JPS5928483A - 脂質の酵素分解法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 体にリパーセを結合させた固定化リパーセを用いて脂質
を分解するにあたり、リパーセの基質である脂質濃度を
５０〜９４％の範囲内で分解することを特徴とする脂質
の酵素分解法に関するものである。

従来、リパーゼを水に不溶性の担体に結合させて固定化
リパーゼとして反応する試みは多くの報告がある。すな
わち、Ｈａｎｓ　ＢＲＡＮＤＥＮＢＥＲＧＥＲがポリス
チレン系のイオン交換樹脂（彼の用いたイオン交換樹脂
は無機イオシが１個か２個人る網目構造を有していたで
あろう）にリパーゼを共有結合で固定化することを報告
して以来（　Ｒｅｖ　。

Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｉｎｄ．　Ａｌｉｍｅｎｔ．　１１．
　２３７　（１９５６）　）、ポリスチレン、ンリコー
７、エチルセルロースなどの高分子でリパーゼを包括固
定化したマイクロカプセル（北島昌夫、宮野静夫、近藤
朝士、工業化学雑誌７２巻、２号（　１９６９　）　４
９３ページ）あるいは、リパーゼをスペーサーを介して
親水性の疎の構造を有する（マクロポーラスな）アカロ
ースゲルに結合させるもの（　Ａ．　ＫＩＬＡＲＡ，　
Ｋ、Ｍ．ＳＨＡＨＡＮＩａｎｄ　Ｆ．　Ｗ．　ＷＡＧＮ
ＥＲ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　１
９。

１７０３　（１９７７）　）など、リパーゼの固定化法
に関する研究は数多くある。また、固定化リパーゼを実
際の工業的な脂質の加水分解に応用し、分解産物を１２
９７８９　）この技術は、包括固定化であるため脂質の
加水分解のように、水と油の２層系で反応するものに関
しては、最適な反応条件と言えず１、った。また、親水
性のゲルにＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａとい
う菌体を包括固定化し、水飽和のへブタ／中でｄＬ−メ
チル・サクシネイトを加水分解して、ｌ−メツトールを
得ようとする試みがある。（Ｔｅｔｓｕ。

Ｏｍａｔａ、　Ｎｏｒｉｔａｄａ　Ｉｗａｍｏｔｏ、　
Ｔｏｍｉｏ　Ｋｉｍｕｒａ、　Ａｔ５ｕ。

Ｔａｎａｋａ　ａｎｄ　５ａｂｕｒｏ　Ｆｕｋｕｉ　（
１９８１）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　１１
　：　１９９−２０４　）この技術は、有機溶媒中に水
不溶性の基質と水を溶解して均一層にして反応するもの
であ１、て、２層系での反応の欠点は取り除かれてはい
るが、均一層にするためには、基質濃度を上げるにも限
界があり、大量の脂質の加水分解には利用出来ないもの
である。

本発明者らは、大量の脂質の加水分解法について鋭意研
究を重ねた結果、マクロポーラスな多孔性の疎水性担体
に結合させた固定化リパーゼを用いると、マクロポーラ
ス担体の細孔表面が疎水性であるため、基質である脂質
は細孔付近の疎水環境に引きよせられ、基質に対する親
和性が増すのに対し、生産物阻害を起す親水性の生産物
は細孔表面に結合したリパーゼ分子近傍に近寄り難くな
ったため、リパーゼの基質である脂質濃度を５０〜９０
％の範囲にしても、以外にも生産物阻害があまり起らず
高い最終分解率を示す現象を見い出し、この知見に基づ
いて本発明をなすに至った。

本発明に用いるリパーゼとしては、特に起源は選ばない
が、脂質に対する親和性が良くて反応の立ち上がり方が
早く、脂質を高分解率にまで分解する酵素が良い。牛脂
などの高融点の油脂を分解する場合、４５℃以上で反応
する耐熱性リパーゼを利用することが望ましい。

本発明に用いるリパーゼ固定化法としては、担体結合法
である。実施例１で示す如く、従来用いられていた包括
法（モノマーに神経毒のあるアクリルアミドでないもの
を使用した）と比較して、リパーゼと基質の間に高分子
膜が存在しないのでオイルエマルジョノがリパーゼと接
角虫しやすく効率のよい反応が行なわれる。

