JPS5820188A - 新規微生物及びそれを用いるグルタチオンの製造法 - Google Patents
新規微生物及びそれを用いるグルタチオンの製造法Info
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- JPS5820188A JPS5820188A JP56120546A JP12054681A JPS5820188A JP S5820188 A JPS5820188 A JP S5820188A JP 56120546 A JP56120546 A JP 56120546A JP 12054681 A JP12054681 A JP 12054681A JP S5820188 A JPS5820188 A JP S5820188A
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規微生物及びそれを用いるグルタチオンの製
造法に関する。
造法に関する。
特開昭５８− ２０１８８（２）
グルタチオンはＬ−グルタミン酸、Ｌ−システィン及び
グリシンより成るトリペプチドであり。
グリシンより成るトリペプチドであり。
肝疾患治療剤、解毒剤などとして有用な物質であり、ま
た生化学的試薬としても有用な物質である。
た生化学的試薬としても有用な物質である。
従来、微生物を用いてグルタチオンを製造する方法とし
ては、酵母菌体よりグルタチオンを抽出する方法、膜透
過性のよい乾燥酵母にＬ−グルタミン酸−Ｌ−システィ
ン及び グリシンを含有する基質溶液を接触させてグルタチオン
を生成させる方法、酵母や大腸菌の菌体に基質溶液を接
触させてグルタチオンを生成させるに際しＡＴＰ再生系
を共役させる方法などが知られている。しかしながら、
工業的製法としてみた場合、これらの方法はグルタチオ
ンの生成量が必ずしも滴足しうるものではなかった。
ては、酵母菌体よりグルタチオンを抽出する方法、膜透
過性のよい乾燥酵母にＬ−グルタミン酸−Ｌ−システィ
ン及び グリシンを含有する基質溶液を接触させてグルタチオン
を生成させる方法、酵母や大腸菌の菌体に基質溶液を接
触させてグルタチオンを生成させるに際しＡＴＰ再生系
を共役させる方法などが知られている。しかしながら、
工業的製法としてみた場合、これらの方法はグルタチオ
ンの生成量が必ずしも滴足しうるものではなかった。
本発明者らは、かかる状況に鑑み、グルタチオン生産能
の優れた微生物を見い出すべく種々研究を重ねた結果、
γ−グルタミルシスティン合成酵素（ｇ、ｃ、 ６．３
．２．２． 、 Ｋ下水酵素を０４−１１−４と称する
ｊ活性及びグルタチオン合成酵ｇ（ｉ＜、ｃ、６゜３゜
５− ２．３．、以下本酵ＸをＧＳＨ−ＩＩと称する）活性を
有するエシェリヒア・コリを変異させてグルタチオンに
よるＧＳＨ−４への阻害が解除された変異株を取得し、
Ｆｉ変異株よりＱ Ｓ Ｈ−■の遺伝情報を担うデオキ
シリボ核ｅ（ＤＮＡ）を単離し１次いでこｆ）ＧＳＨ−
■の遺伝情報を担うＤＮＡをベクターに組み詰ませ、こ
の組み換えＤＮＡを前記変異株に導入することに成功す
ると共に、か（して得られた微生物が優れたグルタチオ
ン生産能を有することを見い出し１本発明を完成するに
至った。
の優れた微生物を見い出すべく種々研究を重ねた結果、
γ−グルタミルシスティン合成酵素（ｇ、ｃ、 ６．３
．２．２． 、 Ｋ下水酵素を０４−１１−４と称する
ｊ活性及びグルタチオン合成酵ｇ（ｉ＜、ｃ、６゜３゜
５− ２．３．、以下本酵ＸをＧＳＨ−ＩＩと称する）活性を
有するエシェリヒア・コリを変異させてグルタチオンに
よるＧＳＨ−４への阻害が解除された変異株を取得し、
Ｆｉ変異株よりＱ Ｓ Ｈ−■の遺伝情報を担うデオキ
シリボ核ｅ（ＤＮＡ）を単離し１次いでこｆ）ＧＳＨ−
■の遺伝情報を担うＤＮＡをベクターに組み詰ませ、こ
の組み換えＤＮＡを前記変異株に導入することに成功す
ると共に、か（して得られた微生物が優れたグルタチオ
ン生産能を有することを見い出し１本発明を完成するに
至った。
すなわち１本発明は（１）ＧＳＨ−Ｉ活性及びａＳＨ−
１［活性を有しかつグルタチオンによる１）ＳＨ−Ｉへ
の阻害が解除されたエシェリヒア・コリからＩＲ得した
Ｇ１９Ｈ−ｌの遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベク
ターを、当該エシェリヒア・コリに含有せしめた微生物
、（２）該微生物を培養し、得られた菌体よりグルタチ
オンを抽出するグルタチオンの製造法、及び（３１該微
生物を培養し、４られた１体もしくは該菌体の処理物を
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システィン及びグリシンを含有
する基質 ６− 溶液春接触させてグルタチオンを製造する方法に関する
。
１［活性を有しかつグルタチオンによる１）ＳＨ−Ｉへ
の阻害が解除されたエシェリヒア・コリからＩＲ得した
Ｇ１９Ｈ−ｌの遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベク
ターを、当該エシェリヒア・コリに含有せしめた微生物
、（２）該微生物を培養し、得られた菌体よりグルタチ
オンを抽出するグルタチオンの製造法、及び（３１該微
生物を培養し、４られた１体もしくは該菌体の処理物を
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システィン及びグリシンを含有
する基質 ６− 溶液春接触させてグルタチオンを製造する方法に関する
。
以下、上記本発明に関し逐次詳細に説明する。
まず、ＧＳＨ−１：活性及びＧＳＨ−［活性を有するエ
シェリヒア・コリ野性株（例えばエシェリヒア・コリＢ
３５５）からグルタチオンによるａｓｕ−１への阻
害が解除された変異株を取得するに当たっては、まず当
該野性味に変異を誘起せしめてシスティン要求株及びメ
チルグリオキサール耐性株を取得する。変異の誘起は通
常の変興誘処理することにより実施することか出来る。
