JPS5926268B2 - 固定化酵素または微生物菌体樹脂成形体の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、包括法により固定化された酵素または微生物
菌体の樹脂成形体の製造方法に関する。

さらに詳しくは、固定化された酵素または微生物菌体の
活性を、高度かつ永続的に保持するように改良された樹
脂成形体の製造方法に関するものである。

本発明者らは、酵素または微生物菌体の固定化の改良さ
れた方法として、非イオン性もしくはイオン性の親水基
を有する親水性光硬化性樹脂と酵素または微生物菌体の
水懸濁液との均一混合物に活性光線を照射する方法を提
唱した（特願昭５０−１４０８３９および特願昭５０−
１４０８４０ ）。

これらの方法によって、酵素もしくは微生物菌体の活性
を、従来得られなかったほど高度に保持した固定化物を
得ることが可能になった。

しかし、完成された固定化物は、酵素または微生物菌体
が微細な状態に混合され、かつ硬化せしめられた光硬化
性樹脂の成形体であり、これを酵素反応に供する場合、
基質の種類によって固定化物成形体中に寓話された酵素
または微生物菌体との接触の割合が、成形体表面から内
部へ向けての基質の拡散速度によって支配されるため、
機械的強度の面で不利な薄膜状など、比表面積の大きい
形状の成形体とした場合においても、なお、酵素反応の
速度に制限を受けやすいという難点があった。

本発明者らは、このような難点の解消を目的としてさら
に鋭意研究を継続した結果、本発明の完成に至ったもの
である。

すなわち、本発明は、多孔性の無機質粉粒状体、無機質
鱗片状体または無機質繊維状体物をあらかじめ分散させ
た水溶性もしくは水分散性の光硬化性樹脂と酵素または
微生物菌体の水懸濁液との混合物に活性光線を照射する
ことを特徴とする固定化酵素または微生物菌体樹脂成形
体の製造方法に係わるものである。

この方法によって得られる固定化酵素または微生物菌体
樹脂成形体は、上述の無機質粉粒状体等の分散を行なわ
ない場合と比較して、酵素または微生物菌体を固定化せ
しめられた硬化樹脂成形体の緊密さの程度がはるかに低
く、基質の拡散速度がきわめて大きいので酵素反応に供
した場合、著しく高能率で反応を行なわせしめることが
できる。

本発明において用いられる水溶性もしくは水分散性の光
硬化性樹脂は広範囲に選択することができる。

これらの光硬化性樹脂に含有させる親水性基は、イオン
性、非イオン性のいずれであってもよい。

また、光硬化の反応機能としては、一般には遊離ラジカ
ルによる重合反応を利用するのが好適であるが、これに
限定されることはない。

遊離ラジカル重合型光硬化性樹脂としては、通常、１分
子中に２個以上のエチレン状不飽和基を有する数平均分
子量５００〜３０，０００のものが用いられ、具体的に
は、たとえばポリアルキレングリコールもしくは３価以
上のポリオールまたはそれらのポリオールに対するアル
キレンオキシド附加物の（メタ）アクリル酸エステル、
上記ポリアルキレングリコール等のヒドロキシル基部分
にジイソシアネートを介しウレタン結合によりヒドロキ
シアルキル（メタ）アクリレートを結合せしめたもの、
カルボキシル基を含む水溶性セルロース誘導体に（メタ
）アクリル酸グリシジル等の不飽和グリシジル化合物を
結合させたもの、酸価４〇−以上の不飽和ポリエステル
、ビスフェノール型エポキシ樹脂に（メタ）アクリル酸
等の不飽和カルボン酸を反応せしめ、さらに酸無水物を
酸価が４０以上となるように半エステル状に結合させた
もの、不飽和カルボン酸をコモノマーとして合成された
アクリル樹脂のカルボキシル基の一部に４０以上の酸価
を残存せしめ得る割合で不飽和グリシジル化合物を結合
させたもの、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート
および不飽和カルボン酸をコモノマーとして合成された
アクリル樹脂のヒドロキシル基にジイソシアネートを介
しつｌ／クン結合によりヒドロキシアルキル（メタ）ア
クリＩ／−１−を結合させた酸価４０以上の変性アクリ
ル樹脂などがある。

