（。

Ｄ体、ＤＬ体があげられる。

その中で１ｌがＡ−Ｈ３−１１Ｊ５−１１−Ｃ（−（Ａ
は水素またはアシル基を示しＲ３〜Ｒ５はＧｌｙ，Ａｌ
ａ，Ｖａｌ．Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｇｌｎ
，Ｇｌｕ，ｐｙｒｏＧｌｕまたは単結合を示しＲ６はＬ
ｙｓ，Ｌｙｓ（Ｍｅ），Ａｒｇ，またはＴｙｒを示す。

） である基質は、その例としてあげられる更に、 Ｒ１が　Ａ−Ｔｙｒ−、Ａ−Ａｒｇ−、Ａ−Ｌｙｓ−、
Ａ−（ｌｙ−Ｌｙｅ−。

Ａ−１ｘｅ−Ａｒ（、Ａ−（ｌｙ−（ｌｙ−Ａｒｇ−、
Ａ−Ｌｅｕ−（ｌｙ−Ａｌ（−ＩＡ−（］ｌ−Ｇ１ｙ−
Ａ１Ｊ−、Ａ　ｐ３ｌｏ（ｌｕ−４１ｙ−ＡｒＨ−ＩＡ
−Ｌｏｕ−Ａｉａ−Ａｒｇ−、Ａ−Ｐｉｏ−Ｐ＋ｅ−Ａ
ｒｇ−、Ａ−Ｖａｌ−ＬｅＬ−Ｌｙｅ−、Ａ−ＰＩｅ−
Ｖａｌ−Ａｒｇ−、Ａ−１１ｅ−（ｌｕ−Ｕｌｙ−Ａｌ
ｇ−。

である基ｔは好ましい例とし〔あげ）れる。

更に式（１）ｌＪｏＦＩ−Ｌｙｅ−１−Ｎ；、Ａｃ−Ｔ
ｙｒ−α−ＮＥｎｚ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−α−１
化、Ａｃ−Ｐ＋ｅ−Ａｒｇ−α−ＮＦ＋−Ｊｔｏ−Ｐｂ
ｅ−Ａ１ｇ−ｒ−ＩＥ、Ａｃ−（ｌｙ−Ｌｙｅ−α−１
Ｆでｔる基質はかに好ましい例どしてあげられる。

式（１）でＪ２０水素才たはプロツＣ，ブロム置換体は
、６位にブロノの結合した化）物がその例とし〔あげら
れる。

すなわち本発明の方法における化合物（１）は、上Ｃの
少なくとも１つのアミノ酸系のＣ末端カルボキシル基と
が エステル結 合した化合勿である。

酵素と基質の反応時間と、反応温度は、酵素と基質の反
応性、畦等によって決められるか、反応時間は一般に１
時間以内ｅあり、反応温度は一般に２０℃〜４０℃であ
る。好適には３０秒〜９０分で、２０’〜６７Ｏで反応
を行う。Ｆｉ−ＩＴＲパ（ｌａｓｔ　Ｒｅｄ　ＩＬＪ盆
、Ｎ、Ｎ’−ジエチル−４−メトキシメタニラミドジｆ
ゾニウム塩）は、次のり造をもち、好適には１％２Ｚｎ
Ｃ１２が伺加された（Ｘはハロゲンを示す） 状態で使用される。酵素により化イ吻（１）が水カされ
て生成する とＦＲ−ＩＴＲ 塩とが反応することにより生成する色素はアゾ色素であ
り、その際の反応時間は２時間以内であるが、３０秒か
ら９０分で反応は完結する為その範囲でさしつかえない
。

色素の１は比色言や分光光度１青の分光向側）または視
覚的方法により測定する。分光的＋定の場合の測定波長
は主に４５０〜５５［ｎｍである。

また視覚的方法による測定は神準品との対比による方法
、Ｆ＜泳動ｔて６りる酵素パターンの測定。

＋シ７色の県Ｌどに行われる。

ｙ累占−を測定ｊることＧ、ｒ７製斉の品質竹理や、臨
床へ査、■たは血中や尿中の酵素濃隻に１る各４二思の
ｔ１等の為に非常に重要である。

その測定には稍々の方法が知られているか合成光〕を用
いる方法Ｇ」く使用される方法の１つである。

また自成基更の中で、アミノ酸またはペプチドのナノト
ールＴステルは優れた基質として／もれでいる。

（時開昭５ｌ−６ＳＵ４９．時開昭５５−５９１５１）
その基質を用い酵素活性を側＞するＡここに開Ｊされて
る方法ｌｙ素により水ｆされ遊離するナフトールをＦＶ
Ｂ塩（Ｆａｓｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　Ｂ塩）、６−ベンズア
ミド−４−メ］キシ−メタ−）ルイゾン　ジｆゾニクム
盆うと反応さぜシアゾ色素を佑戊さピその畦により測定
ノる方法である。こり開Ｊされた方法におい〔訪うるナ
フトールとＦＶＢ塙を反応さぜろ過程は、氷水で冷し〔
行つ〔いる。これは低温で反応を行わよいウ介、ジアゾ
試薬１斤が加水ｔ）Ｆをつりたり、ジノゾ試へ間−反応
する／どの為吸）Ｌや依人吸収波長（λ！Ｘ）のバラツ
キが生じイ為であイ。

しかし／か１実施例「Ｃ示−４に本発明の方法において
遊離する とＦＲ−ＩＴＲ 鳴を反工さ已る遍損で，［Ｃ〜４じじオいＣλ０度や＜
人吸収波長のバッフ＼傭生じることけＦい。

また開示された方法におい（痺催するナフトールどＩＶ
３塩を反応させるメ杵の時間は正４に行う必要がｂる、
ごれはこの反応時間により吸光度に差を生じる為である
。しかしながら不発明の方法における、遊離する とＦＲ−ＩＴＲ 珈ノ反応＃、ずみやかに完結し、姥たぞのルにおいＣも
吸光度の変化は認められない。

この杼に、開示された方法は％４とノ賀の反応過程の温
度（通常２０〜４０Ｃ）から発色反応過程の温度（ＵＵ
イｉミラへＡ度を駕史し、その測定の際１、正１な時間
を決める必要があった。

しかし不発４の方法は、Ｙ素と基質の反応過程の温度と
発色過４の温度への変更が必要なくなり、また発色過程
の正確な時間設定の必要がなくなった事に大きなり点が
ある。

このことＪ本発明に」り操作方法が非常に簡単こなった
ことのｙｈ−ず操作過程でム度変史が困１である自勺１
Ｔ装置への商目がす能になつこことに大きな扁鳴がＡる
。

また開示された方法による尿中酵素活性の測定において
しくＬｔｌ定直にバラツキのあることか観堅されていた
。このことは、尿中に自まれでいる亜硝酸−４ンがその
原因で）ることか判明した。

しかしながら尿中に、依生物が混在して（る揚」、−硝
酸イメンが生成することは−りしれないことであり、こ
の尿中％素と無関係である４＋４の存在は、尿中酵素の
側屋におＶる開示された方法の史用の太きｆ障實どゑっ
ていた。

（１本臨床３７巻夏季増刊号、２６６８．１９７９）〜
かしＪが１実施例２で示す通り本発明の方法は、このｊ
ｉ酸イ伺ンに影４されえいことに大きな利点を有しＣい
る。

庄た％２と基Ｐとを反応させた後、発色さける３ＡＡ移
ル際、反応液ヲ酸性ニＬ、Ｃ素と＋５との反応を市める
揚Ｈが多いか、ＶＪλを更用する開示された方法では反
応液が酸性（ｒｌｌ〜４）の場合発色反応は進行しない
。しか１なが）本発明の方法に」ればこの酸１Ｋ賊でも
発色が１能−Ａる。Ｉなわち本発明の方法に」れば、Ｙ
素と基Ｔとを反応させた後、酸性にすることによりこの
反応を停止さぜそのままの状ｐでり色過程へ移行できる
という侍長を有している。