シェリヒア・コリ野性株（例えばエシェリヒア・コリＢ
３５５）からグルタチオンによるａｓｕ−１への阻
害が解除された変異株を取得するに当たっては、まず当
該野性味に変異を誘起せしめてシスティン要求株及びメ
チルグリオキサール耐性株を取得する。変異の誘起は通
常の変興誘処理することにより実施することか出来る。
システィン要求株の取得は変異誘起魁珊して帰られた菌
体をシスティン２ＸＩＱ’ｉｉを含む最少培地（例えば
、に＃ＦＩＰＯ＋０．７％、 ＫＨＩＰＯ４Ｑ、３ ％
、 （Ｎ［ａ ）ｓｓｏａＯ，１％、グルコース０．
５嘔の組成の培地、以下ＤＭ培地と称する）で培養し、
生じた小コｏニーを釣菌分離すること署こより行なう。
体をシスティン２ＸＩＱ’ｉｉを含む最少培地（例えば
、に＃ＦＩＰＯ＋０．７％、 ＫＨＩＰＯ４Ｑ、３ ％
、 （Ｎ［ａ ）ｓｓｏａＯ，１％、グルコース０．
５嘔の組成の培地、以下ＤＭ培地と称する）で培養し、
生じた小コｏニーを釣菌分離すること署こより行なう。
一方、メチ−７−
ルグリオキサール耐性株はがＪ紀の変異誘起処理して得
られた菌株をメチルグリオキサールを含むＤ關培地に培
養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離することにより
取得することができる。次いで、取得したシスティン要
求株を含むＤＭ培地に上記メチルグリオキサール耐性株
を培養し、コロニーの周辺にハローを作らないコロニー
を釣菌分離しｚＧｓＨ−Ｉ欠損株を取得する。かくして
得られるＧＳＨ−Ｉ欠損株の例としては１例えばエシェ
リヒア・コリＣ９１２が挙げられる。
られた菌株をメチルグリオキサールを含むＤ關培地に培
養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離することにより
取得することができる。次いで、取得したシスティン要
求株を含むＤＭ培地に上記メチルグリオキサール耐性株
を培養し、コロニーの周辺にハローを作らないコロニー
を釣菌分離しｚＧｓＨ−Ｉ欠損株を取得する。かくして
得られるＧＳＨ−Ｉ欠損株の例としては１例えばエシェ
リヒア・コリＣ９１２が挙げられる。
次いで、ＧＳＨ−Ｉ欠損株に前記と同様の処理手段で変
異を誘起せしめたのち ９−／％イドロキシキノリンを
含むＤＭ培地で培養ｔ、生ずるコロニーを釣菌分離する
ことにより、Ｇ８Ｈ−Ｉ活性及びＧＳＨ−Ｉ［活性を有
しかつグルタチオンによるＧＳＢ−Ｉへの阻害が解除さ
れた菌株（以下。
異を誘起せしめたのち ９−／％イドロキシキノリンを
含むＤＭ培地で培養ｔ、生ずるコロニーを釣菌分離する
ことにより、Ｇ８Ｈ−Ｉ活性及びＧＳＨ−Ｉ［活性を有
しかつグルタチオンによるＧＳＢ−Ｉへの阻害が解除さ
れた菌株（以下。
復帰変異株と称する）を取得することが出来る。
４ｒ７号）が挙げられる。
特開昭５８−２０１８８（１）
次いで、ＧＳＨ−Ｈの遺伝情報を担うＤＮＡ （以下、
染色体ＤＮＡと称する）の上記復帰変異株からの単離精
製は常法に従って行なうことが出来、例えばＢｉｏｏｈ
ｉｍ、 ・Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａａｔａ 、 Ｖｏｌ、
７２ 。
染色体ＤＮＡと称する）の上記復帰変異株からの単離精
製は常法に従って行なうことが出来、例えばＢｉｏｏｈ
ｉｍ、 ・Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａａｔａ 、 Ｖｏｌ、
７２ 。
ｐｐ６１９〜６２９（１９６３）に記載のフェノール法
により行なうことが出来る。
により行なうことが出来る。
次いで、上記で得られた染色体ＤＮＡをベクター、Ｄｆ
Ａに組み込んで組換えＤＮ、Ａを調、製する。
Ａに組み込んで組換えＤＮ、Ａを調、製する。
染色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組込みは常法に従っ
て行なうことが出来る。例えば、染色体ＤＮＡ及びベク
ターＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断して染色体
ＤＮＡ断片及びベクターＤｌｌＡ断片を調製したのち１
両者の混合物をＤ Ｎ Ａ ＩＪガーゼで蛤処理するこ
とにより行なうことが出来る。ここで用いられるベクタ
ーＤＮＡとしては。
て行なうことが出来る。例えば、染色体ＤＮＡ及びベク
ターＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断して染色体
ＤＮＡ断片及びベクターＤｌｌＡ断片を調製したのち１
両者の混合物をＤ Ｎ Ａ ＩＪガーゼで蛤処理するこ
とにより行なうことが出来る。ここで用いられるベクタ
ーＤＮＡとしては。
エシェリヒア・コリを宿主とするｐＢＲ３２２プラスミ
ツド、コリシン（Ｃａｌ ） ｌ １プラス電ツド、ラ
ムダファージなどが挙げられ、とりわけｐＢＲ３２２プ
ラスミツドが好適に用いられる。また制限エンドヌクレ
アーゼとしては９例えはＢｉｎｄ ９− ］［、１ｃｏＲＩ 、 Ｐｓｔ Ｉ 、 ＢａＩＩＩＨ
［ｆｌどが挙げラレ、とりわけＢｉｎｄ Ｎが好遍盛こ
用いられる。更にＤ製ムリガーゼとしては、！４ファー
ジ由来のＤＮＡ啼ガーゼが好適に用いられる。
ツド、コリシン（Ｃａｌ ） ｌ １プラス電ツド、ラ
ムダファージなどが挙げられ、とりわけｐＢＲ３２２プ
ラスミツドが好適に用いられる。また制限エンドヌクレ
アーゼとしては９例えはＢｉｎｄ ９− ］［、１ｃｏＲＩ 、 Ｐｓｔ Ｉ 、 ＢａＩＩＩＨ
［ｆｌどが挙げラレ、とりわけＢｉｎｄ Ｎが好遍盛こ
用いられる。更にＤ製ムリガーゼとしては、！４ファー
ジ由来のＤＮＡ啼ガーゼが好適に用いられる。
次いで、上記方法で痔られた組換えＤＭＡは常法によっ
て０８Ｈ−Ｉ欠損株に導入することが出来、これによっ
て組換えＤＩム含有Ｇ８Ｈ−Ｔ欠損株を調製することが
出来る。例えば１組換えＤＮＡの導入はＭＣｌ１１３１