イオン性親水基として上側のようなカルボキシル基を有
するもののほか、親水性を付与するのにより有効なリン
酸基またはスルホン基を有するものも用いられ、また、
カチオン性親水基を含むものであってもよい。

これらのイオン性親水基は、アルカリ、アミン等による
造塩もしくは４級アンモニウム塩化などによって、より
強大な親水性基に変換されることができる。

これらの光硬化性樹脂は、通常あらかじめ水溶液もしく
は水分散液としておき、必要に応じて公知の光増感剤が
添加される。

光硬化性樹脂中に分散させる無機質の粉粒状体、鱗片状
体および繊維状体物としては、たとえばつぎのようなも
のがある。

粉粒状体の場合には多孔性であるものが好適で、たとえ
ばゼオライト、膨張バーミキュライト、膨張パーライト
、軽石、けいそう土、カオリン、シリカゲル、半焼結ガ
ラス粉、発泡ガラス、素焼陶磁器、煉瓦、活性炭、鹿沼
土などが用いられ、塊状もしくは粗粒状のものは、粒径
５０μ〜１０００μの範囲に好ましくは、１００μ〜３
００μの範囲に破砕したものが用いられる。

無機質鱗片状体としては、たとえばマイカ粉、ガラスフ
レーク、マイカ状酸化鉄、デールナイトナどが用いられ
、それらの粒子径については粉粒状体と同様に考えてよ
い。

無機質繊維状体としては、たとえば石綿、岩綿、炭素繊
維、ガラス繊維などが用いられ、単繊維の径がなるべく
０．１ｍｍ以下、繊維長０．３ ｍｍ−５ｍｍのものが
分散に便利である。

これらの無機質粉粒状体、鱗片状体および繊維状体物は
単独もしくは２種以上併用され、光硬化性樹脂に分散さ
れる割合は、光硬化性樹脂の１００部（重量部、以下同
様）当り通常５〜５００部、とくに好ましくは２０〜３
００部とする。

５部未満の場合には、これらの無機質粉粒状体等を分散
させることの効果が明瞭でなく、５００部をこえると光
硬化性樹脂が結合剤としての機能を果すには不充分で、
成形体が機械的に脆弱になる。

固定化される酵素または微生物菌体の種類については特
に限定はなく対象物は広範囲にわたる。

酵素としては、たとえばアミラーゼ、ウレアーゼ、グル
コースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースイ
ソメラーゼ、カタラーゼ、インベルターゼ、フマラーゼ
、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダー
ゼ、α−ガラクトシダーゼ、アミノアシラーゼ、アスパ
ルターゼ、ペリシリナーゼ、ペニシリンアシラーゼ、ペ
ニシリンアミダーゼ、トリプシン、パパイン、ポリフェ
ノールオキシダーゼ、ナリンギナーゼ、アスパルタ−ゼ
、フマラーゼ、メリビアーゼ、ムタローゼ、パーオキシ
ダーゼ、アルコールオキシダーゼ、β−グルコシゾーゼ
、乳酸デヒドロゲナーゼ、プロテアーゼ、チロシン・フ
ェノール・リアーゼなどに適用され、微生物菌体として
は、たとえばラクトバチルス・ブルガリス、アエロバク
ターアエロゲネス、バチルスズブチルス、アブトバクタ
ーピネランデイ、プロテウス・ブルガリス、クロエラケ
ラなどに適用される。

これらの酵素または微生物菌体を成形体中に含有させる
割合は、完成された成形体を酵素反応に供する場合の必
要とされる反応速度を考慮して定める。

酵素または微生物菌体の水懸濁液と光硬化性樹脂とから
なる混合物に活性光線を照射する際のその形状は、酵素
反応への使用に便利であって活性光線を有効に透過せし
め得るならばとくに制限の必要はないが、通常は厚さ０
，０１〜３ｍ７ｆｔ好ましくは０．０５〜２ｍｍ、の層
状もしくは膜状とするか、直径０．２〜５ｍｍの線状も
しくは粒状とする。

