JPS5939832A - モノクロ−ナル抗体ならびにその製法、使用法 - Google Patents

モノクロ−ナル抗体ならびにその製法、使用法

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JPS5939832A
JPS5939832A JP57149753A JP14975382A JPS5939832A JP S5939832 A JPS5939832 A JP S5939832A JP 57149753 A JP57149753 A JP 57149753A JP 14975382 A JP14975382 A JP 14975382A JP S5939832 A JPS5939832 A JP S5939832A
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cell
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JP57149753A
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Ryota Yoshimoto
吉元　良太
Yoshiaki Hanzawa
榛沢　義明
Junji Hamuro
淳爾 羽室
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Ajinomoto Co Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ハイブリドーマに由来するヒトインターロイ
キン２（以下、ヒトＩＬ２と略記する。）に特異的な単
クローン性抗体とその製造方法に関する。
肺臓細胞と骨髄腫細胞の・・イブリトーマは文献中に記
載されている。例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｎａｔｕ−ｒｅ　２５６．４９５（１９７５）およ
びＥｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６　、５　］　
＋（１９７６）　；　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｎａｔｕｒｅ　２６６　、５５０　（１９７７）　
；Ｗａｌｓｈ、　Ｎａｔｕｒｅ　２６６、４９５（１９
７７）参照。しかし、本発明以前には、ヒ）ＴＩＪンホ
ーマに由来するＩＬ２を抗原として作用させて得られる
抗ヒ）ＩＬ２抗体産生細胞のハイブリトーマを作成し、
ヒ）ＩＬ２に対するモノクローナル抗体、すなわち、抗
ヒ）　Ｉ　Ｌ　２モノクロ一ナル抗体を産生ずる方法に
関しては全く知られていない。
本発明に従えば、ヒ）ＩＬ２に対して特異性を示すモノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマクローンおよ
び該クローンが産生ずる性状の均一な抗ヒトＩＬ２モノ
クローナル抗体が提供される。さらに該モノクローナル
抗体を用いたＩＬ２の微量定量法および精製法が提供さ
れる。
本発明のハイブリドーマクローンは、（ａ）骨髄腫細胞
すなわち骨髄の初期腫瘍からの悪性化細胞と（ｂ）ヒト
ＩＬ２で免疫された動物の肺臓またはリンパ節の細胞中
に存在する抗体産生細胞とのハイブリドーマを作成し、
このハイブリドーマを培養およびクローン化してヒ）　
Ｉ　Ｌ　２に特異性を示す抗体を産生ずるクローンとし
て選択されるものであ目的とするモノクローナル抗体は
このようなりローンを培養した培養上清から塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー等の精製操作により回収でき
るが、必要に応じて全培養上清を用いることもできる。
また抗ヒトＩＬ２抗体産生・・イプリＩ・−マを組織適
合性動物、胸腺欠損ヌードマウス等の腹腔内に移植し、
増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル
抗体を精製、回収することもできる。
ＩＬ２は、Ｔリッツ球が産生ずる可溶性免疫調節物質で
あり、（ａ）機能的に分化成熟したキラ−１゛リンパ球
するいはヘルパー１９７３球をインヒトｐで増殖させる
、（ｂ）未成熟な胸腺細胞の分裂を促進する、（Ｃ）胸
腺細胞あるいはヌードマウスの肺臓細胞から抗原細胞存
在下に細胞障害性Ｔ’Ｊンパ球１［ｆる、（ｄ）Ｔ細胞
の欠如したヌードマウスの肺臓細胞中にＴ細胞依存性抗
原に対する抗体産生細胞を誘導し、ヘルパーＴ機能を誘
導している、等の事実が知られ、種々のＴ細胞の活性化
を通じて免疫応答の調節物質として重要な位置を占めて
いることは公知である。従って免疫不全症、自己免疫疾
患、癌などの患者の血中ＴＬ２濃度を測定するこくは、
その患者の免疫機能の異常を知る上での極めて有用な免
