JPS5934110B2 - 酵素の精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特殊なりロフトグラフィー法による高純度で高
活性なグルクロノグリコサアミノグリカン・ヒアルウロ
ネート・リアーゼを製造する方法に関する。

米国特許明細書第３７０８５７５号では人間の心臓不整
脈症、トロンビー、アテローム性動脈硬化症、脳梗塞症
、脳血栓症、冠動脈血栓症および心臓梗塞症の治療方法
が述べられており、これはそのような治療の必要があっ
た場合に効果的量のグルクロノグリコサアミノグリカン
・ヒアルウロネート・リアーゼ（以下、ＧＬと略す）の
等張性でかつ滅菌した溶液を人間に静脈内、動脈内ある
いは包膜内注射によって投与することよりなるものであ
る。

これまでに入手可能な多くのヒアルウロニダーゼ製剤に
は実際にヒアウロン酸の加水分解触媒として働く酵素に
加えて非常に多量の他の酵素的に活性な物質が含まれて
いた。

ヒアルウロニダーゼの不均質な性質がグレーリングらに
よる文献で論じられている（Ｚ 、Ｐｈｙｓｉｏｌ 、
Ｃｈｅｍ。

３４０巻、２４３頁、１９６５年）。

これまでに入手可能なヒアルウロニダーゼ製剤はしばし
ば他の多くのそして様々な量の酵素、たとえばβ−グル
クロニダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ヘキソースアミニダ
ーゼ、アリールスルファターゼＡおよびアリールスルフ
ァターゼＢなどによって汚染されている。

非常に高純度で高活性なＧＬの製造方法はたとえば我々
の英国特許明細書第１０６０５１３号およびボーダー氏
とラフドリー氏（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４３巻、３７５６〜３７６２頁、１９６８
年）によって述べられている。

しかしながらこれらの公知の方法は非常に長く、複雑な
方法であるので大規模なＧＬの生産のためには経済的に
有用な方法であるとは言いがたく、従って高純度、高活
性なＧＬの生産のためのより経済的な方法を提供するこ
とが必要とされていた。

本発明によると非常に高純度で高活性なＧＬの製造方法
が提供され、その方法は粗酵素の溶液をまず活性基とし
てカルボキシ基を含む交差結合したポリアクリルジビニ
ル−ベンゼン樹脂（たとえば登録商標名“アンバーライ
トＣＧ−５０“の名前で入手可能な樹脂）と接触させ、
次いで吸着された酵素を樹脂から溶離させ、所望の酵素
が多く含まれている溶離フラクションを硫酸アンモニウ
ムの飽和水溶液で透析し、得られた酵素濃縮液を活性カ
ルボキシメチル基を含む交差結合したデキストランゲル
（たとえば登録商標名“ＣＭ−セファデックス“の名前
で入手可能なデキストランゲル）と接触させ、次いでゲ
ルから溶離させて非常に高純度で高活性なＧＬの溶液を
得ることよりなる。

代りに硫酸アンモニウム透析段階からの酵素濃縮液を活
性なカルボキシメチル基を含まない交差結合したデキス
トランゲル（たとえば、登録商標名“セファデックスＧ
−７５“および〃セファデックスＧ−１００“の名前で
入手可能なデキストランゲル）と接触させ、次いでゲル
から溶離させることもできる。

このようにして得られた高活性なＧＬ浴溶液、所望によ
り更に活性なカルボキシメチル基を含む交差結合したデ
キストランゲル（たとえばＣＭ−セファデックス）と接
触させ続イテゲルの溶離を行うことにより精製すること
もできる。

出発材料として用いられる粗酵素の溶液は公知の方法で
所望の酵素に富んでいる資源から製造することができる
。

粗酵素溶液の製造には容易に入手できる牛の精巣のよう
な動物の精巣を用いることが望ましいが、他の材料、た
とえば肝臓のりゾゾームなども用いることができる。

精製の第１段階で用いられるカルボキシ基含有樹脂は常
温で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を用いて
平衡させておくのがよく、また粗酵素も同じ緩衝液中に
溶かしておくのが好ましい。

