JPS5936886B2 - 白血球の分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液、体液またはこれらを処理して得られる細
胞浮遊液（以下、血球浮遊液と略す）から白血球または
リンパ球を純度、収率良く、簡単な操作で分離する方法
に関するものである。

さらに詳しく述べると、本発明は血球浮遊液中の赤血球
を何らかの方法、たとえば蒸留水や０．２％食塩水など
の低張溶液と接触させたり、塩化アンモニウム溶液と接
触させて破壊し、この結果生成した赤血球穀（ゴースト
）や、その他血漿タン白、血小板などを多孔性の膜によ
り口過する際、膜に微小な振動を与えることにより、白
血球以外の成分を選択的に口過することを特徴とする白
血球分離法、およびこの方法によつて得られた白血球浮
遊液から顆粒球を除き、リンパ球を得る方法に関するも
のである。白血球は一般に顆粒球とリンパ球からなるた
め、白血球浮遊液から顆粒球を除去すればリンパ球浮遊
液となる。近年、白血球やリンパ球を血液から分離し、
種種の疾患の治療のために輸血することが行われるよう
になつてきた。

この血液成分輸血は従来の全血輸血と異なり、不必要な
ものを除き、必要な成分を多量濃縮して輸血できるとい
う大きな利点をもつており、白血球数が異常に低下し、
細菌などにより発熱した患者に対する白血球輸血や、種
々の免疫療法のためのリンパ球輸血が各地の病院で検討
されている。このような目的に使用可能な従来の白血球
、リンパ球分離法は、各種血球に作用する凝集剤や遠心
分離、血球の粘着、付着、吸着作用などを利用して行わ
れている。

白血球の分離法としてよく用いられているのは、密度の
異なつた液を重層し、この上に血液をのせて遠心操作を
行い、血球の比重の違いによつて白血球を分離する密度
勾配遠心分離や、赤血球凝集剤によつて赤血球を沈降さ
せ、白血球を得る方法などである。しかしながら、これ
らの方法では多量の白血球を得るのは困難であり、また
時間と人手をかなり要し、得られた白血球の純度も良く
ない。最近、血液を連続遠心分離し、白血球を多量に得
る装置が開発されたが、これも操作が煩雑であり、得ら
れた白血球の純度も良くない。しかも装置が高価で、一
部の大病院で試験的に検討されているにすぎない。一方
、リンパ球の分離法では、少量の血液を処理する方法、
たとえば重層遠心分離などが現在行われているが、これ
も得られるリンパ球の純度が悪く、また多量のリンパ球
を得るのも困難である。

そこで我々は多量の血液から、簡単な操作で、純度よく
、多量の白血球やリンパ球を分離する力法について種々
検討した結果、本発明を完成させるにいたつた。すなわ
ちこの発明は、血液、体液またはこれらを処理して得ら
れる細胞浮遊液中の赤血球を破壊し、この液を微小な振
動を与えた多孔性の膜面にそつて繰り返し流し、白血球
以外の成分を膜外に口過することを特徴とする白血球分
離方法である。

以下、本発明の構成について説明する。本発明でいう血
液、体液またはこれらを処理して得られる細胞浮遊液と
は、血液や体液、たとえば骨髄液それ自身、およびこれ
らの液に何らかの処理、たとえば種々の血球凝集剤、た
とえばデキヌトランやヒドロキシエチルスターチなどの
赤血球凝集剤を加えて得た細胞浮遊液や、遠心分離操作
、たとえば密度勾配遠心分離などにより得た細胞浮遊液
、顆粒状を粘着・付着または吸着する性質をもつ物質、
たとえばポリエステル繊維やナイロン繊維などにより、
顆粒球を除去した細胞浮遊液、電気泳動により得た細胞
浮遊液などをいう。第１図は本発明による白血球分離法
の一つの例を示す概略図である。図中１は血球浮遊液中
の赤血球を破壊した液（以下、溶血液と略す）が流れる
部屋、２は多孔性の膜により口過された成分が流れる部
屋であり、この２つの部屋は膜３により分割されている
。この膜は、孔径が２〜２０ミクロン、好ましくは３〜
７ミクロンの孔が膜の表から裏へほぼ直線的に貫通して
おり、かつ自由に振動できるように上記２つの部屋の間
に固定されている。この膜，の例としては、ポリカーボ
ネートの薄膜に中性子を膜と垂直な力向からあて、孔を
あけて作つたものがあげられる。４は膜から口過された
液が出る出口である。