このように発色剤どしてＦｉ−ＩＴＩ塩を用いた本発明
の方法を多くの非鹿に優れた利点を有−るＹ素活性測定
方法である。

なお、庁Ｉ！求の範囲、発Ｏ）詳細な＋４中の略ｉは以
１の意味を示す。

（１ｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　グ
リシル基　　　　　　　−ＨＮ−ＣＨ２−Ｃ０−Ａｌａ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　アラニ
ル）　　ＶＦｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　バリル％Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ｎ４シル基１１θ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ｒソロイシル基Ｍｅｔ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　メチオニル基Ｐｒｏ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　プロリル
基ｐＨ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　フェニ
ルアラニル基Ｇ［ｎ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　グルタニル基Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　グルタミル基ｐｙｒｏＧｌｕ　　　　
　　　　　　　　　　　　ピログルタミル基Ｔｙｒ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　チロシル基Ｌ
ｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　リ
シル基Ｌｙｓ（Ｍｅ）α−Ｎ−メチル− リシル基 Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ア
ルギニル基Ａｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　アセチル　　　　　　　　　　　ＣＨ３ＣＯＢ
ｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ベン
ゾイルＴｏｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｐ
−トルエンスルホニルＢｏｃ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ｔ−ブトキシカルボニル　　　　（ＣＨ３
）３ＣＯＣＯ−Ｃｂｚ　　　　　　　　　　　　　　　
　ベンジルオキシカルボニルＤａｎｓｙｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ダンシルＭｅ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　メチル　　　　
　　　　　　　　ＣＨ３−６−Ｂｒ−β−ＮＥ　　　　
　　　　　　　　６−ブロム−β−　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ナフチルエステルＤＭＳ
Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　ジメチルスルホキ
サイド次に＞百＋ａＡげ本発明のｆ素泊性測定方法を４
にＩＩ圧脱門３る。

峙Ｖ１４ｙ柑す、実施向に記載されているアミ酸は全（
Ｌイでスる。

実力例１ 茫〕とし（Ｈ−Ｐｒｏ−Ｐｌ９−Ａｒｇ−ｒ−１０をＩ
い、９色りとしＦＲ−ＩＨｒＪ：たは、１ＶＢＸを用い
、尿中カリクメインン１を１定Ｊる７の反応Ｌ曹（反応
時間の及はす影７ １、（１５％Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｅｙｌ　ｌｕＬｆ
ｎｔｅ（ＯＤイ３Ａむ５（）ｍＭ　Ｎａ　Ｐ＋ｏｓｐａ
ｔｅ　Ｌｕ［ｆｏｒ　（ｐＨ７，Ｑ）ｌ、Ｑｎｒｅに、
尿Ｑ、ｉｒｒ及びｌ、５ｎＭ　１−Ｐｒｏ−Ｌ＋ｅ−Ａ
ｒｇ−α−ＩＩの水７ｌ０、１ｍｅを加え、ろ７°ｔろ
Ｏ分間インキュベ−トヲ行った。４いてｌ％Ｉｔ−ＩＴ
Ｒ７水溶１にし、１ｎｔゴコはＩ％Ｆ１７Ｃ水溶液０．
１ｍｌを加えた後、イれ・れＵＣで１Ｕ分間、２５Ｃで
１０６間、２５Ｃで３１分間、６／Ｃで１０力間、ろ７
Ｃで３Ｕ分間と条１◇−え〔反応さ−ぞの後氷目民１，
１ｒｒケ加えて、吸光度を測定しこ。結ＨをＨ１に示す
。

この結果か１わかイ様にｐＶＢ塩を用いた方法は、反尾
Ａ度、反し時間によつ〔↓し度、極大吸収波長（λｎＮ
Ｘ）にり化な生じ見かけ上Ｂ中カリクしイン閾度が変（
ＬＣいる様に観察されるが、１Ｒ−ＩＴＪ菰を用いた本
発明の方法にＪれげ吸光川、罠人吸収波長（λｌｔＫ）
はほとんど影響されす−二の（を）している。

ち施例２ １１とし（Ｉ−Ｐｒｏ−Ｐｂｅ−ＡｒＢ−ｔ−ＲＩｆ用
い、発色剤どしてＦｉ−１１１ＡたはＢＪａＡを用い、
尿中カリクレイン活１をす定する時の、亜硝＋ナトリウ
ムの及ぼす影響 ０、０１５％””Ｓｆ含む５０ｍ＋　１ｎ　Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７，Ｊ）ｉ、Ｊｍ（に、そ
れぞれＵ、１．２．６．４．５１Ｍの１１導１１１、に
／、亜硝酸ナトリウへを含んだ尿Ｑ、ｌｍｌ及び１．５
ｍｌＩ−Ｐｒｏ−Ｉ＋＋−Ａｒｐ−α−１１Ａ漕１ｉｍ
ｌを加え、５７Ｃで３０−間イン）ユベートを行った。

ＡイテＦＬ−ＩＴ１Ｈヲ用いる時は、１％Ｆｆ−ＩＴｌ
Ｊ水溶／１、ｉｍｉを加え、３７Ｕで５分間反応させた
後氷削酸１．０＋＋を加え４７５ｎｍにおゆる吸光二を
測とした。またＦＶＤスを用いる時は、１％ｌｌＩ池水
溶液１．ｉｍｉを加えｏｃで１Ｕ分間反Ｌさせた８、氷
ＩＦ１、０ｍ！を加え５Ｃ５ｎｍにおける吸光ハを＋定
した。

この結ｊを図１に示−゜図中で縦軸は吸光度を、横軸は
亜硝＋ノトリウｔの１１を−Ｊ。ψ印は木兄Ｏ）ＦＬｔ
ｉｒｎＡａ用イタ時、ＯＩはＦｖ３４Ｋ川また時を示す
。この結Ｌか）わかこ中に、１−色リとしてＦＶＢ塩を
用いた方法は、亜硝酸イオンの影響を受け吸光度が大き
く変化しＪ７か１土、ハ中ノリクレインＡが変化し−Ｃ
いる様に観孔にされシが、発色ｉとし−ＦＲ−ＩＴＲｌ
を用いた本発明の方法はシ硝酸−インに目はどん吉影）
されず一定のｍを示し〔いる。

実施例６ ｒｏｅ−ＬｙｓＣＩＮＪＢヲ用イースｒンヒンヲｔｆス
ル方法 ５０ｍＭ　Ｈａ　１ｌｏ＋４ａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（（
旧７．ｔ）１．７ｊｉに生理セ喘水に溶かしたス［ンビ
ン（１，２゜５ＮｒＨ−Ｕ７ｍｌ）Ｑ、ｉＩｌ及びｌＩ
Ｍ　ＴＯＢ１」ｙ８−ａ−Ｎｉ水溶液０．２　ｍｌを加
え、２５ＣＣ１０３間インキュベー１をコつた。ＮイＣ
１％　Ｆｌ−ＩＴＲＡ水＋＋０．２ｊｉを加え、２５Ｕ
で５分間反Ｌさ１た抜、５０チ酢＆２、０ｍｌ加えて、
４７５ｎｍにおける吸（ｍＪ測測定た。

この方法に」る測定結果を図２に示す。図中で縦軸は吸
光度を横軸はスロンビンの量を表わしている。

実施例１ Ｉ０θ−ｂｙθ−α−ｔｒろ用いてトリノ／ンを測定す
る方法 ５［ｍＭ　Ｎａ　ＰｂｏＲｐｌｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｒ
ｌ７．０）１．／ｍｅに生理（塩水に的かしたＩリプシ
ン（Ｕ、２５．０゜５、０．７５μｇ／ｍｌ）０．１ｍ
’及びｌｍＭ　ＴＯ３−Ｌ７ｅ−ａ−７Ｊ（溶液０．２
ｍ１を加え、２５℃で１５分間ｒ／キュベートを行った
。続いてｌ％ＦＲ−１ＴＲ漏水ｈＭ０、２　ｍｌを加え
、２５テ５分１Ｔ応させり後、りＪ％４酸２．０＋＋加
えＣ１４７５ｎｍにおける吸し人を測定した。

