JPS5938656A - 抗体の免疫グロブリンクラス別検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明ｔま、抗体の検出法に関し、更に詳しくｔ」１抗
体の牙、（（Ｈグロブリンクラス別検出法に関する。

免疫グロブリンには、周知のように、ｉｇＧ。

ＩｇＭ、　ＩｇＡ、　ＩｇｌＪ、　ＩｇＥ　　（Ｄ５ａ
ＩｇＡ（Ｄ／う、ｘ、カ存在するが、感染症や自己免疫
疾患の診Ｈ，ｌｉに特姉Ｍ要なのはＩｇＧ抗体とＩｇＭ
抗体である。ヒト又は動物Ｖま、微生物の感染又は抗原
の感作をうけ２）と、先ずＩｇＭ抗体が産生されるが、
比較的短期間に減少し、やがてＩｇＧ抗体が産生ｉ　ｈ
、、長期間持続する。（狛って、該病原体に対するＩｇ
Ｍ抗体は近い過去の感染による抗体をあられし、その感
染症診断の指標となるのに対し、ＩｇＧ抗体は古い感染
に由来するもので、現在の疾患との因果関係に結び付は
畑い、即ち、感染症の診断に当っては、抗体価を測定す
るだ０ではなく、その抗体がＩｇＭ抗体であるか、Ｉｇ
Ｇ抗体であるかを調べることが極めて重要である。

一方、自己免疫疾患における自己抗体は、Ｉｇ＆ｉ抗体
」：りもＩｇＧ抗体の方がはるかにｊＦｆｌい！１″１
異１り［。

を有することが知られており、この出合Ｈ％ＩｇＧクラ
スの自己抗体を１ｌｊｊｉ定することが特に〃・ポ゛ψ
深い。

従来、免疫グロブリンクラス別抗体価の測定は、螢光抗
体法（以下、ｒ　Ｆ　Ａ　Ｊという、）、放射免疫測定
法（ラジオイムノアッセイ；以下、ｒＲｌ、ＡＪ　、！
：いう。）、酵素免疫側ず法（エンザイムイムノアツセ
イ；以下、ｒＥＩＡＪという。）宿が行なわれてきた。

Ｉｉ’　Ａはスライドグラス上の抗原に抗体をれ７合さ
せ、浄°６トシた後、ｆｌｌｌ＠Ｌ。

た抗体に、＋ｊ１）光色；（（でラベルした抗１ｇＧ抗
体又は抗ＩｇＭ抗体をに１１１介させ、結合した螢９°
１；色素による発光をイ１ト光ｆｆ１ｆｉ微什下に判断
する方法で、感度としてははヌ６；１足できるが％掃作
が頻ｔｉｌｌな土１、ｐｉｉ精度の判シ１に多大の労力
と熟紳を３７．Ｖする。この点、ＲＩ　Ａ及びＥＩＡは
、感度、判定オ゛υＷ共に例れているが、反応が１１ｊ
雑で、ｌｉ’　Ａより更に多くの労力と時間を捜゛」る
。またＩｔ　Ｉ　Ａはアイソトープを使用する為のｔｌ
が別人設備を徹する１、−！た、５１１年、　ｉＪｆ＋
合逆受身抗グロブリン赤血球＾？ｃ犯反応（Ｍｉｘｅｄ
　）（ｅｖｅｒｓｅ　ｐａｓｓｉｖｅ　Ａｎｔｉｇｌｏ
ｂｕｌｉｎ１１ｅ＋ｎａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　；
以下、ｒＭＲＰＡＨＪという。）がＨＷ４されたが（Ｒ
，ｌｔ、Ａ、　（：ｏｏｒｎｂｓ　ｅｔ　ａｌ、。

ｉｎｗｎｕｎｏｌｏｇｙ、　３４　、１０３７　、１９
７８　）、この方法は１１１１菌菌体に対する抗体のみ
が測定司能で、　１ｌｌｌ菌／ｉ＋！ξ染４Ｗに限って
応用できるが、その場合でも６１体のＩ４°１定の抗原
に対する抗体の測定は不可能であＡ０捷だ、ウィルス、
マイコプラスマ、糸状「イ１等の６神の微生物や自己抗
体に応用することは不Ｉｉ′Ｊ能である。

