JPS5928399B2 - リフアマイシン誘導体を製造するための生物学的方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリフアマイシン（ｒｉｔａｍｙｃｉｎ）誘導体
、特にリフアマイシンＢからのリフアマイシンＯリフア
マイシンＳおよびリフアマイシンＳＶの酵素的製造方法
に関する。

本発明はまたその醗酵培地からのリフアマイシンＯまた
はリフアマイシンＳの酵素的採取方法に関する。リフア
マイシン類は相互に密接な関係を有する大環状ヒドロキ
ノン−キノン抗生物質の一群であり、アンタイバイオテ
イクス・アニユアル（ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓＡｎｎｕ
ａｌ）、第２６２頁（１９５９年）、アプライド・マイ
クロパイオロソー（Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃにｏｂｉｏｌ、）、第９巻、第３２５頁（１９６
１年）およびプログレス・イン・インダストリアル・マ
イクロパイオロソー（Ｐｒｏｇｒ、Ｉｎｄ、Ｍｉｂにｏ
ｂｉｏｌ、）、第６巻、第２１頁（１９６７年）に記載
されている。リフアマイシン誘導体は、ノカルデイア・
メデイテラネイ（ＮｏｃａｒｄｉａＩｌｄｉｔｅｒａｎ
ｅｉ）の醗酵により生産される抗生物質であるリフアマ
イシンＢの化学変換により製造されている。これらのう
ち、リフアマイシン０およびリフアマイシンＳはリフア
マイシン誘導体合成の重要な中間体であり、大きな治療
上の有用性を示し、リフアマイシンＢから化学的プロセ
スにより製造されていた。例えば特開昭３７−８５５０
号、特開昭３８−１５３５２、英国特許第３２４、４５
２号および西独特許第２、４４４、５２７号の記載のよ
うな先行技術から明らかな如く、上記方法の改良に多大
の努力がなされてきた。醗酵プロスからのリフアマイシ
ン類の採取もまた多くの報告に開示されている。２種の
採取方法が知られている。

リフアマイシンＢとしてプログレス・イン・インダスト
リアル・マイクロバイオロジイ、第６巻、第２１頁（１
９６７年）｛へまたリフアマイシンＯとしては、米国特
許第３，８４７，９０３号、フランス特許第２，２２１
，５１７号、オランダ特許７３−０３，１９６号、特開
昭４９−１１７，６９２号、西独特許第２，３１０，７
−３１号および南アフリカ特許第７３−０１，３２８号
に記載されている。リフアマイシンＯの採取は本質的に
リフアマイシンＢの化学的酸化を基にするものである。
一般に、リフアマイシンＢをリフアマイシンＯに酸化す
るのは有機溶媒または有機溶媒一水混合物中で実施され
る。

人工酸化剤例えば亜硝酸ナトリウム、過硫酸ナトリウム
または過酸化水素を通常微酸性条件（ＰＨ４，５）で使
用する。より酸性の条件ではリフアマイシンＯのリフア
マイシンＳへの加水分解もまた同時に生じる。リフアマ
イシンＯからリフアマイシンＳを製造する改良方法は英
国特許第９２４，４７２号および西独特許第２，４４４
，５２７号に開示されている。これまでに報告されてい
る方法はいずれも人工酸化剤および強酸性条件を必要と
する化学的方法に本質的に基くものであり、この場合副
生成物の実質的な形成が避けられない。従つて、温和な
反応条件を使用し、また酵素の特異性により変換を定量
的な収率で実施することができる酵素的方法が望ましい
。本発明の主たる目的はリフアマイシンＢからリフアマ
イシン誘導体を酵素的に製造する方法を提供するにある
。本発明の他の目的はリフアマイシンＢからリフアマイ
シンＯを酵素的に製造する方法を提供するにある。