樹脂はカラム中で用いることもできるし、あるいはこの
段階では撹拌器のついた容器中で樹脂と酵素茶液とを接
触させるバッチ法によっても行うことができる。

樹脂は０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で洗っ
た後、０．３モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７，７）で溶離
し、その中から酵素の多いフラクションを集め、ためて
おく。

この段階はすべて常温で行うのが便利である。

このようにして得られた酵素の多い溶液は次いで高濃度
の硫酸アンモニウムの水溶液を用いた透析によって酵素
溶液の容量がたとえば約３分の２に減少するまで濃縮さ
れる。

この透析は好ましくは常温以下の温度、たとえば約４℃
で行われる。

透析の袋の中で得られた酵素活性な沈澱物は次いでたと
えば常温で遠心分離することによって単離することがで
きる。

次いでこの沈澱物を０．１モルの塩化ナトリウム水溶液
に溶かし、その溶液を前もって０．１モルの塩化ナトリ
ウム°水溶液で平衡にした約４°Ｃの活性なカルボキシ
メチル基を含まない交差結合したデキストランゲルのカ
ラムに付す。

次いでゲルは０．１モルの塩化ナトリウム溶液を用いて
溶離し、酵素の多いフラクションを集め、ためておく。

透析段階での沈澱物、あるいは活性なカルボキシメチル
基を含まない交差結合したデキストランケルを用いての
処理段階における酵素の多いフラクションは０．１モル
の酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）に溶かし、０．１モルの酢
酸緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡にした約４℃の活性なカ
ルボキシメチル基を含む交差結合したデキストランゲル
のカラムに付すことができる。

次いでこのゲルを１．０Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）
で溶離して酵素に富むフラクションを集め、ためておく
。

同様に透析濃縮物は０．１モル濃酸緩衝液（ｐＨ５０）
に溶かし、０．１モルの酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で平
衡にした約４℃の活性なカルボキシメチル基を含む交差
結合したデキストランゲルにのせ、次いで１０モルの酢
酸緩衝液（ｐＨ５，０）で溶離することもできる。

本発明による方法を用いると酵素活性にして９０倍以上
の純度を得ることが可能であり、その際の酵素の全回収
率は４０％以上になる。

次に本発明を実施例によって説明する。

実施例 １ 第１段階：イオン交換クロマトグラフィーａ）“アンバ
ーライトＣＧ−５０“ （２，２Ｘ１３ｃＩｒＬ）のカ
ラムを常温で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
を用いて平衡にした。

粗製の酵素の同じ緩衝液の溶液４２１ｍ１（７，４６ｇ
のたんばく質と２５５１．Ｕ、の酵素／■、たんばく質
：すなわち１，９０２，３００ Ｉ 、Ｕ、の酵素を含
む。

）をカラムに付し、次いで１１の０．１モルのリン酸緩
衝液（ｐＨ６，０）で洗った。

続いてカラムを常温で０．３モルのリン酸緩衝液（ｐＨ
７，７）を用い約１８０ｍ１／時の流速で溶離し、溶離
物をフラクションごとに集めた。

得られた結果を次の表１に示す。

ｂ）“アンバーライトＣＧ−５０“の長いカラム（４，
２ｘ ３０Ｃｒｎ、）を用いａ）で述べたと同じ方法で
行った。

得られた酵素の収率はより小さいカラムを用いた場合よ
りも高いことがわかった。

得られた結果を次の表■に示す。

第２段階：透析 第１段階からの活性フラクションＢを４℃で硫酸アンモ
ニウムの飽和水溶液を用いて透析を行い、活性フラクシ
ョンの容量が３分の２に減少するまで濃縮した（透析袋
中、約６０〜７０係の飽和硫酸アンモニウム溶液と等価
）。