５は各部分を接続し、なかを液が流れる管である。

６は、７のポンプから送られる溶，血液に圧力変動パル
スを与える振動発生装置であり、この圧力変動パルスは
膜に伝えられ、膜が微小な振動を起こす。

この装置は種々考案されうるが、一例としてはピストン
などを利用して液に圧力変動を与えるものが考えられる
。８は溶血液を入れる貯留器である。

９はこの貯留器に溶血液を入れる注入口で、１０は溶血
液からゴースト、血漿タン白、血小板などを除いた液を
出す取出口である。

１１は溶血液を希釈し洗浄するための液を回路内に注入
する口であり、１２はこの洗浄液を貯留する容器である
。

溶血液は貯留器８からポンプ７、振動発生装置６をとお
つて膜３により仕切られた一方の部屋１へ送られる。

このとき、膜３に微小な振動が与えられる。溶血液はこ
の微小な振動を与えられた膜の膜面にそつて流され、溶
血液中の白血球以外の成分は膜外（部屋２）へ口過され
、口過されない白血球は洗浄液を加えられてはじめの貯
留器８へもどされる。このサイクルの繰り返しにより、
最終的に溶血液から白血球以外の成分が口過され、除去
される。従来、膜の表から裏へほぼ直線的に孔があいた
多孔性の膜で、孔径が２〜２０ミクロンのものは白血球
をよく通過させ、このため白血球の分離には用いること
ができなかつた。

しかし我々が鋭意検討した結果、溶血液を膜面にそつて
流し、この膜に微小な振動を与えると、溶血液中のゴー
スト、血小板、血漿タン白はほとんど何の抵抗もなく膜
を通過するが、白血球は膜を通過しなくなる。この際、
溶血液が図中１の部屋を流れる速度は、平均線速として
１Ｃ！ｎ／Ｓｅｃ以上、好ましくは２〜１０ＣｒｆＬ／
ＳｅＣｌ膜の振動回数は１００〜５，０００回／Ｍｉｎ
ｌ好ましくは４００〜１，０００回／Ｍｉｎｌ口過速度
は３．０ｍ１／Ｍｉｎ−ｄ以下、好ましくは０．１〜０
．５ｄ／Ｍｉｎ・ｄとすると、白血球の回収率は非常に
良い。線速が１Ｃ１ｒＬ／Ｓｅｃ以下だと口液中に白血
球がもれて出ていつてしまう。振動回数が１００回／Ｍ
ｉｎ以下だと白血球が口液中にでてゆき、また、５，０
００回／Ｍｉｎ以上だと、振動発生装置で白血球がかな
り破壊される。また口過速度は３．０ｍ１／Ｍｉｎ−ｍ
ｌを超えると、口液中にかなり白血球が出ていく。膜を
微振動が起こらない状態に固定すると、白血球が口液に
出ると同時に、膜自体も種々の成分がひつかかり、目づ
まりを起こして口過そのものが不可能となる。第２図は
本発明の白血球分離法の他の例である。第１図の例では
ポンプと振動発生装置がわかれているが、第２図の例で
はこの２つが同じ装置となつている。これはローラポン
プというポンプであるが、このポンプでも前述した振動
条件、流速条件を満たせば、白血球が分離できる。第３
図も本発明の一例である。

