JPS5944648A - デオキシリボ核酸の塩基配列決定方法 - Google Patents
デオキシリボ核酸の塩基配列決定方法Info
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- JPS5944648A JPS5944648A JP57155550A JP15555082A JPS5944648A JP S5944648 A JPS5944648 A JP S5944648A JP 57155550 A JP57155550 A JP 57155550A JP 15555082 A JP15555082 A JP 15555082A JP S5944648 A JPS5944648 A JP S5944648A
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は電気泳動によるデオキシリボ核酸（］ＪＮＡ）
の塩基配列決定方法に関する。
の塩基配列決定方法に関する。
本明細書で言う「ＤＮＡ断片」とはマキザムーギルバー
ド（Ｍａｘａｍ−ＧｉＩｂｅｒｔ’）法などを用いて、
ＤＮＡ塩基配列を決定するために試料として用いる、数
百塩基対から成るＤＮＡをさし、生体中に存在する環状
あるいは線形の巨大ＤＮＡを制限酵素などを用いて切断
したものをいう。ｒＤＮＡフラグメント」とは、マキザ
ムーギルバード法などを用いて、ＤＮＡ断片を所定の方
法で塩基特異的に切断し、たどきにでとる個々の長さの
ものをいう。ｒＤＮＡフラグメントザンプル１とは、Ｄ
ＮＡ断片を塩基特異的に切断したときにそれぞれできる
、各程良さのＤＮＡフラグメントの混合物をいう。
ド（Ｍａｘａｍ−ＧｉＩｂｅｒｔ’）法などを用いて、
ＤＮＡ塩基配列を決定するために試料として用いる、数
百塩基対から成るＤＮＡをさし、生体中に存在する環状
あるいは線形の巨大ＤＮＡを制限酵素などを用いて切断
したものをいう。ｒＤＮＡフラグメント」とは、マキザ
ムーギルバード法などを用いて、ＤＮＡ断片を所定の方
法で塩基特異的に切断し、たどきにでとる個々の長さの
ものをいう。ｒＤＮＡフラグメントザンプル１とは、Ｄ
ＮＡ断片を塩基特異的に切断したときにそれぞれできる
、各程良さのＤＮＡフラグメントの混合物をいう。
最近の分子生物学、遺伝子工学の発展に伴ない、ＤＮＡ
の塩基配列決定の必要性が急速（に高まってきている。
の塩基配列決定の必要性が急速（に高まってきている。
事実マクザムーギルバート″’（Ｍａｘａｍ−Ｃｉｌｂ
ｅｒｔ）法をはじめとするいくつかの塩基配列決定法が
開発された。
ｅｒｔ）法をはじめとするいくつかの塩基配列決定法が
開発された。
ところでマクサム−ギルバート法においては。
一端を放射性元素［３２Ｐ）でラベルしたＤＮＡを塩素
特異的に、化学的に切断、すなわちＴ（チミン）、Ｃ（
シトロン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）の位置で
、特異的に切断したＤＮＡフラグメントのザンプルを、
ポリアクリルアミドゲルの所定の位置に左から右へとな
らべ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なうことに
より、１塩基ずつの長さの違いによって分離し、オート
ラジオグラフィーを行なう（図−１）。したがってオー
トラジオグラム上にあられれたゾーンの位置は。
特異的に、化学的に切断、すなわちＴ（チミン）、Ｃ（
シトロン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）の位置で
、特異的に切断したＤＮＡフラグメントのザンプルを、
ポリアクリルアミドゲルの所定の位置に左から右へとな
らべ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なうことに
より、１塩基ずつの長さの違いによって分離し、オート
ラジオグラフィーを行なう（図−１）。したがってオー
トラジオグラム上にあられれたゾーンの位置は。
それぞれの塩基がＯＮＡ中のどの位置に存在しているか
に対応しており、遠くまで移動したゾーンはど、その特
異的切断をされた塩基がＤＮＡＩｔｊの末端近くに存在