本発明の追加の目的はリフアマイシンＢからリフアマイ
シンＳを酵素的に製造する方法を提供するにある。

本発明の更に他の目的はリフアマイシンＢからリフアマ
イシンＳＶを酵素的に製造する方法を提供するにある。

本発明の別の目的は醗酵プロスからリフアマイシンＢを
酵素的に採取する方法を提供するにある。

これらの目的および他の目的は本発明の方法により達成
することができ、本発明の方法はリフアマイシンＢ溶液
またはリフアマイシンＢ醗酵プロスをフミコラ（Ｈｕｍ
ｉｃＯｌａ）Ｓｐｐ．（ＡＴＣＣ２Ｏ６２Ｏ）およびモ
ノシリウム（ＭＯｎＯｃｉｌｌｌｕｍ）Ｓｐｐ．（ＡＴ
ＣＣ２Ｏ６２ｌ）からなる群から選択される微生物酸化
酵素の作用に受けしめることを特徴とする。酵素は微生
物細胞、細胞抽出物、吸着酵素、全細胞または固定酵素
のいずれの形態であつてもよい。方法は２０〜５０℃の
範囲の温度および４〜９の範囲のＰＨでリフアマイシン
ＢをリフアマイシンＯまたはリフアマイシンＳに変換す
るのに十分な時間で行われる。リフアマイシンＢを微生
物オキシダーゼで処理すると、主たる生成物はＰＨ４〜
６ではリフアマイシンＯであり、またＰＨ６〜９ではリ
フアマイシンＳである。

リフアマイシンＳは通常アスコルビン酸の存在下にリフ
アマイシンＳＶに還元され得る。反応終了後、それぞれ
の所望の生成物を反応媒質のＰＨ値の調節により沈殿物
として採取することができる。

化学的方法で通常当面する問題または不利点に鑑み、本
発明者等はリフアマイシンＢのリフアマイシンＯまたは
リフアマイシンＳへの変換を接触する微生物種を見い出
すべく努力をした。

未だ知られていない２種の菌の菌株を使用することによ
り、化学的方法の不利な点のいずれもが除かれ、リフア
マイシンＢからリフアマイシン０およびリフアマイシン
Ｓを製造するための商業上により一層実施可能な方法が
達成されることが見い出された。新規な種の一つはフミ
コラＳｐｐ．と同定され、そしてワシントンのジ・アメ
リカン・タイプ・カルチユア・コしクシヨン（ＴｈｅＡ
ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣＯｌｌｅｃｔ
ｉＯｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託され、そこでこの菌は番号
ＡＴＣＣ２Ｏ６２Ｏヴダペスト条約に基づく寄託）が付
けられている。他の新規な菌株はモノシリウムＳｐｐ．
と同定された。この微生物もまたジ・アメリカン・タイ
プ・カルチユア・コレクシヨンに寄託され、そこでこの
菌は番号ＡＴＣＣ２Ｏ６２ｌ（ブダペスト条約に基づく
寄託）が付けられている。これらの新規な菌株は表Ｉお
よびＨに要約されるように次の菌学的および生理学的特
徴によりそれぞれの属に指定することができる。酵素活
性は所望の微生物を十分な時間の間栄養培地で生育させ
ることにより得られる。