本発明者は、これら従来法のル“；１を点を１９丁決し
、いかなる抗Ｊｌ；−に対する抗体でも、免疫グロブリ
ンクラス毎に容易にしかも短時間内に検出する方法を開
発すべく鋭意研究をルねた結果、抗原を感作した担体粒
子（以下、「抗Ｊｉ；ｔＩ六作粒子」という。）又は不
溶化抗原に、該抗原に対応する抗体を結合させて、この
結合した抗体を免疫グロブリンクラス別に検出する律を
骨子とする方法によって上記目的が達せらｉすることを
見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の抗体の免疫グロブリンクラス別検出法は
、抗原感作粒子又は不溶化抗原に、該抗原に対応する抗
体を結合させ、これを洗浄した後％該抗体のそれぞれの
免役グロブリンクラスに特異的な抗体を用いることによ
り、該抗原に結合し７た抗体を免疫グロブリンクラス別
に検出することを特徴とするものである。

抗原感作粒子又な；１不溶化抗原に結合した抗体を免疫
グロブリンクラス別に検出する方法は従来４ミ〈知られ
ていない方法で、清規なゴ°段である。

以下、本坑５明を更に肝細にｄＩＮ明する。

本発明の、抗ノ９、をＡ＆作する為の１１ｊ体粒子とし
ては、ラテックス、カメリン、赤ＪＣｕ球、τ“・！生
物細胞等が誉けらり、るが、このうちラテックスがｌ（
“をに好凍しい。ここに応用しうるラテックス１ま、ポ
リスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、アミノ基を
有するカルボキシル化ポリスチレン、ホリビニルトルエ
ン、スチレンーブタジェン共中合体、カルポギシル化ス
チレンーブタジェン共ｉト曾体、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体、ビニルトルエン−第三ブチルスチレン
共重イト体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタ
クリル１段、ポリアクリロニトリル、アクリロニトリル
−ブタジェン−スチレン共重合体、ボ’）　ｎｈ　ｒｆ
ビニルアクリレート、ポリビニルピロリドン、塩化ヒニ
ルーアクリレート共重合体屑の合成高分子ラテックス粒
子からなるラテックスてあり、すＪに、これらの合成面
分子ラブックスわ１．子の表面を非イオン界面活性剤桁
で処↓甲したものであってもよい。上記した台成冒分子
ラテックスのなかでもポリスチレンラテックスが女子ま
しい。ラテックス粒子の粒径は、ｏ、ｏｉ〜１０μであ
り、好ましくけ０．１〜１．０μである６また、使用さ
れるラテックス粒子の比重は０．９〜１．４であるが、
高比重の方がわ１已浄が容易である。

赤血球は、哺乳動物１、シ類のいずれの由来のものであ
ってもよい。これらの赤血球は、ホルマリン又はグルタ
ルアルデヒドで固定することができる。微生物細胞もポ
ルマリンもしくはグルタルアルデヒド又は加熱処理によ
って固定することができる。

抗１６１をラテックス又はカオリンに感作うるには、こ
れらの粒子と抗原とを水、生理食塩水、ｐＨ５，５〜１
０、好ましく　ｉｊ：　ｐＨ６，４〜７．６の各秤緩街
液等の中で、簑７５度０．０５〜３％のラテックス粒子
又はカオリン粒子と至適濃度の抗原とを４〜４０Ｃにお
いて３０分−２４肋間ゆるやかに撹拌しながら接触させ
ることによって１〕なう。

緩栴液としては、例えばリン酸塩緩衝食塩水、グリシン
緩衝食塩水勢が掌けらり、る。Ｍ＜作終了後は水性溶媒
、９ｊｌえｔｊｊこれら緩衝液で６−汁することにより
５粒子に吸着さノ］、ない抗原を完全に除去する、更に
、これらの粒子は希釈液にＦＩＷ潤させて粒子の抗原未
感作部分を蛋白質で飽Ａ１１シーｒ　ｊ’；−＜ことが
必要である。

希釈液としてｉｔ　、グリシン緩衝食塩水、す／酸塩緩
丙食隼水等に牛血清アルブミン（以下［ＢＳＡＪと略す
）約０．１％を加えたものを用い、０、　ｌ）　］〜０
．５％のナトリウムアジド（ＮａＮ、＋）を加えて督〈
。