していることになる。したがって実際には、最も遠くま
で移動したゾーンから、順次どの塩基の部分で切断を行
なったＯＮＡフラグメントであるかを調べ、ＤＮＡの塩
基配列を決定する方法である。
に対応しており、遠くまで移動したゾーンはど、その特
異的切断をされた塩基がＤＮＡＩｔｊの末端近くに存在
していることになる。したがって実際には、最も遠くま
で移動したゾーンから、順次どの塩基の部分で切断を行
なったＯＮＡフラグメントであるかを調べ、ＤＮＡの塩
基配列を決定する方法である。
この方法では、２０Ｘ４０ｃｍのポリアクリルアミドゲ
ルを用いて２００〜２５０程度の塩基の配列を決めるこ
とかできると言われているが、そのためには、オートラ
ジオグラム上で、それぞれの塩基の位置で特異的に切断
したＤＮＡフラグメントの移動距離（ゾーンの位置）を
測定し、他のＤＮＡフラグメントの移動距離と比較する
必要がある。この際ＤＮＡフラグメントの移動距離は、
フラグメントの大きさの対数に逆比例していることが知
られており、したがってＤＮＡフラグメントのサイズの
比較的大きい領域では、それぞれのゾーンの移動量の差
は、非常に少さくなり、精度の高い位置測定が要求され
る。
ルを用いて２００〜２５０程度の塩基の配列を決めるこ
とかできると言われているが、そのためには、オートラ
ジオグラム上で、それぞれの塩基の位置で特異的に切断
したＤＮＡフラグメントの移動距離（ゾーンの位置）を
測定し、他のＤＮＡフラグメントの移動距離と比較する
必要がある。この際ＤＮＡフラグメントの移動距離は、
フラグメントの大きさの対数に逆比例していることが知
られており、したがってＤＮＡフラグメントのサイズの
比較的大きい領域では、それぞれのゾーンの移動量の差
は、非常に少さくなり、精度の高い位置測定が要求され
る。
ところが、現在までのところ、マクザムーギルハート法
ニよるオートラジオグラム上のゾーンの自動読み取り１
Ｍ析のシステム化ははかられておらず、人間が肉眼的に
ゾーンの位置を比較、決定しているにすぎない。
ニよるオートラジオグラム上のゾーンの自動読み取り１
Ｍ析のシステム化ははかられておらず、人間が肉眼的に
ゾーンの位置を比較、決定しているにすぎない。
ところで、ＤＮＡ塩基配列、自動読み取り、解析システ
ムを作ろうとした場合に、一つの大きな問題点が存在す
る。すなわち、ポリアクリルアミドゲルの重合の不均一
さ、あるいは電気泳動中に不均一に電場がかかるなどの
理由で、泳動分離されたＤＮＡフラグメントのゾーンが
泳動方向に対して正確に直角にならず、曲がったり、歪
んだりしてしまうことである（図−１）。ところが、こ
の歪みは電気泳動の性質上、除去することは、難しい１
．その歪みの一例を誇張して示すと、図−２のように、
Ｇのゾーンは泳動方向に対し直角になっているが、この
ゾーンはいくらか左側の部分が右側の部分より泳動され
た量が少なく、左上がりに傾いている。さらにＴのゾー
ンは、その傾きの程度が、Ｃよりもはげしくなっている
。このような歪みが認められた場合、肉眼によるゾーン
の順番決定の際には、まず、ＴのゾーンのＣの方向への
延長線を考え、その延長線がＣσ）ゾーンよりも上に来
るか下に来るかを判断する。次いで、同様にしてＣとＧ
のゾーンの相対位置も決定する。３（この場合の局所的
塩基配列はＴＣＧ）。このゾーン位置の決定を機械的に
行なう一番簡単な方法はそれぞれのゾーンの中点の位置
（ｙ座標）を測定し、その値を比較し、ゾーンの順番を
決める方法であるが、図−２にあげた例では、Ｔ、Ｃ，
Ｇそれぞれのゾーンの中点をＹＴ、ｙｃ、 ＹＱとすれ
ばｙＴ＞ ｙＣ＞ ＹＧとなり、この測定の座標軸の取
り方を考慮すると、ｙの値の小さいものほど遠くまで泳
動されたことになるので、この場合の局所的塩基配列は
ＧＣＴとなり、明らかに肉眼でゾーンの順番を決定した
場合と異なる。
ムを作ろうとした場合に、一つの大きな問題点が存在す
る。すなわち、ポリアクリルアミドゲルの重合の不均一
さ、あるいは電気泳動中に不均一に電場がかかるなどの
理由で、泳動分離されたＤＮＡフラグメントのゾーンが
泳動方向に対して正確に直角にならず、曲がったり、歪
んだりしてしまうことである（図−１）。ところが、こ
の歪みは電気泳動の性質上、除去することは、難しい１