３． Ｂ＠ｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 Ｖｏｗ、 １２４ 。
て０８Ｈ−Ｉ欠損株に導入することが出来、これによっ
て組換えＤＩム含有Ｇ８Ｈ−Ｔ欠損株を調製することが
出来る。例えば１組換えＤＮＡの導入はＭＣｌ１１３１
３． Ｂ＠ｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 Ｖｏｗ、 １２４ 。
ＰＰ １〜１０（１９７３）に記載のカルシウムイオン
旭理法により行なうことが出来る。組換えＤＮＡ（すな
わち、０８１−Ｈの遺伝情報を担うＤＭＡを組み込んだ
ベクターＤＭＡ）を含有する菌株の選択方法は、当該組
換えＤＭＡを調製するに際して使用した制限エンドヌク
レアーゼやベクターＤＩ＾の種類によっても異なるが０
例えば制限エンドヌクレアーゼとしてＨｌｎｄ ＩＩを
用い、ベクターＤＭＡとしてｐｌＲ３２２プラスミツド
を用いた場合には２次の如くして行なうことが出来る。
旭理法により行なうことが出来る。組換えＤＮＡ（すな
わち、０８１−Ｈの遺伝情報を担うＤＭＡを組み込んだ
ベクターＤＭＡ）を含有する菌株の選択方法は、当該組
換えＤＭＡを調製するに際して使用した制限エンドヌク
レアーゼやベクターＤＩ＾の種類によっても異なるが０
例えば制限エンドヌクレアーゼとしてＨｌｎｄ ＩＩを
用い、ベクターＤＭＡとしてｐｌＲ３２２プラスミツド
を用いた場合には２次の如くして行なうことが出来る。
すなわち、１１株をテトラメチルチウラムジサル１０−
ファイトを含むＤＭ培地に培養し、生じたコロニーを釣
菌分離することにより第一次選択する。次いでこのコロ
ニーのうちアンピシリン耐性であり、テトラサイクリン
感受性であり、かつニトロプリジッド−アンモニアで赤
色を呈するコロニーを選択し、最終的には菌体内グルタ
チオンの有無及びＧ３１１−ｉ活性の有無でＩＩ認する
。
菌分離することにより第一次選択する。次いでこのコロ
ニーのうちアンピシリン耐性であり、テトラサイクリン
感受性であり、かつニトロプリジッド−アンモニアで赤
色を呈するコロニーを選択し、最終的には菌体内グルタ
チオンの有無及びＧ３１１−ｉ活性の有無でＩＩ認する
。
次いで、上記方法で帰られた組換えＤＨム含有菌株より
組換えＤＮＡを単離する。繊換えＤＭＡの単離は常法に
従って行なうことが出来９例えばＭｕｏｌａｉｏ Ａｏ
ｉｄａ Ｒｅ５ｅａｒｏｈ 、 Ｖａｌｅ ’ｌ、ｐｐ
、１５１３〜１５２３（１９７９）に記載のアルカリ抽
出法により行なうことが出来る。
組換えＤＮＡを単離する。繊換えＤＭＡの単離は常法に
従って行なうことが出来９例えばＭｕｏｌａｉｏ Ａｏ
ｉｄａ Ｒｅ５ｅａｒｏｈ 、 Ｖａｌｅ ’ｌ、ｐｐ
、１５１３〜１５２３（１９７９）に記載のアルカリ抽
出法により行なうことが出来る。
この様にして碍られた組換えＤＮＡを前記の復帰変異株
（すなわち、ＧＳＨ−ｉ活性及び０８Ｂ−■活性を有し
、かつグルタチオンによるＧＳＨ−Ｉへの阻害が解除さ
れた菌株）に導入すれば。
（すなわち、ＧＳＨ−ｉ活性及び０８Ｂ−■活性を有し
、かつグルタチオンによるＧＳＨ−Ｉへの阻害が解除さ
れた菌株）に導入すれば。
組換えＩＩＩＩＡ含有復帰変異株を調製するξとが出来
る。組換えＤＮＡの導入は常法に従って行なうことが出
来１例えばＶａｌｅ（Ｉｌｌ ｇｓｎ、 Ｇｍｎ＠ｔ、
Ｖｏｌ、 １２４ 、 ｐｐ １〜１０（１９７３）
に記載のカルシウムイオン処理法により行なうこと
が出来る。組換えＤＮＡ（すなわち、Ｇ５ｌｌｌ−■の
遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベクターＤＮＡ）を
含有する復帰変異株はアンピシリンを含むＤＭ培地に出
現するコロニーとして取上することが出来る。
る。組換えＤＮＡの導入は常法に従って行なうことが出
来１例えばＶａｌｅ（Ｉｌｌ ｇｓｎ、 Ｇｍｎ＠ｔ、
Ｖｏｌ、 １２４ 、 ｐｐ １〜１０（１９７３）
に記載のカルシウムイオン処理法により行なうこと
が出来る。組換えＤＮＡ（すなわち、Ｇ５ｌｌｌ−■の
遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベクターＤＮＡ）を
含有する復帰変異株はアンピシリンを含むＤＭ培地に出
現するコロニーとして取上することが出来る。
かくして碍られた組換えＤＮＡを含有する復帰変異株の
例としては１例えばＬシェリヒア・コリＲＣ９１２ｐ（
微工研条寄＊ 斗ε 号）が挙げられる。
例としては１例えばＬシェリヒア・コリＲＣ９１２ｐ（
微工研条寄＊ 斗ε 号）が挙げられる。
上記の如くして衣層した本発明の微生物は培養すれば菌
体内にグルタチオンを着量生成蓄積する。
体内にグルタチオンを着量生成蓄積する。
本発明微生物の当該培養に際して用いられる培地として
は、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地または
天然培地のいずれも使用出来る。
は、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地または
天然培地のいずれも使用出来る。
炭素源としては１例えばグルコース、シェクロース、フ
ラクトース、でん粉、でん粉加水分解物。
ラクトース、でん粉、でん粉加水分解物。
糖蜜などの種々の炭化水素が使用出来、その使用量は０
．５〜５．０％程度が好ましい。また窒素源としては１
例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および
有機アンモニウム類、あるいハヘフトン、［ｔエキス、
コーンスチープリカましい。更に無機物としては１例え
ばリン駿第−水票カリウム、す：）ｅｉミニカリウム硫
酸マグネシウム、！ａ酸マンガンなどが使用出来、その
使用量は０．００５〜Ｑ、５％程度が好ましい。
．５〜５．０％程度が好ましい。また窒素源としては１
例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および