疫パラメータとなる。
しかして、本発明によりモノクローナルな抗ヒ１−　Ｉ
　Ｌ　２抗体が提供されたことにより従来微量にしか血
中に存在しないために困難とされていた血中ＩＬ２量の
測定が可能となった。すなわち、血中のＩ　Ｌ　２は抗
ＩＬ２抗体を用いたラジオイムノア、セイあるいはアン
チイムイムノアッセイにより容易に定量することができ
る。
また、本発明によって製造された抗ヒトＩ　Ｌ２２モノ
クロ一ナル抗を担体樹脂などの適当な支持体ｅト結合さ
せ親和クロマトグラフィーを行うことによって細胞また
は菌体を培養した培地中に含まれるＩＬ２を特異的に精
製して極めて純度の高いヒｌ−Ｉ　Ｌ　２を容易に得る
道が開けた。例えば、抗ヒトＩ　Ｌ２２モノクロ一ナル
抗は、プロムシアンチ活性化シタセファロース（ファル
マシア社製）等の支持体に結合させることができるが、
このモノクローナル抗体結合支持体でカラムを作成し、
アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより容
易にＩＬ２を精製することができる。すなわち、ｐ　Ｈ
が中性イ」近の溶媒を用いてＩＬ２を特異的に抗体カラ
ムに吸着させた後、カラムを同一の溶媒でよく洗浄し、
ＰＨを２．８付近に下げると結合していたＩＬ２が活性
を失うことなく溶出してくる。
さらに本発明によって製造された抗ヒトＩＬ２（−／　
９　ローナル抗体を用いてラジオイムノアッセイまたは
アンチイムイムノアッセイを行うことにより微量のＩＬ
２を感度良く定量する方法が開けた。
本発明の・・イブリトーマは、骨髄腫細胞と抗体産生細
胞を融合させることによって製造される。
抗体産生細胞としては、ＩＬ２で免疫されたマウス、ラ
ットなどの動物からの肺臓またはリンハ節細胞を用いる
とよい。骨髄腫細胞と抗体産生細胞の由来する動物の種
は、両細胞が融合可能な限りにおいて異なってもよいが
、通常同一種の細胞を用いた方がよい結果が得られる。
本発明実施のための一つの好ましい・・イブリト−マは
、ヒトＴＩ、２て免疫したマウス肺臓細胞とマウス骨髄
腫細胞の間のハイブリト−マである。
例えば、予め水酸化アルミニウムと百日咳死菌をアジュ
バントとしてヒトＴリンホープ由来ＩＬ２で免疫したＢ
ＡＬＢ／Ｃマウスの抗体産生肺臓細胞とＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ
　／　Ｃマウスの骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ
ｌの間の・・イブリＦ−マで優れた結果が得られた。通
常骨髄腫細胞としては、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　
の他、Ｐ３−Ｘ６３”−Ａｇ８、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａ
ｇ４−１　、ＭＰ（４１−４５，６，７Ｇ、１．７、Ｓ
Ｐ２／Ｖ−Ａｇ１４、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３　（
以上、マウス）、２１０．ＲＣＹ。
Ａｇ］、２．３（ラット）、５ＫＯ−００７、ＧＨ１５
００６ＴＧ−Ａ１２　（Ｕ−ヒ、ヒト）等の８アザグア
ニン耐性の細胞株が用いられる。また、抗体産生細胞は
、例えば、次のようにして得るとよい。まず、マウス、
ラットなどの動物をヒトＩ’Ｌ２で免疫する。ここで用
し・るヒトＩＬ２は、ヒト扁桃腺リンパ球、ヒト末稍血
リンパ球、またはヒ）Ｔリンホーマなどのヒｌ−’Ｊン
パ性腫瘍細胞または人工的に作られた・・イブリドーマ
に由来するものが挙げられる。因みに、ヒトＴリンホー
プ由来ＩＬ２は、容易に大ｈ′Ｌに製造でき、抗原とし
て純度の高いものが使えるので、正常ヒトリンパ球由来
ＩＬ２にまさる。
次に、免疫した動物から婢臓細胞を調製する。その調製
方法は、この技術分野においてよく知られた方法である
が、例えば、「免疫実験操作法」Ａ４４７頁（日本免疫
学全編、昭和５０年）参照。
・・イブリトーマの作成とそれからの抗ヒトＴ　Ｌ２抗
体産生クロー７の選択は、例えば、次のようにして行え
る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセンダイ
ウィルス（’ＨＶＪ）を用し・て抗体産生細胞と骨髄腫
細胞とを融合させる。生じた・・イブリドーマはヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジ／を含む培地中で生
育する。融合しなかった抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、
該培地中では共に死滅し、・・イブリドーマだけが個々
のクローンから増殖してくる。生育したハイブリトーマ