Ｐ過または遠心分離により醗酵プロスから微生物細胞を
分離すると、酵素活性はプロス中よりも主として細胞中
に見い出される。リフアマイシンＢの変換に対応する酵
素は本発見により細胞内酵素である。本発明の好ましい
態様によれば、所望の微生物は空気の存在下に適当な栄
養培地と接触して発育する。適当な栄養培地は本質的に
無機金属イオンを伴うか伴わずして窒素質要素の源およ
び炭素とエネルギーの同化可能な源からなる。主要な炭
素源には炭水化物例えばグルコース、フルクトース、シ
ェークロース、マルトース、でんぷん、グリセリンまた
はデキストリンを包含する。窒素質要素の源には有機物
質例えば大豆紛、コーン・ステイープ・りカー、肉工キ
ズ、ジスチラース・ソリユーブルス、ペプトンおよび（
または）酵母工キズあるいは合成物質例えば簡単な合成
可能な有機および無機化合物例えばアンモニウム塩、硝
酸アルカリ塩またはアミノ酸からなる物質が包含される
。微生物は２５〜３５゜Ｃの適当な温度で適当な時間好
ましくは約２〜４日間酸素源の存在下例えば曝気しなが
らの振とうまたは空気吹込を伴う攬伴により生育する。
培地をリフアマイシンＢの酸化および加水分解に直接使
用することができるが、済過または遠心分離により上澄
液を除去し、酵素の主部分量を含む微生物細胞を反応に
使用する。微生物細胞を全細胞酵素として直接使用する
ことができる。全細胞を破壊し、次に遠心分離した後に
得られた細胞抽出物もまた凍結乾燥するかまたはするこ
となく酵素源として使用し得る。固定された酵素もまた
連続プロセスに使用できるし、またはバツチ式反応にく
り返して使用できる。固定された酵素は細胞抽出物の酵
素をケイ酸塩物質例えばベントナイト、セライト、ケイ
ソウ土、カオリン、シリカゲルまたは他の物質例えば活
性炭またはアルミナに吸着させることにより調製するこ
とができる。アセトン処理による細胞の脱脂を伴うかま
たは伴うことなくアクリルアミドゲルに全細胞を取込し
たものも固定された酵素の調製に使用し得る。リフアマ
イシンＢのリフアマイシンＯへの酸化は任意の普通のＰ
Ｈおよび温度で実施することができる。しかし、酵素の
安定性を考慮すると、反応を好ましくは約６０℃より低
い！度、最適には３０〜４０℃、および約４〜１・７０
の″ＰＨで実施する反応ＰＨの選定は選択されたＰＨで
の相対酵素活性および所望の生成物のタイプに左右され
る。最大酵素活性はフミコラＳｐｐ．（ＡＴＣＣ２Ｏ６
２Ｏ）についてはＰＨ７．５〜８．５でみられ、一方主
要生成物はＰＨ４〜６でリフアマイシンＯであり、また
ＰＨ７．Ｏ以上でリフアマイシンＳである。酸性ＰＨで
のリフアマイシンＯの主要生成はこのＰＨでのその水に
対する不溶性に帰せられる。リフアマイシンＯはアルカ
リ性ＰＨでは水に比較的可溶であり、そこではリフアマ
イシンＳに加水分解される。所望の生成物は、それぞれ
の酵素の接触効率を犠牲とする反応ＰＨの調節によりこ
れらの２種の微生物酵素によつて得ることができる。酵
素反応の度合は、イーストマン・クロマグラム０シート
（ＥａｓｔｍａｎＣｈｒＯｍａｇｒａｒｎＳｈｅｅｔ）
ＮＱｌ３ｌ８ｌおよびクロロホルム／アセトン（１：１
）混合物の展開溶媒を用いる薄層クロマトグラフイ一（
ＴＬＣ）により測定することができる。

酸性ＰＨでの反応の終末点は、リフアマイシンＯスポツ
ト（淡黄色、ＲｆＯ．６）の強化を伴うリフアマイシン
Ｂスポツト（黄色、ＲｆＯ〜０．１）の完全な消失によ
り確認される。アルカリ性ＰＨでは、反応はリフアマイ
シンＯ（ＲｆＯ．６）の初めの出現と共に進行し、次い
でリフアマイシンＳスポツト（紫色、ＲｆＯ．４）の徐
々な強化がある。リフアマイシンＳの製造目的のために
は、リフアマイシンＢおよびリフアマイシンＯの両スポ
ツトが完全に消失し、一方リフアマイシンＳスポツトの
みが残留するときが終末点である。所望により、リフア
マイシンＯをリフアマイシンＳに加水分解した後、リフ
アマイシンＳＶはリフアマイシンＳをアスコルビン酸で
還元することにより得られる。リフアマイシンＯおよび
リフアマイシンＳは通常沈殿物として得られ、反応混合
物から済過または遠心分離により採取することができる
。リフアマイシンＳＶはリフアマイシンＯまたはリフア
マイシンＳよりも中性の水に若干溶解度が高く、それ故
に採取は酸性ＰＨで最大とすることができる。これは酸
例えば塩酸または酢酸を添加することにより容易に行う
ことができる。得られたリフアマイシンＳの黄色沈殿物
は済過または遠心分離により採取することができる。次
に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。