有機アンモニウム類、あるいハヘフトン、［ｔエキス、
コーンスチープリカましい。更に無機物としては１例え
ばリン駿第−水票カリウム、す：）ｅｉミニカリウム硫
酸マグネシウム、！ａ酸マンガンなどが使用出来、その
使用量は０．００５〜Ｑ、５％程度が好ましい。
培養は振とう培養あるいは通気かく拌培養などの好気条
件下に行なうのが好ましい。培養温度は２５〜３７℃が
好適であり、培養−期間は通常１・６〜４０時間程時間
先分である。
件下に行なうのが好ましい。培養温度は２５〜３７℃が
好適であり、培養−期間は通常１・６〜４０時間程時間
先分である。
培養を終了し集菌後の菌体からのグルタチオンの抽出は
菌体に水を加え加熱することによって容易に実施するこ
とができる。抽出液中のグルタチオンはイオン交換樹脂
処理の如き公知の方法で単画 離錆製することができる。
菌体に水を加え加熱することによって容易に実施するこ
とができる。抽出液中のグルタチオンはイオン交換樹脂
処理の如き公知の方法で単画 離錆製することができる。
１３−
〔グルタチオンの製造〔■〕〕
一方、上記培養によって帰られる１体は強い０１１Ｂ−
１活性及びａ ｓ ｍ−Ｈ活性を有しているので、１体
もしくは該菌体の処理物を酵素源とし。
１活性及びａ ｓ ｍ−Ｈ活性を有しているので、１体
もしくは該菌体の処理物を酵素源とし。
該酵素源をＬ−グルタ文ン酸、Ｌ−システィン及びグリ
シンを含有する基質溶液と接触させて酵素反応させるこ
とによってもグルタチオンを製造することが出来る。
シンを含有する基質溶液と接触させて酵素反応させるこ
とによってもグルタチオンを製造することが出来る。
上記酵素反応に用いられる菌体の処理物としては１例え
ば生麿体を乾燥して寿られる乾燥１体。
ば生麿体を乾燥して寿られる乾燥１体。
生一体を超音波処理して得られる無細胞抽出液。
該抽出液より精製して得られる酵素などのほか。
１体あるいは酵素を例えばポリアクリルア之ドゲル包話
法、カラギーナンゲル包括法の如き公知固定化法によっ
て得られる固定化画体あるいは固定化酵素なども用いる
ことが出来る。基質溶液中のＬ−り＆タミン駿の濃度は
５〜５０ｍＭ０．Ｌ−。
法、カラギーナンゲル包括法の如き公知固定化法によっ
て得られる固定化画体あるいは固定化酵素なども用いる
ことが出来る。基質溶液中のＬ−り＆タミン駿の濃度は
５〜５０ｍＭ０．Ｌ−。
スティンの濃度は５〜５０ｎｌ、グリシンの濃度は５０
〜１００ｍｍ程度が好ましい。本酵素反応はｐＨ７〜Ｓ
、Ｓ６度で行なうのが好ましく９反応温１４一 度は２０〜５０℃、とりわけ３０〜３７℃が好適である
。尚９本＃素反応を効率よ（実施するためニ０本酵素反
応をアデノシン−５１−三リン＃（＾テＰ）再生系と共
役させるのが好ましい。＾テＰ再生系としては１本発明
の微生物が有するアセトキナーゼ、解糖系酵素、カルバ
ミルリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどによる反
応を利用することが出来９例えばアセトキナーゼによる
反応を利用する場合には、基質溶液中にマグネシウムイ
オンをマグネシウム＃１（例えば硫酸マグネシウム、塩
化マグネシウム）として５〜２９ｍＭ、アデノシン−５
′−三すン駿（ＡＴｉ’）を２〜５ ｍ Ｍ 。
〜１００ｍｍ程度が好ましい。本酵素反応はｐＨ７〜Ｓ
、Ｓ６度で行なうのが好ましく９反応温１４一 度は２０〜５０℃、とりわけ３０〜３７℃が好適である
。尚９本＃素反応を効率よ（実施するためニ０本酵素反
応をアデノシン−５１−三リン＃（＾テＰ）再生系と共
役させるのが好ましい。＾テＰ再生系としては１本発明
の微生物が有するアセトキナーゼ、解糖系酵素、カルバ
ミルリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどによる反
応を利用することが出来９例えばアセトキナーゼによる
反応を利用する場合には、基質溶液中にマグネシウムイ
オンをマグネシウム＃１（例えば硫酸マグネシウム、塩
化マグネシウム）として５〜２９ｍＭ、アデノシン−５
′−三すン駿（ＡＴｉ’）を２〜５ ｍ Ｍ 。
及びアセチルリン酸を５〜ｌ Ｑ ｍ Ｍ程度存在させ
て詔くのが好ましい。
て詔くのが好ましい。
かくして反応終了液中にグルタチオンが生成蓄積するが
、生成したグルタチオンはイオン交換樹脂処理の如き公
知す滌で単離精製することが出来る。例えば１反応終了
液を硫酸でｐＨ３とした後。
、生成したグルタチオンはイオン交換樹脂処理の如き公
知す滌で単離精製することが出来る。例えば１反応終了
液を硫酸でｐＨ３とした後。
カチオン交換樹脂（例えばＤｉａｉｏｓｓ Ｐ！−２２
８ｔ）に導通する。吸着したグルタチオンを０．５１水
酸化アンモニウムで溶出し、溶出液を硫酸でＰＨ４゜５
とした後、アニオン交換樹脂（例えばＤｕｏｌｉｔ・＾
２ｃｎｓｃｏｏ−型）に導通する。吸着したグルタチオ
ンを０．５ＭＶＬ＠で溶出し、溶出液にＳＯＳエタノー
ルを加え、析出した結晶を単離することにより、グルタ
チオンを取得することが出来る、。
８ｔ）に導通する。吸着したグルタチオンを０．５１水
酸化アンモニウムで溶出し、溶出液を硫酸でＰＨ４゜５
とした後、アニオン交換樹脂（例えばＤｕｏｌｉｔ・＾
２ｃｎｓｃｏｏ−型）に導通する。吸着したグルタチオ
ンを０．５ＭＶＬ＠で溶出し、溶出液にＳＯＳエタノー
ルを加え、析出した結晶を単離することにより、グルタ
チオンを取得することが出来る、。
以下１本発明の実施例を示す。
実施例 １
（１）ｒ−グルタミ絶シスナイン合成酵素の遺伝情報を
担う染色体ＤＮＡのａｍ エシェリヒア・コリＢ ３５５より変異誘導したエシェ
リヒア・コリＲＣ９１２（微工研条寄第４７号）をＬ−
培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５鳴、グルコース
ｏ、ｉ’）、塩化ナトリウム０゜５哄、ｐＨ７，２）２
００−中、２８℃で５時間振とう培養した。一体を集洗