透析袋から得られた酵素活性な沈澱物は次いで常温で３
分間、４０００ｒｐｍの回転数で遠心分離して単離した
。

第３段階ニゲル沖過 〃セファデックスＧ−７５“（４，２ｘ７５ｃｍ）のカ
ラムを４°Ｃで０．１モルの塩化ナトリウム水溶液を用
いて平衡にした。

第２段階で得られた酵素単離物を１５ｍ１の０．１モル
塩化ナトリウム水溶液に溶かし、直接ゲルカラムにのせ
た。

次いでカラムを０１モルの塩化ナトリウム水溶液を用い
、５０ｍ１／時の流速で溶離し、溶離物をフラクション
ごとに集めて酵素の多いフラクションをためた。

酵素の多いフラクションは最初の酵素活性の４０．３係
を含んでおり、酵素活性は９２．５倍の純度を示した。

３段階の精製の全体にわたる結果を次の表■に示す。

実施例 ２ 第１段階：イオン交換クロマトグラフィー“アンバーラ
イトＣＧ−５０“のカラム（４，４Ｘ６０ｃ１１１）を
常温で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を用い
て平衡にした。

同じ緩衝液中、粗酵素の溶液５５０ｍ１（５，９８ｇの
たん白質および３４０１、Ｕ、の酵素／■、たん白質、
すなわち２．０３ｘ１０６１．Ｕ、の酵素を含む。

）をカラムにのせ、次いで２．５１の０．１モルリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）で洗った。

カラムを常温で０３モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，７）を
用い、３０ｍ１７時の流速で溶離し、溶離物をフラクシ
ョンごとに集めた。

酵素の多いフラクションをためた。第２段階：透析 第１段階からの活性フラクションを４°Ｃで硫酸アンモ
ニウムの飽和水溶液を用い、実施例１で述べた方法で透
析を行ない濃縮した。

第３段階ニゲル濾過 〃セファデックスＧ−７５“のカラム（４，４Ｘ７２ｃ
ｍ）を４℃で０．１モル塩化ナトリウム水溶液を用いて
平衡にした。

第２段階で得られた酵素単離物を１８．５ｍｌの０．１
モル塩化ナトリウム水溶液に溶かし直接ゲルカラムにの
せた。

次いでカラムを０．１モル塩化ナトリウム水溶液を用い
て２０ｒｎｌ／時の流速で溶離し、溶離物をフラクショ
ンごとに集めた。

酵素の多いフラクションをためた。第４段階：イオン交
換クロマトグラフィー“ＣＭ−セファデックス“のカラ
ム（１３Ｘ１．５ｃｆｒＬ）を４℃で０．１４モル酢酸
緩衝液（ｐＨ５，０）を用いて平衡にした。

第３段階の酵素の多いフラクションをカラムにのせ、０
．４２モル酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で洗った。

次いでカラムを４°Ｃで０．８５モル酢酸緩衝液（ｐＨ
５）を用いて溶離し、溶離物をフラクションごとに集め
た。

ためた酵素の多いフラクションは初期酵素活性の２３係
を含み、酵素活性は８８．３倍の純度を示した。

４段階の精製の全体にわたる結果を次の表■に示す。

実施例 ３ 第１段階：イオン交換クロマトグラフィー“アンバーラ
イトＣＧ−５０“のカラム（３，５×３２ｃ７ｒＬ）を
常温で０．１モルリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡に
した。

同じ緩衝液中、１１０ｍ１の粗酵素溶液（５８５ｍｇの
たん白質と３００１．Ｕ。

の酵素／■、たん白質、すなわち１７５，５００Ｉ 、
Ｕ。

の酵素を含む。

）をカラムにのせ、次いで７００ＴＬｌの０．１モルリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で洗った。