から抗ＩＬ２抗体を産生するクローンが選択される。
全てのハイブリドーマクローンが抗体を産生ずるわけで
はない。また、個々のクローンによって産生される抗体
は特異性が異なり、全てのクローンが抗ヒｌ−Ｉ　Ｌ　
２抗体を産生するのではない。従って、ＪＬ２に％Ｉし
て特異性を示す抗体を産生ずるクローンを選択しなけれ
ばならない。
抗ヒ）ＩＬ２抗体産生クローンの選択は、例えば、次の
ようにして行える。ギリス（Ｇ１１ｌｉｓ　）等（ザ・
ジャーナル拳オブｅイム／ロジ−（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
＋、　）】２０巻２０２７頁（１９７８）　）によれば
、細胞障害性Ｔリンパ球株（ＣＴＬＬ　）はＩＬ２存在
下に増殖し、ＣＴＬＬの細胞内へのトリチウムで放射標
識したチミジンの取り込みはＩＬ２の存在下ＤＮＡ合成
の増大に伴って増大する。ＣＴＬＬはヒト■Ｌ２によっ
ても増殖し、抗ヒ）Ｉ　Ｌ２抗体によりこの増殖作用は
阻害されるので、・・イブリトーマの培養−１−清をヒ
トＩＬ２と共存させＣＴＬＬの増殖が阻害されるか否か
を判定することにより抗ヒトＩ　Ｌ　２抗体の存否を判
定することができる。抗ヒ）Ｉ　Ｌ２抗体がＩＬ２の活
性部位に％ｊＬ特異的であれば、該抗体の添加によって
ＩＬ２の活性は阻害され、また抗体の特異性がＩＬ２の
活性部位以外の部位に対するものである場合は、抗体と
共にブドウ球菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ
ｒｅｕｓ　）によって抗原抗体複合物を沈降させ、ＩＬ
２を培地中から吸収消滅させることによりＩＬ２活性は
消失する。
・・イブリトーマはインビトロで長期連続継代培養する
ことがてぎ、フラスコ、シャーレ、ローラーボトル、ス
ピナーフラスコ、回転ジャー、タンク培養器等で培養で
きる。あるいは組織適合性動物または胸腺欠如ヌードマ
ウス中において生育することができる。・・イブリドー
マは培地あるいは動物の血清、または腹水からこの技術
分野において知られバ方□法によって回収できる。例え
ば、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
テミー・オブ・ザイエンス・ユ・ニスのエイ（Ｐｒｏｃ
、　Ｎ’ａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　８．
　Ａ、　）　７５巻１５１０頁（１９７８）参照。
以下に、・・イブリドーマの一つの細胞株を製造し抗ヒ
）Ｉ　Ｌ２モノクローナル抗体を製造するための一つの
典型的な例を挙げる。この例の方法はＢＡＬＢ／Ｃマウ
スの肺臓細胞とＢＡＬＢ／Ｃ由来の骨髄肺細胞を融合す
ることで示しているが、他の抗体産生細胞および他の骨
髄腫細胞を用いても行うことができる。同様にこの方法
はヒ）Ｔ細胞系白血病細胞Ｊ　１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ
８１２９）に由来するヒトＩ　Ｌ２を免疫に用いている
が、他の細胞に由来するヒトＩＬ２もまた使用できる。
（、）　　抗体産生肺臓細胞の製造 ＢＡＬＢ／Ｃマウスを２，５００ユニツトのＪ１１１由
来ヒトＩＬ２で水酸化アルミニウム２”ｙ１１日咳死菌
１０°個と共に腹腔内注射し免疫する。１４日後、さら
に５，０００ユニツトのＩＬ２を水酸化アルミニウム４
　ｍｇと共に５個所に分けて背中に筋肉注射し補助免疫
する。さらに１４日後、５，０００ユニツトのＩＬ２を
アジュバントなしに腹腔内に注射し補助免疫する。最終
補助免疫から１４日抜粋肺臓摘出し、細胞浮遊液をゲル
ハル）　（Ｇｅｒｈａｒｄ　）等（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、、互、　？２０（１９７５））の方法に従っ
て調製し、５Ｘ１０７個の細胞を予め６００レントゲン
のＸ線を照射したＢＡＬＢ／Ｃマウスに静脈内移入し、
同時にＩＱ、ＱＱＱユ＝、トのＩＬ２を２ｔｒｑの水酸
化アルミニウムと共に腹腔内注射し補助免疫する。３目
抜肺臓を摘出し、細胞浮遊液とし、融合のための抗体産
生細胞とする。
（ｂ）　　骨髄腫細胞の製造 ブロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ニー・ニス−エイ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔＪ、ｓ、Ａ、
）　？６．４０６］　（１９７９）に記載された如きヒ
ポキサンチンホスホリボノルトランスフェラーゼが欠損
したＢＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８−ＬＪＩ）を培地、例えば、ｌＯ％牛脂児血清（
Ｆｅ２）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持する。