実施例 １ （ａ）醗酵・・・・・・凍結乾燥コーン・ステイープ・
りカー（２％）、大豆粉（１％）および酵母工キズ（０
．５％）からなり、ＰＨ７．Ｏに調節した水性培地１１
を小型培養タンクに加え、オートクレーブ処理した。

冷却後、３０℃で２日間同一培地にモノシリウムＳｐｐ
．（ＡＴＣＣ２Ｏ６２ｌ）を生育させて得られた種培地
５０ｍ１を加えた。これを通気速度０．５ＶＶＭおよび
攪拌速度３００ｒｐｍで３日間３０℃で培養した。（ｂ
）酵素の調製・・・・・・培養プロスをプールし、全細
胞を淵集した。

細胞を１０分間超音波処理して破壊した。３０分間１０
，０００ｒｐｍで遠心分離後の上澄液を採取し、４℃で
保存した。

（ｃ）反応・・・・・・細胞抽出物１０ｍ１を０．１％
リフアマイシンＢ溶液（１０ｍＭアセテート緩衝液、Ｐ
Ｈ５．５）５００ｍ１に加えた。

通気攪拌下４５℃での反応中に、反応溶液はリフアマイ
シンＯの沈殿物の形成により濁つたものとなつた。終末
点は、ＴＬＣ中のリフアマイシンＢスポツト（ＲｆＯ−
０．１、黄色）の完全な消失を伴つてリフアマイシンＯ
の淡黄色スポツト（ＲｆＯ．６）の形成により検出され
た。

反応は５時間以内で完了した。ワツトマン（Ｗｈａｔｍ
ａｎｎ）魔１淵紙で吸引淵過した後、沈殿を採取し、硫
酸ナトリウムで乾燥した。この方法により、リフアマイ
シン０（純度９８％）の０．４５９が得られた（収率一
９６％）。実施例 ２ （ａ）醗酵・・・・・・５００ｍ１エルレンマイヤーフ
ラスコ１０本の各々にグルコース（１％）、カゼイン加
水分解物（１％）、酵母工キズ（１％）、およびＣｕＳ
Ｏ４・５Ｈ２０（０．００５％）からなる水性培地を入
れ、ＰＨ７。

Ｏに調節し、そしてオートクレーブ処理した。冷却後、
各フラスコにフミコラＳｐｐ．（ＡＴＣＣ２Ｏ６２Ｏ）
の肉工キズ寒天斜面培地の１白金耳を接種した。接種物
を振とう（６ｃｍストローク、２００ｒｐｍ）しながら
２８℃で４日間培養した。（ｂ）全細胞の採取・・・・
・・培養プロスをプールし、そして全細胞を１０分間３
，０００ｒｐｍで遠心分離して採取した。

細胞ペーストは酵素活性を実質的に失うことなく１ケ月
間４℃で保存することができる。（ｃ）酵素反応・・・
・・・湿潤細胞ペースト２９を０．１（！ｌ）リフアマ
イシンＢ溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ＰＨ７．８）５
００ｍ１に加えた。

攪拌、通気しながら３７℃での反応中に、色が当初のリ
フアマイシンＢの黄色からリフアマイシンＳの紫色に徐
徐に変化した。８時間反応後、展開溶媒としてクロロホ
ルム／アセトン（１：１）混合物を用いてのＴＬＣでリ
フアマイシンＢスポツト（黄色、ＲｆＯ〜０．１）の完
全な消失によつて確認されるように反応が完了した。

巨大気孔焼結グラスフイルタ一での淵過により細胞を分
離した後、淵液を４℃に維持しながら２０分間１０，０
００ｒｐｍで遠心分離した。沈殿を硫酸ナトリウムで乾
燥することにより、粗製リフアマイシンＢＯ．４９が得
られた。メタノール／水（１：１）（ＰＨ２．５）から
再結晶するとリフアマイシンＳＯ．３８９が得られた（
収率−９３（：ｆ））。実施例 ３（ａ）醗酵・・・・
・・ラクトース（１．５％）、ペプトン（１％）および
酵母工キズ（０．５％）からなる水性培地２２１を２８
１シャー・フアーメンタ一中１２１℃で３０分滅菌前後
にＰＨ７．Ｏに調節した。