■後、肛１ｔｏ轟Ｍｉｕｒａの方法（Ｂｉｏｏｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈｙ＊、ムｃｔａ、７２．６１９−一一−−
―−■■−−−１−争 ６２Ｇ（１９６３））でフェノール亀理し、染色体Ｄ）
Ｉム９００μｆを慢た。
担う染色体ＤＮＡのａｍ エシェリヒア・コリＢ ３５５より変異誘導したエシェ
リヒア・コリＲＣ９１２（微工研条寄第４７号）をＬ−
培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５鳴、グルコース
ｏ、ｉ’）、塩化ナトリウム０゜５哄、ｐＨ７，２）２
００−中、２８℃で５時間振とう培養した。一体を集洗
■後、肛１ｔｏ轟Ｍｉｕｒａの方法（Ｂｉｏｏｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈｙ＊、ムｃｔａ、７２．６１９−一一−−
―−■■−−−１−争 ６２Ｇ（１９６３））でフェノール亀理し、染色体Ｄ）
Ｉム９００μｆを慢た。
（２） ベクターＤＮＡの編製
アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性を有するｐ
ＢＲ３２２プラスミツドのＤＮＡｔ’Ｆｆｆｉの如くし
て鰯製した。
ＢＲ３２２プラスミツドのＤＮＡｔ’Ｆｆｆｉの如くし
て鰯製した。
ｐＢＲ３２２をプラスミツドとして持つエシェリヒア・
コリＢ ３５５をＬ−培地ｌｌ中で培養し、対数後期に
１５０μＶ／−のクロラムフェニコールを添加して一夜
培養を続けた。菌体を集注■後、リゾチー＾及びソデイ
ウ＾ドデシルサルフェートで溶菌させ９次いで３５．Ｌ
ｌｏｏＸＦで２時間遠心して上清を得た。上清を２級ブ
タノールで゛電通してＤＮＡを濃縮後、リボ核酸分解Ｉ
ｌｌで３７℃、３時間亀理し２次いでセンウムクロリド
−エチジウムプロミド平衡密度勾配遠心を行ない、ＰＢ
Ｒ３２２プラ・−スミラドＤＮＡ４５０μｆを得た。
コリＢ ３５５をＬ−培地ｌｌ中で培養し、対数後期に
１５０μＶ／−のクロラムフェニコールを添加して一夜
培養を続けた。菌体を集注■後、リゾチー＾及びソデイ
ウ＾ドデシルサルフェートで溶菌させ９次いで３５．Ｌ
ｌｏｏＸＦで２時間遠心して上清を得た。上清を２級ブ
タノールで゛電通してＤＮＡを濃縮後、リボ核酸分解Ｉ
ｌｌで３７℃、３時間亀理し２次いでセンウムクロリド
−エチジウムプロミド平衡密度勾配遠心を行ない、ＰＢ
Ｒ３２２プラ・−スミラドＤＮＡ４５０μｆを得た。
（３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体Ｄ Ｎム１．５μ２をとり、制限エンドヌクレ
アー゛ゼＨ１ｎｄ ｌと１．５ Ｉｉ間反応させた。
た染色体Ｄ Ｎム１．５μ２をとり、制限エンドヌクレ
アー゛ゼＨ１ｎｄ ｌと１．５ Ｉｉ間反応させた。
ｔｅ（２）テ碍：／：ヘクター Ｄ １１ Ａ １．□
ＪｔｌもＨｌｎｄ ｌｌと６時間反応させ、完全に切断
した。Ｘ、［６液を各々６５℃、１０分間加熱処理した
後９両反戦液を１７− 混合し、テ番ファージ由来のＤＮＡリガーゼで１０”Ｃ
，１６時間連結反応を行なった。次いで６５°Ｃ，５分
間熱処理後１反応液に２＃Ｉ溶のエタノールを加え、−
２０℃で１時間放置後、 ３５，０００１ ｆで遠心し
て沈でんを集め、これを５．ＯｆｆｊＭ）！ｊスー塩ｏ
ｔｔｉ＊液（ｐＨ７，５） ０．１５ｄに溶解し、ＤＮ
Ａ溶液とした。
ＪｔｌもＨｌｎｄ ｌｌと６時間反応させ、完全に切断
した。Ｘ、［６液を各々６５℃、１０分間加熱処理した
後９両反戦液を１７− 混合し、テ番ファージ由来のＤＮＡリガーゼで１０”Ｃ
，１６時間連結反応を行なった。次いで６５°Ｃ，５分
間熱処理後１反応液に２＃Ｉ溶のエタノールを加え、−
２０℃で１時間放置後、 ３５，０００１ ｆで遠心し
て沈でんを集め、これを５．ＯｆｆｊＭ）！ｊスー塩ｏ
ｔｔｉ＊液（ｐＨ７，５） ０．１５ｄに溶解し、ＤＮ
Ａ溶液とした。
（４） γ−グルタミルシスティン合成酵素の遺伝情
報を担ったプラスミツドによる形質転換エシェリヒア・
コリＢ ３５５より変異誘導したｒ−グルタミルシステ
ィン合成酵素欠損株Ｃ９１２をＬ−培地５０ｊにて対数
増殖中期（ＯＤ ａｓ。
報を担ったプラスミツドによる形質転換エシェリヒア・
コリＢ ３５５より変異誘導したｒ−グルタミルシステ
ィン合成酵素欠損株Ｃ９１２をＬ−培地５０ｊにて対数
増殖中期（ＯＤ ａｓ。
−約０．３０）まで生育させた後、塩化カルシウム５Ｑ
ｍＭを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７，０）で２
回洗浄後、Ｉ４じ緩衝液１．５ａＪに再懸濁させた。こ
の懸濶液０．２−に（３）で得たＤＮＡ溶液０．１−を
加え、０℃にて！Ｏ分間保持した後、直ちに４２℃、３
分の熱パルスを与え、ＤＮＡを細胞内に取り込ませた。
ｍＭを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７，０）で２
回洗浄後、Ｉ４じ緩衝液１．５ａＪに再懸濁させた。こ
の懸濶液０．２−に（３）で得たＤＮＡ溶液０．１−を
加え、０℃にて！Ｏ分間保持した後、直ちに４２℃、３
分の熱パルスを与え、ＤＮＡを細胞内に取り込ませた。
次いで、この懸洞液をＬ−培地に接種し、振とう培養し
た。菌体を集洗繭後、４１８− ０〜９０ｓｔ／−のテトラメテルチウラムジサルファイ
ドを含むＤ關培地（リン１ＩＩ２第一カリウム０，３チ
、９ン駿第二カリウム０．７％、硫酸マグネシウム・７
永和物０．０１％ 、硫酸アンモニウム０．１％、グル
コース０５チ）に塗霜し、２８℃て２時間培養した。生
じたコロニーについて更に薬剤耐性（アンピシリン耐性
、テトラサイクリン感受性）とニトロプリジッド−アン
モニアによるコロニーの呈色反応及び最終的には１体内
のグルタチオン含量とグルタミルシスティン合成、酵素
活性を検討し、形質転換株Ｃ９１２ｐを取得した。
た。菌体を集洗繭後、４１８− ０〜９０ｓｔ／−のテトラメテルチウラムジサルファイ
ドを含むＤ關培地（リン１ＩＩ２第一カリウム０，３チ
