JPS5928470A - バチルス・ズブチリス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はバチルス・ズブチリス、特にホスホリボ／ル
ービーホスフェート・アミドトランスフェラーゼ） （ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｂｏｓｙ　１ｐｙｒｏｐｈｏｓｐ
ｈａ　ｔｅａｍｉｄｏｉｒａｎｓｒｅｒａｓｅ　；以下
ｒｐ　ＲＰ　Ｐアミドトラノスフエラ−ゼ」と記ス）の
遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチルス
・ズブチリスに関する。

バチルス属の微生物には、ヒボキサンチン、アデニン等
のプリン塩基、イノゾン、グアノゾン、アデノシン等の
プリンヌクレオシド、イノシン酸キサンチル酸、グアニ
ル酸等のプリンヌクレオチドを生産する変異株が知られ
ている。又、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼは、プ
リンヌクレオチド合成系における重要な酵素であり、プ
リンヌクレオチドのみならず、プリン塩基及びプリンヌ
クレオシドの生成散もＰＲＰＰアミドトラ／スフエラー
ゼの活性に大きく依存している。

従って、上記のようなバチルス属の微生物につい−Ｃ’
、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活：生の高い株を
得れば、プリン塩基プリンヌクレオシド又はプリンヌク
レオチドをより高い収率でｉられることか期待できる。

ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性の高い菌株を得
るには従来、バチルス属の微生物に８−アザグアニン等
のプリンアナログに対する耐性を人工変異により（＝１
与する方法が知られている。

叙上のような従来の技術に対し、本発明者らは、遺伝子
組換え技術により、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ
の遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチル
ス・ズブチリスを得ることに成功し、これによって従来
の人工変異法では得られなかったＰＲＰＰアミドトラン
スフェラーゼ活性の極めて高い菌株を得ることに成功し
た。

即ちこの発明は、ＰＲ，ＰＰ・アミドトランスフェラー
ゼの遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチ
ルス・ズブチリスである。

ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼが導入されるバチル
ス・ズブチリスはどのような菌株であってもよい。具体
的に例示すれば、以下のものがある。

ヒボキサンチノ生産菌であるバチルス・ズブチリ二ノ要
求性）　、イノシン生産菌であるバチルス・ズブチリス
ＡＪＩ＋９１３（アルギニノ、ロインγ ン、アデニン要求性、８−アザ−アニン耐性）、イノシ
ン酸生産菌であるバチルス・ズブチリスＡＪＩ＋９１４
（アルギニン、ロイシン、アデニン要求性、８−７ザグ
アニン耐性）、グアノノン生産菌であるバチルス・ズブ
チリスＡＪ、ｌｌ９１５（アルギニン、ロイシン、アデ
ニン要求性）、およびグアニル酸生産菌であるバチルス
・ズブチリスＡＪ１１９１６（アルギニン、ロイシン、
アデニン要求性）等である。

ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼが組み込まれている
台、） （−１’；　ｙ、−；ドを得るには、次のような通常の
方法が用いられる。

染色体ＤＮＡ及びプラスミドベクターを各々制限エンド
ヌクレアーゼを用いて切断する。次にリガーゼにより染
色体ＤＮＡ断片と切断されたベクターＤＮＡとを連結せ
しめる。かくして得られた染色体１）　Ｎ　Ａ断片とベ
クターの結合物の受容菌は遺伝子が増幅・発現するよう
な微生物ならばどのようなものでもよいが、ＰＲＦＰア
ミドトランスフェラーゼ欠損株を用いれば形質転換株を
選択する際に好都合である。このとき受容菌として、ヒ
ボキサンチン要求性変異株や、８−アザグアニン等のプ
リン系核酸アナログ感受性菌を用いることもできる。

組換えＤＮＡを上記のようなりＮＡ受容菌に４八するに
は、例えばＭｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１６Ｌ
　ｌ１１（１９７９）に記載されているような通常の形
質転換法が使用できる。

形質転換株のうちより、ＰＲＰＰアミドトランスフェラ
ーゼが組込まれているようなプラスミドを得るには、受
容菌としてヒボキサンチン要求菌（ＰＲＰＰアミドトラ
ンスフェラーゼ欠損株など）を用い、ヒポキサンチンを
含有しない培地に生育し得るような菌株を選択すればよ
い。また、ベクターＤＮＡのマーカーの性質を併せもつ
菌株を選択できるような培地を用いれば、より選択が容
易である。このようにして一旦選別されたＰＲＰＰアッ
トトランスフェラーゼ遺伝子領域カ組ミ込マれている組
換えベクターは形質転換株より抽出後池のＤＮＡ受容菌
、例えば各種の核酸、アミノ酸生産菌等に導入する事が
できる。