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌの生育はヒポキサンチン・
アミノブラリン・チミジン培地（ＨＡＴ培地）により阻
害さ九る。
（ｃ）　　ハイブリドーマの製造 肺臓細胞および骨髄腫細胞をコブロフスキー（Ｋｏｐｒ
ｏｗｓｋｉ　）等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４　。
２９８５（１９７７））の方法に従ってポリエチレング
リコール（ＰＥＧ　）　１，０００の存在下に融合させ
る。
融合処理の後、細胞をリトルフィールド（Ｌｉｔｔｌｅ
−ｆｉｅｌｄ　）によりサイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　
）　］　４５巻７０９頁（１９６４）に記載されている
ＨＡＴ培地中に懸濁し、そして組織培養プレートの個々
のウェルに接種する。この際栄養細胞として少量のＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞を共存させておくことが好ま
しい。
培養開始後１日、２日、３日後に個４のウェルのＨＡ　
Ｔ培地を半量新たなＨＡＴ培地と交換し、さらに１４日
、１５日、１６日後にヒポキサンチン・チミジンのみを
含む培地（ＨＴ培地）に半量ずつ交換する。
（ｄ）抗ヒ）Ｉ　Ｌ２抗体産生ハイブリドーマの検定Ｈ
ＡＴ培地中に生育してきたハイブリトーマを通常の培地
、例えば、１ｏ％ＦＣ８を含むＲＰＭＩ−１６４０培地
に移し、その培養−ヒ清を抗ヒ）ＩＬ２抗体の検定標品
としてそのまま用いる。ＣＴＬＬを、例えば２％ＦＣ８
を含むクリック培地（Ｃ１１ｃｋ培地）中に懸濁する。
組織培養マイクロプレートの個々のウェルにヒ）　Ｉ　
Ｌ　２　、検定標品、ＣＴＬＬ。
Ｃ１１ｃｋ培地を加え満たす。抗原抗体複合物を沈澱さ
せたい場合は培地の代わりにブドウ球菌（５ｔａｐｈｙ
ｌｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）の死菌を培地に
加える。２４時間培養した後、トリチウムで放射標識さ
れたチミジンを加え、さらに４時間培養してヒトＩＩ、
２に、するＣ　Ｔ　Ｌ　Ｌのチミジン取り込みの増大が
抗ヒト■Ｌ２抗体検定標品によって阻害されるが否かを
細胞に取り込まれた放射活性によって検定する。放射活
性の測定はこの技術分野においてよく知られた方法によ
って容易に実施できる。
（ｅ）　　ハイプν！・−マのクローニング選択（ｄ）
の操作で抗体活性の認められたハイブリト−マをこの技
術分野においてよく知られた限界希釈法によってさらに
クローン化する。生育してきたクローンの培養−ヒ清は
さらに（ｄ）の方法によって抗体活性を検定し、抗体活
性の強いクローンを選択する。
（ｆ）選択クローンを用いて抗ヒ）Ｉ　Ｌ２モノクロー
ナル抗体を製造するには次のようにする。すなわち、ク
ローンを適当な培地、例えば、１０％ＦＣ８を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で細胞濃度がその上限に対するまで
培養する。培養後遠心操作により細胞を培養液から除く
。培養液中には抗体が含まれている。
（ｇ）　　培ｍ−ヒ清あるいは腹水からのモノクローナ
ル抗体の精製は、この技術分野においてよく知られた方
法を用いて容易に実施される。
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであって
、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１　（抗ヒトＩＬ２抗体産生・・イブリドーマの
作成） ヒトＴ細胞系白血病細胞Ｊ−１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ８
１２９）をコンカナバリンＡで刺激して得られたＩＬ　
２　２，５００単位を水産化アルミニウム２ｍへ百日咳
死菌１０１１個と共にＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注
射し免疫した。１４日後、さらに５，０００単位のＩＬ
２を水酸化アルミニウム４〜と共に５個所に分けて背中
に筋肉内注射し補助免疫した。さらに１４日抜粋、　０
００単位のＩＬ２をアジュバントを用いずに腹腔内に注
射し補助免疫した。最終補助免疫から１４日後腕臓細胞
を摘出し、ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）を
用いて細胞を浮遊化させ、５Ｘ１０’個の細胞を含む浮
遊液１ｍｒを予め６００レントゲンのＸ線を照射したＢ
　Ａ　Ｌ　Ｒ／Ｃマウスに静脈内移入し、同時に１０，
０００単位のＩＬ２を２　ｍｙの水酸化アルミニウムと