この方法による測定結果を図６に示す。図中で１１１１
１は吸光＋を黄φはトリゾシンの吊を表わしている。

つＡｙ５ Ａｃ−（ｌｙ−ｂｙ日−α−ｈｔ＝月いてン１入り−ビ
を用斤すス方法 ５ＱｍＭ　Ｎａ　Ｐｂｏｅｐｌｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｔ
（ｐＨ７，Ｑ）１，７ｒｅに生理食塩水に浴かしこ１、
ｊへナーヒ（６０゜１２０．１３Ｊ、２４０．５１１１
０／１１）［、ｌｍｌ及ヒ１ｍＭ　Ａａ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
Ｇ−ｃ−１１水ｎ￥（、２　ｍｌを加え。

２５Ｃで１５分間インキュベー１をＹつだ。井い１ｉ％
Ｆｉｔ−ＩＴ堪水溶＋［、２ｍｌを加え、２５にで５分
間反応させた後、５０チ酢酎２．３ｊｉ加えＣ１４７５
＋ｍにおりるり光（を測定した。

この方法に２）測定結果を図４に示す。図中でｎ＋は吸
光度を位輔はつＬキナービの石を表わしている。

実イす６ １−３−Ｖａ］−Ａｅｕ−１ｙｌ−ｔ−１Ｆを用いＣＣ
プラスミツ測定ノる方法 ５ＪｎＭ　Ｈａ　ＰｔＯ日ｐｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　
（ｐＨ７，Ｑ）ｌ、７ｍｅに生理食Ａ水にｍかしたプラ
スミン（０，１２５，０，２５、Ｏｏろ／５、（Ｊ、５
、０．６２５　ＣＵ／ｍｅ）０．１ｍｅ及びｌｍＭ　Ｉ
−，１１−Ｖｘ１−Ｌ＋Ｑ−ａ−ＮＰの１０％ＤＭＪＯ
水溶液１、２ｍｌを加え、２５℃で１５分間インギュベ
ー１を行った。Ａい一１係上ｔ−ＩｒＲ晶水Ｒ７０、２
ｍｅを加え、２５Ｃで５４間反応させた後、５０％酢酸
２、（Ｊ／加えて、４７５１１における吸光＋を１５し
た。

この方法に」る１定結果を図５に示す。図中で縦軸は吸
光度を１軸はプラスミンの１を表〕シている。

実施例７ Ｂａ−Ｌｌｅ−（ｌｕ−１，ｙ−Ａｒｃ−α−Ｎｌを用
いてＦａｃｔｏｒＸａを測定Ｊる方法 ５ＱｍＭ　Ｎｏ　Ｊ＋ｏｓｌ市ａｔｏ　ｂｕｆｆｅｒ（
ｐＨ７，Ｕ）１．７ｍｌに生Ｌ％話水に溶かしたｌｌｃ
ｌｏｒＸｎ（０．０５，０，１、Ｕ、１５、０．２Ｕ／
ｍｅ）０、ｌｎｌグび１ｍＭ　３ｚ−１１ｅ−ｕｔｕ−
Ｃ目ｙ−Ａｒｇ−ｔ−１Ａの１０％川＋水７Ｅ０．２ｍ
ｌを加え、２ＵＣで１５分間イン−−べ−１を行った。

ＮいＣＩ％ＪＲ−ＩＴｆＡＡＪ＜ｒｊ１．７ｍ（ｔ加え
、２ＵＯで５分間反応させた々、５０％Ａ＜２．Ｊｍｅ
加えて、４７５ｕｎにおける吸光１を！定した。

この方γによる測定Ａ＋を図６に示す。図中ｅし１す吸
光ハを４軸はＦａｃｔｏｒＸａのに１を罎わしている。

実ｈ６８ Ａｃ−（ｌｙ−Ｌｙｅ−α−Ｎりを用い（ＯＪｒを１定
ノ）方法５０ｍＭ　Ｎａ　Ｐｔｏｓｐｌａｔｅ　ｂｕｆ
ｆｏｒ（ｐＨ７，Ｑ）ｉ、７ｍｅに生理食鳩水に浴かし
た０１＋（２，５，５，７，５，１０１ＬＪ／ｍｅ）Ｕ
、１ｍｌ及びｌｍ４　Ａｃ−（ｌｙ−Ｌｙｅ−ｔ−ＩＩ
水ｍｔＥ０．２ｍ！を加え、２５Ｃで１５分間インキ１
ベートを行った。先いて１ヂＦＲ−ＩＴｊ静水溶液Ｌ．
２ｍｌを加え、ソＥＣＱ５分間反応させた良、５０％酢
酸２、０ｍ／えて、４７５旧ｎにＨける吸光１を測定し
Ｌ。

この方法（」る＋定結果を図７に示す。図中でれりは吸
光現を、横軸はＵＩＦの４を表わしている。

実ｊｌ９ Ａｃ−Ｔｙｒ−α−ＮＪを用いＣ］＝を測定する方法５
ＵｎＭ　Ｎａ　Ｐｌｏｅｐｌｒｃｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐ
Ｈ７，０）１．７ｍｅに生〃ＡＡ水にａかしブＣ１百（
２，５，５，７，５，１０ｔｔ／ｍｌ）ｌ、１ｍｌ及び
１ｍＭ　Ａｃ−ｒｙｒ−ｒ−旧りの１０％ＤＭＳＯ水溶
液［、２ｍｌを加え、２５ＣでＡ５力間インギュベー１
をＴツた。Ａい（１％Ｆｉ−Ｉｒｔ４水溶Ｖ、０．２ｍ
ｌ−加τ−２５Ｃで５分間反応さ−た表。

５Ｕ％ｎｉ２．［ｎｒ加えて、４７５ｎｔｃおげ）ｋ光
度を測定した。

この方法シξる１定結果を図８に示す。図中で１１は吸
光ハを４輔はａＦ−の７を衣わ〜ている。

！施）１０ Ａｃ−ｌｙｒ−α−１ｆ、用いてキモトリプシンを測定
する丁二 ５［ｍ＋　４ａ　ＰｌｏｓｐＨａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（
１１７，Ｊ）１．７ｎｅに生理すＡ水に溶かしたキモ；
リノシン（Ｕ、２、＋．４．［、６．０．１３ｐｇ／ｒ
ｌ）［、ｌ　ｍｌ及びｌｍＭＡｃ−Ｕ３ｒ−Ｎ−Ｉｉの
１Ｊ％ＤＭ＋Ｏ／Ｊｔ１，２ｍｌ紮加え、２５Ｏで１５
分１インキュベー１を行った。続い−ｌ％Ｆｔ−ＩＴＬ
番水溶ｉ０．２ｍｌを力え、ン５Ｃで５分間反応させた
後、５０係酢酸２．Ｏｍｅ加えＣ１１７５ロロにおゆる
吸光１を則Ｌシた。

この方法による測定結氷り図９に示−。図中でね細口支
光↓をＭ＋はギモトリブシンの１を表わしている。

シ二多１１ ＢＡ−ＪＬ＋−Ａｌａ−ＡＩｇ−α−ｔｕＪ目いＣスＬ
ンビンヲ＋５−る方法 ５０１１　Ｎａ　ｐＨｏｅｐｈａｔｅ　ｌ）旧ｆｏｒ　
（（旧７．０）１．７ｍｅに生！ＡＡ水に−かし＝スｕ
７ビ７（（、２５゜（、５．０．７５．１．ＯＮ工Ｈ−
Ｉ／ｔｎ）［，ｌｍ（及びｉｍＡＢＺＩＪｅｕ−Ａｌａ
−Ａ１ｇ−ａ−ＮＦ水Ｎ７１、２ｍｌを加え、２５０で
１５分間ｒンキュベートをＴつた。続い（１チＦ１−Ｉ
ＴＲ４水ｙ、；０、２ｍｌを加え、２５℃Ｃ５３１反５
さ、たｒ＞−Ｕ％Ａｒｌ２１ｍｅ加え又、４７５ＩＩに
＋けイＩ１Ｍを量定しこ。