第１図および第２図の例では溶血液に圧力変動パルスを
与え、これを膜に伝える力式を示したが、第３図の例で
は膜により口過された成分が流れる部屋２より振動を膜
に与えるよう設計されたものである。その他６膜面に微
振動を与える力法は種々考えられるが、これらも本発明
に含まれることは言うまでもない。

溶血液を希釈する液は、市販の生理的溶液たとえば生理
食塩水やリン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖を含む血液代
用剤などを用いることができる。

この液を多く加えると、分離した白血球の純度を向上さ
せることができる。この力法によつて充分洗滌して得ら
れた白血球は回収率がよく、血漿タン白や血小板をほと
んど含まず、また赤血球やゴーストも白血球に比らべて
非常に少なくできる。

また、遠心分離などの操作が必要でなく、ポンプと振動
発生装置を作動させるだけでよい。また血液にデキスト
ランなどの赤血球沈降剤をあらかじめ加え、白血球の多
い成分をとり出してから赤血球を破壊し、その後この力
法を適用すれば、一層短時間で純度の高い白血球を得る
ことができる。得られた白血球の機能についても、顆粒
球・リンパ球ともに従来の力法で得られたものとほとん
ど差がなかつた。次にリンパ球分離力法について説明す
る。

現在、血液中の顆粒球のみを粘着・付着または吸着する
物質、たとえばポリエステル系合成繊維やナイロン系合
成繊維、綿などを用いたり、顆粒球に特異的に貧食され
る鉄化合物などを用いて血液中から顆粒球を除去する力
法、および顆粒球と他の血球との比重差を利用して顆粒
球を除去する力法などが一般に行われている。したがつ
て、これらの処理を施して血液中から顆粒球を除去した
血球浮遊液を用意しておき、本発明による白血球分離法
をその液に適用した場合、得られる白血球がリンパ球の
みとなることは自明である。また、顆粒球・リンパ球を
含む血球浮遊液から本発明の力法で白血球浮遊液を得、
その後、前述した顆粒球を除去する力法で顆粒球を除去
しても、リンパ球浮遊液を得ることができる。

さらに、血液中の白血球以外の成分の除去と、白血球か
ら顆粒球を除去することを同時に行うことができる。こ
の力法の一例を第４図に示すと、第１図の力法の回路中
に、顆粒球を粘着、付着または吸着する物質を含む顆粒
球除去装置１４を適当な所にとりつけ、あとは第１図の
力法通りに白血球分離を行う。このようにすれば、白血
球以外の成分の除去と、白血球中の顆粒球の除去が同時
にできる。このようにして得たリンパ球は血漿タン白や
血小板、赤血球・ゴーストなどの混入がほとんど無視で
き、操作も非常に簡単である。また得られたリンパ球は
種々の分裂原、たとえばフイトヘマグルチニンやポーク
・ウイード分裂原によつて幼若化することができ、また
、Ｔ細胞・Ｂ細胞の比率ももとの血液とほとんど変わつ
ていない。以上のように、本発明力法に従うと、血球浮
遊液から白血球やリンパ球を無菌的に純度・収率よく分
離できるとともに、手間がかかるという従来の力法の欠
点が解決されるので、各種医療施設において容易に白血
球、リンパ球成分輸血が行えるものである。

実施例 １ 健康人の血液（赤血球数５０３万／Ｍｄ．白血球数６，
７００／Ｍ７ｌ、血小板数２４万／Ｍｉ．タン白農度７
．０９／ｄｌ）１００ｍ１にヘパリンを１，０００単位
採血時に加え、この血液に蒸留水１１と９．９（ｆ）食
塩水１００ＴＩ１１を加えることにより溶血液を作成し
た。