共に腹腔内に注射し補助免疫した。
３抜粋肺臓を摘出しＤＭＥＭを用いて細胞浮遊液を調製
し、１０７個の肺臓細胞を含むＤＭＥＭＩＯｍｅを予め
ＤＭＥＭＩＯｍｅ中に浮遊させた２×１０６個のＰ３−
Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ　１骨髄腫細胞と混合した。混合物
を８００２で５分間遠心し、上清を除去した後、容器を
よく振盪し、沈澱した細胞をほぐした。
その後５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０
００　　（和光紬薬社製）を含むＤＭＥＭを２５０μを
添加しゆるやかに攪拌した。ＰＥＧ添加後１分おきにＤ
　Ｍ　Ｅ　Ｍ　Ｏ，５ｍｅを添加していき総量を２．２
５ｍ１とする。さらに１分後ＤＭＥＭ１０ｍｌ！を加え
た後５００２で５分間遠心し上清を除去し、１〇−の１
０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に細胞を
浮遊させ、組織培養プレート（コスタ−社製９６穴）の
各ウェルに２００μｔずつ接種し、３７℃、５％ｃｏ、
下で培養した。１日、２日、３日、７日後に培地の半量
（］００μｔ）をＨＡＴ培地（１０％牛脂児血清、４　
Ｘ　１０−７Ｍアミノプテリン、１．６ｘｌＯ−５Ｍチ
ミジン、］　Ｘ　１０−’　　Ｍヒボキサンチンを添加
したＲＰＭＩ−１６４０培地）と交換し、さらに培養を
続けた。培養の１１．１３．１４日口重培地の半量（１
００μｔ）をＨＴ培地（１０％牛脂児血清、１．６　Ｘ
　１０−’　Ｍチミジン、ｌＸｌ０−’Ｍヒポキサンチ
ンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）に交換した。
融合操作開始から１６日後、１４個のウェルからハイブ
リドーマのコロニーが出現した。この・・イブリドーマ
を１０％ＦＣ８を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養
し、その培養上清の抗ＩＬ２活性を次のようにして測定
した。
培養上清を被検液とし、被検液５０μｔと２５Ｕ／ｍｌ
　　のＪ１１１山来ヒトＩＬ２を５０μｔ１さらに４　
Ｘ　１０″個０ＣＴＬＬを総量２００μｔとなるように
クリック／ＲＰＭＩ培地中に温合し、組織培養フレート
（コスタ−社製９６穴）の各ウェルに接種し、２４時間
培養し、最後の４時間を各ウェル０５μＣ１のトリチウ
ム化チミジン（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ
社製　ＮＥＴ−０２７Ｘ）でラベルし、マイクロプレー
ト用ハーベスタ−で細胞をグラスフィルター−ヒに・・
−ベストしＩＬ２によるＣ　Ｔ　Ｌ　Ｌの増殖が・・イ
ブリトーマ培養上清により抑えられるか否かを検討した
。
表１に示すように、ｌ−！Ｉチウム化チミジン３　Ｈ−
Ｔｄ　Ｒの取込み量より、Ｈ−３と命名した・・イブリ
ドーマがＣＴＬＬの増殖を抑制したことがわかる。
表　　　　　１ ＲＰ　ＭＩ−１６４０培地（ブランク）２，６Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８−Ｕｌ　　（対　照）３．２ハイブリドー
マ　Ｈ−１１，８ Ｈ−２１，９ Ｈ−３０，９２ Ｈ−４３，０ Ｈ−５２，８ Ｈ−６’　　　　　３，３ Ｈ−７２，２ ／／　　　　　　）（−８，２，７６ 〃Ｈ−９２，９６ Ｈ−１０３・３６ Ｈ−１’＋　　　　　　　　　　　　２．４２Ｈ＝１’
２　　　　　　　　　　　３．１８Ｈ−１３３，１ ／／、　　　　　Ｈ−１４１，９６ 実施例２　（抗ヒ）Ｉ　Ｌ２抗体産生細胞株のりｐ−ニ
ング） ・・イブリドーマＨ−３細胞株を、】０％ＦＣ８を含む
ＲｐＭｒ−１６４ｏ培地中に１個／　ｍｅ　ノ濃度で浮
遊させ、各ウェル２００μｔとなるように組織培養プレ
ート（コスタ−社製９６穴）に接種し限界希釈法による
クローン化を行った。１４日抜粋８０個のウェルから４
８個のハイブリトーマクローンが出現した。
各クローンの培養上清の抗ＩＬ２活性を実施例１になら
って測定した結果が表２である。いくつかのクローンが
抗ヒｌ−Ｉ　Ｌ　２活性を示したが、Ｈ−３−１２が特
に強い抗ヒトＩＬ２活性を示した。
表　　　　　２ （ｘ１０’ｃｐｍ） ＲＰＭＩ−１６４０培地（ブランク） Ｈ−３１，０４ Ｈ−３−１１，３ 〃−，１００，９４ ／／−１２、０，４ ／／−１８１，４ ／／　　　−２００，９ Ｎ　　　−２５２，２ ／／　　　−２７２，７ ／／　　　−３２１，６ ／／　　　−３８０，９ ／／　　　−４０，０，８ 〃−，４］　　　　’　　　　　　　　　　　　　　　
　　　］、３／／　　　−４５１，１ Ｎ　　　−４７２，２ ／／　　　−４８１，８ 実施例３　（抗ヒトＩＬ２抗体の産生）ハイブリドーマ