本発明に用いる担体は、マクロポーラスな、多孔性担体
で、細孔表面が疎水性であることが不可欠であり、その
平均細孔半径はＩＯＡ〜１００ＯＡのものが用いられる
。平均細孔半径がＩＯＡ以下のものは、通常のリパーゼ
分子の半径が１ＯＡ以上なので、多孔性担体の細孔内に
侵入出来ず、リパーゼの結合する面積が広くとれないた
め活性の高い固定化リパーゼは得られない。また、１０
００人以１上の細孔が多く存在しても、リパーゼの結合
する細孔表面積が減少するので、活性の高いリパーゼは
得られない。マクロポーラスな多孔性の担体とは担体粒
子−個あたりのリパーゼ結合面積が多くなるようなもの
であれば、孔の形状は縦長で細孔半径が求められないよ
うなものでも、いずれのものを用いてもかまわない。従
来、担体の表面積を多くするためには、微細な粒子が用
いられていた。

しかし、微細な粒子はカラムなどにつめると目づまりが
起る。本発明で用いるマクロポーラス担体は、担体自身
は大きい粒子が使え、しかもリパーゼが結合する細孔表
面積が広いので、目づまりのｔい活性の高い固定化リパ
ーゼが得られることになる。

本発明に用いられるマクロポーラスを持つ多孔性の疎水
性担体としては、マクロポーラスなｒオイト、多孔性金
属粒子、親水基をマスクしたセル［１−スなどの担体な
どが用いられる。実施例２で示した如く、マクロポーラ
スな担体の細孔表面の疎水性度（〕＼イドロ７オビシテ
イ）が増すに従。

て、基質濃度を高くしても、高い分解率が得られること
になる。疎水性度は、水和性のない非極性のアルキル基
やフェニル基を多くすると増加する。

また、水酸基などの水和性の親水基をアルキル基等で修
飾してやることによっても増加する。本発明の疎水性担
体とは、細孔表面の疎水性度（）・イドロフオヒシティ
）が高い担体のことを言うのであって、細孔表面に疎水
基が比較的多く存在すれば疎水性担体といえる。

本発明に用いる担体にリパーゼを結合させる方法には、
疎水性担体にリパーゼを直接吸着させる方法、担体とイ
オ：／結合させる方法、あるいは担体と共有結合させる
方法等、いずれのものを用いても差し支えない。

本発明の脂質の酵素分解における反応条件のｐＨや温度
については固定化されたリパーゼの反応に最適なｐＨや
温度イマ１近が用いられる。最適のｐＩＩや温度でなく
ても目的の分解率が得られるならばそれを用いても差し
支えない。また、必要ならば金属イオンや血清アルブミ
ン等を加えてもなんら差し支えない。

本発明に用いる脂質としては、リパーゼの基質になる各
種のグリセリドやエステルなどがあげられる。リパーゼ
が作用するものであれば、いずれのものを用いても差し
支えない。

本発明に用いる反応液中のリパーゼの基質濃度は５０〜
９４％が選ばれる。実施例３に示す如（，５０％以下の
水分濃度にしても、最終分解率は上がらず、反応槽の規
模を小さくしたり、反応後水層に得られるグリセリンの
回収のエネルギーを小さくするためには、この濃度以上
で反応させる方が有利である。また、加水分解反応の化
学量論的な水分含量であるトリグリセライド１分子に７
・）して水３分子の基質濃度である９４％程度になって
も高い分解率を達成することが出来る。

本発明に用いる反応槽としては、固定化リパーゼと反応
液とを混ぜて混合するバッチ式のものと。

固定化リパーゼをカラムにつめた連続式のものとが考え
られる。バッチ式、カラム式ともに、固定化リパーゼの
回収が容易で、生産物の精製段階でのリパーゼ蛋白の除
去の必要がなく、回収した酪酸が空気酸化されないこと
や、連続化が可能であリンを得るためには、少なくても
９０％以上の高分解率を達成するとともに、反応液中の
水分含量は出来るだけ少ない量が望ましい。従来、固定
化酵素を用いる反応では分解率は８０％程度しかなく、
しかも反応液中の水分含量も多かった（特開昭５０−１
２９７８９　）のに、本発明によって初めて、反応液中
の水分含量を著しく少なくしても、油脂を高分解率にま
で分解することが出来るようになった。そのため反応後
、水層に得られるグリセリンを蒸留して回収する壬ネル
ギーを少なくする他、反応槽の規模を少さくし、しかも
分解率が高いのラギーナ／のゲル中にリパーゼを包括さ
せる。５℃に一夜放置し、ゲルを固定化さぜ、遠心分離
してゲルを集め、２％の塩化カリウム溶液中で、更１−
夜放置し、ゲルを強化する。２％の塩化カリウ溶液で洗
浄後、２−の塩化カリウム溶液、８０μｌの２５％ゲル
タールアルデヒド溶液を加え、１０℃で１０分間振盪し
、更にゲルを強固にする。２０％のＩｎ硫酸水素ナトリ
ウム溶液を０．２４加え、余分のゲルタールアルデルヒ
トを除いた後、水及び緩衝液で洗浄して、カラギーナン
で包括したリパーゼを得た。