バチルス・ズブチリスを宿主としうるプラスミドベクタ
ーは、例えば、スタフィロコッカス属微生物由来のｐＴ
１２７．　ｐｃＩ９４．　ｐｃ２２１．　ｐｃ２２３ｐ
ＵＢＩ＋２　（以上Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ　、Ａｃａｄ
　、Ｓｃｉ　、Ｕ、Ｓ、Ａ、　、　７４．１６８０（＋
９７７）参照）、ＰＵＢｌｌｏ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、１３４，３１８（１９７８）参照）、ｐＴＰ４．
　　ｐＴＰ５（以上、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔｅ
ｒＳ、＋＠、５５（＋９７８）参照）、枯草菌由来のｐ
ＬＳ竺ｐＬＳ２８（以上、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、
１３１，６９９（＋９７７）　　参照）、３ ｐＬｓ＠＠（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１２９．１４
８７（＋９７７）参照）、ｐｐｔ、　　菖　［）ＰＬ２
（以」二、　　　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ｌｊし１
，４８４（＋ｃ＋７ｓ）参照）、等がある。更にこれら
プラスミドをもとにして構築した複合プラスミドも当然
のことながらベクターＤＮＡとして利用できうる。

ブチリスは、使用した宿主菌が、アデニン要求性でヒボ
キサンチンの分解能が低下している一合にはヒボキサン
チンを、アデニン要求性でイノシンの分解１止が低下し
ている場合にはイノシンを、アデニン要求性で５′−イ
ノシン酸の分解能が低下している場合には５１−イノシ
ン酸を、アデニン要求性で５　’−Ａ−サンチル酸の分
解能が低下している場合には５１−キサンチル酸を、ア
デニン要求性でグアニンの分解能が低下している場合に
はグアニンを、アデニン要求性でグアノノンの分解能が
低下している場合にはグアノシフを、アデニン要求性で
５＋−グアニル酸の分１ＪＩ１．詣が低下している場合
には５′−グアニル酸を、アデニン分解能が低下してい
る場合にはアデニンを、アゾ、ノンン分解能が低下して
いる場合にはアデノノンを、５′−アデニル酸分解能が
低下している場合には５′−アデニル酸を、２−チアゾ
ールアラニン耐性を有している場合にはし一ヒスチジン
を、それぞれ大溝に生産する。

これらの物質を生産せしめるために本発明の微生物を培
養する方法は、通常の方法と持に窒わる点はない。

即ち、培地は、炭素源、窒素源、無機イオン更に必要に
よりアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常のものが使用できる。炭素源としてはグルコース、
ンユクロース、及びフラクトース並びにこれらの炭水化
物を含有する澱粉解氷分解物、モラセス及び果汁等が使
用できる。

窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水アンモ
ニウム塩、硝酸塩等が好ましい。無機イオンとして、燐
酸イオン、カリイオン、マグネンウムイオン、秩イオン
、マンガンイオン等が必要により適宜培地に添加される
。

有機微量栄養素として、アデニン要求性等の栄養要求性
を有するバチルス・ズブチリスを培−ｉする場合には、
栄養要求性を満足せしめるべぎ物質が培地に添加される
。

培養は好気的条件下で行うのが望ましく、ｐＨ４から８
の範囲の１閥当なｐＨ，２８℃から４２℃の範囲の適当
な温度に調節しつつ培養を行えばより好ましい結果が得
られる。

実施例 ＋１１　　バチルス・ズブチリス　ＡＪ１１７１１（ア
／ｌ／　ｄｒ’　＝　７、＋：＋イシン複要求株）をＮ
’−メチル−Ｎ’ニトロ−Ｎ−二トロングアニジン１０
００と ・／　ｍｌを含む燐酸緩衝液に懸濁し、３１，５℃３゜
ランスフェラーゼ欠損株Ａ　Ｊ　Ｉ　１９２３　（ＦＥ
ＲＭＰ−θｌ、、ｂＬ　）（本菌株はヒボキサンチン要
求株の中より選択した）を誘導した。Ａ　Ｊ　＋１８９
１はヒボキサンチンを蓄積したので以後、ヒポキサ７チ
ン生産菌として用いる。次、？同様の変異操作によって
、イノノン分解能の低下したイノノン生産菌ＡＪＩ＋９
１３（ＮＲＲＬＢ−７ｋｌｏｑ　）、イノシン酸分解能
の低下したイノノン酸生産菌ＡＪ　＋　１９１４（ＮＲ
ＲＬＢ　／ｆ１０ξ　）、グアノシン分解能の低下した
グアノシン生産菌Ａ、）ｚｇ＋５（ＮＲＲｔ。