、９ン駿第二カリウム０．７％、硫酸マグネシウム・７
永和物０．０１％ 、硫酸アンモニウム０．１％、グル
コース０５チ）に塗霜し、２８℃て２時間培養した。生
じたコロニーについて更に薬剤耐性（アンピシリン耐性
、テトラサイクリン感受性）とニトロプリジッド−アン
モニアによるコロニーの呈色反応及び最終的には１体内
のグルタチオン含量とグルタミルシスティン合成、酵素
活性を検討し、形質転換株Ｃ９１２ｐを取得した。
（５）ｒ−グルタミルシスティ 合成酵素の逓伝情報を
担ったプラスミツドのセ フクローニング（４）で碍た
形質転換株Ｃ９１２ｐをＬ−培地１０〇−中で培養し、
（２）と同様にしてクロラムフェニコール処１１を行な
った。１体を集注１後、 ！１ｉｒｎｂｏ紬＆ Ｄｏｌ
ｙの方法［Ｎｕｏｌｅｉｏ Ａｃｉｄｇ Ｒ＠５ｅａｒ
ｏｈ 、 ７ 。
担ったプラスミツドのセ フクローニング（４）で碍た
形質転換株Ｃ９１２ｐをＬ−培地１０〇−中で培養し、
（２）と同様にしてクロラムフェニコール処１１を行な
った。１体を集注１後、 ！１ｉｒｎｂｏ紬＆ Ｄｏｌ
ｙの方法［Ｎｕｏｌｅｉｏ Ａｃｉｄｇ Ｒ＠５ｅａｒ
ｏｈ 、 ７ 。
１５１３〜１５２３ （１９７９））によりグルタ（ル
システイン合成酵累の遺伝情報をムつたｐＢＲ３２２プ
量スｔッＶ（以下ｅ ｐ Ｂ Ｒ３２２−Ｒａｈ−１９
− 蚤と称する）を含む溶液を調製した。この溶液をアガロ
ースゲル電気泳動（アガロース０．７％、９ＧＶ）Ｋか
け、ｐＨＲ３２２−ｇｓｈＩ（７）パ：／Ｆを紫外線照
射下で切り出し、このゲルを透析チューブに入れて再度
電気泳動を行ない、ゲルよりＤＮムを抽出した。抽出液
を２級ブタノールで処理しせ、４られたｐＨＲ３２２−
ｇｓｈＩ ５５μｆを５ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ）
１７．５）に溶解させた。次いで（４）と同様にしてエ
シェリヒア・コリＲＣ９１２にＤＩム取り込み能をもた
せた後、上記Ｐ１１Ｒ３２２−ｇ”ｈＩを取り込ませた
。かくして帰られる菌株をアンピシリン２．５ ｄ／、
ｎｌを含むＤＭ培地に培養し、生じて（るコロニーを分
離することにより形質転換株１１ｃ９］２ｐ（微工研条
寄第４９号）を取慢じた。
システイン合成酵累の遺伝情報をムつたｐＢＲ３２２プ
量スｔッＶ（以下ｅ ｐ Ｂ Ｒ３２２−Ｒａｈ−１９
− 蚤と称する）を含む溶液を調製した。この溶液をアガロ
ースゲル電気泳動（アガロース０．７％、９ＧＶ）Ｋか
け、ｐＨＲ３２２−ｇｓｈＩ（７）パ：／Ｆを紫外線照
射下で切り出し、このゲルを透析チューブに入れて再度
電気泳動を行ない、ゲルよりＤＮムを抽出した。抽出液
を２級ブタノールで処理しせ、４られたｐＨＲ３２２−
ｇｓｈＩ ５５μｆを５ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ）
１７．５）に溶解させた。次いで（４）と同様にしてエ
シェリヒア・コリＲＣ９１２にＤＩム取り込み能をもた
せた後、上記Ｐ１１Ｒ３２２−ｇ”ｈＩを取り込ませた
。かくして帰られる菌株をアンピシリン２．５ ｄ／、
ｎｌを含むＤＭ培地に培養し、生じて（るコロニーを分
離することにより形質転換株１１ｃ９］２ｐ（微工研条
寄第４９号）を取慢じた。
実旋４Ｐｉ１２
下記第１表に示す菌株をグルコ−７０，５％、リン酸第
−水素カリウム０３％、リン酸第二水素カ特開昭５８−
２０１８８（５） リウ＾Ｑ、７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１
哄、硫酸アンモニウム０．１％の組成の培地（ｐＨ７，
０）に接種乙、３７℃で１０時間振とう培養した。培養
終了後、遠心分離により図体を集め、０゜８５％生理食
塩水で洗浄後、菌体中のグルタチオンを水で加熱抽出し
た。抽出液中のグルタチオン量を定量し、Ｉｉ体ＩＦＣ
湿重量）当りのグルタチオン蓄積量（μｒａａｌｅ ）
を算出した。その結果は下記第１表の通りである。
−水素カリウム０３％、リン酸第二水素カ特開昭５８−
２０１８８（５） リウ＾Ｑ、７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１
哄、硫酸アンモニウム０．１％の組成の培地（ｐＨ７，
０）に接種乙、３７℃で１０時間振とう培養した。培養
終了後、遠心分離により図体を集め、０゜８５％生理食
塩水で洗浄後、菌体中のグルタチオンを水で加熱抽出し
た。抽出液中のグルタチオン量を定量し、Ｉｉ体ＩＦＣ
湿重量）当りのグルタチオン蓄積量（μｒａａｌｅ ）
を算出した。その結果は下記第１表の通りである。
第 １ 表
２１一
実施例３
下記第２表に示す菌株をグルコース０．５チ、リン酸第
−水薄カリウム０．３％、リン酸第二水累カリウム０．
７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１チ、硫酸ア
ンモニウム０．１％の組成の培地（ｐｉｆ７．０）に接
種し、３７℃て１６崎間振とう培養した。培養終了後、
遠心分離により謝罎渠め、超音波処理により無細胞抽出
液を細裂した。この無細胞抽出液０．０５−を、■・−
グルタミン酸２５ ｍ Ｍ、Ｌ−システィン２５ｍＭ、
グルシン５０ｍＭ 。
−水薄カリウム０．３％、リン酸第二水累カリウム０．
７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１チ、硫酸ア
ンモニウム０．１％の組成の培地（ｐｉｆ７．０）に接
種し、３７℃て１６崎間振とう培養した。培養終了後、
遠心分離により謝罎渠め、超音波処理により無細胞抽出
液を細裂した。この無細胞抽出液０．０５−を、■・−
グルタミン酸２５ ｍ Ｍ、Ｌ−システィン２５ｍＭ、
グルシン５０ｍＭ 。
塩化マグネシウムｌ□ｎｉｌ、アセチルリン酸１０ｍＭ
及び＾テ［’５ｍＭを含む５０ｍＭトリス龜衝液９．９
５ｄに加え、３７℃で１時間酵素反応させた０反応終了
後１反応液中のグルタチオン量を定量し、一体蛋白１ｗ