なお、リパーゼ活性は山田らの報告しているＮｏｒｄら
の変法（山田法−１太田安英、町０１晴夫、日農化３６
　　巻８６０　（１９６２）　）によ。て行い、６０゛
ＣでｐＨ７，０１分間に１マイクロ当嵐の酸を遊離する
酵素量を１単位とした。

リパーゼ標品は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ−ゼを硫安塩析、透析、クロロホルム盛こ
よる脱りｌ旨：こ　　等を行−た後、凍結乾燥したもの
を用０た。

ム　　　　１００−の三角７ラスコ；こ、牛りｌ旨と０
．１　Ｍ　ＩＪ　７酸緩衝液ｐＨ７，０とで、各種の基
質濃度の反応液をつくり、良（水分を除いた固定化ＩＪ
　）４−ゼを力１１え、６０°Ｃで毎分１７８回振盪し
ながら１８０時間反応させた後の分解率を酸化価とケン
イヒ（市との比から求めた。

第１表 第１表に示した数字は、反応時間１８０時間後の分解率
であるが、反応時間１２０時間以後はなんら変化なか、
ったので、最終分解率と考えられる。

包括固定化したものは、基質濃度５０％以上になると、
著しく最終分解率が減少する。

実施例　２ １ｇのダウエックスＭＷＡ−１（平均細孔半径１５０Ａ
粒子ナイス２０−５０メツシユのポリスチレン鎖をジビ
ールベンゼンで架橋した母体を持つ第三級アミンを交換
基とする弱塩基性陰イオン交換樹で１０分間振盪し、マ
クロポーラスなイオン交換樹脂に結合させる。最後に２
０％の亜硫酸水素ナトリウムを０．２−加え８℃で１０
分間振盪し、余分のゲルタールアルデハイドを除いた後
、水や緩衝液で良く洗浄してダウエックス固定化リパー
ゼを得た。

６．９７９のセルロ７アイノＧＣ−７００（分子量１０
万から４０万までの蛋白のゲル濾過に使用されるような
マクロポーラスなセルロース担体５粒径４５−１０５μ
ｍ、チッソ株式会社製）を２０ｒｎｌの１規定水酸化ナ
トリウム溶液、１１−のエピクロルヒドリンを加えて、
３０℃で４時間振盪しながら反応し、細孔表面に存在す
る親水性の水酸基をエポキシ化した。５００ｄの蒸留水
で洗浄したエポキシ化セルロファインを６．３記のエチ
レンジアミン、１規定水酸化ナトリウム液１−とともに
、６０°Ｃで２．５時間反応し、水で洗浄した。吸引濾
過して集めたエチレンジアミ／セルロノアインｉｐ、０
．１Ｍ　燐酸化セルロファインヲ得た。アルデヒド化セ
ルロファインとリパーゼ（１５００単位）を燐酸緩衝液
中で−・夜叉応し、セルロー２アｒン固定化リパーゼを
得た。

ダウエックス固定化リパーゼ及びセルロ７アイン固定化
リパーゼを実施例１と同様に、牛脂と反応させて最終分
解率を比較した。

アガロース固定化リパーゼは、エポキシ　アクテ・ｆベ
イテッド　セファロース６Ｂ（ファルマシア社製）を用
いて固定化したものを比較として示し可溶性リパーゼは
、通常の固定化操作によっての活性収率は良くても３０
〜４０％であるので、調製に使用した可溶性リパーゼの
１７３を対照として用いた。

第２表に示す如く、担体に結合したリパーゼによる最終
分解率は、担体に存在する疎水性残基が多い方が、最終
分解率が上昇することが解る。また、疎水性担体に固定
化したリパーゼは、以外にも、担体による立体障害等が
考えられない可溶性酵素を使用した場合よりも、最終分
解率が高くなった。

実施例　３ 実施例２と同様にして、調製したダウエックス固定化リ
パーゼを良く乾燥し、牛脂との０．１Ｍ　ＩＪン酸緩衝
液とで各種の基質濃度の反応液をつくり６０℃で毎分１
７８回振盪しながら１６６．５時間反応後の分解率を調
べた。

第３表 基質濃度９４％にしても、高い最終分解率を示すした。

基質濃度５０％以下にしても、最終分解率は変化しなか
また。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. マクロポーラスな多孔性の疎水性担体にリパーゼを結合
   させた固定化リパーゼを用いて脂質を分解するにあたり
   、リパーゼの基質濃度を５０〜９４％の範囲内で分解す
   ることを特徴とする脂質の酵素分解法