．その歪みの一例を誇張して示すと、図−２のように、
Ｇのゾーンは泳動方向に対し直角になっているが、この
ゾーンはいくらか左側の部分が右側の部分より泳動され
た量が少なく、左上がりに傾いている。さらにＴのゾー
ンは、その傾きの程度が、Ｃよりもはげしくなっている
。このような歪みが認められた場合、肉眼によるゾーン
の順番決定の際には、まず、ＴのゾーンのＣの方向への
延長線を考え、その延長線がＣσ）ゾーンよりも上に来
るか下に来るかを判断する。次いで、同様にしてＣとＧ
のゾーンの相対位置も決定する。３（この場合の局所的
塩基配列はＴＣＧ）。このゾーン位置の決定を機械的に
行なう一番簡単な方法はそれぞれのゾーンの中点の位置
（ｙ座標）を測定し、その値を比較し、ゾーンの順番を
決める方法であるが、図−２にあげた例では、Ｔ、Ｃ，
Ｇそれぞれのゾーンの中点をＹＴ、ｙｃ、 ＹＱとすれ
ばｙＴ＞ ｙＣ＞ ＹＧとなり、この測定の座標軸の取
り方を考慮すると、ｙの値の小さいものほど遠くまで泳
動されたことになるので、この場合の局所的塩基配列は
ＧＣＴとなり、明らかに肉眼でゾーンの順番を決定した
場合と異なる。
このように、ＤＮＡ塩基配列自動読み取り装置において
は、単純にオートラジオグラム上の各ノ−ンの中点を正
確に測定しても無意味で、特に１ＤＮＡフラグメントの
大きい領域においでは、肉眼的にゾーンの相対位置を決
定する場合に相当ずろような、何らかのゾーンの歪みに
対する補東方法を開発する必要があて）。この方法では
ポリアクリルアミドゝゲル電気泳動のためのサンプルの
ならべ方は、Ｔ、Ｃ，Ｇ、Ａそれぞれの塩基での特異的
な切断を行なったＤＮＡフラグメントサンプルを順次左
から右へとならべていた（図−１）。このようなサンプ
ルの配列を用いて電気泳動をした結果得られたオートラ
ジオダラム上のＤＮＡフラグメントゾーンの位置決定は
、不完全な電気泳動に起因するゾーンの歪み、曲がりが
存在した場合には、「従来技術の欠点」の項で論じたよ
うに、読み取りが不正確になり、何らかの形で補正をか
ける必要がある。この補正のかげ方の躯１の方法は、肉
眼での読み取りの除に行なう補正と全く同じことをコン
ピュータを用いて行なう方法である。すなわち、図−２
において、Ｔのゾーンの左端と右端の座標を求め、その
値を用いて、このゾーンのＣ方向への延長線を計算する
。この延長線とＣゾーンの中点の位置とを比較し、どち
らのゾーン力方がより遠くまで泳動されたかを判断する
。
は、単純にオートラジオグラム上の各ノ−ンの中点を正
確に測定しても無意味で、特に１ＤＮＡフラグメントの
大きい領域においでは、肉眼的にゾーンの相対位置を決
定する場合に相当ずろような、何らかのゾーンの歪みに
対する補東方法を開発する必要があて）。この方法では
ポリアクリルアミドゝゲル電気泳動のためのサンプルの
ならべ方は、Ｔ、Ｃ，Ｇ、Ａそれぞれの塩基での特異的
な切断を行なったＤＮＡフラグメントサンプルを順次左
から右へとならべていた（図−１）。このようなサンプ
ルの配列を用いて電気泳動をした結果得られたオートラ
ジオダラム上のＤＮＡフラグメントゾーンの位置決定は
、不完全な電気泳動に起因するゾーンの歪み、曲がりが
存在した場合には、「従来技術の欠点」の項で論じたよ
うに、読み取りが不正確になり、何らかの形で補正をか
ける必要がある。この補正のかげ方の躯１の方法は、肉
眼での読み取りの除に行なう補正と全く同じことをコン
ピュータを用いて行なう方法である。すなわち、図−２
において、Ｔのゾーンの左端と右端の座標を求め、その
値を用いて、このゾーンのＣ方向への延長線を計算する
。この延長線とＣゾーンの中点の位置とを比較し、どち
らのゾーン力方がより遠くまで泳動されたかを判断する
。
このような操作をＴ−Ｃ，Ｇ、Ａすべでノソーンについ
てくり返し、各ゾーンの順番を決めろことは可能である
。しかしそのための計算量はかなり多（、また大きな記
憶容量のコンピュータが必要となるばかりでなく、測定
ポジション数も増すので、誤差も大きくなるなどの欠点
がある。
てくり返し、各ゾーンの順番を決めろことは可能である
。しかしそのための計算量はかなり多（、また大きな記
憶容量のコンピュータが必要となるばかりでなく、測定