これを同一培地で２日間３０℃で生育させたフミコラＳ
ｐｐ．（ＡＴＣＣ２Ｏ６２Ｏ）の培養物１１を接種した
。これを撹拌（４００ｒｐｒｒＬ）および通気（０．３
ＶＶＭ）で３日間３０℃で培養した。（ｂ）酵素固定・
・・・・・連続遠心分離によつて採取した全細胞を海砂
による均質化により破壊した。

細胞抽出物を吸引淵過によつて得て、そして激しく攪拌
しながら３０分間セライト１００９で処理した。この操
作の途中で細胞は完全にセライトに吸着された。残留酵
素は済液をセライト１０９で処理することにより回収す
ることができた。セライトケーキを蒸留水５００ｍ１で
洗滌すると、湿つたスラリー２１０９が得られた。ケー
キを４℃で冷凍庫に保存した。（ｃ）反応・・・・・・
セライトに吸着された酵素１０９を１０／）リフアマイ
シンＢ溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ＰＨ８．５）３０
０ｍ１に加えた。

リフアマイシンＳへの変換は通気、攪拌下４０℃で７時
間反応させて完了した。焼結グラスフイルタ一での淵過
で採取したセライト濾過ケーキをメタノール２００ｍ１
で洗滌した。リフアマイシンＳの最終メタノール性水溶
液を、残留リフアマイシンＳ沈殿物を完全に可溶化する
ために、５０℃に加温した。５％アスコルビン酸水溶液
３０ｍ１を連続攪拌しながら滴加した。

リフアマイシンＳの紫色がリフアマイシンＳＶの深赤色
に徐々に変化した。最終ＰＨを４．０に調節した後、４
０℃で吸引蒸発器を用いてメタノールを完全に留去させ
た。最終溶液を２日間４℃に冷却した後、リフアマイシ
ンＳＶ結晶を淵過により採取した。深い黄色昧を帯びた
リフアマイシンＳＶ結晶２．４ｆ１が硫酸ナトリウムで
乾燥後に得られた（収率−８７％）。（施例 ４ ］）醗酵・・・・・・グリセリン（２％）、大豆粉（１
．５％）、酢酸アンモニウム（１％）、ＺｎｓＯ４（０
．００１％）およびＣｕＳＯ４（０．００５％）からな
る水性培地７．０１をＰＨ７．Ｏに調節し、そして１０
０ｊ容量培養タンタで１２１℃で３０分間オートクレー
ブ処理した。

冷後、モノシリウムＳｐｐ．（ＡＴＣＣ２Ｏ６２ｌ）の
培養物３１を接種した。このものは同一培地で１．５日
間３５℃で生育させておいた。このものをＰＨを７．０
に調節して３５℃で３日間培養し、この培養全体にわた
つて通気速度０．５ＶＶＭおよび撹拌速度３００ｒｐｍ
であつた。））酵素固定・・・・・・全細胞を連続遠心
分離により採取した。