Ｂ−／１１０６）、ファニル酸分解能の低下したグアニ
ル酸生産菌ＡＪ１１９１６（ＮＲＲＬＰｅｎａｓｓａｙ
　ＢｒｏｔｈＪ　（商品名、Ｄｉ　ｒｃｏ社製）中で３
０℃で約２時間振盪培養を行い、ヌーｊ数増殖期の菌体
を得て集菌後、通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、８９．１０６５（＋９６５））
により、染色体を抽出、精製し、最終３．３１１１ｇを
得た。

ｆ３１ＰＲＰＰ−アミドトランスフェラーゼの遺伝子領
域をフローニングするため、そのベクターとして自律増
殖性のプラスミドｐｕＢＩＩＯ（カナマイシン、ネオマ
インノ耐性を発現する）を用いた。（２）で得た染色体
ＤＮＡを各々５μ２ずつとプラスミドｐＵＢＩＩ０　５
μ２ずつをそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ
１で３７℃、６０分作用させてＤＮＡ鎖を切断した。

６５℃で１０分間の熱処理後、各両反応液を混合し、Ａ
ＴＰ及びジチオスライトール存在下、Ｔ４ファージ由来
のＤＮＡリガーゼにて１０℃２４時間、ｏ　Ｎ　Ａ　鎖
の連結反応を行った。

（４）　　バチルス・ズブチリスＡＪ＋１９２３（アル
ギニン、ロインンー■−一、ヒポササンチン要求性変異
株）をｒＰｅｎａｓｓｙ−ＢｒｏｔｈＪ　（Ｄｉ　ｆｃ
。

社製）に接種して３０℃にて１晩振盪培養を行い、倒・
Ｉ培養培地（グルコース　５ｆ／１１（ＮＨ＜）ｓｓＯ
４２Ｙ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４６ｆ／４に２ＨＰＯ４１４Ｙ
／ｌ　、　ＭｆＳＯ４・７Ｈ，００，２μ、クエン酸ナ
トリウム＋　９／ｌ、酵母エキス２　ｆ／ｌ。

し−アルギニン２５０Ｔｎ９／ｌ　、　Ｌ−Ｏインン５
ｏｍｇ／ｌ、ヒボキサンチｖ　　ｓｏｍｑ／ｌｌｌを含
む）に接種し、３７℃にて４時間振盪培養を行った後、
さらにオ■培養培地（グルコース５　？　／　ＩＪ　、
（ＮＨ４）２　Ｓ０４　２１ｉＩ／ＣＫＨ２ＰＯ４６Ｇ
１／ｌ。

Ｋ２ＨＰＯ４１４ｆｔ／１．　ＭｙＳＯ，１，２？／１
１　　クエン酸ナトリウム　Ｉ？／ｌ、酵母エキス０．
２　Ｙ／ｌ　。

Ｌ−アルダ＝　７　ｓｏ　ｍ！９／／１．　Ｌ　−ｏイ
：／　７５　ｍ９／　ｌ　。

ヒボキサンチン５０ｍｇ／ｌを含む）へ接種し、３７℃
にて１．５時間振盪培養を行うことによって、いわゆる
コンピテントな（ＤＮＡ取込能を有する）細胞を調製し
た（参考文献、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ、＋８１＋’７４
１（＋９６１））。このコンピテント細胞懸濁液に（３
）で得たＤＮＡ溶液を各々別々に加えて３７℃でさらに
振盪培養を行って形質転換反応を完了させた。次にこの
形質転換株を含む懸濁液を、（グルコース５　ｙ／１１
（ＮＨ４）２Ｓｏ４２９／’１１ＫＨ，Ｐｏ、　　６ｆ
ｌ／ｌ、　　Ｋ２ＨＰＯ４１４ｆｌ／ｌ、ＭｊＳＯ４７
Ｈ２００，２ｆ／ｌ　、　　クエン酸ナトリウムＩｆ！
／１ＳＬ−アルギニ７１００ｍ９／１１Ｌ−ロイシン１
００＋Ｉ＋ｇ／１１カナマイノン５ｒＡｇ／１１寒天２
０　Ｌｉ！／ｌ、（［）　Ｈ７，２）を含む培地１１１
に冷凍し、３７℃て培養した。