この方ζに１）測定結果に図１０に示す。ン中ひ縦軸は
吸光度を横軸はスロンビンの量を壱わし〔いζ。

実Ｍリ１２ Ｔｏｅ−Ｌｙｆ（ｎｇ）−β−Ｊ＜：月いてトリゾンン
を則モー４方法 ５ＬＩＩＡｌリスＡｌｌ４＋−（＋旧７．Ｊ）１．７ｍ
ｌに生理食塩水に溶かした１リゾシン（０，２５，０，
５，０１１５，１，Ｕｔｊ／ｍｌ）［、ｌｍｅ及びｌｍ
Ｍ　Ｔｏｎ−Ｌｙｓ（Ａｅ）−β−ＮＥ水溶７Ｊ、２〃
ｅを加え、２５Ｃで１５分間インキュベーｉを行った。

＾いて１％Ｆ１−Ｌｒｌ臨水清ＫＯ，２ｒｒζ加え、２
５Ｃで５外曲反応させた後、氷酢酸２．Ｏｒｒｈえて、
４９５ｎｍにおしる吸光ムを測うした。

この方法に」る測定結果を図１１に示す。図中で縦軸は
吸光度を横軸はトリノシンの量を表わしている。

実施９１３ Ａｃ−Ｇ１ｙ−Ｊｙｐ−０−３ｒ−β−ＮＪｌを月いつ
ウロキナービを川辷−る方法 ５ｍＭ　Ｎｎ　ｐＨ０Ｑｌｌｎｔｅ　１ｌｔｌ：ＤＩ（
１旧７．Ｊ）１．７ｍｌに生理食塩水に溶かしたつ目）
ヲ−二（３００、６００、、９００．１２ＵＵ、１ｌ／
ｉ：）Ｊ、ｉｍｌ、及Ｑ’ｌｎＭ　Δｃ−ｆ．ｙ−Ｌｙ
Ｉ−６−３ｒ−β−Ｈｉ水ＷＹ１、２ｒｔ−加え、２！
で１３分間ｒンヤユベート嗅１つた。

続いて１％＋ｒ−■ｔＫ水溶液０．２ｎｔを加え、２５
Ｃで５外聞反応させた後、氷酢酸３．０ｍｌＪえて、５
００ｎｍに１しる吸光度を測うＬｔ。

この方法にＪる卵定結果をＧ１２に＋１ｏ図中で縦軸は
吸７度を４軸ｌシロキナ−乙θ１を、シわしでいる。

実施夕１４ Ｔｏｅ−Ｌ７ｅ−ｃ−ＬＥを用い〔アンチス＋７ビンｌ
を測定する方法 １［０／＋！ヘパリンを菖む、５Ｃ１１　１Ｉ　Ｊｔｏ
ｅｐｂａｔＯｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７，４）１．０　ｍｌ
に正猟血りのＵ、２５、５ｔ、７５．１００．１２５％
のアンチスコンピン１何°む血ａ１゜５／Ｉ及び生理食
塩水にｈかしたスＪ７ビ７（１，５ｎＪｎ−ｕ／ｍＯ）
Ｉ、１ｍｌを加え、３７℃で１０３−ｒンキュベート後
２ｍべ　’ｏｎ−ｂｙ日−α−旧：水り４３，１ｍｌを
加え、ろ７ＣｃＩＯ分間−ンＶユベートを行った。株い
て１グＦｋ−ＩＴＩＸの５０％酢酸溶液０．１ｍｌｆ加
えろ７Ｃｅ５分間反８させた；、５Ｊ％酢酸１、０ｍｌ
加Ｃ１／７５＋ｕにおける吸光ルを同定した。

この方法にイ）測＞結ｊをン１３に示す。図中で縦軸は
吸光度を横軸はアンチスロンビンＩＩＩの量を表わし〔
いる。

実１倒１５ オートアナライザーに１７Ｔｏｅ−ＩＹ日−Ｃ−ＤＩを
用いたアンチス」ンビン相のｌｌＩの＋４方法に１血専
の１．ソ５．５Ｊ、７５，１００．１２５チのアンデス
Ｌンビン―菖む血２Ｊｔ！、にスｒンビン（／Ｕ／ｍｅ
）、−バリン（５Ｕ／ｍ０１、Ｂ８Ａ（ｉｍｙ／ｍｌ）
をハむ５ＱｍＭ　Ｎａ　ＰｌＯθｐＨａｔｅｂｕｆｆ：
ｒ（ｐｉ７．４）１．ｔｍｌ１加えろ７Ｃで２分間２ン
ヤユベー１さ１コ表、１％Ｆａ日し　Ｒｅｄ　ｌＴＲｊ
ミラむ２ｍＭ　ｌ０Ｒ−１ｙ日−ｎ−ＩＪ水溶液θ、ｉ
ｍｌを加えろ／ＣでろＣ１川−／＝ユベートさせ、５０
チ自自１．Ｑｍｅ添已〜（、１分葵の５４ＱｎｍＣの吸
光ろ−川臣しこ。

なおオートアナラす−ハ（オ（Ｋａｂｉ社）４川用しこ
。

この方去に、る測定結果を図１４に示す。図中７縦軸は
吸光度を横軸はアンチスロンビンＩＩＩのＩをづ表わし
ている。

実施例１６ Ｈ−Ｐｒｏ−ＰＩＪ−Ａ１車−α−ＮＢを用いて１／カ
リクレインを測ノする方法 ５１ｍＭ　Ｈａ　Ｐｂｏｔｐ＋ａｔθ　ｂｕｒｆｎｒ　
（１旧６．０）２．０ＬＩにりｕ／（加血漿（５，１（
、１５ノ！）及び水に（かしたテＭストう７硫酸（分子
量５Ｕ０、０００）（ろ０μｇ／ｍｔ）１０μｚを力え
、ろ７ＣＣ５５用インキｊべ−１をＪつだ内、０．ｌチ
ＳＤＢを鷹むソｍＭ　＋−１ｒｏ−Ｊｌｅ−Ａｒｇ−α
−ＮＥ水溶液Ｕ、２ｒｎケ加え、６７Ｃで１０５分間イ
ンキニべ−１を行つこ。続いて１％ＦＲ＋ＪＡＡ塩の５
Ｕ％酢酸溶液Ｏ．２ｍｌを加え、３７００５分間反尾さ
せた後．５Ｑ％酢酸２．Ｌｍ／加工Ｃ，４７５＋Ｃ＊お
ける吸光度を測定１た。

この方法によるり定ｉ％／イ１１５に示！。／中で縦軸
は吸光度を横軸はプレカリクレインの量を表わしている
。

実施例１７ Ｉ０Ｒ−１ｙ日−α−ＮＥを用いＣスｌコンピンを測定
する方法 ５０ｍＭ　Ｎａ　Ｐ１ｏｅｐＨａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（
ｐＨ８，Ｕ）ｉ、７＋／に生理食塩水に暗かしたスロン
ビン（Ｕ、５．１．１．５Ｎ工Ｈ−Ｕ／ｍｌ０、ｉｍｌ
、及び１．５ｍＭｌｏｅ−Ｌｙｅ−ｃ−１１水溶液Ｊ、
２ｍｌを加え、３７（、で１Ｕ分間インギュベートを行
った。続いて１％Ｆ１−（ｒｊＨの５Ｕチ酢酸溶液３，
２ｍｅな加え、３７℃で５分間反応させた後、５０％昨
１２．０　ｍｌ加えて、４７５ｎｍにおける吸光度を測
定した。