Ｈ−３−１２クローンの培養上清をジ・エンザイムセン
ター製ブドウ球菌菌体イグゾルブ（Ｔｇｓｏｒｂ　）と
共に３７℃で３０分間インキュベートシ、ＩｇＧを吸収
した後、３，０００　ｒ　１０分間遠心し、」二清の抗
ヒ）ＩＬ２活性を実施例１と同様の方法で測定した。
表３に示したように、イグゾルブでＩｇＧを吸収した上
清には抗ヒトＩ　Ｌ２活性が消失しており、Ｈ−３−１
２クローンは抗ヒトｒ　Ｌ　２　ＴｇＧ抗体を産生じて
いたことがわかる。
表　　　　　３ ＲＰＭＩ−１６４０培地（ブランク）１．８Ｈ−３−１
２０，３ Ｈ−３−１２１６ （イグゾルブ処理） 実施例４　（抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２１ｇＧ抗体の分離精製
）Ｈ−３−１２クローンの培養−１−清を３５％飽和の
硫酸アンモニウムで塩析し、生じた沈澱を最少量、０５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に溶解した後、予め同様の緩
衝液て平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ファルマンア
社製）でイオン交換クロマトグラフィーを行い、非吸着
画分に溶出されるＩｇＧ画分の抗ヒｌ−Ｉ　Ｌ　２活性
を実施例１と同様の方法で測定した。
表４はその結果であるが、このようにして抗ヒ）　Ｉ　
Ｌ　２　ＩｇＧ抗体を分離精製することができる。
表　　　　４ ＲＰＭＩ−１６４０培地（ブランク）　　　　　　１．
９２Ｈ−３−１２０，２６ Ｈ−３−１２ＩｇＧ画分　　　　　　　　０．４実施例
５　　（ＩＩ、２の特異的分離精製）実施例４で分離精
製した抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２１ｇＧ　ＪｌＬ体ヲフロムシ
アンで活性化したセファロース（ファルマンア社製）に
結合させ、抗ヒトＩ　Ｌ　２１ｇＧ結合セファロースケ
ルヲ作成した。このゲルて作成したカラムにヒｈ　Ｔ細
胞系白血病細胞Ｊ−１１１（ＡＴ　ＣＣＣＲＬ８１２９
）をＣａｎ　Ａて刺激した培養子ｌｉ’ｉを通過させ、
−上清中に含まれるＩＬ２を抗ＩＬ２−　ＩｇＧ結合セ
ファｐ−スに結合させた。
十分ｊｉｌ、のリン酸緩衝液（２０ｍＭ、　ｐｔＴ　７
．２）　　てカラムを洗浄後、０．１Ｍグリシン−塩酸
緩衝液（ｐ＋１２８　）でＩＬ２を溶出した。溶出液を
０９％のＮａＣ１を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，２）に透析後、ＣＴＬＬ細胞のＤＮＡ合成てＩＬ２活
性な検定した。
表５に示すように、ＩＬ２は抗Ｉ　Ｌ　２−１ｇＧセフ
ァロースに親和性を示し結合する両分に回収されたこと
がわかる。
表　　　　５ ′　　　ＲＰＭＩ−１６４０培地　　　　　　　　　０
．２２ＡＴＣＣ，ＣＲＬ８１２９１Ｌ２　１．８ＩｇＧ
セファロース未吸着画分　　　　　　０３ＩｇＧセファ
ロース吸着画分　　　　　　　２４実施例６　（抗ヒト
Ｉ　Ｌ　２　ＩｇＭ抗体産生・・イブリドーマの作成） 実施例１と同様の方法にて抗ＩＬ２抗体産生・・イフリ
ドーマの作成を行った。得られたハイブリト−マのコロ
ニーの培養上清の抗ＩＬ２活性を実施例１．！−同様の
方法ｔこて検定した。
その結果は、表６に示したようにＡ７０と命名したハイ
ブリドーマに抗ｒＬ２活性が認められた。
表　　　　６ ＲＰＭＩ−１６４０培地　　　　　　　　　１４Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　　２．３ハイプリトーマ　Ａ　
５６　　　　　　　　　　　１．５Ａ６０　　　　　　
　　　　　２．０ Ａ６４　　　　　　　　　　　１．６ Ａ　６５　　　　　　　　　　　１．５Ａ６６　　　　
　　　　　　　１．８ Ａ６８　　　　　　　　　　　１．８ Ａ７０　　　　　　　　　　　０．５ Ａ７１　　　　　　　　　　　２．０ Ａ７２　　　　　　　　　　　１．９ Ａ７７　　　　　　　　　　　１．７ Ａ７８　　　　　　　　　　　　Ｊ、、ＩＡ　８０　　
　　　　　　　　　１．８Ａ　８２　　　　　　　　　
　　１．７Ａ８３　　’　　　　　　　　　　　１．９
次にＡｌ１の培養上清にヤギのマウスＩｇＭに対す６１
ｇＧ　抗体（カペル・ラボラトリーズ社製）を加え３７
℃、１時間インキュベートした後、イグゾルプを加えさ
らに３７℃、３０分間インキュベートした。遠心操作に
よりイグゾルブを沈澱させた−１−清の抗ＩＬ２活性を
実施例１と同様の方法にて検定した。
その結果、表７に示したように、Ａｌ１・・イブリドー
マの抗ＩＬ２活性は、ＩｇＭ吸収操作により消失する。
従ってＡ　７０の産生する抗ＩＬ２抗体は、ＩｇＭであ
ることがわかった。
表　　　　７ 無　　処　　理　　　　　　　　　　　　　０．フイグ