ポジション数も増すので、誤差も大きくなるなどの欠点
がある。
本発明においては、サンプルは図−２に示すとうり、各
塩基に特異的な切断を行なったＤＮＡフラグメントのそ
れぞれの両側に４種の塩基特異的な切断を行なったＤＮ
Ａフラグメント全部の混合物を対照としてならべろこと
により、ゾーン位置の歪みによる誤差の補正を簡略化す
る。
塩基に特異的な切断を行なったＤＮＡフラグメントのそ
れぞれの両側に４種の塩基特異的な切断を行なったＤＮ
Ａフラグメント全部の混合物を対照としてならべろこと
により、ゾーン位置の歪みによる誤差の補正を簡略化す
る。
本発明は、一端を例えば［３２Ｐ ）からなる放射性元
素でう（ルしたＤＮＡ断片に各塩基特異的切断を行ない
、その切断によって得られたＤ Ｎ Ａフラグメントザ
ンプルを電気泳動して、ラベルされた多数のＤＮＡフラ
グメントをオートラジオダラフイで検出することからな
るＤＮＡ断片の塩基配列決定方法において各塩基特異的
な切断をした４種類のＤＮＡフラグメントサンプル全部
を混合した対照サンプルを１つ置きに並べ、その間に塩
基特異的な切断をしたＤＮＡフラグメントサンプルを置
き、電気泳動してそのサンプルの両側の対照サンプルの
泳動結果から、塩基特異的切断を行なった１つのサンプ
ル中のＤＮＡフラグメントのラインでの一つずつ塩基の
数の違うゾーンの泳動されてくる位置を予測し、その位
置に該当するゾーンがその塩基特異的な切断をしたサン
プルのラインに存在するかどうかを判断して、そのサン
プル中の多数のＤＮＡフラグメントの泳動位置を決定し
、塩基特異的切断を行なった他の各サンプル中の多数の
Ｄ Ｎ Ａフラグメントについても同、鍼な操作を行な
うことにより、塩基特異的切断を行なった。その値のサ
ンプルの多数のＤ Ｎ Ａフラグメントの位置を決定し
、それによって塩基特異的切断を行った各フラグメント
の順序を決定することを特徴とするＤＮＡ断片の塩基配
列の決定方法に関する。
素でう（ルしたＤＮＡ断片に各塩基特異的切断を行ない
、その切断によって得られたＤ Ｎ Ａフラグメントザ
ンプルを電気泳動して、ラベルされた多数のＤＮＡフラ
グメントをオートラジオダラフイで検出することからな
るＤＮＡ断片の塩基配列決定方法において各塩基特異的
な切断をした４種類のＤＮＡフラグメントサンプル全部
を混合した対照サンプルを１つ置きに並べ、その間に塩
基特異的な切断をしたＤＮＡフラグメントサンプルを置
き、電気泳動してそのサンプルの両側の対照サンプルの
泳動結果から、塩基特異的切断を行なった１つのサンプ
ル中のＤＮＡフラグメントのラインでの一つずつ塩基の
数の違うゾーンの泳動されてくる位置を予測し、その位
置に該当するゾーンがその塩基特異的な切断をしたサン
プルのラインに存在するかどうかを判断して、そのサン
プル中の多数のＤＮＡフラグメントの泳動位置を決定し
、塩基特異的切断を行なった他の各サンプル中の多数の
Ｄ Ｎ Ａフラグメントについても同、鍼な操作を行な
うことにより、塩基特異的切断を行なった。その値のサ
ンプルの多数のＤ Ｎ Ａフラグメントの位置を決定し
、それによって塩基特異的切断を行った各フラグメント
の順序を決定することを特徴とするＤＮＡ断片の塩基配
列の決定方法に関する。
一つのＤＮＡフラグメントサンプルに含まれた多数のＤ
ＮＡフラグメントの泳動位置と他のサンプルに含まれた
ＤＮＡフラグメントの泳動位置は第６図に示されるよう
に５つの対照サンプルの間に４つのＤＮＡフラグメント
サンプルを並べて同時に測定しても良いが、別々に測定
しても良い。
ＮＡフラグメントの泳動位置と他のサンプルに含まれた
ＤＮＡフラグメントの泳動位置は第６図に示されるよう
に５つの対照サンプルの間に４つのＤＮＡフラグメント
サンプルを並べて同時に測定しても良いが、別々に測定
しても良い。
はｋんどの電気泳動の不完全さにょる／−ンの歪み、曲
かりは図−４示すように、ゲルの側面に近いものほど泳
動距離が短く、シたがってゲルの左側の部分では左上が
りの傾き、またゲルの右側の部分では、右上がりのゾー
ンが形成されるので、対照１と対照２のそれぞれ第１］
番目のゾーンの位置ｙＴ４、ｙ″＋１の位置を正確に測
定し、そのｙ座１票の直の平均３／１、。−（′Ｖ′。