この方法による測定結果を図１６に示イ。図中で−輛は
！Ｙ度を購＋はスロンビンの−を表わし〔いる。

実施例１８ ＋気泳動に、イ血中酵素パターンの量定内径４＋＋、長
さ７ｃｍのガラス管を用い１リアクリルブミドクルカラ
ムを調製した。これに血＋４θ／Ｍを添加し、２ｎＡで
約！Ｊ分間泳動した後、デルを睨り出しこ。このゲル＝
ＩＵＵ用Ａ　ＮａｐＨｏｅｐｌａｔｅ　ｌｕｆｆｎｒ　
（ｐＨ７，０）に盲かした０．５ｍ４Ｔｏｅ−１ｙｅ−
Ｃｒ−Ｎ！１０ｍ１にと目、２５℃で６０分間インキュ
ペー１し、次に１ヅＬｎｎｔ　ｌθｄ、ｌ王；に水浴液
ｌｍｌし加え、２５ＣでＩ１３間ノ置し杓色した。１上
の方法により、Ｊ中１素パターンな椿赤色の帯状として
観察することが（きた。

図１７に正常人血清を用いた。１１）自の結北を示す。

実施例１９ 血液細胞のｆ素Ｒ性染色法 ＋＋冒加抹シ本を作り、ポルマリン力気で固定１た。水
装置、０．２ｍＭ基質（Ａｅ−１ｙｒ−ｔ−４Ｕ、Ｔａ
Ｓ−Ｌ３ｅ−ｃ−ＨｐブこはＡＣ−Ｕｌｙ−Ｌｙｓ−＋
−ＮＥ）　及び０、１％Ｆａｅし　Ｒｅｄ　ＩＬ塩を３
む１Ｑ０ｕ＋、＋ｎ　ｐｔｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ
（ｐＨ７，０）１０ｍｌ中にぴりソ５Ｃで９Ｕ分間イン
キュペー１を行ない、７Ｆを行）いｉｔしこ。

表２に染色の結果を示ず 実施４２０ 実ｈす１〜１７の方汐こ従って測定した利ノの酵素にメ
−る感度を表６に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法と従来の方法に及ぼす亜硝１１タ
イオンの影響を示Ｊ。！２図は本開明の方法によるスロ
ンビンの１犀を示す。出ろ図は本発明の方法によるトリ
プシンの測定を示す。第４図は本発明の方法によるウロ
キナービの１定を示す。 第５図は本発明の方法によるプラスミンの測定を示−，
８６図は本発明の方法に、るＦａｃｔｏｒ　Ｘａの測定
を示Ｊ。第７図は本発明の方法によるＣ１丘の測定を示
す。第８図は本発明の方法にＪるＯｘｅの測定を示す。 第２図は本発明の方法に」るキモトリプシンの測定を示
す。第１ｏ図は目本明の方法による）ス＋／ビンの測定
を示す。第１１図は本発明のＩリプシンの測定を示−。 ２１２図は本発明の方ζに」るウロキナーしの測−イ示
す。第１ろ図は本発明の方法によるアンチスしンビン■
の測距を示ず。番１４図は本発明の方法によるアンチス
リンビン謝の測定を示す。ｙ１５図は本発明の方法によ
るプレカリフレｆンの測定を示−゜２１６図は本開明の
方法によるスＵンビンの測定を示す。 第１７図は血中酵素パターンを示す。 代理人　浅村　皓 外４名 千　わ“１）１市　正　、ｌ：：　　（ｉｌｌイノｌｌ
ｆ（ｆｕ　５８年　１月１１１−　ｎ１１１゛＋ｒｌｌ
　５７１１ミｖ＋ｊ′１ｌｆｆｉ　１３５５ろ４　；」
二（捕ｊ１をず／・１１′Ｉ 巾］′１との１り旧Ｘ”、　　ｉ’＋：ｌ’ｌ出）５・
１１人１１所 氏　と・　　　鳥居蘭品４イ（；式会社（乙　１：１、
） Ｉｌ、代即人 ５、ｔｌｌ！　＋１：６ｉ＋　１００月１１．１１１ｆ
ｌ　　Ｉ’ｌｌ　　　　　　Ｉ　　　　　　月　　　　
　１１（５，１１１ｉ１１に、］１）増加・１−イ１発
明の数（１）特π１−請求の範囲台・別ＡＩ（のと１．
”　り　ｉｌｌ市′する１゜（２）明細）↓（第４貞８
行の「酵素活性”；＋−ｊ　％：　Ｉ酵素活性−または
その酵素のＩＸ］１古剤、賦活剤、ナモーデンを」にＨ
］正する。 （３）　　同第４員１４行および第５百６〜７行の［ア
ンチスロンビンＩＩＩ、ｊ　（ｉｌ−削除する。 （４）　　同第５貞１０〜１６行のｒ−＋た、・・・・
・・・・・できる」を削除し、ｆ文全加入する。 「−土だ、そノｉ、らの１（１γ素のｌ！ＩＩ　′；！
、＝　ｉｌ＋　）賦〆占炸１、チモークゞンもｄｌｌｌ
　＞ｉｆｉすることができる（たどえば、アンチスロン
ビンＩ１１　、、ヘパリン１．α２−プラスミンインヒ
ビタ−１α）−トリプシンインヒビター、ストレフ０ト
キナーセ゛、１℃ＣＶ　、プレカリクレイン、−１ラス
ミノーゲン、フ０ロスロンビンなど）。」 （５）　　同第５貞末行の「フリー−止／こはアシル基
を−」ヲ「フリー、アノル）＋’４−ｊｆ　ｆｃ、　Ｉ
Ｉスルボニル基２．３に＠］’　、ｒＥする１゜ （６）　四ε０６頁６行の［水素“ま／ζｉｊ：　’ｆ
ンルノ、（」を１′水素、アフル９１「またはスルホニ
ル基」にｇ＋正する。 （力　同第７自９〜１０行の１０末端カル］１ぐキンル
基と 正する。 （８）　　同第８頁下から５行の「で反応は′テこ績す
るハそ」を削除する。 （？））　　同第９以下から６行の１−シア・グ」金ｒ
アゾ」に訂正する。 （１０）　　同第１６Ｖ１バリル基の（閑の正する。 圓　同第１６以ローｆシル基の（１８弓の正する。 （１２）　　同第１８内７行のｒ　ＰｌｌｏＳｐａむｅ
　ｊｆ　（Ｐｈｏｓｐｌ＋ａｔｅ、ｊに訂ｒＥする。 （１３１同第２０員５行のｆ”　ｌ　ｍｅ　Ｊ全「ＯＡ
ｍｌＪに訂正−〕る、。 （１・１）同・れろＯ自２行の１バイメ１奮ＩＩ”コー
パスバイオ」に訂１Ｖ：、する。 （１５）　　同第３０貞８行の「フ０レカリクＬ／イン
Ｊを・（血１４ｒ＞）０ｖカ１．１　フレイン）　Ｋ１
１’＋１：する。 （Ｉｆｉｌ　　同第３１臼１行の［）０レカリク１／イ
ン」を「血漿ＪＪＶＣｆ４Ｊ屯する。 （］７）　　同第３６貞１６〜１４行の「本発明の−１
を「本発明の方法に、１−る」にｒＮ　、ｉｌう、６３
゜（１８１Ｉｎｋ第３６目下から２行の「ソ０レカリク
レ・１／Ｊケ「′面梨）０レカリクレイン、ｊ　ｋ（ｒ
ｉｌ’　ｉｌｉする。 （１１〃　　同第３７　ｄｉ　１行の「を２１＜ず、１
　ｊの後に１図中の↑は原点を示す。」を加入する。 （２０）　　同第３５頁表６の後に不文を加入する。 Ｉ゛　実施例２１ ’ｌ’ＯＳ　−Ｌｙ　ｓ−α−ＮＦ２を用いて血漿プラ
スミノーゲンを測定する方法 人血漿６０　ｐｌに５０１１１＋Ｌイｌｌａ　Ｐｂｏｓ
ｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒ　（＋）１１７．４　）　Ｉ　
Ｑ　ｍ１！を加えた液を希釈して、ろ、　２．５　、２
　、１．５　、１　、０．５μｌ　Ｉｒ１ｔ漿／　ｍｅ
　Ｅ−３ｏ　ｆ’　ｆ　ｅ　１になるように試料液を調
製した。この試料液ぞＪ’Ｌぞれ１．０ＩＩｌｅに水で
溶かしタストレノ）　キ１−−−１！４（１０００１Ｊ
　／’ｍｅ　）０．１ｒｎｌずつ加え３７°Ｃで１０分
間保温後、２　＋１１Ｍ　Ｔｎｓ−ＬｙＳ−＋γ−ＮＥ
　Ｑ　、　１ｍｅイ〒−加え３７°Ｃで１０分間保温し
た。 次に５［］％の酢酸に溶か１７た１’％　Ｆｉ’Ｒ−Ｔ
’ｌ’Ｐｊｎ　Ｏ，１ｍｌを加え、３７°Ｃで１［］分
間反応させ、氷酢酸１．（１＋＋＋ｌを加えて４７５　
＋１ｍでの吸光度を測定した７、 この方法による測定結果を第１８図に示す。 図中で縦軸は吸光度を横軸（Ｊ、血漿の１１［を衣わし
ている。 実施例２２ ＴＯ８−ＬＹＳ−α−ＮＥを用いて面１喰了ンチプラス
ミンを測定する方法 人血漿１５０　ｔｔｌＪに５０１１１＋Ｌ４　Ｎｒ＋　
ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７，４）　１
０　ｍｌ　’ａ：加えた液を希釈して、１５　、１２．
５　、１０　、７．５　、５　。 ２．５　ｐｌ血漿／　ｍｅ　Ｂｕｆｆｅｒになるように
試料液をｍＭ製した。この試料液をそノ１．ぞれ１，０
＋１＋／！に水で溶かしたプラスミン（０，１ｃｏ　／
ｍｅ　）０．１ｒｎｅずつ加え、６７°Ｃで２０秒間保
温後、２１１１Ｍ　ｉ’Ｌ１ｓ−ＴＪＹＳ−α−Ｎ■ｃ
　０．１　ｍｌを力１え、３７℃で１０分間保温した。 次に５０％酢酸に溶かした１％ａ′ｎ−ｒ、゛ｒＲ地０
　、１　ｍｌ　全加工、６７°ｃでｉ。 分間反応させ、さらに氷酢ｒｌｆ２１．０　ｍｌを加え
４７５　ｎｍでの吸光度を測定！、た、この方法による
１ｌｌ１１定結果を第１９図に示す。 図中で縦軸は吸光度を横軸Ｖ１、血漿のｉｊｉ否・表わ
している。 実施ｆ／ｌＪ２３ ’ｐｏｓ−ｒ、ｙｓ−α−トＩＥを用いてヘパリンを測
定する方法 ０．０１　、０．０２　、０．０３　、０．０４　ＩＵ
　／ｍｅになるように水に溶かしたヘパリンＡＶそれぞ
れ０．０５ｍ／に生理食塩水で１０倍に希釈した標準血
漿０．０５　ｍｌ、　　５０　ｍ１ｙ４　Ｈａ　Ｐｂｏ
ｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒ　１．Ｑｍｅ及び水に溶かし
ｉトｏンビン（１，５ＮＨＩ−Ｕ　／　ｍｌ　）　Ｑ、
　１ｍｌを加え、３７　Ｊｃで１０分間保温後、２　ｍ
Ｍ　’Ｉ’ｏｓ−Ｌｙｓ−α−ＮＦ、　Ｑ、　１ｍｌを
加えろ７°Ｃで１０分間保温した。次に５０％酢酸に溶
かした１％ＦＲ−ＴＴＴｔ　Ｊｊ７０．１　ｍｌを、加
え、３７°Ｃで１０分間反応させ、氷酢酸１．Ｑｍｌを
加えて４７５　ｎｍでの１吸光１ｆを測定した。。 この方法による６１１］定結果を第２０図に示す。 図中ｆ　ｉＨｌｌ＋　Ｉｔ、’ｒ　ｌ＆光Ｗ　ｆ横：１
ｌｌｌ　ｌヘパリン（／、）　１４１を表わしている。 １ （２１）同第３７頁２行［１（図面の簡単々ｎｉ１．明
の項）から不文を加入する。 「　第１８図ｖ１、本発明の方法による血漿デラスミノ
ーケ９ンの測定を示すっ 第１９図は本発明の方法による血漿アンチプラスミンの
測定を示す３゜ 第２０図は本発明の方法に」：るヘパリンの測定を示す
。」 （淵　第１８図、第１９図および第２０図を加入する。 ２、特￥Ｆ解ｉ求の範囲 ｔｌｌ　　式（Ｈ （Ｒ１けアミン１′Ｉ＆のカルボキシル基を介し：Ｃス
テル結合し八−少くとも１つのアミン１′Ｉケ基を７−
ｔ（、Ｌ、］りは水素またはブロムを示す） で示される基質と、酵素をＮ