このＪ二うにして、ｉ珪られた感作ラテックス七ｔｌ係
程度に々るＪ：うに希釈液に懸濁させて冷蔵用に保存す
れは二よい。

抗原Ｒｉ１作血球に一製造するには次の杵に行なう。

即ち、カップリング剤を用いて赤血球を処理し、カップ
リング剤処理血球（赤血球表面にカップリング剤が結合
し７た赤血球）を９１１、これに抗原を含む液を接触さ
せ−Ｃ抗原感作血球をに４ｊる。

ラテックス粒子の場合と同好に洗浄し、希釈液に蒋渇し
て保存する。カップリング剤としては、タンニン酸、塩
化クロム、グルタルアルデヒド等が用いられる。不溶化
抗原を調製する為には、グルタルアルデヒドを用いて蛋
白質抗原をｔｊｊ合し、不溶化抗原とする。又、リウマ
チ因子測定の為の■ｇＧ抗原の場合には、６０〜６６Ｃ
１好捷しくは６２〜６４ｔＴで加熱して分子を会＠婆せ
ることによっても不溶化抗原とすることができる。

これらの抗原感作粒子又は不溶化抗原を、４〜４０Ｃに
卦いて、患者血清や免疫血’ｔｉｔ及びこれらの希釈溶
液等の該抗体を含有する精液と混４ｆｌすｉＬば、抗体
は抗原に特異的に結合するので。

一定時間後に洗浄し、ｇ前液等に懸濁ずノ１．は抗イ本
のみの結合しに感作粒子又は不Ｙｉよ化抗原が得らハ、
る。

次に、この感作粒子又１．）不溶化抗原に祠台し／こ抗
体のクラス別の免疫グロブリンの検出には神々の方法が
あるが、逆受身血球凝集反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐａｓ
ｓｉｖｅ　ｌＩｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　；以
下。

ｒ　ＲＰ　ｌ（Ａ　Ｊという。）又は逆受身ラテックス
凝年反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ　１）ａｓｓｉｖｅ　Ｌａｔ
ｅｘ　Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ；以下、ｒ　ＲＰ　
Ｌ　Ａ　Ｊという。）がもつとも容易で適している。Ｒ
Ｐ　ＩＩ　Ａ又ｔｉＲＰＬＡの為の感作血球又は感作ラ
テツクスをよ、常法通りにｔ１゛４異オ１ＩＩＩ、！！
　ｌ、た抗ヒ）ＩｇＧ抗体又は抗ヒ）ＩｇＭ抗体をタン
ニン酸処理赤血球又はラテックスに感作することによっ
て得られる。これらの抗ヒト免疫グロブリン抗体感作血
球又はラテックスを用い−Ｃ１免疫グロブリンを検出す
る方法には、マイクロタイター法又は光学的測定法があ
る。マイクロタイター法では、抗体が結合した抗原感作
粒子又は不溶化抗原を、マイクロプレート上で２系列ダ
イリューターで希釈する。このうちの１系列１１Ｃは、
抗ヒトＩｇＧ抗体感作血球又ｔまラテックスを、他の１
系列には、抗ヒ）ＩｇＭ抗体感作血球又はラテックスを
加える。同時に濃度既知のヒ）Ｉｇ（ン及びＩｇＭにつ
いても同好に処理する。

こｉｌ、らの抗ヒ）ＩｇＧ又は抗ヒ）ＩｇＭ抗体感作ｎ
＋１球ヌはラテックスは一定量以上のヒ）ＩｇＧ又はヒ
トＩｇＭの存在によって′ｅ集するので、一定時開成に
管底凝集像の有無を判定して終末点をよみとり、既知ヒ
トＩｇＧ又はＩｇＭの結果と比較すればＩｇＧ又はＩｇ
Ｍに換３ツ、できる。即ち、該抗体の免疫グロブリンク
ラス別抗体量を求めることができる。

光学的方法は、抗体の結合した感作粒子と抗ヒト免疫グ
ロブリン抗体感作ラテックスを混合して生じた凝集度を
分光光度ｎ（又は私分球式濁度泪を用いて測定し、枠壁
ヒト免疫グロブリンによってイ仔られた（票準曲ｒ１１
から削Ωする。また、定性反応又はスクリーニングの目
的の為には上へ１２凝集をスライドグラス上で行なつ−
Ｃ，１５ｊ（隼の有無を肉眼で判定してもよい。