かりは図−４示すように、ゲルの側面に近いものほど泳
動距離が短く、シたがってゲルの左側の部分では左上が
りの傾き、またゲルの右側の部分では、右上がりのゾー
ンが形成されるので、対照１と対照２のそれぞれ第１］
番目のゾーンの位置ｙＴ４、ｙ″＋１の位置を正確に測
定し、そのｙ座１票の直の平均３／１、。−（′Ｖ′。
＋ｙ／１１）／２を求める。このｙＴｏはＴのラインで
の、ｎ個のヌクレオチド８から成るＤＮＡフラグメント
の泳動されて来る位置を示していることになる。次いで
Ｔのラインの中に、この位置に相当するゾーンが存在す
るかどうかを判断する。図−４に示した例では該当する
ゾ−ンは存在しない。１図−４のＴσ）ラインの例では
。
の、ｎ個のヌクレオチド８から成るＤＮＡフラグメント
の泳動されて来る位置を示していることになる。次いで
Ｔのラインの中に、この位置に相当するゾーンが存在す
るかどうかを判断する。図−４に示した例では該当する
ゾ−ンは存在しない。１図−４のＴσ）ラインの例では
。
対照１、Ｔ、利照２のゾーンは、泳動方向に対し、はぼ
同じだげ傾いていたので、上記の方法で求めたＴライン
でのｎ個のヌクレオチド゛より成るＤＮＡフラグメント
の泳動されて来るべき位置は、本来Ｔライン上でこの大
きさのフラグメントを泳動しまた」場合に、泳動されて
来る位置と全く同じになることは数学的にも明確である
。ところが図−４の対照２、Ｃ，対照乙のように、それ
ぞれのゾーンの傾きが、少しずつ異っている場合（経験
的に傾きの大きさは対照２〉Ｃ＞対照６となっている）
には、計算で求めたＣラインでの泳動位置ｙ。ｎ−（ｙ
′′ｎ＋ｙ′′Ｉｎ）／２と、実際にｎ個のヌクレオチ
ドから成るＤＮＡフラグメントが泳動されて来る位Ｉｔ
Ｒｙｃｙｎとは、わずかだがずれている。しかしこのず
れの程度は、隣接する長さの違うＤＮＡフラグメントの
泳動されて来る位置との差に較べはるかに小さいので、
ある或値内（例えば隣接するゾーンとの位置の違いの３
０％以内）におさまれば、そのゾーンが存在すると判断
してよい。
同じだげ傾いていたので、上記の方法で求めたＴライン
でのｎ個のヌクレオチド゛より成るＤＮＡフラグメント
の泳動されて来るべき位置は、本来Ｔライン上でこの大
きさのフラグメントを泳動しまた」場合に、泳動されて
来る位置と全く同じになることは数学的にも明確である
。ところが図−４の対照２、Ｃ，対照乙のように、それ
ぞれのゾーンの傾きが、少しずつ異っている場合（経験
的に傾きの大きさは対照２〉Ｃ＞対照６となっている）
には、計算で求めたＣラインでの泳動位置ｙ。ｎ−（ｙ
′′ｎ＋ｙ′′Ｉｎ）／２と、実際にｎ個のヌクレオチ
ドから成るＤＮＡフラグメントが泳動されて来る位Ｉｔ
Ｒｙｃｙｎとは、わずかだがずれている。しかしこのず
れの程度は、隣接する長さの違うＤＮＡフラグメントの
泳動されて来る位置との差に較べはるかに小さいので、
ある或値内（例えば隣接するゾーンとの位置の違いの３
０％以内）におさまれば、そのゾーンが存在すると判断
してよい。
このように、直接塩基特異的な切断を行なったＤＮＡフ
ラグメントのゾーン相互の位置を比較するのではなく、
サンプルの画同に必ず対照をおき、これらの対照から一
つずつ長さの違’５ Ｄ Ｎ Ａフラグメントが、サン
プルのラインのどの位置、に泳動されて来るかを予測し
、その位置にＤＮＡフラグメントのゾーンが存在するか
どうかを判断することにより、効果的に、しかも簡単に
不完全な電気法＠に伴なう歪み、曲がりを補正すること
ができる。
ラグメントのゾーン相互の位置を比較するのではなく、
サンプルの画同に必ず対照をおき、これらの対照から一
つずつ長さの違’５ Ｄ Ｎ Ａフラグメントが、サン
プルのラインのどの位置、に泳動されて来るかを予測し
、その位置にＤＮＡフラグメントのゾーンが存在するか
どうかを判断することにより、効果的に、しかも簡単に
不完全な電気法＠に伴なう歪み、曲がりを補正すること
ができる。
本発明のデータ解析の手順の１例を示すと次の通りであ
る。
る。
デンシトメーターとそれに接続したコンピュータを用い
、次の測定、計算を行なう。
、次の測定、計算を行なう。
４−１ 化学修飾された塩基の存在の有無のチェック
図−６において、対１のラインを矢印の方向ニスキャン