湿つた細胞ペースト１００９を脱脂のためにアセトン５
００ｍ１で処理した。このようにして調製したアセトン
乾燥粉末５９を０．１Ｍトリス−ＨＣＩ緩衝液（ＰＨ７
．Ｏ）中のアクリルアミド単量体９．５９およびビス−
アクリルアミド０．５９からなるアクリルアミド溶液２
０ｍ１に加えた。完全に混合した後、ＴＥＭＥＤ２ｍｌ
および過硫酸アンモニウム０．５９を４０℃に温度を維
持しながら重合のために加えた。ゲルをシーブ（メツシ
ユサイズ１６）を通して押し出しした後、これを適当な
サイズ（２０５ｍ０に截断し、次いで蒸留水５００ｍ１
で充分に洗滌した。ｃ）反応・・・・・・アクリルアミ
ドゲルに取込まれた酵素１０９（湿潤重量）を０．１％
リフアマイシンＢ溶液（ＰＨ５．Ｏ）５００ｍ１に加え
た。撹拌および通気しながら３『Ｃで６時間反応させた
後、固定された酵素を涙取し、次にアセトン１００ｍ１
で洗つた。固定された酵素を次の用途のために４℃で保
存した。淵液を４０℃でアセトン減圧留去し、そして１
日間４℃に冷却した。この間に淡い黄色味を帯びたリフ
アマイシンＯの結晶が徐々に形成した。済過、乾燥する
と、生成物０．４７９が得られた（収率−９３％）。実
施例 ５ 実施例４で採取されたアクリルアミドゲルに取込まれた
酵素１０９を０．５％リフアマイシンＢ溶液（ＰＨ８．
Ｏ）の２００ｍ１に加えた。

１０時間の反応期間の間にリフアマイシンＢが完全にリ
フアマイシンＳに変換された。

固定された酵素ペレツトを済取し、次にアセトン５０ｍ
１で洗つた。４０でアセトンを蒸発させた後、反応溶液
を１日間４℃に冷却した。

紫色の沈殿物を３０分間１０，０００ｒｐｍの遠心分離
で採取し、乾燥した。リフアマイシンＳ（Ｎａ＋形態）
８．８９が得られた（収率＝９３％）。実施例 ６ 実施例３の反応から採取されたフミコラＳｐｐ．（ＡＴ
ＣＣ２Ｏ６２Ｏ）のセライト吸着酵素５９を０．１％リ
フアマイシンＢ溶液（ＰＨ５．Ｏ）５００ｍ１に加え、
そして通気しながら４０℃で４時間攪拌した。

セライトケーキを焼結グラスフイルタニで済取し、次い
でアセトン５０ｍ１で洗つた。３０℃で吸引蒸発器によ
りアセトンを留去させた後、溶液を１日間４℃で冷却し
た。

ろ過、乾燥後、リフアマイシンＯの０．４５９が得られ
た（収率＝９０％）。実施例 ７ 実施例２に記載の操作で得られたモノシリウムＳｐｐ．
（ＡＴＣＣ２Ｏ６２ｌ）の全細胞５０９（湿潤重量）を
ノカルデイア・メデイテラネイ（ＮＯｃ−Ａｒｄｉａｍ
ａｄ！Ｔｅｒｒａｎｉ）Ｎ−１の培養によつて得られた
希釈、細胞を含まないリフアマイシンＢ醗酵プロス（１
，０２０ｍｆリフアマイシンＢ／ｌ）２１１に加えた。

ＰＨを５．５に調節した後、酵素反応を通気、攪拌しな
がら４０℃で実施した。３時間の反応後に済過により得
られた粗製リフアマイシンＯスラリーを乾燥すると粗製
リフアマイシン０（純度７０％）２．８９が得られた。

総回収収率は９５％であつた。実施例 ８ 実施例１で得られたフミコラＳｐｐ．（ＡＴＣＣ２Ｏ６
２Ｏ）の全細胞２００９（湿潤重量）を遠心分離したリ
フアマイシンＢ醗酵プロス（５０５０ηリフアマイシン
Ｂ／ｌ）３１！に加えた。

プロスＰＨを８．２に調節した後、８時間プロスを通気
、攪拌した。リフアマイシンＳへの変換は深赤色への色
変化を伴つていた。反応終了後、粗製リフアマイシンＳ
を焼結グラスフイルタ一で済取し、次いでアセトン３０
０ｍｊで充分に洗つた。アセトンを留去し、４℃に冷却
すると、粗製リフアマイシンＳ（Ｎａ＋形態）１８．９
９が得られた（純度＝７４％、収率＝９２．３％）。実
施例 ９ 実施例４に記載の操作で調製したモノシリウムＳｐｐ．
（ＡＴＣＣ２Ｏ６２ｌ）のアクリルアミドゲルに取込ま
れた酵素５０ｆ！（湿潤重量）を遠心分離したリフアマ
イシンＢ醗酵プロス（６１００７！９リフアマイシンＢ
／１１）２１に加えた。