【トユさせ、酵素により（
Ｉ）／ノを水１’＋’（され゛Ｃ生成すて）ＩＴＲｌλ
に、　＞目１′−ジエチルー４−メトキシメタニラミ１
９シア・アニウムｊ凡＾）とを１シ応さＩ］−イ）こと
ばより色素を生成させ、その色素の１１する・ｉＨろこ
とにより酵素活性、また（よその酵素のｌｔｌ　ｌ害剤
、賦活剤、チモーゲンを測定−Ｖる方法 （２）Ｒよが　　Ａ−Ｒ１−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−＋ＦＯ
−（Ａは水素、アシルＪ１いＦたはスルホニル基る′示
しＲ３〜Ｒ５は（Ｆｌｙ　、　Ａｌａ　、　Ｖａｌ、　
、　Ｔ＋ｅ１１　、　Ｉ〕ｅ　、Ｐｒｏ　。 Ｐｈｅ　、　ｔ］Ｉｎ　、　Ｇｉｕ　、　ｐｙｒｏ（Ｊ
］、ｕ　４た’ｔ’！、　ｌｌ’−ｆｉｇ　合を示しＲ
６はＴ＋、’）’Ｅｌ　、　ｒ、ｙｓＢ＋ｅ）　、　Ａ
ｒｇ　、　１．４ｅｔ　２ｐたけｉ’　ｙ　ｒを示す） である’１．ｌＦ許請求の：１１ｊ）囲Ｑ’Ｈ１１（１
ｔ））、１７７人（３）Ａが水素、Ａｃ　、　Ｂｚ　、
　Ｔｎｅ　、山）Ｃ，Ｏｂｚ　。 ］）ａｎｓｙｌ　、　（］　１　ｔ　テ；ｊｚ）ル％　
ｖｒ　１ｉｓｉ　＞Ｊ’＜　ノ＋ｌｉｌ＞　１１１１　
ｒｆ！２：Ｑ：Ｉ　（’）方法 （４）Ｒ１がＡ　−１１１ｙｒ−、Ａ−Ａｌｇ−、Ａ−
ＬｙＲ−、Ａ−＋１ｌｙ−１＋７８−　　、Ａ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ−、Ａ−ｎｌｙ−＋ｌ］ｙ−Ａｒｇ−、Ａ−Ｔ
＋ｅｎ−Ｇ］、ｙ−Ａｒｇ−、Ａ−Ｇ］、ｎ−ｎｌｙ−
Ａｒｇ−、Ａ−ｐｙｒｒ＋ｆｌｌｌｕ−（ｉ’、ｌｙ−
Ａｒｇ−、Ａ−Ｉ＋ｆ３ｕ−Ａ’、１ａ−Ａ、ｒｇ−、
Ａ−Ｐｒｏ−Ｐｂｅ−Ａｒｇ−。 Ａ−Ｖａｌ’−Ｌθｕ−１，＋ｙｓ　−、Ａ−Ｐｉｔｅ
−Ｖａｌ−Δ”ｇ−＋　　へ−ｒｌｏ−ｒｌｌｔ＋−（
ｌｌｙ−Ａｒｇ−。 である時ｇ’ｌ・請求の１１１１χ囲第３墳の方法（５
）式（Ｉ）が　’ｆ’０８−Ｔ＋ｙ８−α−ＩＴ！：　
、　ＡＣ−１’：）’ｌ’−（Ｙ−１１ｎ：ＢＺ　Ｌｏ
ｌｌ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　Ｉ’ｇ−α−ｔＪＩｎ　、　
ＡＣ−’Ｐ＋＋θＡ　Ｉ’（ｒ−α−ｒｌ　Ｅ＋Ｉ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｂｅ−Ａｒｇ−α−１１１１：　　、　　Ａ　
Ｃ−０１，７−Ｌ　７　［１−α−（１１すであろオニ
Ｆ　Ｍ’ｌ・８〜〉１この小１）１用第１ｊ力、２〕頂
、３毛自また（ま４〕百のいずれか一つの方ンＬ （６）　　　自Ｖ　μｂ’　　Ｉ−リ　−ｌシ　ン、　
　キ　モ　１・　リ　フ０　ン′　ン　、　ソＪ　リ　
フレイン、デラ；（ミン、スロンビン、ウロキ−Ｊ−−
ｅ　。 ３漣頁、４Ｊ自］′Ｆ、たは５ノ百のいずれか一つの）
５　？ｌ：牙１Ｂ図　　　　　　牙１９図 ｐ 止 牙２０図 へ１々リン（［Ｕ／テス１−） 特許庁長官殿 １．中ｆ’ｌの表引 １Ｍ（ｒｌｌ　５７　’１１Ｍ１ｔ’ｌｌ：・ｆｌｒｌ
’＋　１５５５３４１）２、発明のｔ′山、 酵素活性測定方法 ３−　　！１１ｉ＋Ｉ：＋する゛１陥 ゛１１１１との閂１ｊ、ｉ’Ｊｊ’ｌ’ｆｌｔｔ、’ｌ
’１人（１１す１ ）（Ｌ１虐　鳥居貼品株式会ｒ１ １１、代理人 １１１１　　（ＩＩ　　　　　　Ｎ　　　　　　月　　
　　　１１（１）特許請求の範囲を別η（のごとく訂正
する。 （２）明細書、５頁５〜９行の［これら・・・・・・・
・・である。」を「酵素の中で、）１．ｏ、３．、　４
．　２１のセリンゾロテアー−ビの測定にＩ、；）’Ｊ
る、本発明の使用は特に優れている。 さらに、セリンゾロテアービの中で、トリノシン、ギモ
トリプシン、ノノリクレーｒン、プラスミン、スロンビ
ン、ウロキ゛ノ゛−ｖ、　ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ　。 ０１ｓ　、ＯＩＦの７１ＪＩＩ定にＪ５ける、本発明の
使用（：１．９・〒にｆψれている。１１にＨｌｌ「す
る。 （３１１１ｉバ和５８年１月１４日［・」手わ、′５抽
正ＩＩ）、６頁下から５行の［表わしている。−１のト
５（に行を変えて下女を加入する。 １−実ｂ１１ｉ例２４ Ｔｏｓ−Ｌ１２−α−１１］ｕ　ｉ；用いＣ−’Ｙンプ
スロンビン１１１を測定する方法 を加えた。この液り　Ｏ／ＩＩＩ！陀それぞね別の記：
験りｆｊ・にとり、３７°Ｃで１０分間インギュペー）
　１．、２　ｍＭ　Ｔｏｓ　（ｉｙ８−ＮＫ　Ｑ、　１
７　ｆ加え６７°Ｃで１０分間インギュベートした。次
に、１０％酢ｒｙ２　ニ溶カｔ、　ｔ、−１％　ＩＦＲ
−ＩＴＲｊｌｃ　Ｏ，１ｍｅｋ加工、３７°Ｃで１０分
間反応させ、ろＯ％ＩＬｉｔ師２０ｍ１　Ｆ加えたのも
４７５　ｎｍ’Ｃの１１）光度を測定した。 この方法による４１１１定結、Ａ４５．第２１１ｘに示
す。 図中でれＣ軸は吸光度”を横軸（」用Ｉ漿の］１【を表
わしている。 実ｈ＋Ｉｉ例２５ Ｔｏｅ−ＴＩｙｓ−α−１１Ｅｊを用いて血ＪＪ１リゾ
ロスロンビン分測定する方法 人血’ＪＲ２０Ｑ　ｔｒｌに５　Ｑ　ｍｌ、ｌす＞　Ｎ
ｔす）　ＩＪウム先υ衝液（＋ＪＩ　７，０　）　１０
　ｍｌを加えた７１′〆を希釈して２，０１１，６　ｊ
ｌ、２　ｒ　［ｌｊｌ　＊　０．４　ｔｕｔ　面Ｕｆｒ
）ｍｌ　Ｌ’υ割ｉｔｙに１ｒ　６　Ｊ：うにイバ：＊
ＦＮ’ｅを調製した。こノ”ｉ・ｅ　ＩＦ　ンＩｋ　ソ
ｉｔ　＋’　し１−　Ｏｍｇ　ニ、ｓ、”ｖ　ｔｒｖ　