機械的に補強することが必要な場合には、基質の浸透に
支障のない範囲で支持体を使用してもよい。

活性光線は波長２５０〜６００ ミＩＪ−、クロンのも
のが好適で、その光源としては低圧水銀灯、高圧水銀灯
、けい光灯、キセノンランプ、カーボンアークランプ、
太陽光などが用いられる。

照射時間は通常１０秒〜３０分である。

不活性ガス中など、空気を遮断した状態で照射を行なう
ことは、とくに遊離ラジカル重合による光硬化性樹脂が
用いられた場合において、照射時間短縮のために有効で
ある。

本発明の製造方法による固定化酵素または微生物菌体樹
脂成形体は、加熱工程を経ることなく得られるものであ
るため、酵素または微生物菌体をその活性が顕著に低下
せしめられることなく固定化して寓話しているうえに、
親水性の光硬化樹脂と極性に富む無機質粉粒状体等の広
大な接触界面を内部に攬蔵しているために、水溶液状で
ある基質に対して酵素反応を及ぼそうとする場合、基質
の浸透がきわめて高速度で行なわれ、基質と酵素または
微生物菌体との接触は均一系での酵素反応の場合と比較
してもほとんど遜色のない位の高能率で行なわれる。

また、光硬化性樹脂を硬化させるためのエネルギー源が
活性光線なので、高エネルギーの電離放射線を用いる場
合のように、それらによる直接的な、または無機質粉粒
状体等の界面で多量に放出される２次電子の作用による
酵素または微生物菌体の失活が生ずるおそれはまったく
すく、高価な酵素または微生物菌体を用いる場合にもき
わめて経済的である。

実施例 １ 数平均分子量約１５００のポリエチレングリコール１モ
ルに対し、キシ１月／ンジイソシアネート２モルおよび
２−ヒドロキシエチルメタクリｌノート２モルを反応せ
しめることにより得られた光硬化性樹脂１００部に対し
てけいそう土５０部およびベンゾインエチルエーテル２
部を混合し、分散させたのち、さらに１％インベルター
ゼ緩衝液（ＰＨ５，０）７５部を添加して液状の混合物
とした。

この混合物を、水平に配置されたポリエステルシート（
厚さ０．３ ｍｍ ）上に設けた厚さ０．５ｍｍのスペ
ーサーからなる内法５ｃｆｒＬ×５ｃＩｒＬの正方形の
枠内に流しこみ、厚さ０．１ｍｒｎのポリエステルフィ
ルムを密着させて、１２ｃｆｒＬ上方から低圧水銀灯（
東芝製ＦＬ−２０ＢＬ型、２０Ｗ）により光照射を５分
間行なって、ゲル状の固定化酵素樹脂成形体を完成した
。

この成形体からポリエステルフィルムおよびシートを除
去し、ＩＣｒｒＬ角に切断したもの１０枚を、水洗後、
１００ミリモルのショ糖水溶液２０ ｍｌに浸漬し、４
０℃で１０分間反応させて、生成したグルコースをグル
コスタットで定量し、固定化しないインベルターゼと比
較したところ、７０％の比活性を示した。

比較例 １ けいそう土の混合を行なわなかったことのほかは、実施
例１と同様にしてインベルターゼ固定化物を作成し、比
活性の測定を行なった結果は４５％であった。

実施例 ２ エピコート１００１樹脂（商品名、シェルケミカル社製
造品、エポキシ当量約４８０ ） ９６０ ｇにアジピ
ン酸２２０ ｇ（１，５モル）を、ついで無水こはく酸
３８０ ｇ（３，８モル）を反応させてエステル化した
のち、グリシジルメタクリレート２８５ ｇ（２，０モ
ル）を反応させて生成した酸価約８５、数平均分子量約
３７００の光硬化性樹脂１００部に５係（重量）ＮａＯ
Ｈ水溶液１００部を加えて液状としたものにマイカ粉２
００部を混合し分散させたのち、さらにベンゾインメチ
ルエーテル１部および２％（重量）グルコースイソメラ
ーゼ緩衝液（ｐＨ７，０） １０ 部を添加して混合物
とした。