以上のように、この反応ｔｉｔマイクロタイター法では
マイクロタイター用の器具のみ、光学的測定法の場合は
分光光度計又は濁肢計だｉＪあれｔＸ測定でき、しかも
、抗原感作粒子又ｄ不溶化抗Ｊｊハ」刈常１〜２年以上
保肴できるので、操作ｐ」非′）６に簡単であり、しか
も感度ｔｒｉ　）Ｉす・めて高く。

ＦＡやＲＩ　ＡよりもｎＪ成低価格で実加１できる。

即ち、本発明ヲ、Ｌ、従来用いらす１．たことのない抗
原１に、作粒子とＩｌＰ　ＨＡ又Ｖ」ｌえＰ　Ｉ、　Ａ
　ｆＫ：ｉｆｆみ合せた全く新しい方法を提供し、免疫
グロブリンクラス別抗体を高感度で容易に定性的又（ｔ
：ｉ　’ｉｊ量的に検出できる糸Ｏて組みたて、感染症
や自己免疫疾患の診断を確実にするの６１勿論のこと、
延いてにｒ感染症の流行予測等公衆ｉＴＪ生土、疫学上
の要請にこたえること／バできる。

以下、調製６１及び実が１８例により、本発明に更に７
羊細に浦、明するが、こ）］らＶ、１１、本発明のｉｉ
ｌ：＋囲に、伺ら制限う２）ものでＱ；Ｌカい。

抗ヒトＩｇＭウサギ血清（］）ＡＫＯ社製）　４　ｍｌ
；に、グルタルアルデヒド不溶化ヒ）’ＩｇＭ５（１９
を加え、室温で３０分かけて抗］、ｇＭ抗体をに、゛７
合享せ“でから遠心ｌ−て分取した。ＪＡ５Ｍ　１．Ｊ
ン酸塩緩衝液（＋１１１７．２’　）　１容と生理食エ
フ１水３容との混合液（以下、ｒＰＩ（ＥｉＪＪ＝いう
。）で７３回洗浄後、グリシン暖刷腋（１）！１２．５
　）に懸霞り、て抗Ｉｇｌν１抗体を解離きぜた。ｐｆ
（’ｔ　Ｎａ０１１で中イ′Ａ−とし、ｌ　ｍ／！の積
刺抗ヒト１ｇＭ抗体を得た。

調製例２　熱会合つツギＩｇＧ感作ラテックスの調製 リウマザ因子’ｌｌ’ｊｌ定用抗原とじて熱会自ウサギ
ＩｇＧを用いた。ウサギＩｇＧをｐＨ３Ｓで１０　Ｉｎ
Ｌ；ｌ　／　ｍｅとし、６３ｔ、’で２０分処理して熱
会合ウサギＩｇＧとしｌｃ６　ラテックス〔武田薬品工
栗Ｃ＜Ａ−、）製、５ＤＬ５９（比Ｎ１．１８．粒径０
９μ）〕久ぞの粒子濃度が０．５％になるようにＰ　Ｂ
　Ｓにｊ１％Ｊ　ｉｐＪし、こノ＋、（７ご、更に１月
３８を用いて０．１　ｒｎｙ／ｎｔｌ　ニナル、１：　
’）に希釈した熱会合ウサギＩｇＧを宿量加え、室温に
：う時間保ち、３０００ｒｐｍでＩＯ分玖ノし分離り、
　−Ｃラテックス粒子を分取し、Ｐ　Ｂ　Ｓ、次いで希
釈液で洗浄したＶ、希釈液に０．５％は二ンにるように
懸７ＨＪ　ｌｙて感作ラテツクスを得た。

ｉｉ）釈ｔ′１ダはＰＢＳに１３ＳＡを０，１％になる
ように加え／ヒものである。保存する為に、防ｊ島剤と
じてこｉｌ−にアジ化ナトリウムを０．１チ番・′（な
るように添加しブξ。

調製例３　・インフルエンザ抗原感作ラテツクスの調製 Ａ型インフルエンザウィルスＳ抗原４０補体結合単位／
　ｍｅを抗原として用いた。感作方法は調製例２と全く
同様である。

ｉＰＩ製例４　抗ヒｌ−ＩｇＭ抗体感作イ１１球の調製
２．５チの固定ニワトリ赤血球を含むＰＢＳに１　：　
１００，０００のタンニン酸／ＰＢＳを等幇加え、３７
Ｃで１５分間タンニン酸処理を行なった後、ＰＢＳで１
回洗浄し、原邪のＰＢＳＫ＠濁させてタンニン血球懸濁
液を調製した。