ＩＩ当りのグルタチオン生成量を算出した。その結果は
下記第２表の通りであった０２２− 第２表
及び＾テ［’５ｍＭを含む５０ｍＭトリス龜衝液９．９
５ｄに加え、３７℃で１時間酵素反応させた０反応終了
後１反応液中のグルタチオン量を定量し、一体蛋白１ｗ
ＩＩ当りのグルタチオン生成量を算出した。その結果は
下記第２表の通りであった０２２− 第２表
Claims (7)
- （１） γ−グルタミルシスティン合成酵素活性及び
グルタチオン合成酵素活性を有しかつグルタチオンによ
るＴ−グルタ１ルシステイン合成酵素への阻害が解除さ
れたエシェリヒア・コリから取得したｒ−グルタミルシ
スティン合成酵素の遺伝情報を担うデオキシリボ核酸を
組み込んだベクターを、当該エシェリヒア・コリに含有
せしめた微生物。 - （２）ｒ−グルタミルシスティン合成酵素の遺伝情報を
担うデオキシリボ核酸を組み込んだベクターが、γ−グ
ルタ之ルシステイン合成酵素の遺伝情報を担うデオキシ
リボ核酸を組み込んだｐＢＲ３２２プラスミツドである
特許請求の範囲第１項記載の微生物。 − - （３） γ−グルタミルシスティン合成酵素活性及び
グルタチオン合成酵素活性を有しかつグルタチオンによ
るｒ−グルタミルシスティン合成酵素への阻害が解除さ
れたエシェリヒア・コリから取得したｒ−グルタミルシ
スティン合成酵素の遺伝情ぺ。 報を担うデオキシリボ核酸を組み込んだ婢りターを、当
該エシェリヒア・コリに含有せしめた微生物を培養し、
かくして得られた菌体からグルタチオンを抽出すること
を特徴とするグルタチオンの ・製造法。 - （４）ｒ−グルタミルシスティン合成酵素の遺伝ぺ。 情報を担うデオキシリボ核酸を組み込んだ叫りタプラス
ミッドである特許請求の範囲第３項記載の製造法。 - （５）ｒ−グルタミルシスティン合成酵素活性及びグル
タチオン合成酵素活性を有しかつグルタチオンによるｒ
−グルタミルシスティン合成酵素への阻害が解除された
エシェリヒア・コツからＲ寿−３− したｒ−グルタミルシスティン合成酵素の遺伝情報を担
うデオキシリボ核酸を組み込んだベクターを、当該エシ
ェリヒア・コリに含有せしめた微生物を培養し、かくし
て得られた菌体もしくは該菌体の処理物をＬ−グルタミ
ン酸、Ｌ−システィン及びグリシンを含有する基質溶液
と接触させ、生成したグルタチオンを採取することを特
徴とするグルタチオンの製造法。 - （６）・ ｒ−グルタ文ルシステイン合成酵素の遺伝情
報を担うデオキシリボ核酸を組み込んだベクタ請求の範
囲第５項記載の製造法。 - （７）マグネシウムイオン、アデノシン−５′−三リン
酸及びア竜チルリン酸の存在Ｆに、ｌｉ体もしくは該一
体の処理物を基質溶液と接触させる特許請求の範囲第５
項又は第６項記載の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56120546A JPS5820188A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | 新規微生物及びそれを用いるグルタチオンの製造法 |
| CA000408485A CA1187430A (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Mutant strain of escherichia coli and its use for the preparation of glutathione |
| ES514572A ES514572A0 (es) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | "un procedimiento para la preparacion de glutation". |
| DE8282304040T DE3279949D1 (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Novel microorganisms of the genus eschericia, hybrid dna for use in their production and the use of the microorganisms in the preparation of glutathione |
| EP82304040A EP0071486B1 (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Novel microorganisms of the genus eschericia, hybrid dna for use in their production and the use of the microorganisms in the preparation of glutathione |
| ES521152A ES521152A0 (es) | 1981-07-30 | 1983-03-30 | Un procedimiento para la preparacion de glutation. |
| US06/690,385 US4598046A (en) | 1981-07-30 | 1985-01-10 | Mutant strain of Escherichia coli and its use for the preparation of glutathione |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56120546A JPS5820188A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | 新規微生物及びそれを用いるグルタチオンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5820188A true JPS5820188A (ja) | 1983-02-05 |
Family