通気、攪拌しながら２５時間４５℃で反応させた後、固
定酵素ペレツトを焼結グラストフイルタ一で済取した。
これをアセトン５００７ｆ１１で充分に洗滌した。残留
沈殿物を別の５００ｍ１のアセトンを加えて完全に可溶
化した。これにアスコルビン酸溶液（１０％水中）１０
０ｍ１をゆつくり攪拌しながら滴加した。リフアマイシ
ンＳＶへの完全な還元を確認した後、ＰＨを３．５に調
節し、４０℃でアセトンを減圧留去した。溶液を１日間
４℃に冷却し、そしてこのようにして形成された黄色味
を帯びた沈殿を沢取し、乾燥した。この操作により、粗
製リフアマイシンＳＶｌ２．５９が得られた（純度＝８
４％、収率＝９３．８％）。実施例 １０ 実施例３に記載した如く、酵素をベントナイトに吸着さ
せることによりモノシリウムＳｐｐ．（ＡＴＣＣ２Ｏ６
２ｌ）の固定された酵素を調製した。

このようにして調製した固定酵素３０９を予めＰＨ９．
Ｏに調節したリフアマイシンＢ醗酵プロス（６２００ワ
リフアマイシンＢ／ｌプロス）２１に加え、そして混合
物を通気下４５℃で１６時間連続攪拌した。固定酵素を
焼結グラスフイルタ一で済取し、次にメタノール５００
ｍ１で洗つた。別の５００ｍ１のメタノールの添加によ
りリフアマイシンＳ沈殿の完全溶解後、１０％Ｈｃｅで
ＰＨを３．０に調節した。３０℃でメタノールを減圧留
去し、そして１日４℃に冷却すると、粗製リフアマイシ
ンＳ（『形態）１３．７９が得られた。

最終生成物の純度は７８％であつた．（収率＝９３．７
％）。実施例 １１実施例４に記載した操作により、フ
ミコラＳｐｐ．（ＡＴＣＣ２Ｏ６２Ｏ）のアセトン乾燥
酵素をアクリルアミドゲルに取込んだ。

このようにして製造した固定酵素ペレツト５０９（湿潤
重量）を予めＰＨ５．５に調節した希釈リフアマイシン
Ｂ醗酵プロス（１２００１！９リフアマイシンＢ／ｌプ
ロス）３１に加え、次に４０℃で通気、撹拌した。４時
間反応した後、固定酵素ペレツトを焼結グラスフイルタ
一で沢取し、次にメタノール３００ｄで洗つた。

淵液を１０％ＨＣＩでＰＨ３．Ｏに調節し、そしてクロ
ロホルム５００ｄで抽出した。有機層を完全に濃縮乾個
した。この操作により、リフアマイシンＯの３．４９が
得られた（純度−９６％、収率９１％）。上記の記載は
当業者が本発明を実施し得るために掲げたものであり、
この記述を読んだ当業者に明らかである本発明の可能な
変化、変形の全てを記述しようとしたものではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リフアマイシンＢを４〜１０の範囲のｐＨにおいて
   フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）ｓｐｐ．（ＡＴＣＣ２０
   ６２０）およびモノシリウム（Ｍｏｎｏｃｉｌｌｉｕｍ
   ）ｓｐｐ．（ＡＴＣＣ２０６２１）からなる群から選択
   される微生物の酵素の反応に受けしめ、そして反応媒質
   からリフアマイシンＯまたはリフアマイシンＳを採取す
   ることを特徴とするリフアマイシン誘導体の製法。 ２ 前記酵素が微生物細胞、細胞抽出物および固定され
   た酵素からなる群から選択される特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３ 前記反応を４〜６の範囲のｐＨで実施してリフアマ
   イシンＯを得る特許請求の範囲第１〜２項記載の方法。 ４ 前記反応を７〜９の範囲のｐＨで実施してリフアマ
   イシンＳを得る特許請求の範囲第１〜２項記載の方法。