ゾルブで吸収　　　　　　　　　　０．５ＲＰＭｌ−１
６４０培地（対照）２．０実施例７　（抗Ｉ　’Ｌ　２
抗体産生・・イブリトーマのマウス腹腔内移植） ・・イブリドーマＨ３をＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に
５Ｘ１０’個、０．５ｍｅの生理食塩水に懸濁し移植し
た。１０日後、マウスの腹部が肥大したことを確めた後
、注射器で増殖した細胞を回収した。
遠心操作により腹水から細胞を除き実施例】と同様の方
法で抗ＩＩ、２活性の検定を行った。
表８がその結果であるが、Ｈ３から腹水中に抗ＩＬ２抗
体が産生されていることがわかる。
表　　　　　８ Ｈ３移植マウスの腹水　　　　　　　　　　０．２無処
理マウスの腹水　　　　　　　　　　　２３特許出願人
　味の素株式会社 手続補正術 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１４９７５３号 ２、発明の名称 モノク１コーナル抗体ならびにその製法、使用法３、補
正をする者 事イ！１との関係　　特許出願人 住所　　　東京都中央区京橋−丁目５番８号５、補正に
より増加する発明の数　　　なし補正の内容 （１）　特許請求の範囲を別紙の通り補正する。
Ｑ）　明細書第４頁７行目に記載の「ヌードマウス」を
「ヌードマウス」と訂正する。
明細書第６頁７行目に記載のｒ　ｐ　１１を２６８付近
に下げる」の次に［あるいは１％ＳＤＳにて溶出する」
なる記載をｌｌＴｉ入する。
明細ｉＱ第第７註９〜１０ ６　３　−Ａ　ｇ　８　−Ｕ　Ｉ　ＪをｒＰ−３−Ｘ　
６　３−Ａ　ｇ　８　Ｕ−１」と訂正する。
明細Ｗ第７頁１１〜１２行目に記載のｒ　Ｉ）　３　−
Ｘ　８　３　−Ａ　ｇ　８　−Ｕ　Ｉ　ＪをｒＰ−３−
Ｘ　６　３−Ａ　ｇ　８　Ｕ−１」と訂正する。
明細Ｗ第１０頁１７行目に記載の「ユ・ニス・エイ」を
「ニー・ニス・エイ」と訂正する。
明細書箱１１頁１５〜１６行目に記載の「筋肉注射し」
を「筋肉内注射し」と訂正する。
明細書箱１２頁１３行目に記載のｒＰ３−Ｘ６３−Ａ　
ｇ　８　−Ｕ　Ｉ　ＪをｒＰ−３−Ｘ８３−Ａｇ８Ｕ−
ＩＪと訂正する。
明細書第１２頁１５〜１６行目に記載のｒＰ３Ｘ　６３
−Ａ　ｇ　８−Ｕ　Ｉ　Ｊをｒｌ’−３−Ｘｅ３−Ａｇ
８Ｕ−１」と訂正する。
明細書第１３頁９行口に記載の「３日後」を「３日、７
１１後」と訂正する。
明細書第１５頁３行口に記載の「対するまで」を「達す
るまで」と訂正する。
明細書第１５頁８行口に記載の「実施される。」の次に
下記の記載を押入する。
ｒ（ｈ）ＩＬ２特異的アッセイ法 （ｇ）にて精製された抗体をマイクロプレートに固定化
させる。次いでＩＬ２被検サンプルを添加後、ビオヂン
化抗体を加えると］　Ｌ　２　ｆｆｉに従って、抗体が
結合ず６゜これに、アビジン化酵素例えばアビジンアル
カリフォスファターゼ（ＥＶ、　’、、ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｉｎｃ、　Ｕ、Ｓ、＾、）を反応させる。
アビジンービオヂンの特異的結合により抗体に結合した
酵素に対する基質例えばＩ’−ｎｉｔｒｏｐｈｅ−ｎｙ
ｌ　ｐｈｏｓｐ＋＋ａｔｅを発色させ吸光度から微量の
Ｉ　Ｌ　２量を測定するシステムを確立した。」明細Ｉ
Ｍ第１６頁１３行目に記αのｒＰ３−Ｘ　Ｏ３−Ａ　ｇ
　８−Ｕ　Ｉ　ＪをｒＰ−３−ＸＥｆ　３−Ａｇ８Ｕ−
Ｉ　Ｊと訂正する。
明細Ｔ’Ｆ第１９頁の表１中細胞株の欄に記載のｒＰ３
Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩＪをｒＰ−３−Ｘｅ３−Ａｇ８Ｕ
−１］と訂正する。
明細書第１３頁９行口に記載の「検定した。」の次に下
記の記載を挿入する。「あるいは、リン酸緩衝液でカラ
ム洗浄後、１％５ＤＳ（７９°Ｃ）で１１．２を溶出。
溶出液を０°Ｃ氷中で急冷しＳＤＳを除き、同様にＣＴ
　Ｌ　Ｌ細胞でＩＬ２活性を検定した。」 明細書第２５頁に記αの表５を次のように訂正する。
表　　５ サ　　ン　　プ　　ル　　　　　　　　　　　　　３Ｈ
−ＴｄＲ取込み（Ｘ１０’ｃｐｍ） １シＩ＋Ｍ＋−１６４０培地　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．２２Ｊｌｌｌ−ＩＬ２　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１．８ＨｇＧセフ
ァロース未吸管画分　　　　　　　　　　　　　　　０
・３ＨｇＧセフ１０−ス吸着画分（ｐｌ＋　２．８溶出
）２．４〃　　　　　　　（１％ＳＤＳ溶出）２．６明
細書第２６頁の表６中細胞株の欄に記■のｒｌ’３−Ｘ
ｆ３３−Ａｇ８−ＵＩＪをｒＰ−３−Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ
−ＩＪと訂正する。