培養３日後には、上記培地１１１上に１０個のコロニー
が出現したので、これを釣菌し、各クローンを各々純粋
に分離した。

培地１１１から得られた形質転換株の性質は、いずれも
アルギニン、ロインン複要求性、カナマイノン耐性ヒボ
キサンチン非要求性を示した。

＋４１ＰＲＦＰ−アミドトランスフェラーゼの遺伝子領
域を含むプラスミドの確認および、各種核酸生産菌への
導入。

１５１　１４１で得られたクローンのうち、ＡＪＩＩ９
２４（ＦＥＲＭ−Ｐ　　ららち３　）を用いてＣ，１，
Ｋａｄ。

らの方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、＋４５．１３６
５．（＋９８１））に基づいたｌ）　Ｎ　Ａ抽出法によ
り、ＤＮＡを抽出しアカロースゲル電気泳動により、プ
ラスミドｐＨＥ１７　（８，２メガダルトン）を確認し
、次に分画採取し精製した。

Ａ　、ｌ　Ｉ　１９２３を精製したプラスミドｐＨＥ１
７を用いて形質転換すると、カナマイ７ノ耐性とヒボキ
ザノチン非要求性の性質が同時に導入されることから、
ＰＲＰＰ−アミドトランスフェラーゼの遺伝子領域が少
なくとも含まれているものと考えられる。そこてＰＲＰ
Ｐ−アミドトランスフェラーゼの活性測定を椎尾らの変
法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６６、１７５（＋９６９）
）を用いて行った。

その結果を牙−表に示す。

第１表 ＡＪ１１７１１　　ａｒｇ−、１ｅｕ−なし　　　　　
　　０．２ＡＪ１１９２３　　ａｒｇ、Ｉｅｉｉ、Ｈｉ
　　　　　なし　　　　　　　０ｔ ／７ この結果から、プラスミドｐＨＥ１１１によるＰＲＰＰ
−アミドトランスフェラーゼの遺伝子増幅が明らかであ
る。

次に（４）と同様な方法により、ヒポキサンチン９１ 生産４ＡＪ　Ｉ　ＩＭ−一、イノノン生産菌ＡＪ＋１９
１３、イノノン酸生産菌ＡＪＩ＋９１４、グアノノン生
産＋ＷＡＪ　Ｉ　１９１５、グアニル酸生産菌ＡＪＩ＋
９１６へプラスミドｐＨＥＩ７を導入した結果、各々形
質転換株Ａ　Ｊ　１１９１７（ＮＲＲＬＢ−／ξｌＯど
　）、ＡＪＩ＋９１８（ＮＲＲＬ　　Ｂ−人ｍ／、）ｃ
／）、ＡＪ１１９１９（ＮＲＲＬ　　Ｂ　−／、ｆ／１
０　　）、Ａ　Ｊ　＋　１　’９２０（ＮＲＲＬ　　　
Ｂ−Ａ！、〜ｌ／／）、ＡＪ］１９２１（Ｎ　ＲＲＬ　
　Ｂ　−／ｒ／／ユ　）を得た。

（６）　　以上のようにして得られた各種核酸生産菌株
を下記培養培地にて、３４℃にて７２時間培養した結果
を牙２表に示す。

※　発酵培地組成はグルコースｓｏｙ／１１ＮＨ，ＣＩ
　　　！　５９／１１　ＫＨ２ＰＯ４５９７’ｌ、　　
Ｍｆｉ’ＳＯ４・７Ｈ，，００，４ｆｌ／１ＸＦｅＳＯ
４・７Ｈ，ＯＩＯｍＬｊ／ｌ、　ＭｎＳＯ４・７Ｈ２０
１０ｍ９／１１ＣａＣ４−２Ｈ２０２ｆ／／ｌ）、味邑
（登録商標）４０ｍｌ／ｌ、　　７　ルギ：７］００ｍ
１４＋ｒ（ラフ１００ｒｒｖ’ｌ１１アゾ＝　７２００
　ｍｑ／　（、、ｐ　Ｈ６，５（ＫＯＨ）てあり、２０
ｍＡを坂ロフラスコに分注し、１１５℃、ｌＯ分オート
クレプして殺菌した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ポスホリボ／ルビロホスフエート・アミドトランスフェ
   ラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｂｏｓｙｌｐｙｒｏｐｈｏ
   ｓｐｈａｔｅａｍｉｄｏｌｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の遺
   伝子が組み込まれているプラスミドを有スるバチルス・
   ズブチリス