ｚｔｙ　−ｃ　ｐ　カした蛇ｅｌ　（Ｋｃ］ｔｉｓ　０
ａｚ１．ｎａｔｕｓ　Ｖｅｎｏｍ　；　１０μνｔｎｌ
　）　”；Ｂ、０，１〃＋／ずつ加え６７°ｃ−ｃｂ分
間保ン晶後、２　ｍｌ、（Ｔｏｅ−工ｒｙＢ−α−１ｏ
ｃ　［１，１ｍｌを加え２５°Ｃで３０分間保温した。 次に５０％の＋’ｉｌｒ　Ｉ没に溶かした１％ＦＲ−Ｉ
ＴＲ塩０．１　ｍｇを加え、３７°Ｃで１０分間反応さ
υ、木酢１投１．０　ｍｅを加えて４７　ｂ　ｎｍ　で
の１［１に光１αを測定した。 この方法にＪ：る測定結果を第２２図に示す。 図中テＡ７ｔイｉｂ　ｌｅｔ　吸光度＞−横１１１１１
＋　Ｉｆ　Ｊｉｌ　！！７１）ｆＪ　６表わしている。 、１１ （４）　　同補正書、７貞４行σ〕［測定を示す。−１
の次に行を俊えて下女を加入する。 「　第２１図は本発明の方法による）・ンチスロンピン
Ｉ１１の測定を示す〇 第２２図は本発明の方法にＪ：る血！１７Ｌプロスロン
ビンの測定を示す。、１ （５）　　添（−Ｊの図面第２１図お上（Ｆ第２２図を
加入する。 ２、待訂１１９　求（７）　Ｒｔｉｊ　［Ｉｔ：（１１
式日） （Ｒ１はアミノＮｆ　９）カルポギシ６ル基を介しエス
テル結合した少くとも１つのアミノ酸ノ、（を示し、Ｒ
２は水素またはブロムを示す） で示されるノ、（質と、酵素を反応さ・口、１′１％素
により（１）が氷解されて生成する ＩＴｎ塩、！目１′−ゾエヂルー４−メトキシメタ二二
ラミドジアゾニ１ンム［、ｆ　）と全反１＋ｉ）ｉざ！
Ｊる（二と（こＪ：り色累を生成さす、その色素の１門
（を測ることにより　−酵素活性、またはその酵素の１
（１（害剤、賦活剤、チモーゲンを測定する方法 （２１Ｒ１が　　Ａ−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−００−
（Ａは水素、アシル基またはス／ｌ・小ニル基を示しＲ
３””　Ｒ５はＧｌｙ　、Ａｌａ　、　Ｖａｌ　、Ｌｅ
ｌｌ、　Ｉｌｅ　、　Ｐｒｏ　。 Ｐｈｅ　、Ｇｌｎ　、　Ｇｌｕ　、　ｐｙｒｏＧｌｕま
たは単結合を示しＲはＴｉｙ８　ａ　Ｔｒｙ８　（λ４
ｅ）　、　Ａ、ｒｇ　、　ＭｅｔまたはＴｙｒ　ｉ示ず
） である特ｔｌ／ｌ’　Ｗｔ’！求の範囲第１項の方法（
３）Ａが水メ釘、Ａｏ　、　ＢＺ　、　Ｔｏｓ　、　Ｂ
ｏａ　、　Ｏｂｚ　。 Ｄａｎｓｙｌ　、（ｌｌｔである’１８８Ｆ’　Ｌ’Ｊ
求のｒｌｌｉｊ囲第２項の方法（４）　　ＲｉがＡ−Ｔ
ｙｒ−、Ａ−Ａｒｇ−、Ａ＝Ｔ＋ｙｓ・−、Ａ−ｆｌａ
ｙ−ＬｙＢ−、Ａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−＃Ａ−Ｇ］、ｙ−
０１．．ｙ−Ａｒｇ−、Ａ−丁＋１３１２−０１、ｙ−
Ａ、ｒｇ　−、Ａ−（１１，ｎ−ｎ−０１ｙ−Ａｒ　、
　Ａ・−ｐｙｒｏｎｌｎ−ｆｌｌ、ｙ　−Ａｒｇ−、Ａ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−、Ａ−Ｐ］〇−円】ｏ−Ａ
ｒ、２−。 Ａ−Ｍａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｙｓ−、Ａ−Ｐｈｅ−Ｖａ：
Ｌ−Ａｒｇ−、Ａ−丁１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
。 である特許ＩＩＪＩ求のＩＩ：ｉｉ囲第３項θ）方法（
５）　　式（１）が　Ｔ　Ｏ８−Ｔ＋ｙ８−α−ＩＪ　
ＩＣ、Ａ　ｃ−’ｒ　ｙ　ｒ−α−ＩＪ　］］！：Ｂｚ
−Ｌ１ｕ−Ａ］、ａ−Ａｒｇ−α−１１１０，Ａｃ−’
Ｐ］＋ｏ−Ａｒｇ−（Ｘ−Ｎｌ！！Ｈ−Ｐｒｏ−Ｐｂｅ
−Ａｒｇ−α−！ＪＫ、Ａｃ−（］］１．ｙ−丁＋Ｖ１
１−α−ＮＩである！ｔＧ　ｇ’ｌ・Ｋ？Ｉ求の範囲第
１瑣、２瑣、３項または４項のいずれか一つの方法 ｉＱＩ　　Ｍ曹（ｅが、ｙ、、ａ、３．　４．’　２１
ノセリンプロテアーゼである、′１′・テｎ’ｌ・ｄ１
１求の・１イＬ囲第１項、：２］Ｊｊ％３項、４項また
は５項のいずれか−っの方法（７１ｒ＋’ｆ　Ｊｇがト
リノシン、ギモトリプシン、カリクＬ−−（ン、プラス
ミン、スロンビン、ウロギナーゼｆａａ七ｏｒＸａ　、
　Ｏｌｓ　、　　ＯＩＦであり、また、ｔｉｌｌ　鈎剤
、賦活剤、ヂモークゞンがアンチスロンビンＩ１１、ヘ
パリン、アンヂノラスミン、プレカリクレイン、ゾラス
ミノーデンである特許請求の範囲第１項、２Ｊｒ１．３
項、４項また（、１５項のいずれが一つの方法５３１− 牙２１図 ５　　　ＩＱ　　　＋５　２４１　２５＋４！’；Ｌ　
（Ｉｃｅ　） 牙２２１閃 ０．４　０８１．２　１．６　２．（’１缶、：ｒ’！
　（７Ｌｐ） 手続補正書（酸） 昭和５７年８　月５１ １１、旨′１庁長官殿 ２、発明の名前 １１ν累活１／１測定方法 ３、補１丁をする者 ・Ｉｆｌ’ｌとの間代　’Ｉ！＃Ｉ′ｆｉｌｉｌｌｌｌ
１人１１所 氏　２′１　　　鳥居共晶１所（；式会社（とｉＦ＋、
） ！＋、代理人 １ｌｉＩ　　Ｉ’ｌｌ　　　　　　ＩＩ　　　　　　月
　　　　　１１６、　　ｔ＋１ｉｉｌ。に、ｊ゛り噌卯
”・ｊ−る発明の数ｆｉｌ　　Ｉ’ｌｌ細書、６頁下か
ら９行Ｑ１次に下女を加入する。 「　Ａの好ましい例として水射、Ａｃ　、　Ｂｚ　、　
Ｔｏｅ、Ｅｏｏ　、　Ｇｂｚ　、Ｄａｎｓｙｌ　、Ｇｌ
ｔ　　があげられる。」（２）　　同書、８頁下から４
行の次に下女を加入する。 「　なお、基質と閂禦の反応と、ＦＲ−１ＴＲ塩による
発色反応は順次１″ｊつでもよいし、同時に行ってもよ
い。」