明細書第２８頁に記載の表８中サンプルの欄に記載のｒ
　Ｐ　３−Ｘ　８３−Ａ　ｇ　８〜ＵＩＪをｒ　Ｐ　−
３−Ｘ６３−ＡｇＵ−ＩＪと訂正する。
明細書第２８頁記載の表８の後に下記の記載をｉｐ人す
る。
「実施例８（ＩＬ２の特異検出定量法）実施例４で精製
した抗ヒ）ＩＬ２１ｇＧ抗体をＰ　ＢＳ　（１’ｈｏｓ
ｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ　）にて
１００μｇ／Ｍｌとし、９６穴マイクロプレートに各４
０μｌ宛滴下、１時間室温に静置し固定化させた。０．
５％牛脂児血清アルブミンを加えたＰ　ＲＳ　（ＲＩＡ
　−ｂｕｆｆｅｒ　）で３回洗浄後、ヒト■１，２を添
加（２０μｌ／ｗｅｌｌ）Ｌ、、１時間室温静置した。
同様にＲＩ　Ａ　−ｂｕｆｆｅｒにて３回洗浄後、精製
ビオヂン化抗ＩＬ２１ｇＧ抗体（３０μｆｆｉ／ｗｅｌ
ｌ）を１時間室温で反応させ、同様に洗浄後アビジン化
酵素（５０μ６／ｗａｌｌ）を添加し、未結合部分を洗
浄除去した後、基質としてＰニトロフォスフエイト（２
μｇ／Ｕｌ、１５０　ａ　Ｊ／ｗｅｌｌ＞を添加発色さ
せた。発色が認められたところで３Ｍ　Ｎａ０Ｈ（１２
５’ｕ　ｔ／ｗｅｌｌ）にて反応を停止させ、分光光度
計にて４０５　ｎｍにおｉｆる吸光度（ＯＤ４ｏ、！ｆ
ｌ）をｆｌｌｌ＋定した。
その結果を表０に示す。
表　　９ すｙフルノｆＪＶ度１１．２　　　　　　　　牛脂児血
ｍアルブミン（倍）　　　　　　　（１，０００μ、／
ｕ）　　　　　　（１００μｇ／ｍ、ｇ）２　　　　　
　　　１．４５　　　　　　　　　　０．１４　　　　
　　　　　　＋、３５　　　　　　　　　　　０．０５
８　　　　　　　　　　＋、　０　　　　　　　　　　
　　０．０５＋６　　　　　　　　　０．５　　　　　
　　　　　　　０．１３２　　　　　　　　　０．３　
　　　　　　　　　　　０．０５１　　　　　　　　　
０．３　　　　　　　　　　　　０．２１２８　　　　
　　　　０．２５　　　　　　　　　　　０．０５２５
Ｂ　　　　　　　　　　０．２　　　　　　　　　　　
０．１特許請求の範囲 （＋１　　抗ヒトインターロイキン２モノクローリ〜ル
抗体。
■　ヒトインターロイキ／２で免疫した動物の抗体産生
細胞と骨髄腫細胞との間にハイプリドーマを形成させ、
該ハイブリドーマをクローン化して抗ヒ１インターロイ
キン２抗体を産生ずるクローンを選択し、このようにし
て選択されたクローンを使用して抗ヒトインターロイキ
ン２モ／クローリール抗体を製造することを特徴とする
モノクローナル抗体の製造方法。
（３）　　該クローンを組織適合性動物または胸腺欠損
ヌードマウスの腹腔内に移植し、増殖させ、該動物腹水
中に抗ヒトインターロイキン２モノクｒＩ−ナル抗体を
産生せしめ、必要に応じてこれを特徴とする特許請求の
範囲第２項の方法。
（４）　　抗ヒトインターロイキン２モノクロ−リール
抗体を結合させた担体樹脂を用いてアフィニディークロ
マトグラフィーを行い、細胞あるいは菌体を培養した培
地中に含まれるヒトインターロイギン２を特異的に精製
する方法。
（５）　　抗ヒトインターロイキン２モノクローナル抗
体を用いてラジオイムノアッセイ、またはアンザイムノ
アッセイを行いインターロイキン２を定量するインター
ロイキン２の微量定量法。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ｎ＋　　抗ヒトインターロイキン２モノクローナル抗体
    。 （２）　　ヒトインターロイキン２で免疫した動物の抗
    体産生細胞と骨髄腫細胞との間に・・イブリトーマを形
    成させ、該ハイブリドーマをクローン化して抗ヒトイン
    ターロイキン２抗体を産生ずるクローンを選択し、この
    ようにして選択されたクローンを使用して抗インターロ
    イキン２モノクローナル抗体を製造することを特徴とす
    るモノクローナル抗体の製造方法。 （３）　　該クローンを組織適合性動物または胸腺欠損
    ヌードマウスの腹腔内に移植し、増殖させ、該腹水中に
    抗ヒトインターロイキン２モノクローナル抗体を産生せ
    しめ、必要に応じてこれを特徴とする特許請求の範囲第
    ２項の方法。 印　抗ヒトインターロイキン２モノクローナル抗体を結
    合させた担体樹脂を用いてアフィニティークロマトグラ
    フィーを行い、細胞あるいは菌体を培養−した培地中に
    含まれるヒトインターロイキン２を特異的に精製する方
    法。 （５１抗ヒトインターロイキン２モノクローナル抗体を
    用いてラジオイムノアッセイ、またはエンザイムノアッ
    セイを行いインターロイキン２を定量するインターロイ
    キン２の微量定量法。
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