し、それぞれσ）ゾーンの中点の位置を読み取り、記憶
する。このＤＮＡ中に化学的に修飾をうけ、したがって
切断されない塩基が存在するかどうかを調べるために、
６つの連続するゾーン１］、ｎ十ｊ、ｎ＋２の位置ｙ
、ｙ＋１、ｙ ＋２ｎ ＩＩ
ｎの間に次の式が成立するかどうかをチェック
する。
し、それぞれσ）ゾーンの中点の位置を読み取り、記憶
する。このＤＮＡ中に化学的に修飾をうけ、したがって
切断されない塩基が存在するかどうかを調べるために、
６つの連続するゾーン１］、ｎ十ｊ、ｎ＋２の位置ｙ
、ｙ＋１、ｙ ＋２ｎ ＩＩ
ｎの間に次の式が成立するかどうかをチェック
する。
Ｙ１１＋２−Ｙｎ＋１（Ｙｎ＋１−Ｙｎ （ｎ＝１．
２、ろ・・・）この式が成立しない場合は、ｎ＋１番目
とｎ＋２番目のヌクレオチドの間に化学修飾された塩基
が存在することになるので、この塩基の位置を記憶し、
以後の計算において、塩基数と補正を行なう。
２、ろ・・・）この式が成立しない場合は、ｎ＋１番目
とｎ＋２番目のヌクレオチドの間に化学修飾された塩基
が存在することになるので、この塩基の位置を記憶し、
以後の計算において、塩基数と補正を行なう。
４−２ ＤＮＡ中のＴの位置の決定
デンシトメーターを用いて、図−２０対１、Ｔ、対２の
ラインのゾーンの中点（Ｙ’（１，Ｙ １ｎ＋ ｙ／ｒ
Ｉｎ−１，２，６・・・）をそれぞれ測定し、コンピュ
ータに記憶する。対１と対２のそれぞれ対応する番号の
ゾーンの位置の平均（ｙｌ、１、ｎ＝１．２．３−）を
とる。記憶されたＴのゾーンの中点の位置（ｙ０ｍｍ＝
１．２．６・・・）の中に、ＹＴｎと次の関係にあるも
のをさがす。
ラインのゾーンの中点（Ｙ’（１，Ｙ １ｎ＋ ｙ／ｒ
Ｉｎ−１，２，６・・・）をそれぞれ測定し、コンピュ
ータに記憶する。対１と対２のそれぞれ対応する番号の
ゾーンの位置の平均（ｙｌ、１、ｎ＝１．２．３−）を
とる。記憶されたＴのゾーンの中点の位置（ｙ０ｍｍ＝
１．２．６・・・）の中に、ＹＴｎと次の関係にあるも
のをさがす。
１ ｙＴＩＩＩ −３’Ｔｎ １（０，３１３／Ｔ＋１
− ｙＴｎ＋ １１（ｎ−１，２，６・・・、ｍ＝１．
２．３−）このようなゾーンが存在した場合、その時の
口の値のところにＴが存在するとして記憶する。この＋
１の値は、ＤＮＡの末端から第１］番目のヌクレオチド
がＴであることを示している３゜ ４−３ ＤＮＡ中の他の塩基の位置決定図−６の対２
と対６を用いで、４−２と同じ方法でＣの位置、対６と
対４からＧ、灯４とズ１５からＡの位置を決め、それを
記憶する。
− ｙＴｎ＋ １１（ｎ−１，２，６・・・、ｍ＝１．
２．３−）このようなゾーンが存在した場合、その時の
口の値のところにＴが存在するとして記憶する。この＋
１の値は、ＤＮＡの末端から第１］番目のヌクレオチド
がＴであることを示している３゜ ４−３ ＤＮＡ中の他の塩基の位置決定図−６の対２
と対６を用いで、４−２と同じ方法でＣの位置、対６と
対４からＧ、灯４とズ１５からＡの位置を決め、それを
記憶する。
４−４ ＤＮＡ塩基配列の決定
記憶した、それぞれの塩基の位置（番号）のデータの中
から、順次第１番目、第２番目・・・にヌ１応する塩基
を呼び出し、その順番をプリントアウトする。
から、順次第１番目、第２番目・・・にヌ１応する塩基
を呼び出し、その順番をプリントアウトする。
４−５ 相補的なりＮＡ鎖を用いての塩基配列の確認
以上述べた方法でＤＮＡの塩基配列？決定することがで
きるが、実験に伴なう誤差などにより、データの解析に
誤りが生じる可能性がある。ここで確実性を増すために
，図−５に示すように、塩基配列な決定しようとしてい
るＤＮＡとそれに相補的なりＮＡとのサンプルのセット
を、一枚のポリアクリルアミドゲルの上にならべて泳動
し、」二記の方法で解析することにより得られた２組の
ＤＮＡの塩基配列を、それぞれのＤＮＡの切断位置、Ｄ
ＮＡの大きさ等を考慮した上で、相補性が成立している
かどうか、即ちＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ対が塩基配列の上で成立
しているかどうか調べる。もし相補性が成立していない
場合は、その旨表示する。
きるが、実験に伴なう誤差などにより、データの解析に