カラムを常温で０．１モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，７）
を用い、２８ｍ１／時の流速で溶離し、溶離物をフラク
ションごとに集めた。

酵素の多いフラクションをためた。

第２段階：透析 第１段階からの活性フラクションを４°Ｃで硫酸アンモ
ニウムの飽和水溶液を用い、実施例１で述べた方法で透
析を行ない濃縮した。

第３段階ニゲル濾過 “セファデックスＧ−１００“のカラム（３，２ｘ５５
ＣＩｒＬ）を４°Ｃで０．１モル塩化ナトリウム水溶液
を用いて平衡にした。

第２段階で得られた酵素単離物を１０７１１１の０．１
モル塩化ナトリウム水溶液に溶かし、直接ゲルカラムに
のせた。

次いでカラムを０．１モル塩化ナトリウム水溶液を用い
、２５７７１１／時の流速で溶離し、溶離物をフラクシ
ョンごとに集めた。

酵゛素の多いフラクションをためた。第４段階：イオン
交換クロマトグラフィー／／ＣＭセファデックス“のカ
ラム（１，６Ｘ１１ＣｒｒＬ）を４℃で０．１４モル酢
酸緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡にした。

第３段階からの酵素の多いフラクションをカラムにのせ
、次いで０．４２モル酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で洗っ
た。

カラムを０．８５モル酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）を用い
て溶離し、溶離物をフラクションごとに集めた。

ためた酵素の多いフラクションは初期酵素活性の３．２
．８％を含み、酵素活性は３８．３倍の純度を示した。

４段階の精製の全体にわたる結果を次の表■に示す。

ＧＬのＩＵ強度はヒアルウロニダーゼの効力検定に対し
国際保健機構で受は入れられた国際標準効力検定方法（
Ｊ、Ｈ，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ、Ｂｕｌｌ、Ｗ。

Ｈ，Ｏ，，１６，２９１／１９５７および米国墓局方、
第１５版、第３２９頁、１９５５年参照）のうち、０．
１モルリン酸緩衝液−〇、１５モル塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ７，０を０，１モル酢酸ナトリウム−０，１５モル
塩化ナトリウム、ｐＨ６，０緩衝液にかえ、人の血清の
かわりに牛の血清を用い、他の条・件は全く同じ方法に
よって決定した。

本発明による方法で得られたＧＬは免疫化学的に純粋で
無菌であり、実質的に牛たん白、発熱性物質、抗原性の
ある成分を含まないものである。

本発明による方法で得られたＧＬは心臓不整脈、トロン
ビー、冠動脈血栓症、心臓硬塞症、心搏動停止、脳溢血
、房室分離、アテローム性動脈硬化症および脳血栓症を
含む人の循環系疾患の治療やあるいは潰瘍性大腸炎やク
ローン病（すなわち局所回腸炎）のように抗体を産生ず
るためにリンパ系に抗原を送る必要のある入の自己免疫
性疾患の治療に甲いることができる。