このタンニン血球懸濁液に調製例１で得た鞘製抗ヒｌ−
ＩｇＭ抗体の１　：　１００希釈液を等１１加え、３７
Ｃで４０分Ｉｎ装して結合させ、ＰＢＳで洗浄後、希釈
液にＱ、　５チになるように懸燭して抗ＩｇＭ抗体感作
廁球を得た。

抗ヒトＩｇＭ抗体の代わりに抗ヒ）　ＩｇＧ抗体を使用
した他はすべて調製例４と同様である。

慢性関節リウマチ患者血ｉｆｆ　Ｏ，２ｔｎｌＶＣ調製
例２で得／こ感作ラテツクスＱ、　２　ｍｌを加え、室
温で相分間反応させた。ラテックス粒子をＰＩ３５で４
回洗浄してから２　ｍｌの希釈液に通ミ濁した。マイク
ロプレート（■型）上で、このラテックスを２系列、マ
イクロタイター法で倍数希釈し、」系列目には調製例４
で得た感作血球、２系列目には調製例５で得た感作血球
をそれぞれ０．０２５ｍ１ずつ滴下シた。同時に、０．
０６４　ｔｉ９／ｍｅのヒトＩｇＭ及びＩｇＧについて
も同様の操作をした。４時間後に感作血球の管底凝集像
を刊５．＋：　し、Ｉ　ｇ　（ｙ及びＩｇＭＩＪウマチ
因子の定量値を得／ｃ０結里を第１表に示す、 実施例２　　ＩｇＧ及びＩｇＭインフルエンザウィルイ
ンフルエンザ患者血清Ｑ、　２ｍｌ３に調製例３で得た
感作ラテックス０．２　ｍｌを加え、室温で１０分間反
応させた。３　、００Ｏｒｐｍ　１０分間の遠心でラテ
ックスを沈殿させて分取し、同じ条件で。

ＰＢＳで４回洗浄し、２ｍｌの希釈液に懸濁、シた。

このラテックスをマイクロタイター法で、マイクロブ！
／−）（Ｖ型）上で２系列倍＃ｔ９希釈し、Ｊ系列目に
は調製例４でイｔｔた感作血球、２系列目には？Ａ製何
例５得た感作血球をそれぞれ０．０２５ｍｌずつ滴下し
た。同時に０．０　（５４μ９／ｍｅのＩｇＧ及びＩｇ
Ｍについても同様の操作を行なった。４時間後に感作血
球の管底凝集像の不無を判定し、インフルエンザウィル
ス抗体のＩｇＧ及びＩｇＭ抗体価を得た。結果を第２表
に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　抗原を感作した担体粒子又は不溶化抗原に。 該抗原に対応する抗体を結合させ、これを洗浄した後、
   該抗体のそれぞれの免疫グロブリンクラスに特異的な抗
   体を用いることにより、該抗原に結合した抗体を免疫グ
   ロブリンクラス別に検出することを特徴とする抗体の免
   疫グロブリンクラス別検出法。 Ｚ　　Ｊｉ１体粒子粒子テックス粒子である特許請求の
   範囲第１項記載の検出法。 ３　担体粒子が固定赤血球である特’ｊｊ’Ｉ’　請求
   の範囲第１項記載の検出法。 ４　担体粒子がカオリンである特許請求の範囲第１項記
   載の検出法。 ５　担体粒子が固定微生物＋Ｉｌ＋Ｉ　ＩＪト１．であ
   る！１′￥許諾求の範囲第１項記載の検出法。 ６　不溶化抗原がグルタルアルテヒド不溶化抗原である
   １１￥ｎト請求の範囲第１項記載の検出法。 ７　免疫グロブリンの検出法が逆受身血球凝犯反応であ
   Ｚ１特許請求の範囲第１項ないし第６項のいずｉＬかに
   記載の検出法。 ８　免疫グロブリンの検出法が逆受身ラテックスとｆ集
   反応である特許請求の範囲第１項ないし第６項記載の検
   出法。 ９　逆受身ラテックス凝集反応が光学的手法である’１
   ４１’　ｊｔＴ請求の帥５囲？Ｐ２８項記載の検出法。