この溶血液から第１図の力法に従つて白血球を得た。

まず溶血液を貯留器８に入れ、血液ポンプによつて部屋
１に平均線速５（Ｔｌｌ／Ｓｅｃで送り、途中ポンプに
よる液の圧力変化をなくしてから振動発生装置６で８０
０回／分の圧力変化を液に与えた。膜の孔径は５ミクロ
ンであり、膜面積は２００？、口過速度は５６ｍ１／Ｍ
ｉｎとした。洗浄液は食塩とブドウ糖を含む生理的溶液
であり、前記溶血液が口過されて約１００ｍ１となつて
から、５６ｍ１／Ｍｉｎずつ２ｈｒ回路に加えた。この
間膜は目づまりすることなく口液を出し続け、最終的に
洗浄白血球がもとの９４％、ゴーストがもとの赤血球の
０．１！）、血小板がもとの０．１５％、タン白濃度０
．０３９／ｄｌを含む細胞浮遊液１００ｍ１を得た。実
施例 ２実施例１とほぼ血球数の類似した血液１００ｍ
１から分子量２０万のデキストランを用いて白血球４．
８×１０８、赤血球２４×１０８、血小板１７Ｘ１０９
の血球浮遊液を得た。

この血球浮遊液中の赤血球を実施例１と同様にして破壊
し、実施例１と同様第１図の力法で処理し、最終的に白
血球がもとの６３％、ゴーストがもとの赤血球の０．０
０１％、血小板がもとの０．０８％の白血球浮遊液を得
た。実施例 ３ 実施例１とほぼ血球数の類似した血液１００ｍ１から分
子量２０万のデキストランを用いて白血球５．１Ｘ１０
８、赤血球３２×１０８、血小板２１Ｘ１０９の血球浮
遊液を得、実施例１と同様の操作で赤血球を破壊し、第
２図の方法で処理した。

この時、種々の条件は実施例１と同様とした。最終的に
白血球がもとの６９％、ゴーストがもとの赤血球数の０
．００１％、血小板がもとの０．１％の白血球浮遊液を
得た。実施例 ４ 実施例１とほぼ血球数の類似した血液１００ｍ１から、
分子量２０万のデキストランを用いて血球浮遊液を得、
実施例１と同様赤血球を破壊し、第３図の力法で溶血液
を処理した。

最終的に白血球がもとの７０％、ゴーストがもとの赤血
球数の０．０００９％、血小板がもとの０．１５％の白
血球浮遊液を得た。

実施例 ５ 顆粒球を粘着させる物質としてポリエステル系合成繊維
をつめた顆粒球除去装置を組み込んだ第４図の方法で実
施例１とほぼ同様の血液１００ｍ１を処理した。

最終的にリンパ球がもとの６０（ｆｌ）、顆粒球がもと
の２％、ゴーストがもとの赤血球数の０．０００３％、
血小板がもとの０．０６％のリンパ球浮遊液を得た。

比較例 実施例１とほぼ血球数の類似した血液１００ｍ１から溶
血液を作成し、第１図の力法で白血球を分離する際、膜
を口液側から１０メツシユのフイルタ一で押さえ、膜が
自由に振動できないようにしておき、他の条件は実施例
１と同様とした。

結果は、口液ｉ）３２５％程度出た時、膜が目づまりを
起こし、以後口液はほとんど出なかつた。また口液に出
た白血球も最初の白血球の２５％であり、ほぼ口液とと
もに膜から出ていつてしまつている。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図はいづれも本発明の白血球分離
方法の例を示す概略図である。 第４図はリンパ球分離方法の例を示す概略図である。３
・・・・・・多孔性膜、４・・・・・・口液出口、６・
・・・・・振動発生装置、７，１３・・・・・・ポンプ
、８・・・・・・溶血液貯留器、１０・・・・・・白血
球浮遊液の出口、１４・・・・・・顆粒球除去装置。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 血液、体液またはこれらを処理して得られる細胞浮
   遊液中の赤血球を破壊し、この液を微小な振動を与えた
   多孔性の膜面にそつて流し、白血球以外の成分を膜外に
   ロ過することを特徴とする白血球の分離方法。