誤りが生じる可能性がある。ここで確実性を増すために
，図−５に示すように、塩基配列な決定しようとしてい
るＤＮＡとそれに相補的なりＮＡとのサンプルのセット
を、一枚のポリアクリルアミドゲルの上にならべて泳動
し、」二記の方法で解析することにより得られた２組の
ＤＮＡの塩基配列を、それぞれのＤＮＡの切断位置、Ｄ
ＮＡの大きさ等を考慮した上で、相補性が成立している
かどうか、即ちＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ対が塩基配列の上で成立
しているかどうか調べる。もし相補性が成立していない
場合は、その旨表示する。
第１図はマクサム−ギルバート法によるポリアクリルア
ミドゲル上のサンプルのならべ方を示す概略図である。 Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ａは、それぞれの塩基に特異的な切断を行
なったＤＮＡフラグメントサンプルである。 第２図はゾーンに歪み、曲がりがおこった」場合の測定
の不正確さを示す概略図である。ｙ工、ｙＣ１３／ｃは
それぞれのゾーンの中点を示す。 第６図は本発明におけるポリアクリルアミドゲル上のサ
ンプルのならべ方を示す概略図である。 対１〜５は、Ｔ、Ｃ，Ｇ、Ａ１重のサンプルを混合した
ものである。 第４図は本発明におけるゾーンの歪み、曲がりの補正の
概念図である。。 第５図はＤＮＡの相補性の確認をする際のホリアクリル
アミトゝゲル上のサンプルのならべ方を示す概略図であ
る。 特許出願人 株式会社三双製作所 第１図 立置 叢２図 ７’Ｔ ＞ ７ｃンｙ９ 策、３図 ’＄ｔ＋出 ・−１會ａ −一嬌
鵬、□□〜１−．．、
ミドゲル上のサンプルのならべ方を示す概略図である。 Ｔ、Ｇ、Ｇ、Ａは、それぞれの塩基に特異的な切断を行
なったＤＮＡフラグメントサンプルである。 第２図はゾーンに歪み、曲がりがおこった」場合の測定
の不正確さを示す概略図である。ｙ工、ｙＣ１３／ｃは
それぞれのゾーンの中点を示す。 第６図は本発明におけるポリアクリルアミドゲル上のサ
ンプルのならべ方を示す概略図である。 対１〜５は、Ｔ、Ｃ，Ｇ、Ａ１重のサンプルを混合した
ものである。 第４図は本発明におけるゾーンの歪み、曲がりの補正の
概念図である。。 第５図はＤＮＡの相補性の確認をする際のホリアクリル
アミトゝゲル上のサンプルのならべ方を示す概略図であ
る。 特許出願人 株式会社三双製作所 第１図 立置 叢２図 ７’Ｔ ＞ ７ｃンｙ９ 策、３図 ’＄ｔ＋出 ・−１會ａ −一嬌
鵬、□□〜１−．．、
Claims (1)
- 一端を灘射性元素でラベルしたＤＮＡ断片に各塩基特異
的切断を行ない、その切断によって得られたＤＮＡフラ
グメントサンプルを電気泳動してラベルされた多数のＤ
ＮＡフラグメントをオートラジオグラフィで検出するこ
とからなるＤＮＡ断片の塩基配列決定方法において各塩
基特異的な切断をした４種類のＤＮＡフラグメントサン
プル全部を混合した対照サンプルを１つ置きに並べ、そ
の間に塩基特異的な切断をしたＤＮＡフラグメントサン
プルを置き、電気泳動して、そのサンプルの両側の対照
サンプルの泳動結果から、塩基特異的切断を行なった１
つのサンプル中のＤＮＡフラグメントのラインでの一つ
ずつ塩基の数の違うゾーンの泳動されてくる位置を予測
し、その位置に該当するゾーンがその塩基特異的な切断
をしたゾーンプルのラインに存在するかどうかを判断し
て、そのサンプル中の多数のＤＮＡフラグメン１、の泳
動位置を決定し、塩基特異的切断を行なった他の各サン
プル中の多数のＤＮＡフラグメントについても同様な操
作を行なうことにより１、塩基特異的切断を行なったそ
の他のサンプル中の多数のＤＮＡフラグメントの位置を
決定し、それ１によって塩基特異的切断を行った各フラ
グメントの順序を決定することを特徴とするＤＮＡ断片