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１） （Ｒ１はアミノ酸のカルボキシル基を介しエステル結合
   した少くとも１つのアミノ酸基を示し、Ｒ２は水素また
   はブロムを示す）で示される基質と、 酵素を反応させ、 酵素により（Ｉ）が水解されて生成すると、ＦＲ−ＩＴ
   Ｒ塩と（Ｆｏｓｔ　Ｒｅｄ　ＩＴＲ塩、ＮＮ′−ジエチ
   ル−４−メトキシメタニラミドジアゾニウム塩）とを反
   応させるごどにより色素を生成させ、 七の色素の級を測ることにすり酵素活性を測定する方法
2. （２）Ｒ１かＡ−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−ＣＯ−（Ａ
   は水素またはアシル基を示し Ｒ３〜Ｒ５はＧｌｙ，Ａｌａ、Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ
   ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，ｐｙｒｐＧｌｕま
   たは単結合を示し Ｒ６はＬｙｓＬｙｓ（Ｍｅ），Ａｒｇ，ＭｅｔまたはＴ
   ｙｒを示す） である特許請求の範囲第１項の方法
3. （３）Ａが水素、Ａｃ，Ｂｚ，Ｔｏｓ，Ｂｏｃ，Ｃｂｚ
   ，Ｄａｎｓｙｌ，Ｇｌｔである特許請求の範囲第２項の
   方法（４）Ｒ１がＡ−Ｔｙｒ−、Ａ−Ａｒｇ−、Ａ−Ｌ
   ｙｅ−、Ａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−、Ａ−Ｐｌｅ−Ａｒｇ−
   、Ａ−Ｃｌｙ−Ｃ１ｙ−４ｖｇ−、Ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
   −Ａｒｇ−、Ａ−ｃ１ｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ａ−ｐｙ
   ｒｏＵｉｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−
   Ａｒｇ−、Ａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−。 Ａ−Ｖａｌ−Ｌｔｉ−Ｌｙｅ−、Ａ−ｐＨｅ−Ｖａｌ−
   Ａｒｇ−、Ａ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｕｌｙ−Ａｔビ−， である特許請求の範囲第３項の方法 ｔ５＋式（１１がＴｏｓ−ＬｙＪ−ａ−ＮＲ、Ａｃ−Ｔ
   ｙｒ−α−ＨＥ＋２−Ｌｅｕ−ＡＪａ−Ａｒ（−α−Ｈ
   ｉ、Ａｃ−Ｐ＋ｅ−Ａｒｇ−α−１ＣＨ−Ｐｔ０−ｐ＋
   θ−Ａｒｇ−Ｃ−Ｎコ、Ａｃ−（］ｙ−Ｌｙｅ−α−Ｖ
   Ｅｃあ７Ｍ許Ｒ求ノ範ｍＩＪＡ、２項、３ｐタＨ。 ４項のいずれか一つの方法 （（ＪＤ索がトリプシン、ギ七トリプシン、カリクレイ
   ン、〕ラスミン、スロンビン、アンチスロンビ７Ｉｌ＋
   、つ占キナ−４、ｆａｃｔｏｒＸａ、ＣＩ；、Ｃ１ｒで
   λる％ｍＷ求ノ＃Ｔ１Ｊ、２ｔ、３項＋４項”！タ１５
   項のいずれか一つの方法