ＧＬはたとえば静脈内、動脈内、包膜内、皮下および筋
肉内投与などの形で、等張性滅菌溶液にして全身系に投
与される。

投与されるＧＬＯ量は治療されるべき病気の激しさによ
るが５０００〜１０６ＩＵの間、好ましくは２０，００
０〜１０６ＩＵの間であることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 粗製のグルクロノグリコサアミノグリカン・ヒアル
   ウロネート・リアーゼ溶液をまず活性基としてカルボキ
   シ基を含む交差結合したポリアクリルジビニル−ベンゼ
   ン樹脂と接触させ、吸着されたリアーゼを樹脂から溶離
   し、所望のリアーゼに富んだ溶離溶液を硫酸アンモニウ
   ムの飽和水溶液で透析し、このようにして得られた酵素
   濃縮液をさらに活性なカルボキシメチル基を含む交差結
   合したデキストランゲルと接触させ、次いでゲルから溶
   離して所望のリアーゼ溶液を得るか、またはその酵素濃
   縮液を活性なカルボキシメチル基を含まない交差結合し
   たデキストランゲルと接触させ、次いでゲルから溶離し
   て所望のリアーゼの溶液を得ることよりなる非常に高純
   度で高活性なグリクロノグリコサアミノグリカン・ヒア
   ルウロネート・リアーゼの製造方法。 ２ 交差結合したポリアクリルジビニル−ベンゼン樹脂
   を常温で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を用
   いて平衡にする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 粗製の酵素を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，
   ０）中で樹脂にのせる特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ４ 樹脂を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で
   洗浄し、次いでリアーゼを０．３モルのリン酸緩衝液（
   ｐＨ７，７）で溶離する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ５ 透析を約４℃で行なう特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ６ 透析濃縮物を０．１モルの塩化ナトリウム水溶液に
   溶かし、その溶液を０．１モルの塩化ナトリウム水溶液
   で平衡にした活性なカルボキシメチル基を含まない交差
   結合したデキストランゲルに約４℃で付す特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ７ 交差結合したデキストランゲルを０．１モルの塩化
   ナトリウム水溶液で溶離する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ８ 透析濃縮物を０．１モルの酢酸緩衝液（ｐＨ５，０
   ）に溶かし、０．１モルの酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で
   平衡にした活性なカルボキシメチル基を含む交差結合し
   たデキストランゲルに約４°Ｃでのせ、次いでゲルを１
   ，０モルの酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で溶離する特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ９ 粗製のグルクロノグリコサアミノグリカン・ヒアル
   ウロネート・リアーゼ溶液をまず活性基としてカルボキ
   シ基を含む交差結合したポリアクリルジビニル−ベンゼ
   ン樹脂と接触させ、吸着されたリアーゼを樹脂から溶離
   し、所望のリアーゼに富んだ溶離溶液を硫酸アンモニウ
   ムの飽和水溶液で透析し、このようにして得られた酵素
   濃縮液を活性なカルボキシメチル基を含まない交差結合
   したデキストランゲルと接触させ次いでゲルから溶離し
   、得られた溶離物を更に活性なカルボキシメチル基を含
   む交差結合したデキストランゲルと接触させ、次いでゲ
   ルを溶離して所望のリアーゼ溶液を得ることよりなる非
   常に高純度で高活性なグルクロノグリコサアミノグリカ
   ン・ヒアルウロネート・リアーゼの製造方法。 １０交差結合したポリアクリルジビニル−ベンゼン樹脂
   を常温で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を用
   ℃・て平衡にする特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 粗製の酵素を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６
   ０）中で樹脂にのせる特許請求の範囲第９項記載の方法
   。 １２樹脂を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で
   洗浄し、次いでリアーゼを０．３モルのリン酸緩衝液（
   ｐＨ７，７）で溶離する特許請求の範囲第９項記載の方
   法。 １３透析を約４℃で行なう特許請求の範囲第９項記載の
   方法。 １４透析濃縮物を０．１モルの塩化ナトリウム水溶液に
   溶かし、その溶液を０１モルの塩化ナトリウム水溶液で
   平衡にした活性なカルボキシメチル基を含まない交差結
   合したデキストランゲルに約４℃で付す特許請求の範囲
   第９項記載の方法。 １５ 交差結合したデキストランゲルを０．１モルの塩
   化ナトリウム水溶液で溶離する特許請求の範囲第９項記
   載の方法。 １６活性なカルボキシメチル基を含まない交差結合した
   デキストランゲルによる処理段階でのフラクションを０
   ．１モルの酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）に溶かし、０．１
   モルの酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡にした活性なカ
   ルボキシメチル基を含む交差結合したデキストランゲル
   に約４℃でのせ、次いでゲルを１．０モルの酢酸緩衝液
   （ｐＨ５，０）で溶離する特許請求の範囲第９項記載の
   方法。