の塩基配列の決定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57155550A JPS5944648A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | デオキシリボ核酸の塩基配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57155550A JPS5944648A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | デオキシリボ核酸の塩基配列決定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5944648A true JPS5944648A (ja) | 1984-03-13 |
Family
ID=15608509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57155550A Pending JPS5944648A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | デオキシリボ核酸の塩基配列決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5944648A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6317477U (ja) * | 1986-07-18 | 1988-02-05 | ||
| JPS6348480A (ja) * | 1986-08-18 | 1988-03-01 | Advantest Corp | 論理波形発生装置 |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| US8097405B1 (en) | 1982-06-23 | 2012-01-17 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleic acid sequencing processes using non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs, and other processes for nucleic acid detection and chromosomal characterization using such non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs |
-
1982
- 1982-09-07 JP JP57155550A patent/JPS5944648A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8097405B1 (en) | 1982-06-23 | 2012-01-17 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleic acid sequencing processes using non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs, and other processes for nucleic acid detection and chromosomal characterization using such non-radioactive detectable modified or labeled nucleotides or nucleotide analogs |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| US6200748B1 (en) | 1984-01-16 | 2001-03-13 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| JPS6317477U (ja) * | 1986-07-18 | 1988-02-05 | ||
| JPS6348480A (ja) * | 1986-08-18 | 1988-03-01 | Advantest Corp | 論理波形発生装置 |
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