ID=14788972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56120546A Pending JPS5820188A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | 新規微生物及びそれを用いるグルタチオンの製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4598046A (ja) |
| EP (1) | EP0071486B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5820188A (ja) |
| CA (1) | CA1187430A (ja) |
| DE (1) | DE3279949D1 (ja) |
| ES (2) | ES514572A0 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59192088A (ja) * | 1982-09-29 | 1984-10-31 | Hikari Kimura | 遺伝子組換えで造成されるプラスミド |
| JPS60105499A (ja) * | 1983-11-15 | 1985-06-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | グルタチオンの製造方法 |
| JP2020000072A (ja) * | 2018-06-27 | 2020-01-09 | 国立大学法人大阪大学 | グルタチオンの製造方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988000182A1 (fr) * | 1986-07-07 | 1988-01-14 | Teijin Limited | ESTER D'ETHYLE DE gamma-L-GLUTAMYL-L-CYSTEINE ET MEDICAMENT LE CONTENANT EN TANT QU'INGREDIENT ACTIF |
| DE3909105A1 (de) * | 1989-03-20 | 1990-09-27 | Gerd Hoermansdoerfer | Waermerohr |
| US5510243A (en) * | 1994-06-21 | 1996-04-23 | Gelman Sciences, Inc. | Multiple chromogen enzyme targeting (MCET) for use in bacterial contamination monitoring |
| CN105906688A (zh) * | 2016-05-01 | 2016-08-31 | 江苏诚信药业有限公司 | 一种谷胱甘肽的提取工艺系统及工艺方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| JPS6041599B2 (ja) * | 1979-12-07 | 1985-09-18 | 田辺製薬株式会社 | グルタチオンの製法 |
-
1981
- 1981-07-30 JP JP56120546A patent/JPS5820188A/ja active Pending
-
1982
- 1982-07-30 ES ES514572A patent/ES514572A0/es active Granted
- 1982-07-30 CA CA000408485A patent/CA1187430A/en not_active Expired
- 1982-07-30 DE DE8282304040T patent/DE3279949D1/de not_active Expired
- 1982-07-30 EP EP82304040A patent/EP0071486B1/en not_active Expired
-
1983
- 1983-03-30 ES ES521152A patent/ES521152A0/es active Granted
-
1985
- 1985-01-10 US US06/690,385 patent/US4598046A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59192088A (ja) * | 1982-09-29 | 1984-10-31 | Hikari Kimura | 遺伝子組換えで造成されるプラスミド |
| JPS60105499A (ja) * | 1983-11-15 | 1985-06-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | グルタチオンの製造方法 |
| JP2020000072A (ja) * | 2018-06-27 | 2020-01-09 | 国立大学法人大阪大学 | グルタチオンの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4598046A (en) | 1986-07-01 |
| ES8308362A1 (es) | 1983-08-16 |
| EP0071486B1 (en) | 1989-09-20 |
| DE3279949D1 (en) | 1989-10-26 |
| EP0071486A2 (en) | 1983-02-09 |
| EP0071486A3 (en) | 1984-03-28 |
| ES8405441A1 (es) | 1984-06-01 |
| ES521152A0 (es) | 1984-06-01 |
| ES514572A0 (es) | 1983-08-16 |
| CA1187430A (en) | 1985-05-21 |
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