この混合物を、水平に配置されたポリプロピレンフィル
ム上に設けた厚さ０．５ｍｍのスペーサーからなる内法
５ＣｒｒＬ×５ＣｒＩＬの正方形の枠内に流しこみ、厚
さ０．１ｍｍのポリプロピレンフィルムを密着させて、
２０ＣｒｒＬ上方から高圧水銀灯（２ＫＷ）により光照
射を３分間行なって、ゲル状の固定化酵素樹脂成形体を
完成した。

ポリプロピレンフィルムを除去されたこの成形体を１に
７７１角に切断し、その１０枚を水洗後、基質溶液とし
ての２係（重量）ぶどう糖水溶液（ｐＨ７，０） ２０
ｍ１に浸漬して４５℃で（イ）分間反応を行なわせ、生
成したフラクトースをシスティン−カルバゾール法で定
量して固定化しない酵素系と比較したところ、６０％の
比活性を示した。

比較例 ２ マイカ粉の混合を行なわなかったことのほかは、実施例
２と同様にしてグルコースイソメラーゼ固定化物を作成
し、比活性の測定を行なった結果は４５％であった。

実施例 ３ 実施例２と同一の光硬化性樹脂のアルカリ中和液状物２
００部に３〜４ｍｖｔに切断したガラス繊維４０部を混
合し分散させたのち、さらにベンゾ・インエチルエーテ
ル１部およびクロエラケラ種酵母を含有量約３０重量係
になるように懸濁させた０、１Ｍ−りん酸緩衝液（ｐＨ
７，２） １０部を添加して混合物とした。

この混合物を水平に配置されたポリプロピレンフィルム
上に設けた厚さ１ｍｒＩＬのスペーサーからなる内法５
ＣｒＩＬ×５ｃｒｒＬの正方形の枠内に流しこみ、その
上に厚さ０．１朋のポリエステルフィルムを密着させ、
１２ｃｒＩ′Ｌ上方から低圧水銀灯（東芝製ＦＬ−２０
ＢＬ型、２０Ｗ）により光照射を８分間行なって、固定
化酵母を含むゲル状の樹脂成形体を完成した。

この成形体が有する酵母菌体単位量当りのカタラーゼ活
性を、２４０ｎｍの吸光度測定によるＨ２Ｏ２の減少速
度によって、ガラス繊維を混合されない対照固定化物と
比較した結果、後者の１．２倍であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 無機質粉粒状体、無機質鱗片状体および（または）
   無機質繊維状体物を分散させた水溶性もしくは水分散性
   の光硬化性樹脂と、酵素または微生物菌体の水懸濁液と
   の混合物に活性光線を照射することを特徴とする固定化
   酵素または微生物菌体樹脂成形体の製造方法。 ２ 無機質粉粒状体が、ゼオライト、膨張バーミキュラ
   イト、膨張パーライト、軽石、けいそう土、カオリン、
   シリカゲル、半焼結ガラス粉、発泡ガラス、素焼陶磁器
   、煉瓦、活性炭および鹿沼土から選らばれた少くとも１
   種である特許請求の範囲第１項記載の樹脂成形体の製造
   方法。 ３ 無機質鱗片状体が、マイカ粉、ガラスフレーク、マ
   イカ状酸化鉄およびゾールナイトから選ばれた少くとも
   １種である特許請求の範囲第１項記載の樹脂成形体の製
   造方法。 ４ 無機質繊維状体が、石綿、岩綿、炭素繊維およびガ
   ラス繊維から選ばれた少くとも１種である特許請求の範
   囲第１項記載の樹脂成形体の製造方法。 ５ 光硬化性樹脂が、１分子中に２個以上のエチレン状
   不飽和基を有する数平均分子量５００〜３０，０００の
   遊離ラジカル重合型光硬化性樹脂である特許請求の範囲
   第１項記載の樹脂成形体の製造方法。 ６ 多孔性の無機質粉粒状体、無機質鱗片状体および（
   または）無機質繊維状体の５〜５００重量部が光硬化性
   樹脂１００重量部中に分散されることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の樹脂成形体の製造方法。